aislamiento y caracterización de bacterias ácido lácticas
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Facultad de Ciencias Veterinarias
-UNCPBA-
Aislamiento y caracterización de bacterias ácido
lácticas de intestino de cerdos con potencial
probiótico.
Eyeralde, Ludmila; Alonso, Mónica; García, Cecilia.
Julio, 2018
Tandil
Aislamiento y caracterización de bacterias ácido lácticas de intestino de
cerdos con potencial probiótico.
Tesis de la Carrera de Licenciatura en Tecnología de los Alimentos,
presentada como parte de los requisitos para optar al título de grado de
Licenciado del estudiante Eyeralde Ludmila Daiana.
Directora: Dra.; Alonso, Mónica Zulema
Codirectora: Dra.; García, María Cecilia.
Evaluador: Ing. Vega, María Fernanda.
Agradecimientos:
En primer lugar agradezco al Laboratorio de Fisiología Celular perteneciente al
Departamento de Fisiopatología de la Facultad de Ciencias Veterinarias que
me dio la posibilidad de realizar las prácticas para formarme profesionalmente.
En segundo lugar agradezco a mi directora, Alonso Mónica y a mi codirectora
García Cecilia que me guiaron y trabajaron junto a mí para que pueda adquirir
prácticas de laboratorio que enriquecieron mi formación.
A mi familia, quien siempre me apoyó y acompañó en este largo camino e hizo
todo para que yo pudiera terminar mi carrera.
A mis amigos Gelfgoth Eric y Pal Silvina, quienes conocí en esta carrera y
fueron parte de ella, formando entre los tres un gran grupo de estudio pudiendo
salvar todos los obstáculos que se nos fueron presentando.
Índice General:
1. Introducción…………………………………………………………………....1
2. Objetivos……………………………………………………………………….3
3. Antecedentes…………………………………………………………………..4
4. Materiales y métodos…………………………………………………………7
4.1 Muestreo…………………………………………………………………...7
4.2 Aislamiento y caracterización fenotípica…………………………….....7
4.3 Evaluación de la capacidad probiótica in vitro………………………...9
5. Resultados y discusión………………………………………………...…....12
5.1 Aislamiento de BAL del tracto gastrointestinal de cerdos…………...12
5.2 Características fenotípicas de las colonias
individuales…………………………………………………………….....12
5.3 Pruebas bioquímicas básicas de las colonias
individuales……………………………………………………………….14
5.4 Evaluación de la capacidad probiótica in
vitro………………………………………………………………………..16
5.5 Actividad antimicrobiana contra patógenos productores de ETA’s..19
6. Conclusión…………………………………………………………………….20
7. Bibliografía…………………………………………………………………….21
Índice de tablas:
Tabla 1: Caracterización fenotípica de las colonias individuales……………….13
Tabla 2: Pruebas bioquímicas básicas de las colonias seleccionadas……...…15
Tabla 3: Crecimiento a diferentes temperaturas……...…………………………..16
Tabla 4: Crecimiento a distintos pH……………………………...……………….. 17
Tabla 5: Tolerancia a sales biliares………….……………………..………………18
Resumen:
La producción porcina a nivel mundial es de aproximadamente 5 millones de
toneladas, siendo la carne de mayor consumo. En el caso de Argentina se
producen 552.428 toneladas y se registra un consumo de 12.88 kg/hab/año.
En este tipo de producción intensiva se utilizan los antibióticos como
promotores de crecimiento entre otras aplicaciones, lo que produce cierta
inquietud en los consumidores, ya que el uso prolongado genera residuos en la
carne. Una de las alternativas para sustituir el uso de éstos es el empleo de
probióticos: como las bacterias ácido láctica (BAL) del género Lactobacillus, ya
que poseen la ventaja de no dejar residuos en la carne destinada al consumo.
Por lo tanto, los objetivos de este trabajo de Tesis fueron aislar y caracterizar
cepas del género Lactobacillus spp. con posible potencial probiótico, identificar
fenotípicamente las cepas obtenidas y evaluar la posible capacidad probiótica
in vitro. Se tomaron muestras de 8 cerdos de una granja de la zona de la
ciudad de Tandil, mediante hisopados de distintas porciones del intestino
(ciego, colon e íleon). Posteriormente, se realizó el aislamiento y la
caracterización fenotípica mediante las pruebas bioquímicas básicas. En las
cepas que presentaron características fenotípicas del género Lactobacillus, se
evaluó el potencial probiótico, mediante algunas determinaciones in vitro como:
el pH, sales biliares y temperaturas extremas. Además, se realizó la prueba de
inhibición contra Salmonella Enteritidis. La cepa obtenida presentó
características del género Lactobacillus, probióticas y actividad inhibitoria
contra la bacteria productora de ETA´s.
