aislamiento y estudio computacional de alcaloides en
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Aislamiento y estudio computacional de
alcaloides en Lycopodium thyoides como posibles
inhibidores de la enzima acetilcolinesterasa para
el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer
Diana Melendez Zamora
Director: Gian Pietro Miscione, Ph.D.
Codirector: Chiara Carazzone, Ph.D.
Trabajo de grado presentado para optar el tıtulo de Quımico
Laboratorio de tecnicas analıticas avanzadas en productos naturales
Grupo de quımica bio-organica computacional
Departamento de Quımica
Facultad de Ciencias
Universidad de los Andes
Bogota, D.C., Colombia
Mayo 2018
“The most beautiful thing we can expe-
rience is the mysterious. It is the source
of all true art and science”
Albert Einstein
Resumen
Se expone una aproximacion computo-experimental para el analisis de la actividad in-
hibitoria, sobre la enzima acetilcolineserasa (AChE), de moleculas tipo alcaloide encon-
tradas en la planta Colombiana Lycopodium thyoides cruz verde (LTCV). De este modo,
el presente estudio ilustra la metodologıa cromatografica y bioensayos, que conducen a
la separacion e identificacion del porcentaje de inhibicion de las fracciones que podrıan
contener: licodina, dihidrolicopodina, α-lofolina, flabelidina, acetilfawcetina y acetildihi-
drolicopodina, denotadas mediante espectrometrıa de masas Tandem. Del mismo modo, se
realiza un estudio computacional paralelo en el cual se efectuaron calculos de Docking XP
y MM-GBSA, con lo cual se obtuvieron las energıas libres de union y modo de “anclaje”,
ası como los tipos de interacciones entre dichas moleculas y los distintos residuos en los
sitios activos de la AChE. Para dichos estudios los resultados experimentales estuvieron
de acuerdo con los computacionales, que denotan que la licodina es el mejor inhibidor
de acuerdo con las caracterısticas de acoplamiento a traves de sistemas pi, pi cationi-
cos, puentes de hidrogeno y distancias a algunos residuos importantes. Dicha molecula
se denoto en 2 de las fracciones con mayor porcentaje de inhibicion. Sin embargo, para
la fraccion que presento el mayor porcentaje inhibitorio no fue posible encontrar ninguna
de las relaciones m/z pertenecientes a las moleculas estudiadas, por lo que se propone
realizar un analisis mediante QTOF y optimizar la separacion de los compuestos en las
fracciones para ası continuar con su identificacion y bioactividad individual.
Palabras clave: Lycopodium thyoides, bioactividad, acetilcolinesterasa, inhibicion, enfermedad
de Alzheimer, docking, MM-GBSA, modo de interaccion, licodina.
ii
Agradecimientos
A mis padres, por ensenarme a leer, caminar, escribir, cuidarme y guiarme en cada uno de
los pasos que me han traıdo hasta aquı. A mi familia, en especial hermanos por propiciar
debates interesantes de variados temas desde ambitos cientıficos hasta temas filosoficos. A
los profesores Chiara Carazzone y Gian Pietro Miscione, por atreverse a hacer ciencia en
un paıs extranjero y cambiar el mundo un dıa a la vez, por motivar en mı la investigacion
en este paıs tan biodiverso y abrir mi mente a cada una de las ideas y herramientas que
en sus cursos proyectaron. A cada uno, tambien gracias por liderar los grupos LATNAP
y COBO respectivamente. En estos gracias a Daniel, Felipe, Gerson, Lida y Paula, por
sus consejos en el uso de los equipos, comentarios a mis ideas en los pasos a seguir
del proyecto, paciencia y por acompanarme “horas extras”; en este grupo, gracias en
especial a Diana Fajardo y Nicolas Morato por su valiosa ayuda en el desarrollo del
presente proyecto, paciencia y ensenanzas. Por parte de COBO, gracias a Andres, Dorian,
Jonathan, Pietro, Santiago, y en especial a Manuel Ruiz, por la gran ayuda en el desarrollo
de los protocolos y a Sergio Correal y Figueroa por el animo que me sostuvo. Finalmente
gracias al departamento, a los profesores de la carrera y al comite de pregrado en Quımca.
iii
Indice de contenidos
Resumen II
Agradecimientos III
Indice de figuras VIII
Indice de tablas XI
Indice de ecuaciones XIII
Indice de esquemas XIV
1 Introduccion 1
1.1 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.1.1 Objetivo general . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.1.2 Objetivos especıficos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.1.2.1 Etapa experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.1.2.2 Etapa computacional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2 Marco teorico 9
2.1 Enfermedad de Alzheimer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.1.1 Hipotesis agregacion de proteınas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.1.2 Hipotesis colinergica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.1.2.1 Acetilcolina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.1.2.2 Acetilcolinesterasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.1.2.3 Morfologıa y tipologıa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.1.2.4 Rol del potencial electrostatico en la union de ligandos
cationicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
iv
Indice de contenidos
2.1.2.5 Moleculas de agua dentro y fuera del sitio activo . . . . . 20
2.1.2.6 Mecanismo de entrada y salida de ligandos . . . . . . . . . 21
2.1.2.7 Sustrato natural de la enzima: ACh . . . . . . . . . . . . . 23
2.1.2.8 Otros sustratos: ligandos inhibidores . . . . . . . . . . . . 25
3 Estado del arte 28
4 Metodos 32
4.1 Cromatografıa lıquida de alta eficacia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
4.1.1 Deteccion de arreglo de diodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
4.1.2 Espectrometrıa de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
4.1.2.1 Modo de ionizacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
4.1.3 Analizador de masas y masas tandem (MS/MS) . . . . . . . . . . . 37
4.1.4 Modo de operacion HPLC-DAD y ESI-MS/MS . . . . . . . . . . . 38
4.2 Espectroscopıa UV-vis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.2.1 Modo de operacion equipo UV-vis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.3 Bioensayos de inhibicion in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.3.1 Metodo colorimetrico de Ellman . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.4 Base de datos de proteınas PDB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.5 Docking . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.5.1 Protocolo Docking . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.5.1.1 Preparacion del receptor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.5.1.2 Preparacion de los ligandos . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.5.1.3 Preparacion del grid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
4.6 MM-GBSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.7 General Drug Discovery . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
5 Metodologıa 50
5.1 Experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
5.1.1 Reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
5.1.2 Preparacion extracto alcaloides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.1.3 HPLC-DAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
5.1.4 Preparacion de las fracciones para los bioensayos . . . . . . . . . . 53
5.1.5 Bioensayos de inhibicion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
v
Indice de contenidos
5.1.5.1 Preparacion de soluciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
5.1.5.2 Blanco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
5.1.5.3 Maximo de absorbancia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
5.1.5.4 Ensayo biologico de cada fraccion . . . . . . . . . . . . . . 55
5.1.5.5 Desarrollo del metodo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
5.1.5.6 Estandar inhibitorio de la AChE . . . . . . . . . . . . . . 56
5.1.6 HPLC MS/MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
5.2 Computacional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
5.2.1 Docking . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
5.2.1.1 Eleccion de los PDB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
5.2.1.2 Preparacion del receptor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
5.2.1.3 Preparacion ligandos nativos . . . . . . . . . . . . . . . . 60
5.2.1.4 Preparacion ligandos identificados en LTCV . . . . . . . . 60
5.2.1.5 Generacion del grid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
5.2.1.6 Calculo de Docking . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
5.2.2 MM-GBSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
6 Resultados, analisis y discusion 62
6.1 Separacion HPLC-DAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
6.2 Bioensayos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
6.3 HPLC MS/MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
6.4 Criterios seleccion PDB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
6.5 Comparacion Docking XP y MM-GBSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
6.6 Analisis geometrico del sitio de union o binding site . . . . . . . . . . . . . 75
6.7 Docking en el CAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
6.7.1 4EY5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
6.7.2 4EY6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
6.7.3 4BDT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
6.8 Docking en el PAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
7 Conclusiones 93
Bibliografıa 95
vi
Indice de contenidos
Appendices 103
A Abreviaciones 104
vii
Indice de figuras
1 Esquema general del procedimiento de Drug Discovery basado en la estructura
mediante el uso de metodos computacionales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2 Tendencia a presentar la enfermedad de Alzheimer de acuerdo con la edad
y el genero. Obtenida de la referencia1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
3 Hipotesis de la cascada amilode relacionada con el deposito de amiloide-β
y la agregacion de proteınas τ . Obtenida de2 . . . . . . . . . . . . . . . . 12
4 Activacion neuronal para contenidos codificados con exito (izquierda) y
diferencias para la respuesta de pacientes con deterioro cognitivo leve (MCI)
y personas cognitivamente normales (CN), derecha. Obtenida de3 . . . . . 13
5 Sistema colinergico en el cerebro humano.4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
6 Ciclo de transmision colinergica.4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
7 Caracterısticas mas importantes de la AChE, el numero de residuo se da
para la TcAChE. Obtenido de5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
8 Ubicacion del ligando natural de la AChE dentro del CAS. . . . . . . . . . 23
9 Estructura de las moleculas inhibidoras reversibles o pseudo-reversibles, de
la enzima AChE, aprobadas por la FDA como medicamentos. . . . . . . . 26
10 Sistema de deteccion mediante el DAD. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
11 Cono de Taylor generado en la ESI. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
12 Diagrama esquematico del analizador de masas: cuadrupolo. . . . . . . . . 37
13 Configuracion general del espectrometro de masas con ionizacion por electro-
spray y analizadores cuadrupolo y trampa de iones. . . . . . . . . . . . . . 39
14 Modo operacion espectrofotometro UV-vis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
15 Parametros empleados para la realizacion del analisis con el MS/MS. . . . 57
16 Parametros configurados mediante Maestro para la preparacion del receptor. 59
17 Cromatograma obtenido al inyectar 20µL-50µL-100µLdel EA. . . . . . . . 63
viii
Indice de figuras
18 Solapamiento de los 10 cromatogramas obtenidos para la recoleccion de
fracciones y su respectivo identificador (tiempo de retencion). . . . . . . . . 64
19 Relacion entre % inhibicion de todas las fracciones y su tiempo de retencion. 65
20 Estructuras de las moleculas del EA de LTCV en las cuales se enfoco la
busqueda de los fragmentos de manera experimental y que fueron estudia-
das de manera computacional. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
21 Cromatograma HPLC-DAD (10-420 nm) de la fraccion 3 del EA de LTCV. 67
22 cromatogramas de iones totales (TIC) para la fraccion 3 del EA. . . . . . . 67
23 Cromatograma HPLC-DAD (10-420 nm) de la fraccion 13.5 del EA de LTCV. 67
24 cromatogramas de iones totales (TIC) para la fraccion 13.5 del EA. . . . . 68
25 Espectro de masas para m/z=243.96 (fraccion 13.5) que se denoto Licodina. 68
26 Espectro de masas para m/z=288.26 (fraccion 13.5), se denoto Flabelidina. 68
27 Espectro de masas m/z=292.25 (fraccion 13.5), Acetildihidrolicopodina. . . 68
28 Cromatograma HPLC-DAD (10-420 nm) de la fraccion 53 del EA de LTCV. 69
29 cromatogramas de iones totales (TIC) en la fraccion 53. . . . . . . . . . . . 69
30 Espectro de masas, m/z=292.40, se denoto Acetildihidrolicopodina (frac.
53). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
31 Espectro de masas para m/z=350.26, se denoto Acetilfawcettiina (fraccion
53). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
32 Estructuras y nombres de los ligandos nativos por cada cristal (#PDB) y
su correspondiente sitio de union (CAS o PAS). . . . . . . . . . . . . . . . 72
33 Conteo de residuos en el binding site para cada una de las 47 poses de los
ligandos en el CAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
34 Conteo de residuos en los binding sites para cada una de las 2 poses de los
ligandos en el PAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
35 Vista de la mejor pose del ligando nativo del PDB 4EY5 (HupA). . . . . . 77
36 Vista de interaccion del ligando para las poses de las moleculas de LTCV
encontradas por el Docking en el PBD 4EY5. . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
37 Diagrama de interaccion de ligandos para la mejor pose del ligado nativo
(a) y la mejor pose del ligando LTCV del PDB 4EY6. . . . . . . . . . . . . 82
38 Interacciones para las diferentes poses y sitios de union obtenidos para el
ligando nativo Huprina W, del PDB 4BDT. . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
ix
Indice de figuras
39 Diagrama de interaccion de ligandos para las poses de Huprina W y la
mejor pose del ligando LTCV del PDB 4BDT, en el sitio PAS. . . . . . . . 88
40 Interacciones desfavorables para la acetildihidrolicopodina y el ligando na-
tivo en la cavidad CAS en el PDB 4BDT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
x
Indice de tablas
1 Algunos datos importantes sobre los medicamentos aprobados por la FDA
para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (AD). . . . . . . . . . . 4
2 Porcentaje de ocupacion del estado abierto en AChE dependiente del nume-
ro de unidades oligomericas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3 Grado de flexililidad de algunos residuos en el gorge. . . . . . . . . . . . . . 22
4 Medicina herbaria china para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer
Obtenida de.6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
5 Metodo en gradiente empleado para la separacion cromatografica del EA. . 53
6 PDB correspondientes a las estructuras de la AChE (receptores), y sus
ligandos nativos, empleados para la realizacion del Docking. . . . . . . . . . 58
7 Porcentaje de inhibicion para todas las fracciones. En verde los tres mejores. 65
8 Grupos de cristales PDB identificados de acuerdo con la posicion de los
residuos en los sitios activos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
9 Puntajes de Docking XP, ∆Gunion MM-GBSA y energıa de tension para las
2 poses del ligando nativo (Huprina W) y las 10 poses encontradas de las
moleculas de LTCV para el PDB 4BDT (CAS). . . . . . . . . . . . . . . . 73
10 Puntajes de Docking XP, ∆Gunion MM-GBSA y energıa de tension del li-
gando para 4 poses del ligando nativo (Huperzina A) y unicamente las 2
poses que se pudo encontrar de dos de las moleculas estudiadas de LTCV
para el PDB 4EY5 (CAS). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
11 Puntajes de Docking XP, ∆Gunion MM-GBSA y energıa de tension para 6
de las 15 poses del ligando nativo (Galantamina) y 7 de las poses encon-
tradas para las moleculas de LTCV para el PDB 4EY6 (CAS). . . . . . . . 74
xi
Indice de tablas
12 Puntajes de Docking XP, ∆Gunion MM-GBSA y energıa de tension para las
2 poses del ligando nativo (Dihidrotansinona I) encontradas. El calculo de
Docking no arrojo ninguna pose para las moleculas de LTCV estudiadas.
(PAS). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
13 Distancia a los residuos del binding site para las poses en el PDB 4EY5. . 78
14 Tipos de interacciones de los residuos en el binding site con cada una de
las poses obtenidas tanto para el ligando nativo (Huperzina A), como para
los ligandos de LTCV. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
15 Puntajes para las poses elegidas, tres mejores (verde) y tres peores (rojo),
del ligando nativo del PDB 4EY6 (galantamina) junto con los residuos con
los que presentan algun tipo de interaccion. . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
16 Distancia a los residuos del binding site para las poses en el PDB 4EY6. . 83
17 Tipos de interacciones de huprina W (ligando nativo) con los residuos en
el binding site para el PDB 4BDT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
18 Distancia a los residuos del binding site para las poses en el PDB 4BDT
que se ubicaron en el PAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
19 Distancia a los residuos del binding site para las poses en el PDB 4BDT
que se ubicaron en el CAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
xii
Indice de ecuaciones
1 Ecuacion de Langevin para el proceso de BD. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2 Ecuacion de Plank. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
3 Relacion entre absorbancia y transmitancia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4 Ley de Lambert Beer. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
5 Expresion original de una funcion de scoring. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
6 Ecuacion general metodos MM-GBSA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
7 Calculo del porcentaje inhibicion de para una fraccion dada. . . . . . . . . . . . 56
xiii
Indice de esquemas
1 Reaccion general para la sıntesis de ACh mediada por la enzima ChAT. . . . . . 15
2 Reaccion general para la degradacion de ACh mediada por la enzima AChE. . . 16
3 Mecanismo de hidrolisis por AChE para ligandos tipo ester. . . . . . . . . . . . . 24
4 Metodo colorimetrico de Ellman para la tiocolina. . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
xiv
1Introduccion
Colombia es el segundo paıs mas biodiverso del mundo, superado unicamente por Brasil.
De acuerdo con las estadısticas, Colombia ocupa el primer lugar en diversidad de aves,
el segundo en plantas, el sexto en reptiles, el septimo en mamıferos y el decimoquinto en
peces. Adicional a ello, se ha evidenciado que gran cantidad de plantas y frutos endemi-
cos presentan actividad biologica de algun tipo. Sin embargo, la investigacion en cuanto
a identificacion, aislamiento y estudio de metabolitos secundarios responsables de dicha
actividad es reducida. Dichos metabolitos se definen generalmente como pequenas molecu-
las organicas, derivadas a menudo de sustratos de origen metabolico primario, las cuales
son producidas por un organismo y no son esenciales para su crecimiento, desarrollo y
reproduccion, pero son necesarias para la supervivencia de este en su ecosistema. Algunos
de los metabolitos que tienen actividad biologica, en humanos mayoritariamente, se pue-
den clasificar en los grupos de moleculas conocidos como terpenoides, fenoles, flavonoides,
macrolidos, alcaloides, entre otros.7–9
1
. 1. Introduccion
Al ser moleculas dependientes del ecosistema en el cual se encuentre el organismo, tanto
la variabilidad, como el conjunto de metabolitos producido por este, dependera de la
especie y de su ubicacion geografica. En el caso especıfico de las plantas, cada especie
elabora su complemento especıfico de metabolitos secundarios. Ello ocurre a partir de
mecanismos de defensa ante ataques de depredadores o patogenos del entorno, o en funcion
de respuesta a estımulos o cambios termicos o lumınicos, convirtiendo al reino vegetal
en una fuente rica en compuestos organicos complejos, muchos de los cuales presentan
actividades farmacologicas en los seres humanos. Lo anterior, ademas de representar una
importante razon por la cual considerar compuestos presentes en plantas, en un paıs con
tan alta biodiversidad de las mismas, establece que el estudio de estos metabolitos, los
cuales son tambien conocidos como “productos naturales”, es un area en la que aun debe
investigarse ampliamente.9,10
Debido a que la estructura de los productos naturales suele ser compleja, presentandose
moleculas con multiples centros quirales y diversidad de grupos funcionales, su sıntesis
quımica no es economica. Lo anterior, ya que pueden requerir el uso de catalizadores
especıficos para favorecer la obtencion de un estereoisomero sobre otro, reacciones en varias
etapas o procesos de purificacion que son costosos tanto en tiempo, como en reactivos.
Es por ello que, en la actualidad, las plantas son la fuente de aproximadamente el 25 %
de los productos farmaceuticos en el mercado. Una clase de metabolitos secundarios con
muchos miembros fisiologicamente activos son los alcaloides. Estos pueden ser definidos
como moleculas organicas que poseen uno o varios anillos con uno o mas atomos de
nitrogeno y generalmente tienen efectos sobre el sistema nervioso central (SNC). De este
modo, han sido usados como analgesicos, anestesicos, estimulantes, relajantes musculares
y tranquilizantes.9,11–14
Historicamente, la extraccion de este tipo de metabolitos en plantas y su uso en con-
centraciones correctas correspondio a un avance en cuanto al tratamiento terapeutico de
enfermedades. La quinina, por ejemplo, obtenida de la corteza de un arbol, es el medica-
mento anti-malaria mas antiguo conocido. En la actualidad, tanto tratamientos terapeuti-
cos como medicacion general para enfermedades asociadas con desordenes del SNC estan
ampliamente distribuidos en el mercado, ejemplos de ellos son:
2
. 1. Introduccion
- Fisostogmina, que se emplea para el tratamiento del glaucoma y actua causando
excitacion del sistema nervioso parasimpatico ademas de contraccion de los musculos
esqueleticos. Lo anterior es atribuido a un bloqueo de la destruccion de la acetilcolina
(ACh) por el obstaculo llamado colina esterasa (ChE).15
- l-DOPA (l-3,4-dihidroxifenilalanine), empleado para el tratamiento contra el Parkin-
son y es efectivo ya que, al ser el precursor de dopamina, se favorece la formacion de
esta ultima. Lo anterior, es vital para el tratamiento ya que se relaciona la enferme-
dad de Parkinson con el incorrecto funcionamiento del tracto extrapiramidal debido
a la falta de un equilibrio entre la cantidad de ACh y dopamina (en la enfermedad
de Parkinson, falta la dopamina). Por lo tanto, para el tratamiento, la medicacion
con agentes anti-acetilcolina o con l-DOPA, es efectivo.16
Respecto a los ejemplos nombrados anteriormente, es de notar que se relacionan ambos
con la molecula ACh. Estos han sido seleccionados especialmente por ello ya que, por
una parte, esta molecula corresponde a un neurotransmisor ampliamente distribuido en
el SNC y, por otra, es el sustrato natural que sufre degradacion a traves de la enzima
estudiada en el presente trabajo, la acetilcolinesterasa (AChE). En particular, la inhibicion
de esta enzima es el principal modo de operacion de los medicamentos actuales contra la
enfermedad de Alzheimer AD y, por supuesto, en este caso tambien se emplean alcaloides
como principios activos, siendo estos la galantamina, el donepezilo o la rivastigmina,
medicamentos aprobados por la Administracion de Alimentos y Medicamentos (FDA).
