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ÁREA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLOPROGRAMA ACADÉMICO DE QUÍMICA

ESPECIALIDAD TECNOLOGIA AMBIENTAL

GRUPO

QU- 304

MATERIA

MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

TITULO

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

DE LA MATRIZ AMBIENTAL: AGUA

ASESORA

Dr. ROSA RICO MATA

DATOS DE IDENTIFICACIÓN DE LOS ANALISTASFecha de inicio del análisis: 1 de Julio del 2015Fecha de termino: 9 de Julio de 2015

Nombre Cargo María Guadalupe Regina Salas Padilla Responsable

Víctor Manuel Guadalupe Piña Cardona Administrador

Andrés Ramírez Sánchez Laboratorista 1

Noé Miguel Ángel Pedroza Díaz Laboratorista 2

Jorge Rentería Aldana Laboratorista 3

GENERACIÓN: 2014-2016

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DATOS DEL SITIO EN ESTUDIO1.- Breve descripción del estatus ambiental del sitio de estudio: La muestra para el análisis microbiológico se tomó de la planta tratadora de aguas residuales de la Universidad Tecnológica de León, en la cual llegan descargas de aguas a diario, las mismas que después del proceso en el que se someten son utilizadas para las áreas verdes y para el drenaje de la misma universidad, de esta manera haciendo de esta una simbiosis ambiental.

SITIO DE MUESTREO

Nombre Ubicación /coordenadas GPS

Imagen de mapa satelital

Planta Tratadora de agua residual de la

UTL

21.062997,-101.582700.

2. Evidencia fotográfica del sitioFecha:30 de Junio del 2015Hora:10:40 a.m.

Fecha:30 de Junio del 2015Hora:10:45 a.m.

DATOS DE LAS MUESTRAS A ANALIZAR

1. Identificación

Matriz ambiental:Agua Hora de toma de muestra:10:40 a.m.

Hora de siembra:11:00 a.m.

Punto de Muestreo (ubicación /coordenadas GPS): Tiempo de exposición (aplica solo para muestra de aire)

Nombre del/ los analistas que tomaron la muestra:Noé Miguel Ángel Pedroza Díaz

Nombre del/ los analistas que sembró la muestra:Andrés Ramírez Sánchez

2.Parámetros Fisicoquímicos

Color:Café Temperatura (oC) ambiental: 20 º CpH:5

Olor: Materia orgánica en descomposición y heces fecales.

Describir condiciones climatológicas:Soleado

3. Evidencia fotográfica del sitio de toma de muestra

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

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1. Justificación del proceso para la identificación bacterianaLa identificación de una bacteria que interviene en un ciclo biogeoquímico es de suma importancia ya que se estudia su proceso metabólico, que nos permite conocer la manera en la que asimila los nutrientes proporcionados por el micromedio ambiente en donde se encuentre, sobre todo a conocer que mecanismos metabólicos utiliza para degradar o transformar sustancias orgánicas o inorgánicas que se encuentran disueltas en el agua y cuya función del microorganismo es retirarlas de dicha matriz como un proceso de depuración de agua, y por lo tanto se debe de aislar en un medio selectivo para poder hacer las pruebas correspondientes para su identificación, para después poder implementar el microorganismo en un proceso de Biorremediación si es que sus propiedades metabólicas pudiesen favorecer al mismo.

2. Dos medios de siembra (Nombre y Composición)

Agar Triple Azúcar de Hierro Agar Kliger de Hierro

Morfología Colonial (Medio 1) Morfología Colonial (Medio 2)Descripción

Imagen Imagen

1.- Extracto de Carne 7.- Sulfato de Hierro y amonio

2.- Pluripeptona 8.- Tiosulfato de Sodio

3.- Cloruro de Sodio 9.- Rojo de Fenol

4.- Lactosa 10.-Agar

5.- Sacarosa

1.- Peptona de Carne 8.-Rojo de Fenol

2.- Cloruro de Sodio 9.-Agar

3.-Lactosa

4.-Tripteina

5.-Glucosa

Crecimiento de colonias de una forma puntiforme, con bordes ondulados, y una superficie convexa lisa y cremosa.