Palabras clave: cerdos, probióticos, Lactobacillus.
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1. Introducción:
La producción porcina a nivel mundial es de aproximadamente 5 millones de
toneladas, siendo el tipo de carne de mayor consumo. En Argentina se
producen 522.428 toneladas y registra un consumo de 12,88 kg/hab/año
(MINAGRI, 2016).
En este tipo de producción la sanidad de los animales se puede ver afectada
por distintos tipos de enfermedades, las cuales se propagan rápidamente y
provocan pérdidas, principalmente económicas.
En el año 1940, Stokestad y Jukes descubrieron, mediante la alimentación de
pollos, que el uso de antibióticos como promotores de crecimiento generaban
ciertos cambios beneficiosos como: mayor ganancia de peso, mejor resistencia
a infecciones y rápida conversión alimentaria.
Desde ese momento, el uso de antibióticos como promotores de crecimiento se
extendió en la alimentación de diversas especies con producción intensiva,
como por ejemplo, la producción porcina (Gutiérrez et al, 2013).
Entre los fármacos que se utilizan principalmente para prevenir enfermedades
se encuentran los coccidiostaticos y los agentes promotores del crecimiento
(Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, 2000). Éstos son utilizados
como aditivos que aumentan la eficiencia de los alimentos y, por ende, generan
mejoras en el peso aumentándolo significativamente. El motivo por el que
sucede es porque se producen modificaciones en los procesos digestivos y
metabólicos de los animales (Gutiérrez et al, 2013).
Sin embargo, la resistencia a ciertas cepas bacterianas se debe al uso
excesivo de antibióticos que se acumulan en la carne y esta problemática
preocupó a los consumidores. A raíz de esta situación, se buscó una alternativa
reemplazando los antibióticos por probióticos, siendo éstos producto naturales
y sin riesgos para el consumidor (Carro y Ranilla, 2011).
Entre ellos se encuentran las bacterias ácido lácticas (BAL) del género
Lactobacillus, que forman parte de la flora benéfica que provocan un efecto
inhibitorio sobre patógenos productores de enfermedades transmitidas por los
alimentos (ETA´s) (Rondón et al, 2008). En base a lo mencionado
2
anteriormente, el objetivo general de este trabajo de Tesis es aislar y
caracterizar cepas del género Lactobacillus spp. con posible potencial
probiótico.
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2. Objetivos
Objetivo general:
Aislar y caracterizar cepas del género Lactobacillus spp. con posible
potencial probiótico.
Objetivos específicos:
Identificar fenotípicamente las cepas obtenidas.
Evaluar la capacidad probiótica in vitro.
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3. Antecedentes:
La porcicultura moderna, caracterizada por la explotación intensiva de la
producción, no está exenta de factores causantes de desequilibrios en los
animales. La alta densidad de población, vacunación, altas o bajas
temperaturas, humedad inadecuada, incidencia de gases tóxicos, alta carga de
microorganismos patógenos e inmunodepresión, son algunas de las
problemáticas causantes de altos niveles de estrés en los cerdos. Estas
situaciones constantes traen consigo la aparición frecuente de diversas
enfermedades y la disminución de los niveles de producción de los cerdos
(Carro y Ranilla, 2011). Para contrarrestar estas problemáticas, la producción
porcina implementó el uso de antibióticos como promotor de crecimiento, lo que
generó cierta inquietud en los consumidores, obligando a los productores a
buscar otras alternativas para sustituir el uso de los mismos. Por ejemplo el uso
de probióticos.
Un probiótico se define como un “organismo vivo que ingerido en cantidades
adecuadas confiere un beneficio al huésped” (FAO/OMS, 2002). Para que un
microorganismo sea considerado probiótico debe cumplir ciertos requisitos
como: tolerancia al pH gástrico, temperaturas y sales biliares. Además, pueden
tener actividad inhibitoria contra microorganismos productores de ETA`S, entre
otros. Se entiende por ETA`s al conjunto de síntomas originados por la
ingestión de agua y/o alimentos que contengan agentes biológicos, que afectan
la salud del consumidor (FAO/OMS, 2002). Por ejemplo, los microorganismos
del género Salmonella, son causantes de graves problemas en la Salud
Pública.