La AD es un trastorno neurodegenerativo progresivo en el que ocurre una destruccion
o dano de las celulas cerebrales, conduciendo a una perdida de la memoria que puede
alcanzar una afectacion grave en las funciones cognitivas. A pesar de diversos factores
como: ser considerada la enfermedad neurodegenerativa mas comun de la era moderna,
estar asociada con la demencia, reducir gravemente la calidad de vida de los pacientes
y traer una gran carga economica para la familia y la sociedad, su causa u origen no es
bien conocido. Sin embargo, se ha determinado que factores como depositos de amiloide-β,
agregacion de proteınas τ , estres oxidativo, inflamacion en el tejido cerebral y niveles bajos
de ACh, tienen papeles importantes en la expresion de la AD. Ademas de lo anterior, la
aparicion de la enfermedad es esporadica y no se ha establecido un factor determinante
que lo origine, por lo cual se ha determinado como una enfermedad multifactorial.17,18
3
. 1. Introduccion
A pesar de que las investigaciones en cuanto a las posibles causas de la AD han avan-
zado notoriamente en los ultimos 20 anos, no existe una cura para esta enfermedad y
los medicamentos actualmente disponibles para su tratamiento solo retardan su avance,
poseen una efectividad limitada, son pocos y atacan unicamente por 2 mecanismos. En el
primero de ellos, el tratamiento de la enfermedad se logra por la accion inhibitoria sobre
la AChE. Al ocurrir esto se favorece el aumento de la concentracion del neurotransmisor
ACh, un mensajero quımico involucrado en los procesos de la memoria, el juicio, funciones
cognitivas, entre otras. En esta enfermedad, las celulas cerebrales que liberan acetilcolina
tienen deformaciones o son destruıdas, causando una reduccion de la cantidad disponible
del neurotransmisor, ası, los inhibidores de la AChE reducen la degradacion de la ACh
y, al mantener los niveles de acetilcolina, este mecanismo puede ayudar a compensar la
perdida de las celulas cerebrales en funcionamiento y favorecer la hipotesis colinergicaa.
A traves de este mecanismo actuan el donepezilo, la galantamina y la rivastigmina, que
son comercialmente conocidos como Aricept®, Razadyne® y Exelon® respectivamente.
Un segundo mecanismo de accion, el cual corresponde a la molecula llamada memantina
(Namenda®), actua mediante la inhibicion o la accion antagonista del receptor N-Metil-
D-Aspartato (NMDA). En este caso el medicamento actua bloqueando parcialmente el
receptor NMDA, el cual regula la actividad del glutamato, una molecula involucrada en el
procesamiento, almacenamiento y la recuperacion de la informacion, que a su vez, regula
la liberacion del calcio al entorno quımico de las neuronas. Finalmente, un ultimo medica-
mento aprobado, el cual se conoce bajo el nombre de Namzaric®, corresponde a la mezcla
de donepezil con memantina, aprovechando ası la utilidad de ambos mecanismos.19–21
Tabla 1: Algunos datos importantes sobre los medicamentos aprobados por la FDA parael tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (AD).
MecanismoNombre
medicamentoNombre
comercialAno
aprobacionAprobado
para
Inhibicion AChEDonepezilo Aricept 1996 Todas las etapasRivastigmina Exelon 2000 Todas las etapasGalantamina Razadyne 2001 Etapa leve-moderada
Receptor NMDA Memantina Namenda 2003 Etapa moderada-severa
CombinadaDonepezilo ymemantina
Namzaric 2014 Etapa leve-moderada
aMediante la cual se establece que la mejora de los niveles del neurotransmisor acetilcolina, o lainhibicion de su degradacion, mejora la funcion cognitiva.
4
. 1. Introduccion
Es de notar que, aunque los anteriores medicamentos corresponden con principios activos
aprobados por entidades administrativas como la FDA, los efectos secundarios se suelen
presentar en un gran porcentaje de pacientes y varıan la intensidad de los sıntomas en
cuanto este indicado para etapas avanzadas de la enfermedad (Ver Tabla 1). Sin embargo,
algunos de los llamados productos naturales, en especial los alcaloides presentes en las
plantas de la familia Lycopodiaceae, han demostrado tener efectos positivos en el trata-
miento de la AD, con la gran ventaja de que estos productos no tienen grandes efectos
secundarios o se presentan en menos del 10 % de los sujetos en pruebas.22,23 Lo anterior es
atribuido principalmente al alcaloide conocido como Huperzina A (HupA), obtenido de la
planta Huperzia Serrata de la familia Lycopodiaceae, el cual actua como inhibidor de la
AChE y ha sido empleado en la medicina tradicional china y hasta la actualidad. La fa-
milia Lycopodiaceae se compone de aproximadamente 500 especies de plantas vasculares,
las cuales se caracterizan por su pequeno tamano y crecimiento ademas de su capacidad
de distribuirse en una gran variedad de ecosistemas, siendo principalmente encontradas
en bosques tropicales y subtropicales. En Colombia, esta familia se compone de tres gene-
ros principales: Huperzia, Lycopodium y Lycopodiella, que se encuentran distribuidos en
todo el paıs, estimandose que corresponden a cerca del 39 % de las especies neotropicales
encontradas en el territorio colombiano.24–26
De acuerdo con lo anterior, y a pesar del alto porcentaje de especies reportadas en el paıs
para los generos mencionados, ası como sus importantes antecedentes en cuanto al trata-
miento de la AD en el mundo, para Colombia solo existen algunas investigaciones que las
mencionan. Una de ellas corresponde a un trabajo en el cual se estudia la composicion
quımica y separacion de los principales alcaloides en Lycopodium thyoides y Lycopodium
contiguum, los cuales correspondieron a licopodina, fawcettiina, acetilfawcettiina y acetil-
dihidrolicopodina. En un par de estudios adicionales se denota el uso de plantas de esta
especie, Lycopodium catharticum entre oras, como tratamiento en la demencia senil en el
noroeste de la Amazonıa y otras enfermedades en tribus indıgenas.27–29
En base a dichos estudios no se establece que la actividad encontrada se relacione direc-
tamente con las moleculas mayoritarias identificadas para las especies, ni cuales son las
caracterısticas que poseen dichas moleculas para realizar la inhibicion. Es de este modo
que la utilizacion de metodos computacionales, como lo son el Docking o el MM-GBSA
(Molecular Mechanics-Generalized Born Surface Area) pueden ser utiles en este caso.
5
. 1. Introduccion
Por una parte el Docking, o acoplamiento molecular, es un metodo que permite predecir
la conformacion que minimiza la energıa entre una molecula, la cual se conoce como
ligando, y un sustrato con el cual se acopla, que se conoce como receptor. Este metodo
arroja un resultado que se conoce como Docking score o puntaje del Docking. Lo anterior
es importante, ya que conocer que tan favorable o desfavorable es la union entre ellas
representa una oportunidad de conocer si un ligando de interes serıa un buen inhibidor
enzimatico, en este caso para la AChE, importante en el tratamiento de la AD.
Sin embargo, las funciones de scoring para el Docking estan disenadas para procesar
grandes cantidades de moleculas en un periodo corto de tiempo, lo que implica que su
capacidad y precision para predecir la fuerza de dichas interacciones es limitada. Ası
pues, se emplea tambien el MM-GBSA, que es un metodo computacional mas preciso y,
por tanto, mas demandante, el cual basa su enfoque en una combinacion de un termino
de energıa de mecanica molecular con un modelo de solvatacion continua y un termino
dependiente del area de superficie para predecir las diferencias de energıa libre.30–32
Figura 1: Esquema general del procedimiento de Drug Discovery basado en la estructura me-diante el uso de metodos computacionales.
Ahora bien, es pertinente establecer que tanto el Docking, como el MM-GBSA hacen parte
de la primera etapa en lo que se conoce como Structure Based Drug Discovery o desarrollo
de medicamentos basado en la estructura (Ver Figura 1).
6
. 1. Introduccion
Este es un procedimiento en el cual se identifican: un receptor, que esta implicado en un
mecanismo bioquımico asociado a la expresion de una enfermedad; y moleculas, que pue-
den tener efectos sobre la etiologıa de una enfermedad y son estudiadas por laboratorios
farmaceuticos o academicos. Estas ultimas son luego filtradas mediante procesos de selec-
cion computacional, que inician tıpicamente con protocolos de Docking y posteriormente,
mediante el uso de filtros mas especıficos, se escogen unos pocos candidatos a los cuales, si
es posible, se proponen mejoras. Entonces son propuestos para las fases preclınica, clınica
y finalmente a su comercializacion. Es importante resaltar que este es un proceso multi-
etapa, muchas veces iterativo, que constituye el principal metodo para el descubrimiento
de nuevos farmacos, ya que proporciona una manera eficiente para el estudio de datos
estructurales tridimensionales conocidos y la propuesta de nuevas moleculas con mejores
caracterısticas para la re-evaluacion experimental.
De acuerdo con lo antedicho, el presente trabajo busca contribuir con el estudio de los
alcaloides presentes en la planta del genero Lycopodium thyoides encontrada en Colom-
bia. Esto, como un trabajo conjunto entre los grupos, pertenecientes al departamento
de Quımica, de la Universidad de Los Andes: COBO y LATNAP, siglas que identifican
respectivamente al grupo de Quımica Bio-Organica Computacional (siglas en ingles para
Computational Bio-Organic Chemistry) y al Laboratorio de Tecnicas Analıticas Avanza-
das en Productos Naturales (Laboratory of Advanced Analytical Techniques in Natural
Products). Con lo cual se espera brindar informacion que aporte al estudio de moleculas
derivadas de productos naturales para el caso colombiano y, ademas, dar una aproxi-
macion computo-experimental para el analisis de su actividad biologica, en cuanto a la
inhibicion de la AChE.
Este proyecto esto se llevo a cabo mediante la obtencion de un extracto de alcaloides
(EA) a partir de la planta Colombiana Lycopodium thyoidesb, con posterior recoleccion
de fracciones para la realizacion del aislamiento e identificacion de 6 de ellos y, finalmente,
realizacion de bioensayos de inhibicion con la AChE. En paralelo, se realizaron de calculos
de Docking y MM-GBSA, lo que permite tener una estimacion del valor de afinidad entre
la enzima y los alcaloides aislados. Por lo cual los objetivos estan enfocados en el analisis
tanto experimental, computacional ası como en el conjunto.
bFue recolectada por el grupo “Productos Naturales Vegetales Bioactivos y Quımica Ecologica” de laUniversidad Nacional de Colombia, sede Bogota.
7
. 1. Introduccion
1.1. Objetivos
1.1.1. Objetivo general
Estudiar y analizar la bioactividad de los alcaloides presentes en la planta LTCV, respecto
a la inhibicion de la AChE.
1.1.2. Objetivos especıficos
1.1.2.1. Etapa experimental
- Recolectar fracciones a partir del EA, para su posterior bioensayo de inhibicion
sobre AChE.
- Identificar la bioactividad de cada fraccion frente al ensayo de inhibicion de la AChE.
- Establecer las fracciones en las cuales se encuentran los compuestos de interes me-
diante el uso de espectrometrıa de masas tandem.
1.1.2.2. Etapa computacional
- Realizar Docking sobre la AChE, empleando como ligandos las moleculas de interes
y aquellos co-cristalizados, los cuales corresponden a inhibidores reportados.
- Reconocer la forma de union y caracterısticas de los ligandos en las mejores poses
del Docking, correspondientes a los mejores Docking scores, tanto en XP como en
MM-GBSA.
- Identificar los patrones, si los hay, con los cuales se explique y pueda prever la
afinidad de ligandos con la AChE.
- Ejecutar procedimientos de MM-GBSA con el fin de confirmar la veracidad del Doc-
king score y analizar comparativamente ambos metodos.
8
2Marco teorico
2.1. Enfermedad de Alzheimer
La enfermedad de Alzheimer es un trastorno neurodegenerativo que afecta principalmen-
te las celulas nerviosas conocidas como neuronas, causando su dano o destruccion. Ello
resulta en una perdida gradual de las funciones cognitivas, la memoria y, eventualmente,
causa demenciaa.
Consiste principalmente de tres etapas, la primera de ellas tiene una duracion aproximada
de 1-4 anos, en los cuales la persona presenta episodios de perdida de memoria a corto
plazo, que se ve evidenciada en una dificultad para seleccionar las palabras adecuadas al
momento del habla, no recordar nombres de personas o perder objetos.
aTermino general que se emplea para referirse a una disminucion de la capacidad mental que es losuficientemente grave como para interferir con la vida cotidiana.19
9
. 2. Marco teorico
En este periodo tambien se presenta irritabilidad y dificultad para aprender nuevas cosas,
hechos que generalmente son caracterısticos a lo largo de la misma. Esta es la etapa tem-
prana de la enfermedad y aunque se encuentra catalogada de este modo, los primeros pasos
en los procesos de la enfermedad no son claros, no se han identificado biomarcadores que
ayuden con un diagnostico clınico temprano, ni los sıntomas presentados la personalidad
son facilmente reconocibles para esta etapa. Solo cuando los sıntomas interfieren signifi-
cativamente con las actividades sociales y laborales, son reconocidos por otras personas
y ello se da generalmente en una etapa intermedia. En esta, se presentan alteraciones en
el comportamiento, desorientacion, dificultad para caminar y se evidencia una afectacion
importante en las funciones cognitivas. La depresion ocurre en el 24-32 % de los casos, la
ansiedad en el 17-27 %, la apatıa hasta en el 41 % y los delirios en el 23 %. En una etapa
final de la enfermedad, que puede extenderse hasta los 10 anos, se llega a una perdida
completa de la memoria, no se tiene nocion del tiempo y puede haber una perdida total
de la autonomıa, lo que puede requerir atencion integral.18,33,34
Es de resaltar que esta enfermedad suele tener una aparicion esporadica, la cual no esta
determinada por una causa especıfica, y tampoco existe evidencia de una circunstancia
luego de la cual se presente, aunque los principales factores de riesgo se asocian con la edad
y la mayorıa de casos se presentan en mujeres, siendo la tendencia para estos exponencial
(Figura 2) aunque es de resaltar que factores asociados a la calidad de vida, estres y
alimentacion tambien han demostrado tener efectos sobre la expresion de la misma.1,35
Respecto al aumento de la enfermedad, en febrero del presente ano, Brookmeyer y co-
laboradores publicaron un artıculo en el cual resaltan los estudios realizados sobre una
poblacion de personas en Estados Unidos (EEUU), con el fin de determinar la cantidad de
estas que presentan AD, o tienen predisposicion a esta enfermedad. Los resultados arroja-
ron que, en 2017, aproximadamente 6 millones de estadounidenses presentaron la AD en
etapas clınicas o tuvieron deterioro cognitivo leve debido a la AD. Ademas, 46.7 millones
de estadounidenses la presentaron en etapas preclınicas (amiloidosis, neurodegeneracion,
o ambos) y estimaron que la poblacion que sufrira la AD en etapas clınicas para el ano
2060 crecera a 15 millones. Lo que esta de acuerdo con cifras entregadas en otros reportes:
13.8, 11 y 16 millones de personas afectadas para 2050. Lo anterior, en parte, debido a
un incremento en la esperanza de vida.36–38
10
. 2. Marco teorico
Figura 2: Tendencia a presentar la enfermedad de Alzheimer de acuerdo con la edad y elgenero. Obtenida de la referencia1
De acuerdo con lo anterior, la AD ha sido catalogada como la enfermedad neurodegenera-
tiva mas comun de la era moderna. Esta se asocia con la demencia, al representar mas del
80 % de los casos de demencia en todo el mundo en personas de edad avanzada. Para esta,
a pesar de haber sido descubierta en 1907 por el Dr. Alois Alzheimer, aun no se conoce
su etiologıa, por lo cual, actualmente existen dos grandes hipotesis: deposito o agregacion
de proteınas y colinergica.37–39
2.1.1. Hipotesis agregacion de proteınas
La mayorıa de los trastornos neurodegenerativos suelen asociarse con depositos de pro-
teınas agregadas. En el caso de la AD, los agregados extracelulares de amiloide-β, confor-
mados por los peptidos βA42, y maranas neurofibrilares de la proteına-τ son los dos rasgos
distintivos neuropatologicos de la enfermedad. Desde la epoca del Dr. Alois Alzheimer,
los neuropatologos han identificado placas amiloides a traves de las autopsias a cerebros
de personas con AD, lo que sugiere que estas patologıas causan la enfermedad.40,41
11
. 2. Marco teorico
Aunque, segun esta hipotesis, los depositos de amiloide-β y la agregacion de la proteına-τ
son las principales causas para el desarrollo de la AD, en la actualidad se ha propuesto un
“avance” en esta hipotesis, el cual establece que se trata de un procedimiento en cascada,
al conocerse vıas interconectadas relacionadas con factores geneticos, como mutaciones en
los genes PSEN1, PSEN2 y de la APP, los cuales se relacionan con las presenilinas, una
familia de proteınas transmebranales, ası como alteraciones en el cromosoma 21, como se
ve en la Figura 3.42 Ademas el mismo Alois Alzheimer describio en sus textos originales:
Parece que la transformacion de las fibrillas coincide con el almacenamiento
de un producto patologico todavıa no bien conocido del metabolismo de la
neurona. Alrededor de un cuarto o un tercio de todas las neuronas de la corteza
cerebral mostraban esas alteraciones. Numerosas neuronas, especialmente en
las capas celulares altas, habıan desaparecido totalmente.43
Figura 3: Hipotesis de la cascada amilode relacionada con el deposito de amiloide-β y laagregacion de proteınas τ . Obtenida de2
12
. 2. Marco teorico
2.1.2. Hipotesis colinergica
Por otra parte, la hipotesis colinergica argumenta que los bajos niveles del neurotransmisor
ACh, causados por el dano o destruccion de las celulas colinergicas (neuronas que emplean
la ACh como neurotransmisor), corresponde a la principal causa de la AD.
Esta hipotesis fue desarrollada alrededor de la decada de 1970. En esta, el estudio me-
diante autopsias, denoto una perdida pronunciada tanto de enzimas colinergicas en la
corteza, como de celulas colinergicas en el cerebro anterior basal, particularmente en las
sub-regiones que se proyectan a la corteza afectada por la enfermedad de Alzheimer.
Dichos hallazgos, en conjunto con el conocimiento de que la contribucion colinergica fa-
vorece procesos como la memoria y otras habilidades cognitivas, condujeron a realizar
investigaciones exhaustivas sobre este tipo de celulas y sus enzimas.3,44
Es por ello que en la actualidad, la mayorıa de los medicamentos aprobados por la FDA,
se basan en esta hipotesis para el tratamiento de la AD y, aunque ha perdido un poco de
credibilidad a causa de que estos no la retrasan efectivamente o a una mejor tasa, una
serie de investigaciones recientes en el area de neurociencias confirman el papel vital de
la neurotransmision colinergica en la funcion cognitiva, especıficamente en la atencion y
la codificacion de la memoria. Es el caso del estudio realizado por Richter et al. (2018)
en el cual concluyen que un deficit colinergico es uno de los factores que influyen en la
respuesta a la estimulacion colinergica. Ello lo aducen gracias a estudios que miden la
respuesta cerebral a traves de imagenes de resonancia magnetica, mediante las cuales se
evidencia una mejora en el rendimiento de la memoria dependiente del aumento colinergico
local en las estructuras relevantes para la realizacion de las tareas en prueba.3,44–46
Figura 4: Activacion neuronal para contenidos codificados con exito (izquierda) y di-ferencias para la respuesta de pacientes con deterioro cognitivo leve (MCI) y personascognitivamente normales (CN), derecha. Obtenida de3
13
. 2. Marco teorico
De acuerdo con lo nombrado, segun esta hipotesis la disminucion en el numero y actividad
de celulas colinergicas, que conlleva a una disminucion de la ACh, es la principal causa de
la perdida de la memoria y la disminucion en el rendimiento cognitivo. Lo anterior, corres-
ponde con las caracterısticas principales de la AD, por lo que inhibir la enzima responsable
de la degradacion de la ACh aumenta su concentracion y favorece el sistema de transmi-
sion colinergica. Ahora bien, al ser el neurotransmisor ACh, el componente colinergico
empleado en esta ruta es necesario abordar esta molecula con mayor profundidad.
2.1.2.1. Acetilcolina
La ACh es un neurotransmisor que se encuentra ampliamente distribuido en el sistema
nervioso y, por ende, desempena un gran numero de funciones tanto en el SNC como en
el SNP (sistema nervioso periferico). En este ultimo es responsable de la contraccion de la
musculatura lisa, la dilatacion de vasos sanguıneos, el aumento en las secreciones corpo-
rales y la disminucion de la frecuencia cardıaca. Lo anterior, al encontrarse mayormente
asociado con el sistema parasimpatico (una sub-division del sistema nervioso autonomo, el
cual pertenece al SNP). Por otra parte, en el SNC, este neurotransmisor ha sido asociado
en el desempeno de papeles crıticos en el desarrollo de la corteza cerebral, la actividad
cortical, el ciclo sueno-vigilia y el control del flujo sanguıneo, ası como la modulacion de
los desempenos cognitivos y los procesos de aprendizaje y memoria. Dichas funcionalida-
des se asocian con las neuronas colinergicas localizadas en clusters principalmente en dos
zonas del cerebro, la primera de ellas, ubicada en la zona anterior basal y la otra, en los
nucleos pedunculopontino y tegmental laterodorsal, para las cuales se ha evidenciado una
distribucion a traves de los “pathways” mostrados en la Figura 5.47,48
A lo largo de los anos, se ha documentado que Los cambios en el sistema colinergico en el
cerebro durante el envejecimiento y en la AD son los responsables del decaimiento de la
respuesta en las funciones cognitivas y el avance de dicha enfermedad. Ello se ha realizado
mediante la evaluaciones post-mortem, en las cuales el estudio de placas seniles denota
la ausencia o dano de celulas colinergicas o de los patways asociadas a estas, o mediante
imagenes a traves del estudio de los principales componentes funcionales de las celulas
colinergicas (acetilcolina, enzimas) y la senalizacion.33
14
. 2. Marco teorico
(a) Ubicacion de neuronas colınergicas. (b) “Pathways” colinergicos.4
Figura 5: Sistema colinergico en el cerebro humano.4
La senalizacion mediante este neurotransmisor se conoce como transmision colinergica y
ocurre en 6 etapas principales:4,49
1. La molecula colina es llevada al interior de la terminal presinaptica del axon, a traves
de transporte activo y a mediante sistemas de transporte dependientes de iones sodio
(Na+). Una vez adentro, la colina reacciona con la molecula acetil coenzima A
(acetil CoA), lo cual requiere la catalisis a traves de la enzima colinacetiltransferasa
(ChAT), para formar acetilcolina (ACh). Esquema 1.