El uso de los probióticos se sugiere como coadyuvantes dietéticos porque
benefician la fisiología del huésped al modular la inmunidad, así como mejorar
el balance nutricional y microbiano en el tracto gastrointestinal (TGI) (Basualdo,
2006).
Existen numerosos microorganismos con características probióticas, dentro de
los cuales se encuentran las BAL que, según el criterio taxonómico, pertenecen
a la familia Lactobacillaceae, phylum Firmicutes y comprenden 20 géneros:
Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus,
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Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Tetragenococcus,
Vagococcus y Weisella (Devlieghere et al, 2004).
Éstas también pueden clasificarse por un criterio taxonómico fenotípico que
incluye la descripción morfológica y fermentación de hidratos de carbono (Fox
et al, 2005). Se trata de bacilos largos, aunque pueden observarse bacilos
cortos y cocos que, generalmente, son inmóviles y Gram positivos.
Históricamente, las BAL se incorporaban a los alimentos para prolongar la
viabilidad de éstos e inhibir el crecimiento tanto de microorganismos
patógenos, como de los microorganismos que producen el deterioro de los
alimentos. Este efecto conservador de los productos alimenticios, se debe a la
producción por parte de las BAL de sustancias inhibidoras de crecimiento como
ácidos orgánicos, etanol, diacetilo, peróxido de hidrogeno (H2O2) y
bacteriocinas (Pineda et al., 2012). Todos ellos con propiedades bacteriolíticas
y/o bacteriostáticas que inhiben el crecimiento de otros organismos, entre ellos
los patógenos (Leroy y De Vuyst, 2004).
Las BAL representan un alto potencial biotecnológico, dada su presencia en
diversos procesos fermentativos de alimentos destinados al consumo humano
y animal. Estas bacterias no sólo contribuyen al desarrollo de las
características organolépticas de los alimentos, sino que generan ambientes
poco favorables para el desarrollo de microorganismos patógenos, debido a su
marcada capacidad antagonista. La mayor parte de las BAL obtienen la energía
a partir del metabolismo de azúcares por lo que sus hábitats están restringidos
a lugares donde estos están presentes (Agudelo, 2014). Dependiendo del tipo
de catabolismo que lleven a cabo, se puede dividir este grupo de bacterias en
dos subgrupos:
Homofermentativos: realizan glucólisis y originan ácido láctico como
producto final.
Heterofermentativos: utilizan la vía de la 6 fosfo-cetolasa, generando
etanol, acetato y CO2 (Parra, 2010).
Dentro de las BAL, el género Lactobacillus es uno de los más utilizados como
probiótico en la industria, presentando ciertas características propias como:
catalasa negativa y no reducen los nitratos. También presentan condiciones
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nutricionales y de crecimiento complejo como la utilización de aminoácidos,
péptidos, derivados de ácidos nucléicos, vitaminas, sales, ácidos grasos y
carbohidratos fermentables. Generalmente estos requerimientos están
presentes en un medio de cultivo como el MRS (Garcia Ibarra, 2007). En este
medio se observan colonias blancas mucosas características. Además se ha
comprobado que son beneficiosas para la salud tanto humana como animal.
Sin embargo, para utilizarlos como probióticos es necesario realizar una
adecuada evaluación de cepas de acuerdo con diferentes criterios de
selección, de forma tal que los microorganismos colonizadores lleguen en
estado viable y en cantidades suficientes una vez que han superado las
barreras ácida y biliar en el tracto digestivo. De ahí que, el éxito de un
probiótico depende en gran medida de realizar una buena selección de cepas
que posean la capacidad de sobrevivir y adherirse a la mucosa intestinal.
Por ello es importante investigar dentro de las prácticas de alimentación de los
animales, la incorporación de diferentes productos biológicos que contrarresten
los efectos negativos anteriormente citados.
En el presente trabajo se aislaron y seleccionaron cepas de Lactobacillus a
partir de la caracterización parcial de sus propiedades probióticas, mediante
pruebas de resistencia a pH ácido y sales biliares, entre otras.