Esquema 1: Reaccion general para la sıntesis de ACh mediada por la enzima ChAT.
2. La ACh es transportada a la vesıcula presinaptica que evita su degradacion.
3. El potencial de accion, que corresponde a una onda de descarga electrica que viaja
a lo largo de los axones, modificando ası su distribucion de carga electrica, ocasiona
una activacion de los canales de calcio, los cuales se abren permitiendo la entrada
de Ca2+, favoreciendo la fusion de la vesıcula con la membrana.
15
. 2. Marco teorico
Luego, mediante exocitosis, se da la liberacion de la ACh. Ademas, parte de esta se
une tambien a los receptores presinapticos para inhibir la liberacion de mas ACh.
4. La ACh liberada se une al receptor post-sinaptico, lo cual conlleva a la apertura
de los canales ionicos, permitiendo el paso de estos y ası, ocasionando la respuesta
colinergica.
5. Para el quinto paso, la AChE finaliza la funcion de la ACh mediante el rompimiento
o hidrolisis de la molecula, en la hendidura sinaptica. Ello resulta en la generacion
de acetato y colina, en un proceso necesario para permitir que la neurona colinergi-
ca vuelva a su estado de reposo despues de la activacion y para permitir su uso
nuevamente en la re-sıntesis del neurotransmisor.50,51
Esquema 2: Reaccion general para la degradacion de ACh mediada por la enzima AChE.
6. Finalmente, la colina libre es llevada nuevamente al interior de la neurona presinapti-
ca para repetir el ciclo.
(a) Sıntesis y degradacion de la acetil-colina.
Figura 6: Ciclo de transmision colinergica.4
16
. 2. Marco teorico
Ahora bien, habiendo establecido la importancia y funcionalidad del neurotransmisor
ACh es de interes denotar las caracterısticas de esta molecula, con motivo de reconocer
su naturaleza en terminos de las interacciones quımicas que pueda presentar.
La ACh es un ester de colina y acido acetico, que presenta un nitrogeno cuaternario,
cargado positivamente, en un grupo trimetilamonio (TMA). Respecto a este grupo, en
compuestos aromaticos el TMA actua como desactivante o meta-orientador debido a la
deficiencia de carga sobre el nitrogeno y la mayor electronegatividad de este respecto al
carbono. Ahora bien, respecto a los oxıgenos del grupo funcional ester, es posible establecer
que la molecula tiene una polarizacion fuerte y no tiene posibilidad de donar enlaces de
hidrogeno, pero sı puede ser aceptora de los mismos. Con lo anterior, al ser ACh una
molecula polar y cargada no es posible que logre penetrar membranas lipıdicas y, por
tanto, tampoco la barrera hematoencefalica.
2.1.2.2. Acetilcolinesterasa
La AChE hace parte de las colinesterasas, una familia de enzimas presentes en el SNC,
particularmente en tejido nervioso, muscular y de los globulos rojos, que catalizan la
hidrolisis del neurotransmisor acetilcolina en colina y acido acetico (Esquema 2). Existen
dos tipos de colinesterasas, la acetilcolinesterasa (AChE) y la pseudo o butirilcolinesterasa
(BChE). La AChE se encuentra principalmente en la sangre, especıficamente en las mem-
branas de globulos rojos, las uniones neuromusculares y las sinapsis neuronales, mientras
la BChE, que se produce en el hıgado, se encuentra principalmente en el plasma.33,52
Probablemente una de las caracterısticas mas notables de la AChE es que hidroliza la ACh
a una tasa muy elevada, acercandose al lımite de difusion, lo cual implica que el encuentro
de la ACh con la enzima es el limitante de la velocidad. Ademas, se ha encontrado que
la asociacion del sustrato, las transformaciones quımicas y la disociacion del producto
proceden a tasas similares por lo cual ha sido catalogada como una enzima evolutiva
perfecta. En consecuencia, la AChE no solo ha sido estudiada debido al importante rol en
los procesos de transmision colinergica, sino tambien con motivo de conocer los factores
estructurales que hacen posible su elevada eficiencia catalıtica.53,54
17
. 2. Marco teorico
2.1.2.3. Morfologıa y tipologıa
La informacion estructural de la AChE proviene de datos cristalograficos obtenidos a
partir de 1991, ano en el cual se logro purificar y realizar el primer cristal de la AChE
aislada de Torpedo californica (TcAChE), una mantaraya electrica de aguas tropicales la
cual presenta abundancia de esta enzima en sus organos electricos. Como resultado se
conoce que se trata de una enzima de tipo serina hidrolasa, al ser su funcion principal
la hidrolisis y tener un residuo de SER en el sitio donde se realiza la catalisis (sitio
catalıtico). Ademas, los datos cristalograficos para AChE muestran que el sitio catalıtico
se localiza en un hondo agujero o gorge que se extiende a traves de 20 A de profundidad
desde la superficie de la enzima y tiene un diametro de alrededor 5 A. Sin embargo, dicho
diametro no es constante a lo largo del gorge ya que, aproximadamente en la mitad de
este se evidencia un “cuello de botella” formado principalmente por las cadenas laterales
de PHE y TYR. Este es un tramo muy angosto del gorge, que en su estado cerrado admite
unicamente el paso de moleculas de agua. Por otra parte, se han identificado en el gorge
dos sitios de union: el sitio anionico catalıtico (CAS) y el sitio periferico anionico (PAS).
El CAS, ubicado cerca del fondo del gorge contiene una trıada catalıtica (HIS-GLU-SER)
y un residuo aromatico clave, TRP. El PAS, se ubica cerca de la entrada del gorge, en
este un TRP es el componente principal.5
Figura 7: Caracterısticas mas importantes de la AChE, el numero de residuo se da parala TcAChE. Obtenido de5
18
. 2. Marco teorico
Es de resaltar que debido a las caracterısticas descritas con anterioridad, no es claro como
los ligandos entran y los productos salen del sitio catalıtico a las velocidades encontradas
experimentalmente. Lo anterior, ya que en las estructuras cristalinas, este sitio parece
accesible solo a traves del gorge, lo cual indica que fluctuaciones estructurales son reque-
ridas para que la enzima desempene su funcion, ademas de sugerir la evaluacion de otras
caracterısticas para entender su facultad en la catalisis.
2.1.2.4. Rol del potencial electrostatico en la union de ligandos cationicos
La AChE presenta una distribucion de carga asimetrica a lo largo del gorge asociada con
la carga de los residuos en este. Ello resulta en la generacion de un fuerte dipolo y, al
estar alineada lo largo del eje del agujero, se favorece la atraccion de ligandos cargados
positivamente para penetrar en el sitio activo.5
Lo anterior se ha asociado con una teorıa de direccion electrostratica, mediante la cual
se establece que dicha asimetrıa de cargas genera un campo electrostatico que puede
acelerar el encuentro de un ligando cationico con la entrada al sitio activo y, debido
al alto contenido de residuos aromaticos del gorge (≈60 % area total del mismo), estos
pueden servir como estabilizadores.
Se ha sugerido que estas dos caracterısticas pueden funcionar juntas. De manera que
el dipolo proporciona una fuerza motriz, mientras que los multiples grupos aromaticos
sirven como una serie de sitios de union de baja afinidad para los ligandos cargados
positivamente y ası, el tunel que conduce al sitio activo actua como un “aspirador” que
asegura un suministro rapido del sustrato cationico al sitio activo.5,55
Lo anterior fue estudiado por Antosiewicz et. al. mediante simulaciones de dinamica
Browniana (BD), a traves de la integracion numerica de la ecuacion de Langevin (Ecua-
cion 2.1.2.4). Para ello, representaron la distribucion de carga de ACh en el campo de
AChE, encontrando que el campo efectivamente guıa el sustrato a la desembocadura del
gorge. Sin embargo, la correlacion entre las tasas calculadas y las medidas experimen-
talmente no era muy buena, por lo cual propusieron que fluctuaciones estructurales en
la enzima o eventos posteriores al encuentro podıan contribuir a la limitacion de la tasa
calculada.56,57
19
. 2. Marco teorico
Sin embargo, estudios posteriores mas cuidadosos denotaron que la direccion electrostatica
esta limitada a distancias relativamente cortas de la superficie de la enzima y no solo la
carga total sino tambien el momento dipolar es responsable de la direccion electrostatica.58
ma = mδv
δt= F(x) − βv + η(t) (1)
Donde, m masa, a aceleracion de la partıcula browniana, F(x) fuerza de interacciones y η
esta relacionada con una constante asociada a procesos estocasticos.
Finalmente, la realizacion de diversos estudios en los cuales se variaba la ionizacion o
carga de algunos residuos selectivamente, o en la superficie o en el CAS, denotaron que
cuando se neutralizaban residuos anionicos en la superficie, la velocidad de reaccion no
presentaba cambios significativos, mientras que al neutralizar los residuos presentes en el
sitio catalıtico la variacion no era despreciable.59
2.1.2.5. Moleculas de agua dentro y fuera del sitio activo
Otra de las caracterısticas representativas de los datos cristalograficos tanto para las
AChE, como para complejos con ligandos, esta vinculada con el gran numero de molecu-
las de agua con las que son cristalizadas. Ello, esta relacionado con que este tambien
corresponde a uno de los factores que podrıan afectar la tasa de la reaccion.5
Koellner et al. sugiere que grandes arreglos de moleculas dentro del gorge actuan como un
“lubricante” el cual facilita las fluctuaciones estructurales. Otros autores, han establecido
tambien papeles similares para las moleculas de agua. El anterior es el caso del estudio
realizado por Shen et. al. en el cual estimaron la fuerza de traccion al incluir moleculas de
agua en estudios de dinamica molecular. Lo anterior mostro que la fuerza disminuyo de
≈ 1500 pN en vacıo a ≈ 800 pN en solucion acuosa. Por lo cual es importante considerar
las moleculas de agua para la realizacion de los calculos.60,61
20
. 2. Marco teorico
2.1.2.6. Mecanismo de entrada y salida de ligandos
A pesar de que los factores nombrados con anterioridad favorecen el acercamiento o en-
cuentro de los ligandos con el sitio activo, el cuello de botella es uno de los elementos
fundamentales para que ocurra dicho encuentro. Lo anterior, pues al encontrarse en me-
dio del gorge y poseer una estrecha seccion transversal, los sustratos e inhibidores con una
seccion transversal mucho mas grande que el cuello de botella no tendrıan acceso al CAS,
lo cual no esta en concordancia con su eficiencia catalıtica.
Ası pues, los primeros estudios realizados para comprender el mecanismo de entrada a
la AChE se hicieron con TcAChE mediante dinamicas moleculares. Estas denotaron una
variacion en las dimensiones del gorge, especialmente del cuello, debido principalmente
a que los residuos se mueven durante la simulacion. Mediante estos se establecio que
la enzima presentaba estados cerrados - abiertos en relacion con el movimiento de las
cadenas laterales de los residuos de los aminoacidos PHE330 y TYR121. Dichos estudios
fueron migrando gradualmente hacia la relacion entre el porcentaje de ocupacionb de los
estados abiertos dependiendo del numero de unidades oligomericas o del tipo de sistema
estudiado: receptor o complejo (ligando + receptor).5,62
Tabla 2: Porcentaje de ocupacion del estado abierto en AChE dependiente del numero deunidades oligomericas.
Tipo % Ocupacion estado abiertoMonomero 0.2 %
Complejo monomero 13.8 %Dımero 19.1 %
Complejo dımero 45.6 %
Cabe resaltar que los estados nombrados con anterioridad son un resultado de fluctuacio-
nes de un gran numero de residuos. Por ello, de acuerdo con las estructuras cristalinas y
simulaciones de dinamica molecular (DM) se establecen tres grandes grupos de acuerdo
con la “libertad” que presentan (Tabla 3).
bParametro dependiente del tiempo que se emplea para determinar en que porcentaje del tiempo totalse presento la propiedad de interes.
21
. 2. Marco teorico
Tabla 3: Grado de flexililidad de algunos residuos en el gorge.
Nivel de flexibilidad o libertadTipo I
“libres”Tipo II
Muy altaTipo III
Muy bajaTRP84
(principal en CAS)PHE330
(principal en el cuello de botella)TYR121
(principal en el cuello de botella)
TYR130TYR442TYR334
W279 (CAS)
TYR70 (PAS)PHE120PHE331PHE228PHE290TRP233TRP432
Ahora bien, habiendo establecido como se da la entrada de los ligandos al sitio activo de
la AChE y cuales son los factores que propician el encuentro de ambas partes, es necesario
abordar la manera en que ocurre la circulacion de los ligandos, una vez dentro. Ello,
en cuanto a las rutas alternativas para facilitar el trafico de ligandos o disolventes dentro
y fuera de esta y que son necesarias para explicar su alta eficiencia catalıtica. En ese
sentido, se han realizado varios estudios de simulacion mediante DM para investigar las
vıas de liberacion de moleculas pequenas, como el acido acetico, la colina y las moleculas
de agua. Ası pues:5
- 1994: simulacion corta (119ps) de TcAChE en solucion acuosa.
Revelo una apertura transitoria de un canal corto cerca del residuo TRP84, fomenta-
da por un cambio conformacional local cerca de la cavidad CAS. Esta fue nombrada
como “puerta trasera”, y conecta al CAS con el bulk. Un estudio realizado en 1999
tambien lo observo.63,64
- 2010: simulaciones de DM convencionales para la liberacion de tiocolina (TCh).
Se observo que la cadena lateral aromatica de TRP84 es crucial para que la TCh
salga o ingrese. Dicho movimiento ocurre ya que una rotacion de la cadena lateral de
TYR442, ocasiona el rompimiento el enlace de hidrogeno que lo une al TRP haciendo
que este se mueva. Lo anterior tambien fue respaldado por informacion experimental
en la cual se identifico actividad catalıtica en baja medida, aun cuando inhibidores
que se unen fuertemente en el PAS, bloquean la entrada al gorge.65,66
22
. 2. Marco teorico
Por otra parte, un estudio realizado por el grupo de McCamon encuentro la existencia
de una puerta lateral ubicada a ≈ 15 A del CAS, aproximadamente perpendicular a la
entrada de gorge. Esta se compone de los residuos 67 - 94 en lo que se conoce como Ω-loop
(Figura 7). Para este, tanto estudios computacionales como experimentales, indican que
es flexible, contribuye con los cambios de tamano transitorios del gorge y facilita la union
y liberacion de ligandos a traves de las puertas lateral y trasera.5
Finalmente, a traves de simulaciones DM de 500 ps del dımero de TcAChE con tacrina en
el CAS, se descubrio que ademas del gorge y las puertras trasera y lateral, existen entradas
alternativas al CAS a traves de la pared lateral de la AChE que permiten transitoriamente
el intercambio de moleculas pequenas, de agua por ejemplo.67
2.1.2.7. Sustrato natural de la enzima: ACh
La ACh presenta una carga positiva que, como se ha denotado, tiene efectos sobre la tasa
de encuentro enzima-ligando, lo cual facilita la union de este en el CAS. Ademas de ello,
segun diversos estudios, la ACh unida al CAS no solo se acopla a la trıada catalıtica,
sino que tambien, debido a al tamano, carga y forma del TMA, es complementaria con la
configuracion (arreglo tridimensional) de la cavidad como se evidencia en la Figura 8.5,54
(a) ACh en el CAS, vista 3D. (b) ACh en el CAS, vista 2D.
Figura 8: Ubicacion del ligando natural de la AChE dentro del CAS.
23
. 2. Marco teorico
Al estar unida la molecula de ACh, al sitio catalıtico de la enzima, esta sufre hidrolisis.
El mecanismo de reaccion se expone en el Esquema 3. En este R corresponde a la cadena
unida al O del ester que posee grupo TMA.
Esquema 3: Mecanismo de hidrolisis por AChE para ligandos tipo ester. Obtenida de54
De acuerdo con el Esquema 3 se evidencia que la reaccion de los esteres carboxılicos
con AChE ocurre en una etapa de acilacion y una de desacilacion. En la primera, una
molecula actua como base retirando el proton hidroxilico del residuo SER. Esta etapa
avanza a traves de un estado de transicion que similar a un intermediario tetraedrico
inestable, el cual colapsa resultando en la enzima acilada y el alcohol libre (colina, para
el caso de la hidrolisis de la acetilcolina). En una segunda etapa, la acil-enzima sufre un
ataque nucleofılico por una molecula de agua asistida por HIS y la enzima libre se regenera
a traves de un segundo intermedio tetraedrico, con la liberacion de acido acetico.54,68
Respecto a las vıas de circulacion de las moleculas, varios estudios o revisiones realizadas
por Van Belle et.al. denotaron que la salida o entrada de pequenas moleculas, como
amonio, metano o agua, se da a traves de rutas aleatorias, mientras que las moleculas
polares, como metilamonio y acido acetico, se liberan de la enzima unicamente a traves
del gorge. Finalmente, los ligandos mas grandes, tales como TMA y el ion de acetato
mas pequeno, permanecen atrapados dentro del sitio activo. Esto denota que las vıas que
pueden tomar los ligandos (para salir o entrar de la enzima) varıan de acuerdo al tamano
y las propiedades quımicas de estos. Ademas, el PAS parece tener un rol tanto en la
captura, como en la liberacion de ligandos cationicos, a causa de las interacciones de los
ligandos con los residuos aromaticos de ese sitio.5,69
24
. 2. Marco teorico
2.1.2.8. Otros sustratos: ligandos inhibidores
Los sustratos inhibidores de la AChE pueden ser irreversibles, reversibles, o intermediarios
entre ellos. Los primeros, corresponden con moleculas organofosforadas, las cuales pueden
formar un enlace de tipo covalente con la SER del sitio catalıtico, causando una fosfori-
lacion en esta e impidiendo que la enzima cumpla su funcion. Ello causa una afectacion
grave al sistema nervioso y a las funciones controladas por el neurotransmisor ACh. Estos
se conocen como agentes nerviosos y la sarina, el soman y el tabun se encuentran entre los
compuestos mas toxicos conocidos de este tipo. En la actualidad se han dedicado muchos
esfuerzos al desarrollo de tratamientos terapeuticos orientados a civiles y soldados que
han estado expuestos a ellos.5
En segundo lugar, se encuentran los inhibidores reversibles o pseudo-reversibles, los cuales
tienen potencial uso como farmacos o actualmente lo son (Figura 9), es el caso de:70,71
- Donepezilo (Aricept®): Inhibidor reversible, de accion prolongada, basado en pipe-
ridina y relativamente selectivo a AChE. La dosis recomendada es 5 o 10 mg/dıa,
via oral.
- Rivastigmina (Exelon®), Inhibidor pseudo-irreversible (lentamente reversible). Tam-
bien inhibe BChE, pero es relativamente selectivo a AChE en el SNC, especialmente
en las areas de la corteza cerebral y el hipocampo. La dosis diaria varıa entre 6-12
mg, via oral y se administra dos veces/dıa.
- Galantamina (Razadyne®): Inhibidor reversible y competitivo para AChE , presen-
ta baja actividad sobre BChE. Fue obtenido en un principio de una planta amari-
llidacea (Galanthus woronowi), pero actualmente es sintetizada. Se administra de
manera oral dos veces por dıa y la dosis varıa entre 16-24 mg/dıa.
Para los ligandos reversibles, el sitio de union con la enzima puede variar encontrandose 3
cavidades principales: la primera de ellas corresponde al CAS, la segunda de ellas al PAS
y un tercer sitio, se localiza a lo largo del gorge, uniendo el PAS y el CAS, por lo cual en
el presente trabajo se denota PAS-CAS.
25
. 2. Marco teorico
Figura 9: Estructura de las moleculas inhibidoras reversibles o pseudo-reversibles, de laenzima AChE, aprobadas por la FDA como medicamentos.
Un ejemplo de inhibidor para el sitio PAS-CAS es el E2020 ((R,S)-1-benzil-4-)[(5,6-
dimetoxi-1-indanon)-2-il]metilpiperidina), que es un inhibidor bivalente tıpico el cual se
extiende por todo el gorge presentando interacciones tanto con los residuos del CAS, co-
mo del PAS. En este ultimo interactua fuertemente con los residuos aromaticos y forma
puentes H, las cuales son caracterısticas importantes en la inhibicion.5
Respecto a esto, las caracterısticas mas importantes encontradas en los inhibidores de la
AChE, y que pueden tener otros enfoques para el tratamiento de la AD, corresponden
con:
1. Aromaticidad:
Poseer 1 o mas anillos aromaticos, con flexibilidad moderada, si son varios, es pre-
ferible que sean conjugados.
2. Enlaces de tipo puente de Hidrogeno:
Tener la posibilidad de aceptar al menos un enlace de hidrogeno, y en lo posible
de donarlo. En compuestos de tipo fenolico se ha evidenciado que la posibilidad de
donar puentes de H es importante ya que “es bien sabido que los hidroxilos fenolicos
son los grupos mas potentes para neutralizar ROS a traves de la donacion de atomos
de H [73] y tambien son eficaces para quelar los iones de metales de transicion [26].
Sin embargo, la presente descripcion muestra que los compuestos fenolicos naturales
van mas alla de la captura de ROS o de los metales de transicion quelantes. Pueden
inhibir las actividades de varias enzimas y prevenir la agregacion de proteınas”.39
26
. 2. Marco teorico
3. Carga:
Positiva, pero en principio la enzima es capaz de unirse a gran variedad de ligandos
neutrales.54
4. Scaffolds :
Pueden ser de diversos tipos y difieren tanto en los los espaciadores como en la
distancia de estos.
5. Otros:
En lo posible, tener un N cuaternario, unido a una cadena lateral.