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4. Materiales y métodos:
4.1 Muestreo:
El ensayo se realizó en el Laboratorio de Fisiología Celular del Departamento
de Fisiopatología de la Facultad de Cs. Veterinarias, UNCPBA. Se tomaron
muestras en un ensayo previo de 8 cerdos de una granja de la zona de la
ciudad de Tandil, mediante hisopados de distintas porciones del intestino
(ciego, colon e íleon). Cada hisopo se colocó en 5 ml de caldo MRS y se incubó
durante 48 hs a 37ºC en condiciones de microaerofilia. Posteriormente, se
tomaron alícuotas de cada uno de los cultivos y se conservaron en glicerol al
30% a -70ºC (congelado inicial) (Ávila et al, 2010).
4.2 Aislamiento y caracterización fenotípica:
A partir del congelado inicial, se tomó una ansada, se sembró en placas con
agar MRS y se incubaron a 37ºC durante 48 hs en condiciones de
microaerofilia. Posteriormente, se realizaron las siguientes pruebas bioquímicas
básicas:
Morfología de colonias.
Tinción de Gram y observación en microscopio óptico.
Prueba de la catalasa.
Capacidad fermentativa.
Reducción del nitrato.
4.2.1 Morfología de colonias:
Se observó la forma, el tamaño, la superficie y el borde de las colonias como
así también los distintos colores, texturas y consistencias. También, en esta
caracterización, se pudo apreciar el olor que contenían las placas al momento
de retirarlas de la lata.
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4.2.2 Tinción de Gram y observación en microscopio óptico:
Se tomó una ansada de una colonia, se la extendió en un cubreobjetos y se la
fijó en el mechero de Bunsen. Se le agregó el primer colorante, violeta de
Genciana, y se lo dejó actuar 1 minuto. Transcurrido el tiempo, se lavó con
abundante agua eliminando el exceso del colorante. Luego, se le agregó lugol
para fijar el colorante y se lo dejó 1 minuto, se lavó con agua y se le agregó
alcohol-acetona para realizar la decoloración, dejándolo actuar 20 segundos.
Se volvió a lavar con agua y por último, se colocó el segundo colorante
también nombrado como colorante de contraste, fucsina o safranina; se lo dejó
actuar 1 minuto y se lavó con abundante agua. Finalmente, se secó con calor.
Para la observación en el microscopio óptico, se colocó una gota de aceite de
inmersión y se realizó la observación con un aumento de 100 X.
Según las características de la pared, se pueden observar bacterias teñidas de
color violeta, indicando que son Gram positivas o teñidas de color fucsia
indicando que son Gram negativas (Mac Faddin, 1980).
4.2.3 Prueba de la catalasa:
Se tomó una colonia con un ansa en punta y se colocó en un portaobjeto de
vidrio limpio, al que previamente se le agregó una gota de agua oxigenada.
La formación de burbujas indica una prueba positiva, es decir que está
presente la enzima catalasa, mientras que la ausencia de formación de
burbujas indica que es negativa (Mac Faddin, 1980).
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4.2.4 Capacidad fermentativa:
Una ansada se colocó en un tubo con caldo MRS modificado sin citrato con
campana de Durham y se incubó a 37 ºC durante 48 hs en condiciones de
microaerofilia.
Si el microorganismo es homofermentativo, no se observa burbuja en la
campana, ya que solo produce ácido láctico. Si es heterofermentativo, produce
burbuja, ya que genera además dióxido de carbono y ácido acético (Mac
Faddin, 1980).
4.2.5 Reducción del nitrato:
Cada colonia se sembró por punción en agar nitrato-glucosa y se incubó a
37ºC durante 24 hs en condiciones de microaerofilia.
Si el medio cambia su color de verde a amarillo indica que utiliza glucosa.
Posteriormente, se añadieron los reactivos (α-naftilamina y ácido sulfanílico) y
se observó si varió la coloración de los mismos. La desnitrificación es un
proceso metabólico que usa el nitrato como aceptor terminal de electrones. Si
el microorganismo reduce el nitrato a nitrito, los reactivos adquieren una
coloración rojo intenso, de lo contrario no se observa cambio de color (Mac
Faddin, 1980).
4.3 Evaluación de pruebas que indicarían capacidad probiótica in vitro:
Para evaluar la capacidad probiótica se seleccionaron aquellas colonias que
presentaron características fenotípicas del género Lactobacillus. Cada una se
reactivó en 5 ml de caldo MRS a 37ºC, durante 48 hs, en condiciones de
microaerofilia, cultivo reactivado (CR).
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4.3.1 Crecimiento a diferentes temperaturas:
Se tomó una ansada del CR y se sembró en tubos con caldo MRS e incubó a
15ºC, 37ºC y 45ºC durante 24 hs en condiciones de microaerofilia.
Posteriormente, se evaluó la turbidez de cada tubo y se determinó viabilidad
sembrando una alícuota en agar MRS durante 48 hs, en condiciones de
microaerofilia (Rondón et al, 2008). Se utilizaron diferentes temperaturas para
evaluar la viabilidad bacteriana a temperatura óptima y a temperaturas
extremas.
4.3.2 Crecimiento a distintos pH:
Se tomó una ansada de cada CR, se colocó en caldo MRS ajustado con HCl a
pH 2 y pH 4 e incubó a 37ºC durante 24 hs en condiciones de microaerofilia.
Posteriormente, se observó si los tubos presentaban turbidez y se determinó la
viabilidad mediante siembra en placa en agar MRS a 37ºC, durante 48, hs en
condiciones de microaerofilia (Rondón et al, 2008).
4.3.3 Tolerancia a sales biliares:
Se tomó una ansada del CR y se la colocó en tubos con caldo MRS con una
concentración de sales biliares al 0,15%. Estos tubos se incubaron a 37ºC
durante 24 hs en condiciones de microaerofilia. Posteriormente, se observó
turbidez y se determinó la viabilidad de las colonias, sembrando una alícuota
en placa con agar MRS incubando 48 hs a 37ºC en condiciones de
microaerofilia (Rondón et al, 2008).
4.3.4 Actividad antimicrobiana contra patógenos productores de ETA’s:
Cada cepa del género Lactobacillus se enfrentó con un cultivo puro de una
cepa de referencia, Salmonella Enteritidis, aportada gentilmente por el
Laboratorio de Bacteriología de INTA EEA Balcarce. El ensayo se realizó por
duplicado.
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La cepa de S. Enteritidis se suspendió en una solución salina con una turbidez
de 1 de la escala de Mc Farland. Se sembró masivamente en agar nutritivo y se
realizaron los cilindros en el agar solidificado.
Las cepas de Lactobacillus se reactivaron en caldo MRS a 37ºC durante 48 hs
en condiciones de microaerofilia (cultivo bacteriano: CB). Una alícuota del CB,
se centrifugó a 10.000 rpm durante 15 minutos para obtener el resuspendido
libre de células (RLC). Posteriormente, se sembró una alícuota de 100 µl del
CB y del RLC en cada cilindro por duplicado. Las placas se incubaron a 37ºC
durante 24 hs en condiciones de aerobiosis.
La presencia de halos indica actividad antimicrobiana contra el patógeno
empleado (Jurado, et al, 2009).
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5 Resultados y discusión:
5.1. Aislamiento de BAL del tracto gastrointestinal de cerdos:
Todos los hisopados de diferentes porciones de intestino (ciego, colon e íleon)
crecieron tanto en caldo, observándose turbidez, como en placa.
5.2. Caracterización fenotípica de las colonias individuales:
Las muestras de ciego, colon e íleon presentaron diferente morfología de
colonias. Se observaron colonias grandes y pequeñas, con distintas texturas,
mucosas, de color blanco (mayor tamaño) y transparentes (menor tamaño). En
algunos casos se observó una pátina en la placa.
En cuanto a la observación al microscopio óptico, se pudieron observar
distintas morfologías bacterianas: cocos, cocobacilos y bacilos, tanto Gram +
como Gram – (Tabla 1).
Comparando los resultados obtenidos con los expuestos por Ávila, en su
trabajo de capacidad probiótica de cepas del género Lactobacillus extraídas del
tracto intestinal de animales de granja, podemos decir que obtuvieron, en su
mayoría, morfologías del tipo bacilo a diferencia con nuestros resultados donde
también se obtuvieron cocos (Ávila et al., 2010).