2 partes hidrofobicas. Tener pi-stacking, aunque no afecta directamente en la capa-
cidad de inhibicion, juega un papel importante en impedir la formacion de fibrillas
de amiloide-β.72
27
3Estado del arte
Como se ha visto anteriormente, al presente, la cantidad de informacion tanto sobre la
AChE como sobre la AD, es considerable de acuerdo con los amplios estudios realizados
para analizar la dinamica de la enzima y sus complejos, ası como con las investigaciones
experimentales en personas que poseen dicha enfermedad. Sin embargo, a pesar de que
la hipotesis colinergica fue ampliamente aceptada alrededor de 1970, la primer estructura
cristalina de AChE, fue purificada en 1991, y hasta dos anos mas tarde se aprobo “Ta-
crina”, el primer medicamento contra la AD, que serıa descontinuado en anos posteriores
al encontrarse evidencia de que pacientes medicados con esta sufrieron fallas hepaticas
graves. De acuerdo con esto y aunque los farmacos actualmente aprobados por la FDA
presentan diversidad de efectos secundarios que van desde problemas relacionados con el
sistema digestivo (nauseas, vomitos, estrenimiento o soltura, dolor abdominal, perdida del
apetito, entre otros), nervioso (hiperactividad, excitabilidad) o disminuyen la frecuencia
cardiaca, no existen alternativas diferentes para el tratamiento de la AD.5,44,73
28
. 3. Estado del arte
No obstante, es bien conocido alrededor del mundo que la medicina china ha tratado esta
enfermedad mediante el uso de plantas medicinales desde hace cientos de anos. Respecto
a esto, es de notar que ello se ha logrado gracias a los metodos de extraccion en caliente
de los llamados metabolitos secundarios o productos naturales.6
Actualmente, estudios farmacologicos han confirmado los efectos terapeuticos de muchos
componentes activos derivados de las hierbas medicinales chinas:6
- Ginsenosido Rg1, extraıdo de Radix Ginseng
Inhibe la γ-secretasa, lo cual disminuye la agregacion de Amiloide-β, ademas puede
disminuir la apoptosis de las celulas neuronales.
- Tansinona IIA, obtenida de Radix Salviae miltiorrhizae, y baicalin, de Radix Scu-
tellariae
Se ha sugerido que pueden evitar la lesion por estres oxidativo en las celulas neuro-
nales.
- Evodiamina, presente en Fructus Evodiae, y curcumina, en Rhizoma Curcumae Lon-
gae
Efectos anti-inflamatorios. Curcumina puede actuar tambien sobre el Amiloide-β y
la proteına-τ .
- Huperzina A (HupA), extraıda de Huperzia serrata Inhibidor de la AChE(AChIn).
De las anteriores moleculas, la HupA es aquella que genera un mayor interes. Ello, pues el
mecanismo de accion sobre la AD corresponde con el que emplea la mayorıa de medica-
mentos aprobados por la FDA. Empero, tiene una menor biotoxicidad, al ser los efectos
secundarios presentados en un menor porcentaje de pacientes y ser bien tolerado en do-
sis mayores. Ademas, tiene un efecto de larga duracion en el organismo, lo cual ha sido
comprobado computacionalmente mediante SMD (Steered Molecular Dinamics). Con ello
se evidencio que la fuerza para extraer HupA del CAS es mucho mayor que la fuerza re-
querida para empujarla a este. Lo anterior, fue atribuido a que se visualiza impedimento
esterico “a la salida” pero no en el proceso de union, y a que forma multiples puentes H
con el agua y algunos residuos en el CAS, lo cual la hace muy afın a esta cavidad.5,74
29
. 3. Estado del arte
Tabla 4: Medicina herbaria china para el tratamiento de la enfermedad de AlzheimerObtenida de.6
Para evaluar la efectividad y seguridad de la HupA, Yang et. al. realizaron una revision
de los resultados de 20 estudios de ensayos clınicos aleatorios que incluyen 1823 parti-
cipantes. Uno de dichos estudios relaciono datos en los que, de 20 ensayos, 7 (35 %) no
informaron sobre eventos adversos, 1 (5 %) informo eventos adversos y los 12 restantes
(60 %) describieron episodios esporadicos tıpicos asociados con el sistema gastrointesti-
nal y nervioso. Aunque ninguno de los ensayos incluidos informo eventos adversos graves
relacionados con la HupA, dicho estudio reporta no poder brindar conclusiones certeras
sobre la seguridad de dicha molecula, ya que 7 ensayos no brindaron informacion sobre
los efectos adversos de esta, ademas que la duracion del tratamiento en la mayorıa de los
ensayos fue de 8 o 12 semanas, por lo que el potencial efecto beneficioso o perjudicial de
la HupA para el tratamiento de la AD podrıa ser el resultado de cambios sintomaticos y
corta duracion del tratamiento.75
Estudios recientes, en los que se incluyen especies de Brazil y Argentina, han denotado que
los extractos de alcaloides obtenidos de plantas de la familia Lycopodiaceae (Huperzias,
Lycopodium y lycopodiella) presentan actividad biologica relacionada con la inhibicion de
la AChE y con otras etiologıas de la enfermedad tales como efectos antioxidantes y anti-
inflamatorios. Encontrando que los componentes mayoritarios para estas corresponden a
licopodina y acetildihidrolicopodina.6,23,76,77
30
. 3. Estado del arte
Debido a los menores efectos secundarios, y teniendo en cuenta que un enfoque prometedor
en el tratamiento de la AD es el uso de productos naturales, tambien se estan llevando a
cabo estudios sobre plantas con actividad inhibidora de la AChE en Colombia. Sabiendo
que los antecedentes para estos productos establecen multiples efectos sobre la etiologıa
de la AD a causa de la presencia de alcaloides, principalmente. Sin embargo tambien
presentan curcuminas, triterpenos, ligninas y compuestos fenolicos, de los cuales tambien
se ha reportado actividad.39
De este modo, en el 2006 Nino et. al. publicaron un estudio de inhibicion in vitro de
la AChE por extractos totales de plantas de la flora colombiana de diferentes familias
(Asteraceae, Euphorbiaceae, Melastomataceae, Rubiaceae y Solanaceae) encontrando altas
actividades inhibitorias para dos especies de dichas familias: S. leucocarpum y W. coccolo-
boides. Posteriormente, en el 2015, un estudio de la Universidad de Antioquia incluyo
estudios computacionales de Docking y experimentales de actividad inhibitoria a AChE e
identificacion mediante GC/MS, para plantas Amaryllidaceae colombianas, encontrando
3 potenciales alcaloides con actividad inhibitoria.78,79
Finalmente, en el ano 2017, un estudio realizado por LATNAP, el cual efectuo bio-ensayos
tanto de inhibicion de la AChE, como de actividad antioxidante para extractos totales
de dos especies de plantas del genero Lycopodium denoto que estas presentaban valores
moderados de actividad para ambos analisis. Con lo anterior se establecio que estas plantas
pueden corresponder con fuentes de agentes farmacologicos para el tratamiento de la AD,
ya que tanto la actividad antioxidante como la actividad inhibitoria de la AChE parece
ser una estrategia adecuada para la seleccion de productos naturales que actuen sobre
esta enfermedad.76,80
Es por lo anterior que el presente trabajo busca continuar con el estudio realizado por
LATNAP, al efectuar una separacion de los alcaloides presentes en la planta Lycopodium
thyoides encontrada en Colombia. Esto, con motivo de contribuir con el estudio de esta
especie en el paıs, ası como identificar cual de ellos presenta un mayor efecto inhibitorio
sobre la AChE. Esto, con el adicional de brindar una aproximacion computacional para
el analisis de la actividad biologica, en cuanto a la inhibicion de dicha enzima, lo que
representa un avance en el estudio y comprension de factores presentes en las moleculas
de dichas plantas Colombianas, las cuales favorecen la inhibicion.
31
4Metodos
4.1. Cromatografıa lıquida de alta eficacia
La palabra cromatografıa se deriva de las raıces griegas chroma (color) y graphia (escri-
bir). Ello se debe a razones historicas ya que este termino fue empleado por primera vez
por el botanico Mijaıl Tsvet en la separacion de pigmentos de origen vegetal. Esta fue
una cromatografıa lıquida en una columna de vidrio empacada con CaCO3 (fase estacio-
naria), eluyendo con mezclas de eter de petroleo/etanol (fase movil) y la deteccion fue
visual, gracias a la tonalidad de los analitos. Actualmente, el termino cromatografıa hace
referencia a la migracion diferencial de los analitos, o compuestos de una mezcla, en una
fase estacionaria. Esta ultima puede ser solida o lıquida, los analitos, solidos, lıquidos o
gaseosos, la fase movil gaseosa o lıquida y la deteccion se realiza a traves de detectores
especializados de acuerdo con las caracterısticas de los analitos que se desee estudiar.
32
. 4. Metodos
La cromatografıa lıquida de alta eficacia (HPLC) surgio durante la decada de 1970 como
una poderosa herramienta analıtica que mejoraba la cromatografıa lıquida. Esta, emplea
una fase estacionaria en estado lıquido o solido, sobre un soporte solido, y una fase movil
lıquida o gaseosa. El mecanismo responsable de la distribucion entre las fases incluye
reparticion, adsorcion, intercambio ionico y efectos estericos.81,82
Principalmente, existen diversas metodologıas para llevar a cabo dicha cromatografıa,
de las cuales dos metodologıas estan basadas en diferencia de polaridad, estas son: fase
normal y fase reversa. En la primera de ellas, la fase estacionaria tiene caracter polar
(silica, alumina) y la fase movil caracter apolar, mientras que en la reversa, como su
nombre lo indica, es al contrario. La eleccion de cada una se da de acuerdo con el tipo
de analitos que se deseen analizar o aquellos que se desea tengan un tiempo de retencion
mayor. Ası, para analitos polares es usual emplear fase normal, mientras que para analitos
apolares, la fase reversa es la mas utilizada. En esta ultima, el analito de interes se une
a la columna por interacciones hidrofobicas (apolares), en presencia de un disolvente
hidrofılico (i.e. agua) y eluye al aumentar el porcentaje de un disolvente mas hidrofobo o
apolar como metanol o acetonitrilo.
La eleccion del metodo HPLC como herramienta analıtica suele darse para compues-
tos organicos, inorganicos, macromoleculas, analitos cargados o neutros y moleculas no
volatiles o termicamente inestables, por lo cual representa una tecnica muy versatil y am-
pliamente usada para la separacion de compuestos. Sin embargo, la identificacion de los
analitos a traves de este metodo es complicado y usualmente requiere la combinacion de
dos o mas metodos de deteccion. Empero, una de las ventajas principales de este metodo
es la capacidad de acoplarse a una gran diversidad de detectores como son: ultravioleta,
fluorescencia, masas, entre otros.83
Para la realizacion del presente trabajo se hizo uso de cromatografıa liquida de alta eficacia
en fase reversa, acoplada a un detector de arreglo de diodos (DAD): HPLC-DAD y a un
detector de espectrometrıa de masas tandem (MS/MS), el cual, corresponde a una trampa
de iones con ionizacion por electrospray (ESI): HPLC-ESI-MS/MS.
33
. 4. Metodos
4.1.1. Deteccion de arreglo de diodos
La deteccion mediante el arreglo de diodos pertenece al tipo de detectores basados en
las propiedades del soluto. Por tanto, para hacer uso de este, es necesario que el anali-
to o molecula de interes sea capaz de absorber radiacion electromagnetica en el rango
ultravioleta (UV) - visible (vis) o que posea un grupo cromoforo.
Figura 10: Sistema de deteccion mediante el DAD.
El DAD posee dos fuentes de radiacion, una de ellas corresponde con una lampara de
tungsteno, la cual se encarga de emitir las longitudes de onda en el rango del espectro
visible (≈400-800 nm), mientras que una segunda lampara, usualmente de deuterio, emite
las longitudes de onda en el rango ultravioleta (≈15-400 nm). La luz UV es dividida
principalmente en cuatro subcategorıas: UV-A (400–320 nm), UV-B (320–280 nm), UV-C
(280–200 nm) y UV lejano (200–15 nm).84
El modo de operacion del DAD se expone en la Figura 10. En este, las fuente de radiacion
se ubican en un extremo, la luz emitida es entonces focalizada por una configuracion de
lentes, para posteriormente atravesar una cubeta de flujo continuo, a traves de la cual
circula la fase movil y analitos que han eluıdo de la columna cromatografica. Al pasar por
dicha cubeta parte de la radiacion emitida es absorbida por la muestra, dependiendo de
las caracterısticas quımicas de la misma.
34
. 4. Metodos
La radiacion resultante es posteriormente dispersada por una rejilla de difraccion que
descompone y redirige la luz hacia un arreglo de diodos, el cual recoge todas las longitudes
de onda al mismo tiempo.
Respecto a lo anterior, es de notar que la recoleccion de las longitudes de onda resultantes
(radiacion luego de ser absorbida por la muestra) ocurre de manera simultanea. Ello,
representa una ventaja al corresponder con un metodo de deteccion rapido, simple y
robusto. Ademas, de acuerdo con diversos autores, la resolucion, sensibilidad y selectividad
son buenas por lo cual es uno de los detectores mas empleados en la actualidad.85
4.1.2. Espectrometrıa de masas
En el ano 1897 el fısico J.J. Thomson realiza experimentos con rayos catodicos con el
fin de estudiar su naturaleza. Mediante estos experimentos descubre que dicho rayo se
compone de partıculas cargadas negativamente, las cuales llama corpusculos (electrones),
y al analizar la trayectoria del haz en presencia de un campo magnetico calcula la relacion
masa carga (m/z) para dichas partıculas.
En la actualidad, la relacion m/z es el fundamento de la espectrometrıa de masas, una
de las tecnicas de elucidacion estructural mas importantes en la quımica. En esta una
muestra de composicion desconocida es ionizada, para luego atravesar campos magneticos
o electricos, lo cual causa la separacion de los iones de acuerdo con dicha relacion. Lo
anterior genera un espectro de masas que es caracterıstico para cada molecula y que
ademas brinda informacion acerca de la composicion isotopica de la misma.
De acuerdo con lo anterior, mediante la espectrometrıa de masas (MS) es posible realizar
una separacion e identificacion de moleculas, a traves de la relacion m/z de las mismas.
Estas, pueden encontrarse en una matriz lıquida, solida o gaseosa, sin embargo, como
se ha dicho previamente, para poder encontrar dicha relacion, es necesario que se gene-
ren fragmentos cargados, lo cual ocurre al darse la ionizacion de las moleculas en dicha
muestra.
35
. 4. Metodos
4.1.2.1. Modo de ionizacion
La ionizacion de una muestra se pude lograr a traves de la aplicacion de distintos metodos.
Estos dependen del estado en el que se encuentre la matriz que contiene los analitos, siendo
principales: ionizacion quımica (CI) o ionizacion electronica (EI), para gases, ionizacion
quımica a presion amosferica (APCI) o ionizacion por electro-spray (ESI), para lıquidos,
o ionizacion por desorcion de la matriz asistida por laser (MALDI) para solidos.
En la realizacion del presente proyecto se trabajo con una matriz lıquida, cuyos analitos de
interes corresponden con productos naturales, alcaloides de la planta Lycopodim thyoides.
Segun diversos autores y Demarque et. al., el metodo de fragmentacion mediante ESI en
MS, corresponde a una herramienta util en la elucidacion estructural y la caracterizacion
de productos sinteticos y naturales. Por lo cual esta tecnica fue escogida para la realizacion
del presente trabajo, y por ende, se explicara en detalle en la presente seccion.86
El metodo ESI es una tecnica de ionizacion suave que se lleva a cabo a presion atmosferica,
el grado de fragmentacion es controlable (de acuerdo con el voltaje aplicado), es muy bueno
para producir iones multi cargados y consiste en la creacion de moleculas ionizadas en
estado gaseoso.
En este la muestra lıquida es transportada hasta el extremo de un capilar delgado (100
µm), cuyas paredes son metalicas y se ha aplicado un alto voltaje. Al ocurrir lo anterior,
se forma lo que se conoce como cono de Taylor y se da el desprendimiento de pequenas
gotas cargadas que contienen los analitos o moleculas de interes (Figura 11).
Figura 11: Cono de Taylor generado en la ESI.
36
. 4. Metodos
Al encontrarse estas gotas en una zona con alto voltaje y temperatura, inicia la evapo-
racion del solvente, lo cual ocasiona su colapso a traves de mecanismos conocidos como
fision de Coulomb y evaporacion del ion. En el primero de ellos se postula que la gota es
inestable debido a la gran densidad de carga en la misma. Ası, la gota inestable se divide
en gotas mas pequenas que eventualmente conduciran a iones individuales. Por otra parte,
el mecanismo de evaporacion del ion asume que la gran densidad de carga que resulta de
la evaporacion del solvente causa que la repulsion de coulomb supere la tension superficial
del lıquido, lo que resulta en una liberacion de iones desde las superficies de las gotas.
Finalmente, los iones individuales son conducidos a traves de un tubo de transferencia de
iones y posteriormente a un sistema de lentes electrostaticos que los focalizan para que
entren en el analizador de masas.
4.1.3. Analizador de masas y masas tandem (MS/MS)
En este caso el sistema analizador de masas emplea un cuadrupolo de transmision y
trampa de iones para producir un primer espectro de masas (MS), luego algunos de los
fragmentos con m/z de interes quedan en la trampa, que se llena con Helio y fragmenta
la molecula. Finalmente, los fragmentos que fueron producto de la colision se separan de
acuerdo con su relacion m/z produciendo ası un segundo espectro de masas (MS/MS).
Cuadrupolo
Como su nombre lo indica consiste de un montaje de 4 polos, que corresponden a 4 barras
paralelas de seccion circular con cargas opuestas. Estos se conectan a fuentes de voltaje de
radiofrecuencia (V0Cosωt) y de corriente continua (V ), como se muestra en la Figura 12.87
Figura 12: Diagrama esquematico del analizador de masas: cuadrupolo.
37
. 4. Metodos
Este tipo de analizador puede emplearse para separar las masas de los iones en funcion de
la estabilidad de sus trayectorias de vuelo a traves de un campo electrico oscilante en el
cuadrupolo. De este modo, solo los iones con un m/z especıfico seran estables y los demas
poseeran trayectorias inestables lo cual ocasionara choques con las barras. Los voltajes
de radio frecuencia y de corriente continua se pueden fijar de manera que el cuadrupolo
actue como un detector especıfico para iones de un m/z particular o para enfocar iones.
En este caso se emplea unicamente como un trasmisor (focalizador) de los iones.88
Trampa de iones
Este tipo de analizador emplea una combinacion de campos electricos y magneticos para
capturar los iones dentro de una camara de vacıo. Existen multiples configuraciones para
las trampas de iones, las cuales incluyen capturas en 2D (Orbitrap) y en 3D (Fleet, usada
en este caso). Esta ultima emplea el mismo principio que el cuadrupolo, pero los elementos
geometricos que producen el campo son distintos.
En este, las barras paralelas son reemplazadas por dos electrodos de metal
hiperbolicos (tapas de extremo) y un electrodo de anillo es colocado a medio
camino entre los electrodos de la tapa del extremo; los iones estan atrapados
en una trayectoria de vuelo circular basada en el campo electrico aplicado.88
Mediante esta tecnica de analisis es posible detectar selectivamente multiples analitos
dentro de una familia de compuestos de manera cualitativa. Lo anterior, ya que permite
obtener informacion estructural en base a los patrones de fragmentacion, que son especıfi-
cos para una molecula, lo cual conduce la posibilidad de identificar compuestos en una
muestra compleja.89
4.1.4. Modo de operacion HPLC-DAD y ESI-MS/MS
Como primera medida, la muestra se inyecta al cromatografo lıquido. Luego, dicha muestra
pasa a traves de la columna empleada, en la que, de acuerdo con los parametros empleados,
se da la separacion de los componentes, los cuales eluyen (salen) con diferentes tiempos
(tiempo de retencion).
38
. 4. Metodos
Ası, a medida que los componentes eluyen de la columna, pasan a traves de una cubeta
de flujo la cual es irradiada por dos lamparas, una que emite longitudes de onda en
UV y otra que emite luz Vis, la muestra absorbe algo de esta radiacion y aquella que
consigue pasar es difractada por una rejilla, la cual tambien se encarga de redirigir dicha
radiacion al arreglo de diodos. En esta etapa se produce un cromatograma en el cual el
eje-x corresponde al tiempo de retencion y el eje-y a un promedio de la intensidad de las
senales obtenidas para todas las longitudes de onda.
Posterior a ello, el flujo de fase movil con el analito avanza al detector de masas LQC Fleet.
En este, primeramente se produce la ionizacion mediante ESI, y los iones producidos son
entonces dirigidos a traves del tubo de transferencia de iones hacia un sistema de lentes
que los “alinean” para que entren en el sistema analizador de masas, el cual consiste de
un cuadrupolo de transmision y una trampa de iones. De este modo, se realiza el “Full
scan analysis” al entrar estos en la camara de ion trap que esta subdividida en dos, la
primera de ellas, con alta presion en la que se favorece el enfriamiento de los iones y
la segunda de ellas con baja presion, en la que se disminuyen las fragmentaciones por
colisiones y se aumenta el voltaje para ser dirigidas al detector en funcion de su relacion
m/z. Finalmente, dependiendo como se haya configurado el procedimiento (en este caso
los 2 compuestos con m/z mayores), son redirigidos a una segunda camara identica a
la anterior en la cual se realiza de nuevo la colision a dichos fragmentos, obteniendo un
segundo espectro de masas.
Figura 13: Configuracion general del espectrometro de masas con ionizacion por electro-spray y analizadores cuadrupolo y trampa de iones.
39
. 4. Metodos
4.2. Espectroscopıa UV-vis
Como ya se ha comentado previamente, la luz ultravioleta es el componente de la radiacion
electromagnetica que posee longitudes de onda menores a 400 nm. Los fotones ubicados en
esta region del espectro son muy energeticos, al ser inversamente proporcional la relacion
entre energıa (E) y longitud de onda (λ) de acuerdo con la ecuacion de Plank, donde
h corresponde a la constante con este mismo nombre y tiene el valor 6,022 × 10−34Js
(Ecuacion 4.2).
E = h ν︸︷︷︸cλ
(2)
De este modo, los fotones en esta zona, radiacion UV, puede tener interacciones con las
estructuras de las moleculas quımicas. Pudiendo llegar a romper los enlaces o conducir a
la degradacion de las propiedades de una molecula determinada. No obstante, la mayorıa
de las estructuras quımicas suele interactuar con estos fotones en diferentes modos, entre
los cuales se resaltan principalmente: fosforescencia, fluorescencia, dispersion y absorcion.
Siendo este ultimo el principio fundamental de la espectroscopıa UV-vis.90
De acuerdo con lo anterior, la espectroscopıa UV-vis se basa en analizar la cantidad
de radiacion absorbida o emitida por una muestra en los rangos de longitudes de onda
delimitados para estas regiones. En estas, y de acuerdo con la Ecuacion 4.2, las energıas
de los fotones se encuentran entre 36-72 Kcal/mol, para el rango visible, y hasta 143
Kcal/mol para la region UV, las cuales corresponden con las energıas tıpicas para excitar
los electrones desde un estado basal a un estado excitado.80
La cantidad de energıa absorbida variara dependiendo la naturaleza de la molecula o
sustancia quımica con la cual interactuen los fotones. Segun este principio, y como cada
molecula corresponde con un arreglo espacial unico de atomos, la interaccion de dicha
radiacion con la materia proporcionara un patron unico, caracterıstico para una molecula
determinada, el cual se vera expresado como una grafica que en el eje-x presenta la λ y
en el eje-y, la medida de absorcion o emision.
40
. 4. Metodos
4.2.1. Modo de operacion equipo UV-vis
La grafica nombrada con anterioridad, es proporcionada por un software especıfico del
equipo empleado para este fin, el cual se conoce como espectrofotometro. Este, provee
dichos resultados comparando la intensidad de la radiacion electromagnetica incidente
(I0), con la que obtiene luego de pasarla por la muestra (It transmitida) de acuerdo con
Iabs = I0 − It y la transmitancia: T = ItI0
. Sin embargo una variable mas representativa
en terminos experimentales corresponde con la absorbancia (A), la cual corresponde a la
linealizacion de la ecuacion de transmitancia mediante la aplicacion de logaritmos.
A = −logT = −log ITI0
(3)
La fuente de radiacion del equipo corresponde nuevamente con dos lamparas. Cada una
de ellas emite radiacion electromagnetica en las regiones UV y vis, por separado. Esta se
hace pasar por una celda que contiene la muestra, de igual modo como se emplea para
el DAD, pero en este caso, se cuenta con dos modos de operacion: realizar un barrido
en todas las longitudes de onda para conocer en cual de ellas la muestra presenta una
intensidad maxima o realizar la medida para una unica longitud de onda de emision, y
obtener la longitud de onda emision de la muestra (o viceversa). Para este ultimo caso se
requiere el uso de un monocromador que, como su nombre lo indica, permita el paso de
una sola longitud de onda, como se ve en la Figura 14
Figura 14: Modo operacion espectrofotometro UV-vis.
41
. 4. Metodos
Finalmente, la luz transmitida llega al detector, que corresponde a una fotocelda, la cual
se encarga de convertir las senales luminosas en pulsos electricos para, de este modo,
poder ser procesadas por la electronica interna del equipo y proporcionar una senal de
absorbancia que es linealmente proporcional con una constante ε propia de cada analito
(coeficiente de extincion molar), el camino optico (b) y la concentracion (C).
A︸︷︷︸y
= εb︸︷︷︸m
C︸︷︷︸x
(4)
4.3. Bioensayos de inhibicion in vitro
Cuando se esta trabajando con reactivos que corresponden a enzimas, las pruebas en-
zimaticas tienen un papel fundamental. Lo anterior, ya que estas corresponden con meto-
dos de ensayo para medir propiedades cineticas de inhibicion, entre otras, que proporcio-
nan informacion valiosa acerca de los mecanismos de catalisis enzimatica y de las interac-
ciones de las mismas con moleculas inhibidoras, farmacos o candidatos de los mismos.91
Estas pruebas usualmente corresponden con etapas iniciales de estudio y se enfocan al
aislamiento e identificacion de compuestos biologicamente activosa en el laboratorio, por
lo cual se suelen llevar a cabo de manera in vitro y se conocen con el nombre de bioensayos.
Sin embargo, este tipo de pruebas brindan informacion limitada sobre el metabolismo, la
distribucion y los efectos del flujo sanguıneo sobre la penetracion de determinada molecula,
por lo cual la realizacion de pruebas in vivo, que conduzcan a conocer los efectos globales
en un organismo vivo, son necesarias en etapas avanzadas.92
Es importante resaltar que los bioensayos de inhibicion enzimatica evaluan los cambios, en
funcion del tiempo, de la concentracion de un sustrato consumido o un producto generado
en una reaccion, en la cual interviene la enzima de interes. Esta puede ser monitoreada
a traves de experimentos cineticos (velocidad maxima, inicial, en equilibrio) o metodos
espectrofotometricos, fluorimetricos, de quimioluminiscencia, cromatograficos, entre otros.
aQue presentan algun tipo de efecto sobre un sistema de un organismo vivo.
42
. 4. Metodos
4.3.1. Metodo colorimetrico de Ellman
Uno de los metodos mas empleados para monitorear la inhibicion enzimatica corresponde
al metodo colorimetrico de Ellman. Este recibe su nombre debido al reactivo de Ellman:
DTNB o acido 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoico), que desarrolla de un color amarillo intenso
al reaccionar con compuestos que presenten el grupo funcional sulfhidrilo (tiol, -SH) o su
anion (S– ). El color que se desarrolla es bastante estable durante aproximadamente 10
minutos y la reaccion se ve poco afectada por la variacion de temperatura.93
Para el caso del presente trabajo, el sustrato empleado corresponde con la acetiltiocolina.
Esta se hidroliza por accion de la AChE resultando en la formacion de tiocolina y aceta-
to. Posteriormente, la tiocolina reacciona con el acido 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoico) para
formar el anion acido-5-tio-2-nitrobenzoico, de acuerdo con el Esquema 4.3.1. Este anion
presenta una coloracion amarilla que presenta una banda de absorcion entre 400-420 nm,
y sera monitoreado a 417 nm.
Esquema 4: Metodo colorimetrico de Ellman para la tiocolina.
De este modo, la tasa de formacion del color es directamente proporcional a la actividad
enzimatica de la AChE. Por lo anterior, si se anade a esta prueba una molecula que
inhiba la enzima, la hidrolisis de la tiocolina se vera afectada y, por ende, no se generara la
tiocolina, lo que a su vez afectara la formacion del anion amarillo y ello se vera representado
en la disminucion de la absorbancia en dicha longitud de onda.94
43
. 4. Metodos
4.4. Base de datos de proteınas PDB
La base de datos de proteınas o PDB por sus siglas en ingles, corresponde a una gran
biblioteca virtual de libre acceso en la cual se encuentran datos estructurales tridimen-
sionales de una gran cantidad de macromoleculas tales como proteınas o enzimas las
cuales son obtenidas a traves de cristalografıa de rayos X, resonancia magnetica nuclear,
microscopıa electronica, entre otras tecnicas de elucidacion estructural.
En esta es posible encontrar geometrıas de los receptores de interes sin necesidad de
construir la geometrıa por otros metodos, como analogıa, de novo, entre otros. Cada una
de las entradas, o registros, de esta base de datos posee un codigo unico de 4 caracteres que
pueden incluir letras y numeros. Ademas, en cada una de las entradas es posible verificar
la informacion del ano en el cual fue publicado dicho cristal, los metodos empleados para
su obtencion y caracterizacion, parametros de validacion de calidad del cristal, mutaciones
o modificaciones a la estructura biologica original, secuencia, entre otros.95
Finalmente, cabe resaltar que estas entradas pueden descargarse en formato “*.pdb”, el
cual es un archivo de texto que consiste de un encabezado e informacion geometrica, y
que, aunque es una herramienta muy util, presenta algunas limitaciones relacionadas con
el hecho de que el cristal es solo una conformacion posible de la estructura biologica.
4.5. Docking
El Docking o acoplamiento molecular es un metodo que permite predecir la conformacion
preferida de una molecula, la cual se conoce como ligando, al estar unida como un complejo
estable con un receptor, el cual es generalmente una proteına o enzima. Lo anterior se logra
ya que este estudio proporciona un resultado cuantitativo, el cual se ve representado como
un Docking score del cual se hablara mas adelante. El Docking puede realizarse variando
la forma como se desee modelar tanto el receptor como el ligando, siendo los modos: rıgido,
flexible o sus combinaciones. Ello depende de los resultados que se busquen con el estudio
de Docking, aunque generalmente se emplea el ligando flexible y el receptor rıgido.
44
. 4. Metodos
Lo anterior se hace para poder darle flexibilidad al complejo, sin necesidad de incluir todos
los grados de libertad que implicarıa si se aplicara flexibilidad al receptor, lo cual harıa
mucho mas demandante el algoritmo. En otras palabras, en el Docking molecular se trata
de realizar un proceso o serie de pasos ordenados cuyo fin es encontrar la conformacion
optima para un ligando en una cavidad de un receptor rıgido, haciendo que la orientacion
relativa minimice la energıa libre de union.96,97
En el Docking, la conformacion u orientacion del ligando en el receptor se conoce como pose
y el proceso mediante el cual se evalua la afinidad de union de una pose, de acuerdo con
el conteo de interacciones intermoleculares favorables, se conoce como scoring. Este da un
resultado numerico, el cual ha sido estimado mediante una funcion matematica construida
para representar un ∆Gunion que tiene en cuenta las interacciones mas importantes, como
se evidencia en la Ecuacion 5. Esta corresponde a la primera funcion empırica empleada
para reproducir los resultados experimentales, planteada por Hans-Joachim en 1994, y es
empleada en la actualidad como una plantilla para la construccion de funciones mejoradas
incluyendo GlideScore.98–100
(5)∆Gunion = ∆G0 + [Atipo]∆Gtipo + ∆GEnlacesH
∑f(∆r,∆α)
+ ∆Gion
∑f(∆r,∆α) + ∆GrotNrot
En la Ecuacion 5 todos los ∆G, a excepcion del ∆G0, corresponden a parametros energeti-
cos que deben ser ajustados de manera que reproduzcan, lo mejor posible, el ∆Gunion ex-
perimental. Por otra parte, el ∆G0 representa un termino energetico asociado mayormente
a la entropıa del sistema, ya que al realizar un estudio de Docking, el ligando pierde grados
de libertad pues se encuentra restringido a una cavidad. Finalmente, el termino Atipo hace
referencia a un area de superficie, aquella relacionada con el contacto lipofılico.101
4.5.1. Protocolo Docking
Como ya se ha mencionado, elDocking consiste en la realizacion de una serie de pasos de
manera ordenada. Estos consisten en la preparacion del receptor, los ligando y el grid.
45
. 4. Metodos
De este modo se expondra brevemente en la presente seccion la finalidad de cada uno de
los pasos anteriormente nombrados.
4.5.1.1. Preparacion del receptor
Como los receptores empleados para efectuar los calculos de Docking provienen de estruc-
turas cristalograficas, se debe verificar si para la obtencion del cristal de interes los autores
realizaron modificaciones en la estructura de la proteına o enzima tales como mutaciones
(cambiar un residuo por otro), agregar o quitar atomos o residuos. En cuyo caso se deben
deshacer las mutaciones o completar o eliminar los atomos para acercarse lo mejor posible
a la estructura biologica sobre la cual es de interes realizar los calculos.
Ademas, debido a que la tecnica que emplea la cristalografıa corresponde a los Rayos X,
los hidrogenos no estan incluıdos en la estructura de PDB descargada, por lo que otro de
los objetivos de preparar el receptor es el anadir los atomos de H que no se ven debido a
la tecnica empleada.
Tambien es de resaltar que se debe elegir cuales residuos conservar o quitar (moleculas
de agua, cofactores, glicosilaciones, entre otras) y realizar una relajacion rapida de la
estructura.
4.5.1.2. Preparacion de los ligandos
Este paso puede variar de acuerdo con la procedencia de los ligandos. Para los casos en
los que el PDB descargado posea un ligando co-cristalizado (ligando nativo) y este sea
de interes para la realizacion del Docking (reproducir el acoplamiento del ligando en el
cristal, por ejemplo), se debe realizar la extraccion de dicho ligando. Lo anterior se hace
mediante la creacion de un nuevo archivo que solo contenga el ligando, suprimiendo toda
la estructura de la proteına en ese PDB. Por otra parte, si los ligandos provienen de una
base de datos, basta con descargarlos en un formato que sea reconocible por el programa
a emplear para la realizacion del Docking. Finalmente, si corresponden a ligandos que no
estan en una base de datos pero se conoce su estructura, es posible dibujarlos.
46
. 4. Metodos
Al tener el archivo del ligando, la preparacion de este incluye la adicion de hidrogenos,
si es necesaria, la generacion de tautomeros, isomeros o distintas conformaciones posibles
del ligando, ademas de generar las estructuras que posean estados de protonacion acordes
al pH en el cual se desea realizar el estudio, que corresponde generalmente a 7,0±2,0 (pH
biologico).
4.5.1.3. Preparacion del grid
El grid corresponde a la cavidad en la cual se realizara el acoplamiento molecular y
contiene todos los parametros tanto geometricos como quımicos que se tendran en cuenta
al momento de realizar el calculo del Docking. Para ello, lo primero que evalua el Docking
son los parametros geometricos del ligando en la cavidad y si el ligando pasa ese primer
filtro, el algoritmo procede con el calculo de las interacciones energeticas.102
El anterior procedimiento es importante, ya que las interacciones entre biomoleculas son
fundamentales para los procesos biologicos. Por lo que, conocer que tan favorable o des-
favorable es la union entre 2 de ellas representa una oportunidad de estudio de estos
sistemas. Sin embargo, dichas funciones de scoring estan disenadas para procesar gran-
des cantidades de moleculas en un periodo corto de tiempo. Lo anterior implica que su
capacidad y precision para predecir las energıas libres es limitada. Esto se debe al hecho
que diversas aproximaciones como: la falta de flexibilidad en la proteına, el no tener en
cuenta la solvatacion, o la naturaleza simplista de la funcion energetica, son usadas en
tales calculos. A pesar de ello, metodos de perturbacion de energıa libre (FEP) y de in-
tegracion termodinamica (TI), que se han aplicado con exito para reproducir a cabalidad
las energıas libres determinadas experimentalmente, son computacionalmente inviables.
Por lo que el uso de enfoques computacionales intermedios como calculos de dinamica
molecular, simulaciones de Monte Carlo y MM-PBSA son adecuados.31,103
47
. 4. Metodos
4.6. MM-GBSA
El MM-PBSA (Molecular Mechanics- Poisson-Boltzmann Surface Area) es un modelo
propuesto por Srinivasan et. al el cual basa su enfoque en una combinacion de un termino
de energıa de mecanica molecular con un modelo de solvatacion continua y un termino
dependiente del area de superficie para predecir las diferencias de energıa libre. En este
caso se usara un modelo MM-GBSA el cual es un derivado de este pero con algunas
simplificaciones.
Este ultimo se basa en el concepto de que la combinacion de terminos de solvatacion polar
y no polar, terminos entropicos y energıas de la mecanica molecular (MM), representan
una energıa libre de union aproximada entre ligando y receptor. Para este calculo, la
energıa libre para cada uno (ligando, receptor y complejo) se descompone en terminos
de energıa de MM en fase gaseosa, polar y no polar, y un termino de entropıa, como se
muestra en la siguiente ecuacion:32
∆G = ∆EMM + ∆Gsolv − T∆S (6)
= ∆Ebat + ∆EvdW + ∆E − culomb+ ∆Gsolv,p + ∆Gsolv,np − T∆S
De acuerdo con las consideraciones adicionales que presenta este metodo sobre el Docking
convencional, en cuanto a las interacciones energeticas, los resultados que proporciona el
MM-GBSA son mejores que los dados por las funciones de scoring que utiliza el Docking
para clasificar las poses obtenidas.
4.7. General Drug Discovery
Actualmente, el trabajo experimental en conjunto con la simulacion y el analisis compu-
tacional representan las principales herramientas cientıficas para entender los procesos
de acoplamiento y se suelen hacer en paralelo como metodos complementarios para el
descubrimiento o la proposicion de nuevos farmacos.
48
. 4. Metodos
De acuerdo con este ultimo punto, las simulaciones computacionales se han convertido
en una herramienta fundamental para estudiar los mecanismos y modos de actuar de las
moleculas en los organismos y, con ello, encontrar moleculas que puedan ser utilizadas
como sustancias bioactivas para modificarlas, mejorando ası su funcionalidad.96
Los metodos nombrados con anterioridad hacen parte de la primera etapa en lo que se
conoce como Structure Based Drug Discovery o desarrollo de medicamentos basado en la
estructura (Ver Figura 1, en el capıtulo: Introduccion) y constituyen el principal metodo
para el desarrollo de nuevos farmacos. Este es un proceso multi-etapa y muchas veces
iterativo ya que proporciona una manera eficiente para el estudio de datos estructurales
tridimensionales conocidas (generalmente obtenidas de una biblioteca) y la propuesta de
nuevas moleculas con mejores caracterısticas para la re-evaluacion experimental.
Esta primera etapa puede basarse en dos enfoques diferentes, el primero de ellos, en el
cual se conoce una enzima target (blanco) para la cual se desea encontrar una molecula
que cumpla una funcion especıfica al acoplarse a dicho target o, un segundo enfoque en el
cual se tiene una molecula para la cual se conozca su funcion, pero no se sepa en cual, o
cuales, target actua. Para el primero se ejecuta un procedimiento conocido como virtual
screening, el cual consiste en aplicar procedimientos de Docking sobre una base de datos
que se compone de una gran cantidad de moleculas o compuestos cuya actividad biologica
es desconocida en el target previamente escogido. Los compuestos son clasificados segun
su afinidad hacia el target utilizando funciones de scoring y, sucesivamente, mediante la
aplicacion de diversos filtros se llega a la reduccion de su numero para la realizacion de
ensayos biologicos.
49
5Metodologıa
Para la realizacion del presente proyecto se realizo, como primera instancia, la identifi-
cacion del receptor AChE (enzima involucrada en el mecanismo bioquımico de la AD),
posteriormente se identifico que un extracto de alcaloides (EA) obtenido de la planta Co-
lombiana Lycopodium thyoides presentaba actividad biologica sobre dicha enzima. De este
modo, se eligieron 6 moleculas presentes en este, se realizo la separacion por fracciones del
EA y sobre cada una de estas se efectuaron pruebas biologicas para, finalmente, realizar
estudios de Docking y MM-GBSA con lo cual poder establecer correlaciones. Ası pues, es
de notar que el presente estudio se llevo a acabo en 2 etapas, una experimental y otra
computacional.
50
. 5. Metodologıa
5.1. Experimental
5.1.1. Reactivos
Para la realizacion de la etapa experimental se emplearon los reactivos en orden alfabetico:
- Acetonitrilo grado HPLC (ACN)
Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. CAS# 75-05-8.
- Acido 5-5’-ditiobis-(2-nitrobenzoico) (DTNB)
Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. CAS# 69-78-3.
- Acido clorhıdrico (HCl)
Chemı, Bogota D.C. CAS# 7647-01-0.
- Acido formico (FA)
Sigma- Aldrich, St. Louis, MO. CAS# 64-18-6.
- Agua desionizada
Obtenida del equipo SMART Ultra pure Water System.
- Albumina serica bobina (BSA)
Albumina fraccion V: para bioquımica. Merck KGaA, Darmstadt. CAS# 90604-29-
8.
- Cloruro de sodio (NaCl)
Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. CAS# 7647-14-5.
- Diclorometano (DCM)
Rodaquımicos, Bogota D.C. CAS# 75-09-2.
- Enzima Acetilcolinesterasa (AChE)
Aislada de anguila electrica. Tipo VI. Obtenida de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
CAS# 9000-81-1.
- Eserina
Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. CAS# 57-47-6.
51
. 5. Metodologıa
- Etanol absoluto (EtOH)
Rodaquımicos, Bogota D.C. CAS# 64-17-5.
- Hidroxido de sodio (NaOH)
PanReac AppliChem, Darmstadt. CAS# 1310-73-2.
- Nitrogeno gaseoso
Cryogas, Medellın.
- Sulfato de sodio anhidro Na2SO4
Sharlau, Sentmenat. CAS# 7757-82-6.
- Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)
Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. CAS# 77-86-1.
- Yoduro de acetiltiocolina (ATCI)
Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. CAS# 1866-15-5.
5.1.2. Preparacion extracto alcaloides
100 mL de una solucion de HCl al 5 % p/v fueron anadidos a 50 mL del extracto total
(ET) de la planta Lycopodium thyoides. Dicho ET fue obtenido previamente del mate-
rial vegetal recolectado en el paramo cruz verde, Choachı - Cundinamarca (434’53.90”
N, 7402’26.38” O), por el grupo “Productos Naturales Vegetales Bioactivos y Quımica
Ecologica” de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogota, el cual fue identificado
como Lycopodium thyoides en el Herbario Nacional de Colombia por el Dr. Jose Murillo,
y cuya preparacion se puede consultar en la referencia80
A continuacion se siguio un procedimiento de extraccion lıquido-lıquido (L-L) mediante
la adicion de 50 mL de DCM por 3 veces, se recolectaron y juntaron las fases acuosas
cada vez. Estas ultimas fueron posteriormente basificadas con la adicion de una solucion
de NaOH al 5 % y extraıdas de nuevo a traves de L-L con 3 × 50 mL de DCM. A traves
de lo cual se recolectaron las fases organicas a las que fue anadido Na2SO4 como agen-
te desecante, posterior eliminacion del solvente mediante presion reducida y finalmente
reconstitucion en 5 mL de EtOH.