En el trabajo de Tesis de Vélez Zea, existen similitudes en los resultados, ya
que además se encontraron bacterias con morfología del tipo bacilos y cocos
bacilos (Vélez Zea, 2014).
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Tabla 1: Caracterización fenotípica de las colonias
Animal Gram Morfología de las colonias encontradas en la placa
Morfología al microscopio
1 (cie) + Colonias blancas grandes mucosas y colonias chiquitas transparentes.
Cocos en racimos G+ y bacilos G-.
1 (col) Crecimiento exagerado, colonias transparentes, levaduras.
No se pudo realizar.
1 (ile) + Crecimiento exagerado, colonias transparentes.
Cocobacilos y bacilos.
2 (cie) + Crecimiento exagerado, colonias transparentes.
Cocobacilos, cocos y bacilos.
2 (col) Crecimiento exagerado, colonias transparentes.
No se pudo realizar.
2 (ile) Colonias blancas mucosas. No se pudo realizar, todas las colonias eran catalasa +.
3 (cie) Descarte. Descarte.
3 (col) + Morfología variada. Bacilos G+ y G-.
3 (col) - Morfología variada. Bacilos largos.
3 (ile) Colonias transparentes. No se pudo realizar.
4 (cie) + Colonias transparentes. Bacilos cortos en abundancia.
4 (col) + Colonias transparentes. Bacilos cortos en abundancia G+ y G-.
4 (col) + Colonias blancas mucosas, hongos y patina.
Cocobacilos.
4 (ile) + Cocobacilos G+ y G-.
5 (cie) + Colonias pequeñas, homogénea, crecimiento masivo, no hay patina.
Cocos.
5 (col) + Pocas colonias medianas blancas mucosas, patina muy transparente.
Cocobacilos.
6 (cie) + Colonias blancas mucosas chicas, colonias transparentes/translucidas,
levadura
Cocobacilo G+ y pocos G-.
7 (cie) + Mucho crecimiento, colonias blancas mucosas medianas, colonias
translucidas.
Cocos.
7 (col) + Cocos.
7 (col) + Menos crecimiento, colonias blancas mucosas medianas, colonias
translucidas
Bacilos G+ y G-.
7 (ile) + Cocobacilos.
8 (cie) + Mucho crecimiento, colonias pequeñas blancas mucosas y patina translucida.
Cocos G+ y bacilos G-.
8 (col) - Menor crecimiento, colonias pequeñas blancas mucosas.
Cocos.
Cie: ciego; Col: colon; Ile: íleon; G: Gram.
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5.3 Pruebas bioquímicas básicas de las colonias individuales:
Se seleccionaron 6 colonias con características del género Lactobacillus para
realizar las pruebas bioquímicas básicas.
Todas fueron Gram positivas, catalasa negativa y nitrato negativo, mientras que
una sola colonia fue heterofermentativa (Tabla 2).
Estos resultados son similares a los obtenidos en los trabajos de Vélez Zea,
donde todas las cepas seleccionadas fueron catalasa negativas, y no se
observó la producción de burbuja en presencia del peróxido de hidrogeno,
debido a que las BAL del género Lactobacillus carecen de la enzima (Vélez
Zea, 2014).
En cuanto a capacidad fermentativa, en el trabajo de Ávila se observaron
coincidencias con los resultados de nuestro trabajo de Tesis, donde las
bacterias estudiadas tenían la capacidad de fermentar varios hidratos de
carbono como así también algunas bacterias sólo fermentaban un solo tipo de
carbohidratos (Ávila et al, 2010). Sin embargo el trabajo de Zamudio, reportó
diferencias ya que todas las bacterias eran heterofermentativas, mientras que
en nuestro trabajo solamente una presentó esa característica (Zamudio et al,
2003).
En cuanto a la prueba de nitrato, Vélez Zea, informó cepas nitrato positivo, a
diferencia de nuestro trabajo donde no se encontró ninguna cepa con esa
característica (Vélez Zea, 2014).
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Tabla 2: Pruebas bioquímicas básicas de colonias seleccionadas.
Animal Gram Catalasa Nitrato Capacidad fermentativa
4 (cie) + - - Heterofermentativa
4 (cie) + - - Homofermentativa
4 (col) + - - Homofermentativa
5 (col) + - - Homofermentativa
6 (col) + - - Homofermentativa
7 (cie) + - - Homofermentativa
Cie: ciego; Col: colon; Ile: íleon.