52
. 5. Metodologıa
5.1.3. HPLC-DAD
El equipo UHPLC+ Focused - Dionex UltiMate 3000 RS Pump (Thermo Fisher Scientific,
Walthman, MA, EEUU) fue usado como cromatografo lıquido para la realizacion de la
separacion. Este contaba con auto-muestreador, loop de 100 µLy horno para la columna.
Ademas, para la visualizacion de los picos cromatograficos se empleo deteccion UV fija a
215 nm, ası como el detector DAD entre 190 y 340 nm.
Una fase movil constituida de ACN y H2O desionizada fue conducida en gradiente, el cual
se puede evidenciar en la Tabla 5, a traves de la columna Hewlett Packard LiChrosorb®
(reverse phase) RP-18, dimensiones 5 µm, 200 × 4.6 nm (Agilent Technologies, Inc.), por
un tiempo de 70 minutos.
Tabla 5: Metodo en gradiente empleado para la separacion cromatografica del EA.
Con dichas condiciones se realizaron inyecciones de 20, 50 y 100 µL para las que se eva-
luo cual correspondıa al volumen optimo de inyeccion que presentara un balance entre
cantidad de muestra y resolucion cromatografica. A partir de las inyecciones, y del segui-
miento en directo de los picos cromatograficos, 28 fracciones fueron colectadas realizando
repeticiones por un total de 10 veces.
5.1.4. Preparacion de las fracciones para los bioensayos
Cada fraccion fue dispuesta para un tratamiento de eliminacion del solvente, primero
mediante la evaporacion del ACN, a traves del uso de nitrogeno gaseoso, y segundo, la
eliminacion del agua a traves del procedimiento de liofilizacion.
53
. 5. Metodologıa
Para este ultimo se dejaron las fracciones, ya sin ACN, en una nevera a -20C por un
tiempo de 12 - 24 horas. Posterior a ello se dispusieron en el liofilizador LABCONCO
# 7750021® durante un tiempo variable, de acuerdo con la cantidad de agua en cada
fraccion, entre 12-72 horas.
Finalmente, se peso el solido obtenido y se reconstituyo cada fraccion con 600 µL de
EtOH.
5.1.5. Bioensayos de inhibicion
Para la determinacion de la actividad inhibitoria de cada una de las fracciones sobre la
AChE se empleo el metodo colorimetrico de Ellman con ligeras modificaciones optimizadas
previamente en LATNAP.80
5.1.5.1. Preparacion de soluciones
Ası, como primera medida, se prepararon los siguientes buffers que fueron ajustados a pH
8 con HCl al 37 %:
- Buffer A:
200 mL de una solucion 50 mM Tris (1.2114 g) con 1 % de BSA (0.1 g) en agua
desionizada, ajustando pH con HCl.
- Buffer B:
100 mL de una solucion 50 mM Tris (0.6057 g) con 0.1 M de NaOH (0.5840 g) en
agua desionizada, ajustando pH con HCl.
Posterior a ello, se procedio a preparar una solucion 3 mM de DTNB (0.1189 g) en los
100 mL del Buffer B. Esta se sometio a sonicacion por 30 minutos.
Por otra parte, se preparo la solucion de la AChE pesando 0.001 g de esta y disolviendo
en 100 mL de Buffer A.
54
. 5. Metodologıa
Finalmente, una solucion de ATCI 1.42 mM (0.0388 g) es preparada en 100 mL de agua
desionizada.
Las anteriores soluciones fueron almacenadas en condiciones oscuras y temperaturas entre
0 - 10 C.
5.1.5.2. Blanco
A un ependorf de 1.5 mL fueron adicionados 60 µL de la solucion de ATCI, 750 µL de
DTNB y 690 µL del Buffer A, para completar el volumen.
5.1.5.3. Maximo de absorbancia
Se preparo mediante la adicion de 60 µL de la solucion de ATCI, 750 µL de la solucion
de DTNB, 675 µL de Buffer A y finalmente, 15 µL de la solucion de la AChE.
5.1.5.4. Ensayo biologico de cada fraccion
Se tomaron 60 µL de ATCI, 750 µL de DTNB, 200 µL de la fraccion correspondiente, 475
µL de Buffer A y finalmente, 15 µL de la solucion de la AChE.
5.1.5.5. Desarrollo del metodo
Para la realizacion de los ensayos de inhibicion se midio la absorbancia de tres blancos,
tres maximos y cada una de las fracciones, todos por triplicado. Lo anterior se llevo a cabo
a una longitud de onda de 417 nm con el software Simple Reads del espectrofotometro UV-
Vis Cary 60 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EEUU), realizando dicha medicion
para tres momentos correspondientes a los tiempos 0 (al anadir la solucion de la enzima),
20 y 45 minutos. Ası, se monitoreo la formacion del anion 5-tio-2-nitrobenzoato el cual es
amarillo y resulta de la reaccion de la tiocolina con el DTNB (Esquema 4.3.1).
55
. 5. Metodologıa
El porcentaje de inhibicion de cada fraccion fue calculado mediante la comparacion entre
el maximo real de absorbancia, que es hallado como la diferencia entre las absorbancias
promedio obtenidas en los 3 maximos menos la de los 3 blancos, con la absorbancia
obtenida en la prueba para cada fraccion en el tiempo de 45 minutos (Ecuacion 7).
%Inhibicionfraccion =AbsfraccionAbsMaxReal︸ ︷︷ ︸
Absmax−Absblanco
× 100 % (7)
Ahora bien, es de resaltar que los blancos, los maximos y las fracciones para los bioensayos
corresponden a mezclas de las soluciones expuestas en la Subsubseccion 5.1.5.1 y fueron
preparadas para obtener un volumen final de 1.5 mL, por lo cual se realizaron en ependorf
de volumen estandar.
5.1.5.6. Estandar inhibitorio de la AChE
Se empleo eserina como control positivo al ser esta una molecula inhibidora de la AChE.
Para ello, una solucion 5 µM fue preparada mediante diluciones sucesivas a partir de la
solucion madre 1 mM de eserina (0.0028 g) en 10 mL de agua desionizada.
La curva de calibracion de la eserina se realizo tomando 0.2mL de la solucion de ATCI,
2.5mL de la solucion de DTNB, 4mL de buffer A y diferentes volumenes de la solucion de
eserina preparada previamente, con el fin de obtener concentraciones finales de 0.1, 0.2,
0.4 0.6, 0.8 y 1M. Se registro la absorbancia cada 10 segundos durante 40 minutos en el
programa Kinetics y la medida fue realizada por triplicado.80
5.1.6. HPLC MS/MS
La identificacion de los compuestos en las fracciones fue llevada a cabo mediante el uso del
equipo UHPLC+ Focused - Dionex UltiMate 3000 RS Pump (Thermo Fisher Scientific,
Walthman, MA, EEUU) acoplado al espectrometro de masas LQC FleetTM Ion Trap
(Thermo Fisher Scientific, Walthman, MA, EEUU).
56
. 5. Metodologıa
Para este se empleo una fase movil constituida de ACN y H2O desionizada acidificada
con FA, la cual fue conducida de manera isocratica por un tiempo de 10 minutos, para
cada fraccion, a traves de la columna Waters XTerra® MS C18 de dimensiones 3.5 µm,
100 × 2.1 nm (Waters Corporation, Miliford, MA, EEUU).
Los parametros empleados para esta parte se evidencian en la Figura 15.
Figura 15: Parametros empleados para la realizacion del analisis con el MS/MS.
57
. 5. Metodologıa
5.2. Computacional
5.2.1. Docking
Se trabajo con el protocolo de Docking como sigue: Eleccion de la estructura de la AChE
a partir de los datos cristalograficos disponibles en la base de datos de proteınas (PDB),
preparacion de los PDB (receptores) y de los ligandos nativos ası como de los correspon-
dientes a las moleculas presentes en LTCV, generacion del grid y calculo del Docking.
5.2.1.1. Eleccion de los PDB
Como primera medida, fueron seleccionadas las entradas PDB correspondientes a la AChE
filtrada por organismo (Homo Sapiens). Ello redujo el numero de estructuras a analizar
de 233a a 32. Estas fueron descargadas en su forma Biological Assembly y mediante la
aplicacion, por inspeccion y criterio de la autora, de algunos filtros, que seran discutidos
en el Capıtulo 6 se llego a un total de 4 estructuras clasificadas de acuerdo al sitio de
union del ligando como se ve en la Tabla 6.
Tabla 6: PDB correspondientes a las estructuras de la AChE (receptores), y sus ligandosnativos, empleados para la realizacion del Docking.
Sitio de union # PDB LigandoPAS 4M0E Dihidrotansinona I
CAS4BDT Huprina W4EY5 Huperzina A4EY6 Galantamina
aCuando se busco “acetylcholinesterase” sin especificar ningun parametro adicional
58
. 5. Metodologıa
5.2.1.2. Preparacion del receptor
Cada uno de los receptores empleados en el presente estudio (estructuras PDB de los
cristales identificados en la Tabla 6) se prepararon empleando la herramienta Protein
Preparation Wizard a traves del programa Maestro® (Schrodinger, LLC, NY, EEUU).
Para esto, se configuraron los parametros en la Figura 16.
Figura 16: Parametros configurados mediante Maestro para la preparacion del receptor.
Ası pues, se efectuo la aplicacion de dichos parametros para la preparacion de cada uno
de los receptores, al hacer clic en el boton write. Esto genero 2 archivos (*.in, y *.sh), de
los cuales se ejecuto el “*.sh”.
59
. 5. Metodologıa
5.2.1.3. Preparacion ligandos nativos
Como para la realizacion del presente estudio se emplearon PDB que contenıan en su es-
tructura un ligando (nativo o co-cristalizado), se realizo la extraccion del mismo mediante
la creacion de un duplicado desde Maestro®. Ası, se selecciono e incluyo la entrada del
PDB preparado correspondiente, luego se dio clic derecho sobre este y en el sub-menu
“Duplicate” se eligio In Place, para el cual seguidamente se selecciono [L] en el menu
Quick Select, clic derecho, “Invert selection” y se suprimio el receptor, para finalmente
cambiar el nombre del archivo por el “#PDB-Ligando” (para cada caso).
Posterior a ello la preparacion del ligando nativo se dio empleando el campo de fuerza
OPLS3, mediante la herramienta LigPrep, que se encuentra escribiendo ello en el menu
buscar de Maestro®. Posteriormente se da clic en el boton write, el cual genera 3 archivos
con extensiones *.maegz, *.in, y *.sh, de los cuales se debe ejecutar el “*.sh”.
5.2.1.4. Preparacion ligandos identificados en LTCV
Las moleculas: Licodina, dihidrolicopodina, α-lofolina, flabelidina, acetilfawcettiina y ace-
tildihidrolicopodina fueron dibujadas manualmente en el 2D Sketcher de Maestro® o des-
cargadas en formato “*.mae” para ser posteriormente sometidas a una minimizacion rapi-
da, mediante “Minimize structures”, y a LigPrep, con el campo de fuerza OPLS3, para
finalmente generar los 3 archivos *.maegz, *.in, y *.sh, mediante write, y ejecutar el “.sh”.
5.2.1.5. Generacion del grid
Sobre cada uno de los PDB preparados se llevo a cabo la generacion del grid. Esto se
hizo teniendo en cuenta la posicion del ligando nativo del cristal y mediante el uso de la
herramienta “Receptor Grid Generation”, en la cual se empleo Pick to identify the ligand
molecule.
Posteriormente, se efectuo el procedimiento de write, que genero 3 archivos (*.maegz, *.in,
y *.sh) y se ejecuto el “*.sh”.
60
. 5. Metodologıa
5.2.1.6. Calculo de Docking
El calculo de Docking se lleva a cabo mediante la herramienta Ligand Docking y te-
niendo preparados los archivos de las anteriores secciones (cuyo resultado es un archivo
“*-out.maegz” para LigPrep y “.zip” para Receptor Grid Generation). De este modo, en
la ventana de Ligand Docking se seleccionan dichos archivos en las correspondientes ca-
sillas: “Receptor Grid”, From file, y en “Ligands”, Files, Use ligands from:. Finalmente,
se selecciono precision extra (XP) en la seccion “Settings”, se da en el boton write y se
ejecuta el archivo “*.sh”.
El resultado de este calculo se puede verificar en un archivo de extension “.log” en el cual
se puede verificar si el algoritmo pudo encontrar (calcular) una pose de Docking para el
ligando o si, por el contrario, no le fue posible (en este ultimo caso se ve “NO VALID
POSES AFTER MINIMIZATION: SKIPPING.” en una lınea de dicho archivo).
Cabe resaltar que este ultimo paso del protocolo de Docking genera un archivo “* pv.maegz”
si se encntro al menos una pose para los ligandos en el calculo.
5.2.2. MM-GBSA
Se empleo la herramienta “Molecular Mechanics General Born Surface Area” o MM-
GBSA, la cual se encuentra en Task. En el recuadro “Structures” se selecciono “Take
complexes from a Maestro Pose Viewer file” y allı se busco el archivo “* pv.maegz”
generado por el calculo de Docking, se eligio VSGBb 2.0 como el modelo de solvatacion y
se dio clic en write, por ultimo, se ejecuto el archivo “*.sh”.
bVariable dielectric surface generalized Born model.
61
6Resultados, analisis y discusion
6.1. Separacion HPLC-DAD
Para esta etapa se identifico que la mejor proporcion entre volumen de inyeccion de la
muestra y la resolucion cromatografica correspondıa cuando se inyectaban 50µL del EA a
la columna. Para establecer lo anterior, y como se denota en la Metodologıa, se inyectaron
volumenes de 20, 50 y 100µL de la muestra, con los cuales se obtuvieron los cromatogramas
que se evidencian en la Figura 17.
62
. 6. Resultados, analisis y discusion
Figura 17: Cromatograma obtenido al inyectar 20µL-50µL-100µLdel EA.
Para la Figura 17 se evidencia, en color violeta, la inyeccion de 20 µL de muestra. En este
cromatograma se visualiza que los picos estan bien definidos, la resolucion cromatografica
es muy buena y la lınea base se conserva. En el otro extremo, en color azul, cuando se
inyectan 100 µL de muestra, los picos cromatograficos se anchan y no se tiene una buena
resolucion, ya que es difıcil distinguir una lınea base. Lo anterior es importante en este
estudio ya que es mediante esta ultima que es posible definir donde termina o comienza un
nuevo pico cromatografico y al ser ası el proceso de recoleccion de fracciones serıa difıcil.
Ahora bien, evaluando que si se inyectaba un volumen de 100 µL de muestra se perdıa
tanto resolucion cromatografica, como calidad en la separacion, pero la recoleccion de
fracciones podrıa llevarse a termino en un tiempo mas corto, y que si se inyectaban 20
µL se lidiaba con todo lo contrario. Se procedio a inyectar un volumen un poco menor al
promedio entre los dos volumenes anteriores (50 µL). Para dicho volumen, el cromato-
grama (en verde) comprobo que aunque no se tenıa una resolucion tan buena como en el
caso del cromatograma obtenido con el volumen de inyeccion de 20 µL, sı se lograba la
separacion de los picos cromatograficos del EA. Ademas, los picos presentaban simetrıa y
la lınea base no presentaba alteraciones importantes debido al overload o sobrecarga de
la columna.
63
. 6. Resultados, analisis y discusion
De acuerdo con lo anterior, realizando inyecciones con volumen de inyeccion igual a 5
µL, se llevaron a cabo 10 corridas cromatograficas sucesivas con el metodo de la Tabla 5
(Capıtulo 5: Metodologıa). Con lo cual se visualiza la Figura 18, en la que ademas se
resalta la numeracion de cada uno de las fracciones recolectadas de acuerdo con el tiempo
de retencion o el tiempo en el cual empezo a eluir.
Figura 18: Solapamiento de los 10 cromatogramas obtenidos para la recoleccion de frac-ciones y su respectivo identificador (tiempo de retencion).
Es de notar que cada fraccion fue recolectada 10 veces, una por cada inyeccion, es decir,
cada uno de los cromatogramas en la Figura 18. Posterior a la recoleccion de las fracciones,
se juntaron estas, se procedio a eliminar la fase organica mediante el flujo de nitrogeno y
la fase acuosa a traves del proceso de liofilizacion y finalmente se reconstituyeron en 600
µL de etanol para la realizacion de los bioensayos.
64
. 6. Resultados, analisis y discusion
6.2. Bioensayos
Se realizaron las pruebas de bioensayos a todas las fracciones recolectadas encontrando
porcentajes de inhibicion entre el 28 y el 65.7 %, como lo denota la Tabla 7.
Tabla 7: Porcentaje de inhibicion para todas las fracciones. En verde los tres mejores.
Es de notar que para la realizacion del presente trabajo se escogieron las tres fracciones
que presentaron el mayor porcentaje de inhibicion, es decir, aquellas nombradas como 3,
13.5 y 53 (en verde). Ademas de lo anterior un aspecto a mencionar en esta instancia
responde a que la polaridad de las fracciones no parece ser un factor fundamental para
la actividad inhibitoria de las mismas. Lo anterior, ya que aquellas que presentaron los
mayores porcentajes de inhibicion correspondieron con fracciones a tiempos de retencion
variados (uno muy pequeno: 3 min y otro 53 min).
Para verificar lo anterior, se construyo la Figura 19, en la que aunque se evidencia una
ligera tendencia a que el porcentaje de inhibicion disminuye en cuanto aumenta el tiempo
de retencion, es decir, el porcentaje de inhibicion tiende ser mas bajo para fracciones
mas apolares. Sin embargo, tiene una gran dispersion y cabe resaltar que, teniendo en
cuenta que las moleculas presentes en dichas fracciones corresponden a alcaloides, estos
son poseen polaridades similares, por lo cual no es posible concluir certeramente.
Figura 19: Relacion entre % inhibicion de todas las fracciones y su tiempo de retencion.
65
. 6. Resultados, analisis y discusion
6.3. HPLC MS/MS
Para esta etapa, el presente estudio se centro en las tres fracciones que mayor porcenta-
je de inhibicion presentaron. De este modo, y mediante el uso de cromatografıa de alta
eficacia acoplada a un detector de espectrometrıa de masas tandem, se realizo la busque-
da de las moleculas: licodina, dihidrolicopodina, α-lofolina, flabelidina, acetilfawcetina y
acetildihidrolicopodina, cuyas estructuras y relaciones m/za se presentan en la Figura 20.
Figura 20: Estructuras de las moleculas del EA de LTCV en las cuales se enfoco labusqueda de los fragmentos de manera experimental y que fueron estudiadas de maneracomputacional.
Ası pues, dos de las tres fracciones que presentaron mayor actividad, aquellas recolecta-
das en tiempos de retencion 13.5 y 53 minutos, mostraron la presencia de algunos iones
con relaciones m/z y fragmentaciones similares a los compuestos de la Figura 20 en sus
correspondientes espectros de masas. Por otra parte, para la fraccion 3, que presento el
mayor porcentaje inhibicion (65.7 %) no fue posible identificar ninguna de las relaciones
m/z de las moleculas estudiadas.
A continuacion se denotan los cromatogramas HPLC-DAD y los TIC para cada una de
las nombradas fracciones. Ademas se expone el espectro de masas asignado a cada una
de las moleculas identificadas. Cabe resaltar que dicha denotacion se realizo por analogıa,
a traves de las fragmentaciones reportadas en la literatura, estas ultimas se denotan en
los cromatogramas con numeros de color negro y mayor tamano sobre las figuras y una
flecha indicando la correlacion. De lo contrario se expone, en color gris, el numero en el
cual deberıa presentarse el fragmento (segun la literatura) y un signo de interrogacion.
aQue al obtenerse mediante el metodo de ionizacion ESI son de la forma M+1.
66
. 6. Resultados, analisis y discusion
Figura 21: Cromatograma HPLC-DAD (10-420 nm) de la fraccion 3 del EA de LTCV.
Figura 22: cromatogramas de iones totales (TIC) para la fraccion 3 del EA.
Del mismo modo, para la fraccion 13.5 (porcentaje inhibicion = 64.4 %) se exponen los
cromatogramas HPLC-DAD y TIC. Ademas, para este caso, se denotan los espectros de
masas para los iones con m/z = 243.96, el cual fue denotado para licodina, 288.26 para
flabelidina, y 292.25 para acetildihidrolicopodina.
Figura 23: Cromatograma HPLC-DAD (10-420 nm) de la fraccion 13.5 del EA de LTCV.
67
. 6. Resultados, analisis y discusion
Figura 24: cromatogramas de iones totales (TIC) para la fraccion 13.5 del EA.
Figura 25: Espectro de masas para m/z=243.96 (fraccion 13.5) que se denoto Licodina.
Figura 26: Espectro de masas para m/z=288.26 (fraccion 13.5), se denoto Flabelidina.
Figura 27: Espectro de masas m/z=292.25 (fraccion 13.5), Acetildihidrolicopodina.
68
. 6. Resultados, analisis y discusion
Finalmente, para la fraccion 53 (60.3 %inhibicion) se denotaron los iones de m/z = 292.40
y 350.26, que se asocian respectivamente con acetildihidrolicopodina y acetilfawcettiina.
Figura 28: Cromatograma HPLC-DAD (10-420 nm) de la fraccion 53 del EA de LTCV.
Figura 29: cromatogramas de iones totales (TIC) en la fraccion 53.
Figura 30: Espectro de masas, m/z=292.40, se denoto Acetildihidrolicopodina (frac. 53).
Figura 31: Espectro de masas para m/z=350.26, se denoto Acetilfawcettiina (fraccion 53).