5.4 Evaluación de la capacidad probiótica in vitro:
Se evaluó el potencial probiótico de las 6 colonias mencionadas anteriormente.
Se observó que, si bien las pruebas se realizaron in vitro, se trabajó en
contextos que pretenden simular las condiciones gástricas.
5.4.1 Crecimiento a diferentes temperaturas:
A las 24 hs se observaron resultados similares en las temperaturas extremas
(15ºC y 45ºC), la mitad de las muestras no creció y el resto presentaron
colonias pequeñas; mientras que a 37ºC se observó mayor crecimiento.
A las 48 hs todas las muestras presentaron crecimiento a las tres temperaturas,
observándose colonias blancas y transparentes de tamaño pequeño. Algunas
muestras presentaron contaminación y/o pátina (Tabla 3).
En el análisis de Ávila se pudieron realizar comparaciones ya que se trabajaron
con las mismas temperaturas que en nuestro trabajo de Tesis, obteniéndose
como resultado que el máximo crecimiento fue a temperatura extrema de 45ºC
en comparación con el nuestro que fue a 37ºC. Se observó una tendencia a
crecer más a medida que se incrementa la temperatura (Ávila et al., 2010).
En cambio, Vélez Zea demostró que, trabajando con temperaturas similares a
nuestro trabajo de Tesis como 12ºC, 37ºC y 40ºC, también presentaron
crecimiento, siendo la mayoría a 12ºC y 37ºC y, sólo algunas crecieron a
temperaturas extremas como 40ºC.
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Tabla 3: Crecimiento a diferentes temperaturas (15ºC, 37ºC y 45ºC) en caldo y agar MRS durante 24 y 48 horas.
Cie:ciego; Col:colon; Ile:íleon; S/:sin; -:muestra contaminada.
Animal 24 horas 48 horas
15ºC 37ºC 45ºC 15ºC 37ºC 45ºC 4 (cie) S/ crecimiento Colonias
pequeñas S/ crecimiento Pátina Pátina Pátina
4 (col) S/ crecimiento No creció S/ crecimiento Pocas colonias pequeñas
transparentes
Colonias pequeñas blancas
Colonias medianas y
blancas
4 (col) S/ crecimiento No creció S/ crecimiento Colonias blancas pequeñas
Colonias pequeñas blancas
Colonias blancas pequeñas
5 (col) Colonias pequeñas y transparentes
Colonias blancas
Colonias blancas y pequeñas
Colonias blancas pequeñas
Colonias blancas patina
transparentes
Colonias blancas pequeñas
6 (cie) Colonias pequeñas blancas
Colonias pequeñas blancas
Colonias blancas
Colonias blancas pequeñas
Colonias pequeñas blancas
Pátina
7 (col) Colonias blancas grandes y mucho
crecimiento
- Colonias blancas y
crecimiento masivo.
- - -
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5.4.2 Crecimiento a distintos pH:
A las 24 hs de incubación a pH 2, se observó crecimiento en dos muestras
solamente, mientras que a pH 4 todas crecieron. A las 48 hs se registró mayor
desarrollo en ambos pH (Tabla 4).
Los resultados obtenidos coinciden con el trabajo de Ávila, observándose que,
al incrementar las condiciones ácidas, el crecimiento se reduce
significativamente (Ávila et al, 2010).
En el trabajo de tesis de Vélez Zea, los resultados obtenidos fueron similares a
nuestro trabajo de investigación. Comprobando que un microorganismo para
ser probiótico, debe tener una viabilidad alta a las concentraciones ácidas del
estómago (Vélez Zea, 2014).
En el trabajo de Jurado se puede observar que, exponiendo las bacterias a pH
extremos como 2, 3 y 4 similares a los evaluados en este trabajo, no hubo
crecimiento alguno (Jurado et al, 2009).
Tabla 4: crecimiento a distintos pH
Animal 24 hs. pH2
pH4
48 hs. pH2
pH4
4 (cie) s/ crecimiento Colonias blancas
pequeñas
Colonias blancas medianas
Colonias pequeñas blancas
4(cie) s/ crecimiento Colonias muy pequeñas
s/ crecimiento Colonias grandes blancas
4(col) s/ crecimiento Colonias pequeñas
transparentes Y blancas
Colonias blancas medianas
Colonias pequeñas blancas
5(col) s/ crecimiento Colonias transparentes y
blancas
Colonias blancas
Patina y colonias
pequeñas blancas
6(cie) Colonias blancas
pequeñas
Colonias blancas
pequeñas
Colonias blancas
Colonias pequeñas blancas
7(col) Colonias blancas grandes
- - -
Cie: ciego; Col: colon; Ile: íleon; S/: sin; - : muestra contaminada.