69
. 6. Resultados, analisis y discusion
De acuerdo con lo observado anteriormente, se pudo realizar la notacion de tres de las
moleculas de interes que poseen una correspondencia buena con el espectro de MS/MS
de la literatura: licodina, flabelidina y acetilfawcettiina. Una cuarta molecula, acetildihi-
dolicopodina, la cual se denoto para para las fracciones 13.5 y 53 se descarta, en cuanto a
su identificacion mediante analogıa con los fragmentos en la literatura, ya que aunque la
relacion m/z es correspondiente a dicha molecula y los fragmentos reportados en la litera-
tura se evidencian en cada uno de los cromatogramas, los patrones de fragmentacion son
distintos (Figura 27 y Figura 30). Lo anterior podrıa estar relacionado con que se trata de
moleculas analogas a la acetildihidrolicopodina, lo cual es completamente plausible pues
son moleculas de tipo alcaloide y las familias de estas suelen muy diversas en cuanto a
pequenas variaciones estructurales, con el mismo scaffold.
6.4. Criterios seleccion PDB
De acuerdo con la Subsubseccion 5.2.1.1 (en Metodologıa), el primer filtro aplicado a los 32
PDB seleccionados correspondio con una inspeccion mediante la cual fueron descartados
aquellos que no poseıan al menos un ligando nativo (molecula co-cristalizada). Con ello,
se redujo a 21 la cantidad de estructuras para la realizacion de los calculos. Lo anterior
debido a que el presente estudio fue planteado para realizar calculos de Docking sobre
sitios activos conocidos y pre-establecidos, puesto que al realizar el Docking rıgido, y no
hacer ningun tipo de dinamica o minimizacion del complejo, puede que no se encuentren
poses para los ligandos ya que las cavidades de los PDB sin ligandos co-cristalizados (o
nativos) pueden no estar en la configuracion adecuada para la recepcion de una molecula.
Ahora bien, se procedio a analizar los PDB seleccionados y la manera como los ligandos
se encontraban unidos. Al hacer ello se identifico un gran numero de estructuras con
ligandos unidos covalentemente al residuo catalıtico serina (SER) de la enzima. Se denoto
que estos correspondıan a ligandos de tipo organofosfato, los cuales competen a moleculas
que actuan como agentes nerviosos y pesticidas comunmente empleados. De este modo, al
analizar las moleculas identificadas de LTCV (Figura 20) ninguna de ellas poseıa grupos
fosfatos ni la capacidad de formar enlaces covalentes con ningun residuo, por lo cual fueron
descartados 10 PDB que presentaban ligandos con dicho tipo de union.5
70
. 6. Resultados, analisis y discusion
Posteriormente se efectuo una clasificacion de los 11 PDB restantes de acuerdo con el sitio
activo en el cual se encontraba cristalizado el ligando. Para ello se realizo la identificacion
de los sitios: PAS (Sitio Anionico Periferico), CAS (Sitio Anionico Catalıtico) y PAS-CAS
(una cavidad que une ambos sitios y se ubica en todo el gorge de la enzima). Ello se efectuo
mediante la ubicacion, en cada uno de los cristales, de los residuos clave reportados para
cada sitio (Figura 7 en Marco teorico).
De este modo, e identificando que cada residuo se encuentra en una posicion que se denota
por un numero (en el archivo PDB), se hallaron principalmente 2 grupos: uno en el que
los residuos se encontraban en un conjunto de numeros fijos (posiciones) y otro para el
cual el numero de la posicion era variable o no se pudo identificar algunos residuos ya que
correspondıan con otro, tal como se evidencia en la Tabla 8.
Tabla 8: Grupos de cristales PDB identificados de acuerdo con la posicion de los residuosen los sitios activos.
Sitio deunion
Residuo reportadoen la literatura
# Posicion paraGrupo 1
# Posicion paraGrupo 2
PAS Triptofano (TRP) TRP286 No Identificado
CAS
Glutamato (GLU) GLU334 HID325Histidina (HIS) HIS447 HIS438Serina (SER) SER203 SER198
Triptofano (TRP) TRP86 TRP82
De acuerdo con ello se racionalizo que si las estructuras, de los 11 PDB con los que se
contaba, efectivamente correspondıan a la misma enzima no deberıa existir una variacion
tan significativa tanto en las posiciones de los residuos, como en el tipo de este. Ası, se
procedio a realizar un alineamiento de las secuencias de los PDB en ambos grupos con
un software disponible en la web. Ello arrojo un 66 % de similitud entre los dos grupos, lo
cual llevo a pensar que algunas de las estructuras con las que se trataba no correspondıan
a AChE humanas (Homo Sapiens) o se trataba de BChE. Por las razones anteriores, se
descartaron los PDB en el “Grupo 2” (5 estructuras), quedando 6 estructuras PDB, de
las cuales 4 poseen ligandos que estan en el CAS o PAS. Estos corresponden aquellos que
se referencian en la Tabla 6 en el Capıtulo 5: Metodologıa, y para los cuales se presentan
a continuacion las estructuras y nombres de los ligandos nativos (Figura 32).
71
. 6. Resultados, analisis y discusion
Figura 32: Estructuras y nombres de los ligandos nativos por cada cristal (#PDB) y sucorrespondiente sitio de union (CAS o PAS).
6.5. Comparacion Docking XP y MM-GBSA
Como se ha denotado con anterioridad, los puntajes derivados de calculos de Docking y
del metodo MM-GBSA no son equivalentes en muchos casos, ya que este ultimo trata con
funciones mas rigurosas lo cual lo lleva a a ser un metodo mas robusto. De este modo, en
la presente seccion se discutira cada uno de los PDB estudiados en funcion de los puntajes
que se referencian en las Tablas 9 - 12. En estas se denota una columna para los puntajes
de Docking XP, de MM-GBSA y una energıa de tension para el ligando (strainb).
Es importante aclarar en esta seccion que debido a que se eligieron 4 PBD, cada uno
de ellos con ligandos en alguna de las cavidades (Figura 32) y los calculos se efectuaron
sobre enzimas que tenıan co-cristalizado el ligando nativo, la estructura de dicho PDB
se encuentra “optimizada” para dicho ligando y por ende, es de esperar que los puntajes
sean buenos para las poses de los mismos.
bCalculada por Maestro® primero extrayendo el ligando del complejo optimizado y ejecutando uncalculo de energıa sin minimizarlo, con lo que se obtiene la energıa del ligando al encontrarse en el sitiode union, a continuacion, ejecuta una minimizacion de energıa sobre el ligando fuera del receptor. Ladiferencia de energıa es la energıa de tension del ligando.
72
. 6. Resultados, analisis y discusion
Tabla 9: Puntajes de Docking XP, ∆Gunion MM-GBSA y energıa de tension para las 2poses del ligando nativo (Huprina W) y las 10 poses encontradas de las moleculas deLTCV para el PDB 4BDT (CAS).
Tabla 10: Puntajes de Docking XP, ∆Gunion MM-GBSA y energıa de tension del ligandopara 4 poses del ligando nativo (Huperzina A) y unicamente las 2 poses que se pudoencontrar de dos de las moleculas estudiadas de LTCV para el PDB 4EY5 (CAS).
73
. 6. Resultados, analisis y discusion
Tabla 11: Puntajes de Docking XP, ∆Gunion MM-GBSA y energıa de tension para 6 de las15 poses del ligando nativo (Galantamina) y 7 de las poses encontradas para las moleculasde LTCV para el PDB 4EY6 (CAS).
Tabla 12: Puntajes de Docking XP, ∆Gunion MM-GBSA y energıa de tension para las2 poses del ligando nativo (Dihidrotansinona I) encontradas. El calculo de Docking noarrojo ninguna pose para las moleculas de LTCV estudiadas. (PAS).
De estas se evidencia, como primera medida, que el Docking XP es, en general, una
herramienta precisa aunque en algunos casos puede tener grandes desviaciones, como se
denota en la Tabla 9.
74
. 6. Resultados, analisis y discusion
En esta puede verse claramente que la pose de los ligandos de LTCV que esta mejor
calificada segun el puntaje de Docking corresponde a aquella con el peor MM-GBSA
(pose numero 3). De esta tambien se evidencia una gran energıa de tension del ligando
acetildihidrolicopodina. Lo anterior implica que este se encuentra en una conformacion
muy desfavorable para ser alcanzada por el ligando, el cual, aunque en esa posicion es el
que mejor score tiene no serıa favorable energeticamente para el mismo. Por lo cual es
posible cuestionar la capacidad de inhibicion de dicho ligando.
Ademas es posible establecer que varios de los ligandos de LTCV presentan puntajes XP
cercanos a los del ligando nativo, como se evidencia para la licodina (Tabla 10) y la ace-
tildihidrolicopodina (Tabla 11). Lo cual es un primer indicio de que podrıan actuar como
buenos inhibidores experimentalmente. Sin embargo, como ya de ha denotado, la molecula
acetildihidrolicopodina presento energıas de tension altas en los casos en los cuales se en-
contro clasificada de primeras mediante el Docking XP score. En contraposicion, aunque
la molecula de licodina no se encuentra tan bien calificada de acuerdo con los puntajes de
Docking XP, en cada una de las poses que se exponen de la Tabla 10 hasta la ??, se denota
que el puntaje de MM-GBSA para dicha molecula es el mejor de todas las presentadas.
Por lo cual parece ser la mas prometedora de aquellas estudiadas en el presente estudio.
Sin embargo es necesario estudiar otros aspectos que resultan tambien de los calculos.
6.6. Analisis geometrico del sitio de union o binding
site
Para el estudio de los resultados de Docking se planteo la utilizacion de un parametro
geometrico para luego realizar un analisis a traves de las posibles interacciones con los
residuos en cada uno de los sitios de union. De este modo, para todos los ligandos, tanto
nativos del cristal, que se simbolizaran como “#PDB-Ligando”, como para los ligandos de
LTCV en ese mismo cristal (#PDB), se identificaron todos los residuos en la cavidad que
se encontraban a un radio de 5 A en cada una de las poses obtenidas. De este modo, se
consiguio un arreglo de numeros que corresponden a los identificadores de dichos residuos
y al unir estos se obtuvieron los residuos del binding site para cada sitio (PAS, CAS).
75
. 6. Resultados, analisis y discusion
Figura 33: Conteo de residuos en el binding site para cada una de las 47 poses de losligandos en el CAS.
Como primera medida, para el CAS, resultaron 47 poses y 81 residuos en total (binding
site). Como se ve en la Figura 33, todos los ligandos en todas las poses, al acomodarse en
este sitio, presentaron cercanıa con los residuos TYR124, PHE297, PHE338 y en 44/47
casos se incluyo el ASP74 (93.6 %). Algunos residuos representativos, que se reportan
en la literatura como: la serina responsable de la catalisis, SER203, y los residuos claves
en el CAS, el TRP86 y la HIS447 (ver Marco teorico) se presentaron en 42/47 poses
(89.4 %), mientras que en valores intermedios o bajos (61.7-36.2 %) se encuentran residuos
numerados como ochocientos y dos mil, los cuales corresponden con moleculas de agua.
Figura 34: Conteo de residuos en los binding sites para cada una de las 2 poses de losligandos en el PAS.
76
. 6. Resultados, analisis y discusion
Finalmente, para el sitio PAS se encontraron unicamente 2 poses, las cuales interactuan
en total con 36 residuos (Figura 34). En este, los residuos TYR124, PHE338, ASP74 y, se
resalta, TRP286, vuelven a ser representativos. Ademas, es denotar que en este caso, las
moleculas de agua corresponden a 16/36 o 44 % del total de los residuos en los binding sites
obtenidos. Ello esta de acuerdo con la ubicacion de este sitio (en contacto con el bulk),
sin embargo no es posible extraer mucha informacion de estos datos, al ser unicamente 2
poses (ya que para ninguno de los ligandos de LTCV el Docking arrojo un resultado).
6.7. Docking en el CAS
Para el estudio especıfico de las interacciones con los residuos en el CAS, se tiene que el
Docking realizado en este sitio incluyo los cristales correspondientes a los PDB identifi-
cados como: 4BDT, 4EY5 y 4EY6. Para cada uno de estos se analizaron las variables:
distancia a los residuos, tipos de interacciones y energıa de interaccion tanto para los
ligandos nativos, como para los de LTCV. Analizando tambien comparativamente las
interacciones entre estos dos grupos (ligandos nativos y ligandos de LTCV).
6.7.1. 4EY5
El ligando nativo de este cristal corresponde con la Huperzina A (HupA), para esta, el
Docking arrojo 4 poses (la mejor de ellas se expone en la Figura 35).
Figura 35: Vista de la mejor pose del ligando nativo del PDB 4EY5 (HupA).
77
. 6. Resultados, analisis y discusion
(a) Licodina. (b) α-lofolina.
Figura 36: Vista de interaccion del ligando para las poses de las moleculas de LTCVencontradas por el Docking en el PBD 4EY5.
Por otra parte, en cuanto a los ligandos de LTCV, el Docking solo arrojo una pose para
la licodina (Figura 36, a) y otra para la α-lofolina (Figura 36, b). Los puntajes de Glide,
Docking y MM-GBSA se exponen en la Tabla 10. De acuerdo con esta se ha seleccionado
con un borde grueso aquellas poses que presentan los mejores puntajes y en rojo se senalan
aquellos valores desfavorables.
Ahora bien, para empezar el analisis de interaccion con los residuos en el binding site CAS,
para estos ligandos, se evaluo el efecto de la distancia con cada uno de ellos (Tabla 13).
En esta se denotan en azul los residuos reportados como importantes en la literatura y
en la escala de colores el verde indica cercanıa y el rojo, lejanıa.
Tabla 13: Distancia a los residuos del binding site para las poses en el PDB 4EY5.
78
. 6. Resultados, analisis y discusion
Con la Tabla 13 se identifica que se obtienen mejores puntajes cuando:
- Los residuos ILE451 y TRP439 se encuentran a distancias mayores del ligando.
- La distancia a TYR119 es 2.7a.
- Se encuentra cercano al residuo clave HIS447.
- La distancia al residuo TRP86 esta entre 2.3-2.4 A. Lo anterior, ya que se verifica
dicha distancia para la primera pose mejor calificada tanto de LTCV como el ligando
nativo. Lo mismo ocurre con el residuo GLY120, para el cual se observa una distancia
de 2.7 A.
- El GLU202 se encuentra una distancia entre 2.6 y 2.8 A.
Habiendo establecido lo anterior, es ahora importante estudiar las caracterısticas mas
importantes de las poses de los ligandos nativos, respecto a las interacciones con algunos
residuos en el binding site. Ello, en funcion de evaluar las interacciones mas relevantes del
ligando nativo en este sitio, para ası compararlas con aquellas que estan presentes en las
poses obtenidas para los ligandos de LTCV.
Ası, se realizo la Tabla 14, en esta, “PH” equivale a puente de hidrogeno, “PH Ar” a
puente de hidrogeno entre un atomo de H y un atomo unido a un anillo aromatico, “pi-
cat” a la interaccion entre la cara de un sistema rico en electrones π con un cation y
enlace halogeno (EH). Ademas, las distancias, en A, para dichas interacciones se denotan
en parentesis.
Tabla 14: Tipos de interacciones de los residuos en el binding site con cada una de lasposes obtenidas tanto para el ligando nativo (Huperzina A), como para los ligandos deLTCV.
79
. 6. Resultados, analisis y discusion
Con la anterior, se denota que:
- Para 4/5 poses (80 %), se presenta al menos un PH, todos con residuos que estan
presentes en el 89-100 % de los binding site.
- Solo una pose presento interacciones de tipo PH con una molecula de agua.
- El residuo TRP86 parece ser importante debido a la capacidad de hacer interacciones
de tipo pi-cat y la distancia a este residuo parece ser un factor fundamental.
- La pose de HupA que mayor cantidad de interacciones presenta (con 7 residuos) no
es la que esta mejor calificada. Es de notar que la mayorıa consiste de PH Ar, por
lo cual parece que esta no es una caracterıstica favorable. Aunque los porcentajes
para algunos de los residuos con este tipo de interacciones destacan presentarse en
el 100 % de los binding site. Sin embargo no ocurren mas PH Ar en otras poses, lo
que impide analizarlo con mayor detalle.
- El EH no parece tener mucha relevancia para este cristal ni sus ligandos.
ASPECTOS DESTACADOS
- De acuerdo con las caracterısticas analizadas del ligando nativo, respecto a las in-
teracciones mas importantes con algunos residuos, se evidencio que las moleculas
de agua no presentan un papel determinante para la clasificacion (ranking) de los
puntajes para todos los ligandos.
Lo anterior, ya que solo se evidencio un enlace de tipo PH para una de las poses del
ligando nativo y este corresponde con el numero 814, el cual, como puede verificarse
en la Figura 33 se presenta solo en el 12 % de los binding sites.
- Se observo la importancia del residuo TRP86, con el cual los ligandos interactuan
de modo pi-cat. Ello explica por que la distancia corresponde a un factor importante
tambien para ese residuo. Lo mismo ocurre con la GLY120, con la cual se observan
interacciones tipo PH. Para dichos residuos, las poses mejor calificadas tanto de
LTCV como de la HupA presentan las mismas distancias.
- Las interacciones de tipo PH Ar, parecen no ser favorables.
80
. 6. Resultados, analisis y discusion
- Finalmente, se evidencia la importancia de los PH para esta cavidad, ya que el 80 %
de las poses para los ligandos lo presentaron y, en general, todos los puntajes fueron
buenos Por lo que las caracterısticas denotadas aquı se exponen para los mejores
entre unas poses muy buenas (respecto al mejor puntaje del ligando nativo).
Para culminar la presente seccion, y de acuerdo con lo que se ha nombrado, es posible
establecer que el mejor ligando de LTCV para este sitio en este PDB corresponde a
la molecula llamada licodina. Lo anterior se debe en primer lugar, a que esta molecula
presenta similitud con la segunda pose del ligando nativo Huperzina A. En segundo lugar,
esta molecula posee el mejor XP score, el mejor MMGBSA dG Bind y la mejor energıa de
ligamento. Cabe resaltar que la otra molecula analizada, la α-lofolina posee puntajes mas
altos de energıa MM-GBSA y de tension, por lo cual es posible descartarla como optima.
6.7.2. 4EY6
El PDB nombrado como 4EY6 posee galantamina como ligando nativo. Para este se
obtuvieron 15 poses. Se expone en la ??: (a), el diagrama de interacciones para la mejor
de ellas. Es de notar que l gran canidad de poses obtenidas en este caso responde a la
presencia de tres centros asimetricos (23 estereoisomeros), y dos estados de protonacion
posibles (carga 0 y +1) en la galantamina. De acuerdo con estas caracterısticas es posible
establecer como hipotesis, en primera instancia, que aquellas estructuras que no presenten
carga se encontraran mas abajo en la clasificacion de acuerdo con el Docking score. Lo
anterior, pues cabe resaltar que el CAS es un sitio anionico.
Por otra parte, para los ligandos de LTCV, el calculo de Docking arrojo 14 poses. Estas
se distribuyeron de modo: acetildihidrolicopodina, 7 poses, α-lofolina y dihidrolicopodina,
2 poses cada una, flabelidina, licodina y acetilfawcettiina 1 poses cada una. Con lo que
se obtiene un total de 29 poses para ambos grupos de ligandos (nativo y de LTCV). Se
presenta el diagrama de interacciones para la mejor pose de los ligandos LTCV, la cual
fue establecida como la licodina, ya que aunque la acetildihidrolicopodina fue la mejor
calficada de acuerdo con el Docking XP score, tiene mejor MM-GBSA, la licodina (??:
(b)).
81
. 6. Resultados, analisis y discusion
(a) Galantamina. (b) Licodina.
Figura 37: Diagrama de interaccion de ligandos para la mejor pose del ligado nativo (a)y la mejor pose del ligando LTCV del PDB 4EY6.
Ahora bien, debido al gran volumen de datos presentado en este caso se tomaron las tres
mejores y la tres peores poses del ligando nativo, para buscar establecer un patron y
con ello comparar las interacciones correspondientes a los ligandos de LTCV que mejores
puntajes presentaron. en base a esto se obtuvieron las tablas 15 y 16
Tabla 15: Puntajes para las poses elegidas, tres mejores (verde) y tres peores (rojo), delligando nativo del PDB 4EY6 (galantamina) junto con los residuos con los que presentanalgun tipo de interaccion.
82
. 6. Resultados, analisis y discusion
Tabla 16: Distancia a los residuos del binding site para las poses en el PDB 4EY6.
De las anteriores se evidencia que efectivamente los ligandos cargados se ubicaron en
partes superiores de la tabla. Sin embargo, es de notar que la carga no representa un
factor determinante, que implica automaticamente que la pose sea buena o que vaya a
tener una afinidad alta por la cavidad, a pesar del caracter anionico de esta ultima. Ello
se denota en la pose numerada como “3” (Tabla 16) en la cual el puntaje de Docking XP
es bueno pero a pesar de ello el δGunion MM-GBSA da un valor positivo.
Confirmando lo anteriormente dicho, es de resaltar que de hecho, la pose 3 presenta un
comportamiento mas similar a las ultimas poses de la Tabla 15, aun siendo dichas poses
(14 y 15) neutras, y a la que se hace referencia, positiva. Lo anterior, ademas de apoyar
que la carga no es un factor determinante para asumir la tendencia de afinidad de un
ligando en esta cavidad, verifica la importancia de realizar un calculo mas riguroso como
lo es el MM-GBSA, para confirmar la veracidad del ranking realizado por el Docking.
Ahora bien, las caracterısticas que presentan los ligandos nativos al interactuar con los
residuos en el binding site son principalmente de tipo PH y PH Ar. Lo que presenta una
variacion en este caso corresponde con el numero de residuo con el cual interactue:
- Para las poses catalogadas como “mejores”, basados en los puntajes calculados
(Tabla 15), el conjunto de residuos se compone por: GLU202, SER203, PHE338
e HIS447.
- Para aquellas que presentaron mayores energıas se evidencia la presencia de inter-
acciones con los residuos: TRP86, TYR124, GLU202 y un enlace de tipo PH Ar con
una molecula de agua, que se simboliza como HOH###.
83
. 6. Resultados, analisis y discusion
- De acuerdo con lo anterior, se ve que el residuo de GLU202 esta presente en todas
las poses y corresponde con una interaccion de tipo PH. Ademas, los valores de
distancia (entre parentesis y en A) son aproximadamente constantes, variando entre
1.6 -1.8 A (excepto para la pose 15), lo cual indica que la presencia de un enlace de
tipo PH con este residuo es clave para este sitio.
- Respecto a la Tabla 16, la correlacion por colores es evidente, presentandose con
mayor claridad en los residuos numerados como: TYR449 y TRP439, para los cuales
distancias cercanas a 5A son favorables, HIS447 y PHE295 (valores de distancia entre
2.5-2.6 A son ideales) TYR133 (distancias no mayores a 3 A), LEU130 (4.7-4.8 A),
SER125 (2.2-2.3 A), GLY121 (valor fijo 2.6 A), THR83 y GLY82 (residuos lejanos,
al rededor de 4-5 A respectivamente).
Habiendo establecido lo anterior, y evaluando las mismas propiedades para las poses de
los ligandos LTCV se evidencia:
- Para ninguno de los ligandos del LTCV, la distancia a TYR133 es mayor a 3 A.
- Los valores mas cercanos a 4 A se encuentran para las poses mejor calificadas.
- En general para la GLY202 se denotan mejores puntajes entre mas cerca de encuen-
tren del ligando. Lo cual confirma que puede corresponder con un residuo importante
para este sitio.
ASPECTOS DESTACADOS
- Se evidencio que aunque la carga del ligando tiene un papel importante en la orga-
nizacion de los puntajes de Docking, esta no es fundamental determinar la afinidad
de union de un ligando.
- Gracias a los calculos de MM-GBSA, fue posible verificar que la pose 3, la cual
poseıa una carga positiva y ademas gozaba de un mejor Docking score que la 8,
resulto tener un comportamiento similar a las poses en peor calificadas, tanto por
Docking, como por MM-GBSA. Con lo cual se apremia la gran utilidad de dichos
calculos en complemento con el Docking.
84
. 6. Resultados, analisis y discusion
- El residuo GLY202 parece tener un papel importante en este sitio.
- Las correlaciones entre las poses del ligando nativo y las de ligandos de LTCV no
fueron muy buenas. Sin embargo sı fueron representativas para poses intra-ligando
nativo: las tres mejores y las tres peores presentaron patrones marcados relacionados
con la distancia fija a algunos residuos (GLY121, valor fijo 2.6 A), y la poca variacion
en otros (HIS447 y PHE295, 2.5-2.6 A son ideales para un buen score).
Como analisis final, se encuentra que el mejor ligando de LTCV para este sitio, en el
presente PDB, es la molecula licodina. Lo anterior ya que se analizaron los puntajes de
XP GScore, MMGBSA dG Bind y la energia de tension del ligando para las mejores
moleculas, las cuales fueron licodina y acetildihidrocopidina, siendo la pose de licodina
aqeulls que poseıa los mejores puntajes. Ademas, como complemento de analisis, se exa-
minaron las distancias optimas de las moleculas a los residuos importantes del sitio, para
lo cual se obtuvo que la licodina se situa en un mejor lugar para todos los residuos impor-
tantes. Especıficamente, esta tiene mejor distancia para los residuos TYR449, TRP439,
HIS447, THR83 y GLY82. En cambio la acetildihidrocopidina tuvo mejor distancia para
los residuos PHE295,TYR133, LEU130, GLY121.
6.7.3. 4BDT
Para este cristal el ligando nativo corresponde a la Huprina W. Como caracterısticas
importantes de esta molecula se destaca la presencia de dos anillos aromaticos, uno li-
geramente desactivado al tener unido un cloro, y otro correspondiente a un pirrol con
un grupo amino (activante fuerte), un grupo hidroxilo unido al extremo de una cadena
alifatica de 2 miembros y un “esqueleto” compuesto de estructuras cıclicas de carbono.
Para dicho ligando se obtuvieron 2 poses, como se ve en la Tabla 9. Para la primera de
ellas se resalta el gran puntaje tanto de XP GScore, como de δ G de union MM-GBSA.
De acuerdo con lo anterior, y en funcion de entender la gran diferencia entre los puntajes
obtenidos para el ligando nativo (la pose mejor calificado de Huprina W posee un XP score
de aproximadamente -16 y la segunda, de -8), lo primero que se realizo fue un analisis de
las interacciones con los residuos en el binding site (Tabla 17).
85
. 6. Resultados, analisis y discusion
Tabla 17: Tipos de interacciones de huprina W (ligando nativo) con los residuos en elbinding site para el PDB 4BDT.
Al analizar las interacciones de las poses de huprina W con los residuos se evidencio que no
existıan residuos en comun con los cuales interactuaran. Ello llevo a pensar que se trataba
de 2 poses que no se habıan anclado al mismo sitio de union, por lo cual se procedio a
visualizar las poses en cuestion (Figura 38).
(a) Ligando nativo con el primer (mejor) score. (b) Ligando nativo con el segundo mejor score.
Figura 38: Interacciones para las diferentes poses y sitios de union obtenidos para elligando nativo Huprina W, del PDB 4BDT.
Al evaluar visualmente las poses arrojadas por el calculo de Docking (Figura 38) se vio
que el calculo efectivamente las habıa anclado a lugares diferentes en el receptor y que
la pose con el mejor Docking score corresponde a la molecula ubicada en el fondo del
CAS (como se esperaba), y posee una gran cantidad de interacciones con unos pocos
residuos. Mientras que la otra pose obtenida para la misma molecula corresponde a una
completamente diferente. Esta ultima se situa hacia la superficie de la enzima en contacto
con el “bulk” y ademas tiene gran cantidad de interacciones con residuos en esta zona.
86
. 6. Resultados, analisis y discusion
Lo anterior hace pensar que se obtuvo una pose en el sitio PAS con la utilizacion de
este PDB y el grid que contenıa este mismo ligando nativo y esto es importante ya que
corresponde con informacion que no estar reportada especıficamente en el artıculo del cual
se obtuvo el PDB analizado en la presente seccion.
Con lo que se ha denotado anteriormente se establece:
- Interacciones CAS en 4BDT:
Para esta pose se observa que priman las interacciones de tipo PH y PH Ar, pre-
sentandose distancias alrededor de 2.A para los primeros, mientras que para los
segundos se tienen distancias mayores entre 3-4 A.
- Interacciones PAS en 4BDT:
De la Tabla 17 se denota que la mayorıa de interacciones que presenta esta pose del
ligando nativo posee en su mayorıa interacciones de tipo PH.
- Finalmente es de notar que los puntajes de ambas zonas no son directamente com-
parables entre sı ya que corresponden con distintos arreglos de ligandos (numero de
los residuos con los que se unen los ligandos varıan en gran medida). Lo que sı se
puede establecer es que, como podrıa preverse, los puntajes para el ligando en el
PAS son menores que en el CAS. Ello debido principalmente a que el numero de
residuos con los cuales puede tener interaccion este ultimo es menor y por tanto no
puede ser tan estable, como tambien se reporta en la literatura.
Ahora bien, para los ligandos de LTCV se obtuvieron 10 poses que se reparten ası: 5 de
acetyldihydrolicopodina, 2 dihidrolicopodina, 2 α-lofolina y 1 de licodina. Para este PDB,
como ya se habıa denotado anteriormente, la relacion entre los puntajes provenientes del
Docking y de MM-GBSA son muy diferentes. Ello se ve reflejado principalmente en el
caso del ligando de LTCV clasificado como el mejor segun el Docking score (-8.97), pero
denotado como el peor segun el calculo de delta de union MM-GBSA (25.56). Como se
ve en la Tabla 9, ello se ha atribuido a la gran energıa de tension del ligando presentada
para esta pose. Es de notar que la situacion descrita con anterioridad se presenta tambien
para otra pose del mismo ligando (fila 4) y para una pose de dihidrolicopodina y otra de
α-lofolina.
87
. 6. Resultados, analisis y discusion
Respecto a todo lo anterior, y habiendo establecido que los ligandos nativos para este
PDB, de acuerdo con el grid seleccionado, arrojaron dos posibles sitios de union (PAS
y CAS) se realizo primero una inspeccion visual de las poses obtenidas de los ligandos
LTCV. Al llevar a cabo ello se determino que los ligandos con numeracion 6, 7, 8 y 11 (en
base a la Tabla 17) corresponden con aquellos anclados en el PAS y los numerados como
3, 5, 6, 7, 10 y 11 fueron ubicados en el CAS a traves del calculo de Docking.
A continuacion se muestra una representacion de las interacciones de ligando para la pose
del ligando nativo (Huprina W) en el PAS y ello mismo para la mejor pose de los ligandos
LTCV en el PAS (Acetildihidrolicopodina).
(a) Huprina W.
(b) Acetildihidrolicopodina.
Figura 39: Diagrama de interaccion de ligandos para las poses de Huprina W y la mejorpose del ligando LTCV del PDB 4BDT, en el sitio PAS.
Tabla 18: Distancia a los residuos del binding site para las poses en el PDB 4BDT que seubicaron en el PAS.
88
. 6. Resultados, analisis y discusion
De este modo, mediante un analisis realizado para las interacciones dependientes de la
distancia a los residuos en el binding site (Tabla 19 y Tabla 19) es posible establecer:
PAS:
- Ninguna de las cuatro poses encontradas para los ligandos en el PAS, para este
PDB, presento valores muy altos de energıa de strain. Esto, comparando los valores
antedichos con los obtenidos para las poses en el CAS. Ello se esperaba, ya que el
PAS es un sitio mas expuesto al “bulk” que el CAS y, por tanto, las interacciones
presentadas con el ligando se pueden dar en un estado mas relajado del mismo.
- Por otra parte, se evidencio que la mayorıa de las distancias a los residuos evaluados
presentan una tendencia de acuerdo con los valores de energıa obtenidos para estos.
Destacandose el TRP439, para el cual entre mas lejos se encuentren los ligandos (8-
10 A), mejores energıas y PHE295 para el cual ocurre lo contrario (mejor en 1.8-3.8
A)
- Respecto a los residuos con los que el ligando nativo presenta algun tipo de inter-
accion (Tabla 17) se evidencia que para ASP74 y TYR341, con los cuales huprina
W tiene interacciones de tipo PH, la relacion con la distancia es, en general, entre
mas cerca mejores puntajes. Por otra parte, para el residuo TRP286, con el cual se
tienen interacciones de tipo pi-cat, la distancia es constante para todos los ligandos
de LTCV.
Ahora, realizando el mismo analisis para las poses obtenidas en el CAS, se evidencio:
Tabla 19: Distancia a los residuos del binding site para las poses en el PDB 4BDT que seubicaron en el CAS.
89
. 6. Resultados, analisis y discusion
CAS:
- Para este caso fue mas difıcil establecer correlaciones. Lo anterior, a causa de las
discrepancias entre los puntajes calculados mediante XP Docking y aquellos propor-
cionados por el δG de union MM-GBSA.
- En relacion a lo anterior, se evidencia que las poses de los ligandos mejores calificados
por el Docking son aquellos que tienen energıas δ G de union peores. Ello hace
referencia especıficamente al ligando acetildihidrolicopodina, para el cual se logro
explicar lo anterior a traves de factores estericos relacionados con el acoplamiento
de dicha molecula en esta cavidad. La cual, como se puede observar en la Figura 40,
presenta una distribucion espacial que se parece mayormente a una esfera (Figura 40,
b), mientras que el ligando nativo se acomoda dentro de la cavidad asemejandose
mayormente a dos planos (Figura 40, a).
(a) Ligando nativo en el CAS. (b) Acetildihidrolicopodina (pose 3) en el CAS.
Figura 40: Interacciones desfavorables para la acetildihidrolicopodina y el ligando nativoen la cavidad CAS en el PDB 4BDT.
Lo anterior se debe principalmente a emplear la enzima rıgida o no haber permitido
una minimizacion del complejo. Lo cual causa que la geometrıa que posee dicho
ligando en el binding site, al ser un espacio cerrado, dentro de la enzima y comple-
tamente rodeado, sea desfavorable.
- En este caso, a traves del criterio de distancia a los residuos del binding site se
puede visualizar una correlacion con el ASP74. Aunque para este no se evidenciaron
interacciones de algun tipo en la Tabla 17 para este sitio.
90
. 6. Resultados, analisis y discusion
- Al evaluar el tipo de interacciones de todos los ligandos en LTCV se determino que
TRP86 es importante debido a la interaccion de tipo pi-cat con el N+.
- Finalmente, de acuerdo con la pose 5 en la Tabla 19, se evidencio que presento
interacciones de tipo acoplamiento π − π, PH con el residuo TYR124 y pi-cat con
TRP86, el cual resulto ser tambien un residuo con el cual el ligando nativo presen-
taba interacciones, pero de tipo PH Ar.
ASPECTOS DESTACADOS
- De acuerdo con las poses obtenidas para el ligando nativo (Huprina W) se identifico
que este tambien se une de una manera estable y con gran cantidad de residuos al
CAS, lo cual no se encontro reportado en la literatura correspondiente al artıculo
del cual proviene este PDB.
- En base a la anterior observacion para el ligando nativo se pudo analizar las poses
obtenidas para los ligandos de LTCV dividiendolo en dos casos, CAS y PAS
- respecto a las poses del CAS, al comparar los puntajes tanto de XP del Docking,
como del delta G de union calculado mediante MM-GBSA, no se denota una corres-
pondencia buena, por lo cual fue difıcil establecer correlaciones.
- En conjunto, se evidencio que la presencia de PH Ar y PH son importantes para un
buen puntaje en el CAS (para este PDB), mientras que las interacciones tipo pi-cat
y PH son importantes para la obtencion de un buen score tanto mediante Docking,
como mediante MM-GBSA en el PAS.
- Adicional a lo anterior se denoto la importancia del residuo TRP86. Al presentarse
en el CAS, y poder tener distintos tipos de interacciones con los ligandos, lo cual
mejora sus puntajes.
Finalmente, se puede afirmar que el mejor ligando de LTCV en el presente sitio en este
PDB corresponde a una paridad entre las moleculas licodina y acetildihidrocopidina. No se
define una molecula optima unica debido a diferencias en CAS y PAS respectivamente, lo
cual hace que la comparacion entre ambas moleculas tenga un elevado grado de dificultad
y podrıa ser resuelta mediante analisis mas exhaustivos.
91
. 6. Resultados, analisis y discusion
Dicha paridad se genera debido a que los puntajes de Docking y de MM-GBSA son muy
similares pero favorecen a la licodina. Por otra parte, la diferencia radica en la energıa de
tension del ligando, para la cual la acetildihidrocopidina presenta un mejor valor. Como
aproximacion a la eleccion de una unica molecula, se prefiere la licodina, debido a que
exhibe, en baja cantidad, mejores puntajes que la acetildihidrocopidina.
6.8. Docking en el PAS
Como se especifico al iniciar el presente capıtulo, los datos que se obtuvieron para el
cristal 4M0E, el cual contenıa el ligando dihidrotansinona. Solo arrojo 2 poses para dicho
ligando y ninguna para la de los ligandos de LTCV. Por lo cual no es posible realizar un
analisis.
92
7Conclusiones
De acuerdo con los estudios experimentales se comprobo que el extracto de alcaloides
de la planta Lycopodium thyoides obtenida del paramo Cruz Verde, presenta actividad
biologica relacionada con la inhibicion de la enzima acetilcolinesterasa.
En base a lo anterior se verifico que dicha actividad se debe a una serie de moleculas,
ya que la actividad inhibitoria no es constante o especıfica para una unica fraccion. Ası,
dicha actividad se presenta en mayores porcentajes para las fracciones que corresponden
con los tiempos de retencion: 3, 13.5 y 53 minutos (Respectivamente: 65.7, 64.4 y 60.3 %
inhibicion, respecto al maximo).
Para dos de las fracciones con mayores porcentajes de inhibicion (13.5 y 53), se denoto
la posibilidad de la presencia de las moleculas licodina, flabelidina, acetilfawcettiina y,
eventualmente acetildihidrolicopodina.
93
. 7. Conclusiones
Cabe resaltar que lo anterior se hizo mediante el uso de la tecnica de espectrometrıa de
masas en tandem con una energıa de colision de 50 eV, e identificando por analogıa, con
fragmentos reportados en la literatura para las nombradas moleculas.
Ahora bien, relacionando los estudios computacionales con aquellos resultados de la parte
experimental se denoto que el mejor ligando inhibidor de la enzima acetilcolinesterasa
corresponde a la licodina. Ello responde a que dicha molecula actua como inhibidor en
el sitio CAS el cual, segun la literatura es el sitio de union principal de los ligandos al
efectuar mejor su funcion. Ademas, se identifico a esta molecula como el mejor ligando
inhibidor en varios de los PDB estudiados para dicho sitio. a causa interacciones de tipo
puente de hidrogeno con los ligandos en el CAS y que su distancia era ideal respecto a la
obtenida para las mejores poses del ligando nativo, siendo las interacciones adicionales de
tipo pi, bien sea acoplamiento pi-pi (PHE338) o pi-cation (TRP 86).
En base a la parte computacional, tambien se evidencio una correlacion entre el resultado
de los calculos de Docking con los resultados experimentales, ya que se identifico licodina
en la fraccion 13.5, la cual presento el segundo porcentaje de inhibicion mas alto (64.4 %).
Ademas de lo anterior, computacionalmente tambien se evidencio que el ligando acetil-
dihidrolicopodina presenta una gran cantidad de poses en todos los PDB estudiados y
en ellas las interacciones son medianamente favorables, por lo cual se establecio como la
segunda mejor molecula inhibidora de la AChE en el CAS. Sin embargo, de acuerdo con
la metodologıa del Docking empleada para los calculos (receptor rıgido) se evidenciaron
energıas de tension altas ya que la molecula tiende a tener una conformacion mas espa-
ciosa que la de los ligandos nativos. Es importante mencionar ello ya que esta tambien se
propuso para ser encontrada en la fraccion mas activa, por lo cual se propone la realiza-
cion de dinamicas moleculares para encontrar una conformacion del receptor que no este
adecuada al ligando nativo y de este modo obtener resultados sin dicho sesgo.
Finalmente, hay que resaltar que para la fraccion con mayor porcentaje de inhibicion
(obtenida a tiempo de retencion 3) no fue posible encontrar ninguna de las relaciones
m/z pertenecientes a las moleculas estudiadas, por lo que se propone realizar un analisis
mediante QTOF y optimizar la separacion de los compuestos en las fracciones para ası
continuar con su identificacion y estudio de bioactividad individual.
94
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102
Appendices
103
AAbreviaciones
Se denotan las abreviaciones, con su correspondencia, por orden alfabetico:
- Acetil CoA: Acetil coenzima A.
- ACh: Acetilcolina.
- AChE: Enzima acetilcolinesterasa.
- AD: Enfermedad de Alzheimer.
- APCI: Ionizacion quımica a presion atmosferica.
- Ar: Aromatico.
- BChE: Enzima butirilcolinesterasa.
- BD: Dinamica Browniana.
104
Apendice A. Abreviaciones
- CAS: Sitio anionico catalıtico.
- CAS#: Numero de Chemical Abstracts Service.
- Cat: Cationico.
- ChE: Colina esterasa.
- CI: Ionizacion quımica.
- CN: Cognitivamente normal.
- CnAT: Colinacetiltransferasa.
- COBO: Quımica bio-organica computacional.
- DAD: Detector de arreglo de diodos.
- E2020: ((R,S)-1-benzil-4-)[(5,6-dimetoxi-1-indanon)-2-il]metilpiperidina).
- EA: Extracto de alcaloides.
- EEUU: Estados unidos de america.
- EH: Enlace halogeno.
- EI: Ionizacion electronica.
- ESI: Ionizacion por electrospray.
- ET : Extracto total.
- FDA: Fereracion de alimentos y medicamentos.
- FEP: Perturbacion de energıa libre.
- GC: Cromatografıa de gases.
- HPLC: Cromatografıa lıquida de alta eficacia.
- HupA: Huperzina A.
- l-DOPA: l-3,4-dihidroxifenilalanina.
105
Apendice A. Abreviaciones
- LATNAP: Laboratorio de tecnicas analıticas avanzadas en productos naturales.
- LTCV: Lycopodium thyoides obtenida del paramo cruz verde.
- m/z: masa/carga (relacion).
- MALDI: Ionizacion por desorcion de la matriz asistida por laser.
- MCI: Deterioro cognitivo leve.
- MM-GBSA: Mecanica Molecular-Generalized Born Surface Area.
- MO: Missouri.
- MS: Masas.
- NMDA: Receptor N-Metil-D-Aspartato.
- OPLS3: Potencial optimizado para Simulaciones en lıquido (Campo de fuerza).
- PAS: Sitio anionico periferico.
- PDB: Base de datos de proteınas.
- PH: Puente de hidrogeno.
- QTOF: Cuadrupolo - tiempo de vuelo
- RP: Fase reversa.
- SMD: Dinamica molecular dirigida.
- SNC: Sistema nervioso central.
- SNP: Sistema nervioso periferico.
- TcAChE: Enzima acetilcolinesterasa de Torpedo californica.
- TCh: Tiocolina.
- TI: integracion termodinamica.
- TIC: Cromatograma de iones totales.
106
Apendice A. Abreviaciones
- TMA: Grupo trimetilamonio.
- UV: Ultravioleta.
- Vis: Visible.
- VSGB: Variable-dielectric generalized Born model (modelo de solvatacion).
- XP: Extra precision.
Abreviaciones de los reactivos empleados:
- ACN: Acetonitrilo grado HPLC.
- DTNB: Acido 5-5’-ditiobis-(2-nitrobenzoico).
- HCl: Acido clorhıdrico.
- FA: Acido formico.
- BSA: Albumina serica bobina.
- DCM: Diclorometano.
- Enzima Acetilcolinesterasa (AChE)
- EtOH: Etanol absoluto.
- NaCl: Cloruro de sodio.
- NaOH: Hidroxido de sodio.
- Na2SO4: Sulfato de sodio anhidro.
- Tris: Tris(hidroximetil)aminometano.
- ATCI: Yoduro de acetiltiocolina.
107