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5.4.3 Tolerancia a sales biliares: El 50 % de las muestras no presentó crecimiento a las 24 hs de incubación,
mientras que la mayoría lo desarrolló a las 48 hs (Tabla 4).
Los resultados de este trabajo de Tesis son similares a los reportados por
Ávila, quienes obtuvieron crecimiento de Lactobacillus en las mismas
condiciones utilizadas en el presente ensayo (Ávila et al, 2010).
En 2003 Brizuela, determinó la tolerancia de los probióticos que crecen en
presencia de altas concentraciones de bilis (0,15%), mayores a las que se
pueden encontrar en el intestino (Brizuela, 2003). Esta característica se puede
correlacionar con la supervivencia in vivo en el tracto gastrointestinal, después
de permanecer durante 4 horas en caldo MRS, que es el tiempo más extremo
de permanencia en dicho sistema, ya que en condiciones normales el tiempo
de permanencia es de 2 a 4 horas.
En el trabajo de Jurado, se analizaron concentraciones superiores a las de
nuestro estudio (10%), observándose que el 50 % de las bacterias crecieron, al
igual que en nuestro trabajo de Tesis (Jurado et al, 2009).
Tabla 5: Tolerancia a sales biliares.
Animal 24 horas 48 horas
4 (cie) No creció Pátina
4 (cie) No creció Colonias pequeñas blancas
4 (col) No creció Colonias pequeñas blancas
5 (col) Colonias blancas y
transparentes pequeñas
Colonias pequeñas blancas
6 (cie) Colonias pequeñas blancas Colonias pequeñas blancas
7 (col) - -
Cie: ciego; Col: colon; Ile: íleon; -: muestra contaminada.
19
5.5 Actividad antimicrobiana contra patógenos productores de ETA’s:
En base a las características fenotípicas y las pruebas probióticas in vitro, se
seleccionó la cepa 6 (cie) para evaluar su capacidad inhibitoria contra
patógenos productores de ETA`s como Salmonella Enteritidis.
Tanto el cultivo bacteriano (CB) como el resuspendido libre de células (RLC) de
la colonia seleccionada, presentaron actividad inhibitoria contra patógenos
productores de ETA´s.
Los halos promedio de inhibición para el CB fueron de 1,55 cm y para el RLC
fueron de 1,35 cm.
Estos datos coinciden con los reportados por Sánchez y Tromps, quienes
observaron que cepas de Lactobacillus aisladas presentaron halos de inhibición
contra Salmonella typhimirium (Sánchez y Tromps, 2014).
También, los resultados coinciden con lo expuesto por Vélez Zea, donde la
actividad bactericida se detectó con la formación de halos de inhibición de 7
mm aproximadamente, representada por zonas claras sin crecimiento de
colonias de Salmonella Thipymurium (Vélez Zea, 2014).
Las investigaciones realizadas por Casey que aislaron BAL del tracto
gastrointestinal de origen porcino observaron una inhibición significativa del
crecimiento de Salmonella Thipymurium, al igual que este trabajo de Tesis
(Casey et al, 2007)
20
6. Conclusiones:
En este trabajo de Tesis se caracterizaron fenotípicamente bacterias del
género Lactobacillus, provenientes del tracto gastrointestinal de cerdos de la
zona de Tandil, mediante pruebas bioquímicas básicas.
Se aisló una cepa con características fenotípicas de este género con posible
potencial probiótico. Ya que se observó la capacidad para sobrevivir en
condiciones gástricas in vitro como pH, sales biliares y temperaturas extremas.
Además, al enfrentar el cultivo bacteriano contra una bacteria productora de
ETA´s (Salmonella Enteritidis), la cepa presentó actividad inhibitoria.
Considerando la información obtenida, esta cepa podría ser evaluada
experimentalmente en lechones para determinar su potencial en la mejora
productiva porcina sin riesgos para el consumidor.
21
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