Descripción

Crecimiento de colonias de una forma puntiforme, con bordes ondulados, y una superficie convexa lisa y cremosa.

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3. Dos Medios selectivos de resiembra (Nombre y composición)

Agar Triple Azúcar de Hierro Agar Mac Conkey

Morfología Colonial (Medio 1) Morfología Colonial (Medio 2)Descripción

Colonias incoloras con bordes regulares de 1,5 mm aproximadamente de Shigella Flexneri

Descripción

Colonias incoloras con bordes regulares de 1,5 mm aproximadamente, regreso en Shigella flexneri

Imagen Imagen

1.- Peptona

2.- Pluripeptona

3.-Lactosa

4.- Mezcla de sales biliares

5.- Cloruro de Sodio

6.-Agar

1.- Extracto de Carne 7.- Sulfato de Hierro y amonio

2.- Pluripeptona 8.- Tiosulfato de Sodio

3.- Cloruro de Sodio 9.- Rojo de Fenol

4.- Lactosa 10.-Agar

5.- Sacarosa

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4. Procedimiento de Aislamiento(describir detalladamente la cantidad de materiales y los pasos a seguir)

Materiales y equipo 1 parrilla de calentamiento 1 agitador de vidrio 2 matraces Erlenmeyer 250 mL 2 vasos de precipitado 250 mL 3 cajas Petri

Reactivos y medios de cultivo Agar triple azúcar de hierro

Preparación de medios de cultivo:

Pesar 6.25 g de Agar Triple Azúcar de Hierro y disolverlo en 100 mL de agua destilada y calentarlo durante 1 minuto o hasta que el medio se disuelva completamente en el agua, después llevar a esterilizar durante 15 minutos a 120 º C, en condiciones estériles distribuir el medio en las placas Petri (Aproximadamente 33. 33 mL en cada caja), se necesitan 3 cajas; una para la siembra, otra para la resiembra y una tercera de control. Una vez que se repartió el medio se dejan solidificar.

Pasos para el aislamiento del microorganismos (siembra, selección de la colonia y resiembra):

Siembra: Una vez que se distribuyó el medio en las placas, se toma la muestra de agua de la planta de tratamiento de aguas residuales de la UTL ya previamente recolectada, con ayuda del mechero se esteriliza el asa metálica de nicromo y se toma un poco de la muestra, después esta se distribuye en el medio por el método de estriado, como se muestra en las siguientes imágenes y se pone a incubar a 37 ° C de 18 a 24 horas.

Selección de la colonia: Después del periodo de incubación se observa el crecimiento que hubo en el mismo y verificar que la morfología de las colonias sean las que se pretenden identificar puesto que en un medio de cultivo pueden crecer diferentes tipos de bacterias, ya que se verificó que la colonia que se busca identificar se elige la que haya quedado aislada de las demás, de esta manera lograr un cultivo selectivo para su resiembra.

Resiembra: Se hace una división en la placa seleccionada para la resiembra, esta se marca por debajo de la misma con ayuda de un marcador, para poder hacer dos estriados y aislar dos colonias previamente seleccionadas, cada una en su respectiva zona de la caja Petri con su crecimiento, con ayuda del mechero se esteriliza el asa y se toman dos colonias y se siembran mediante el método ya mencionado, se incuban a 37 ° de 18 a 24 horas.

2 charolas de pesado

1 espátula

Agua destilada

Mecheros Bunsen

Asas metálicas

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5. Esquema del Perfil bioquímico (metabólico ) para la identificación del microorganismo seleccionado

Tinción de Gram

(-)

RESULTADOS DEL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

Prueba de Motilidad

Cápsula

Catalasa

Degradación de la Caseína (-)

Producción de Indol (-)

Prueba Rojo de Metilo (-)

Vogues Proskauer (-)

Producción de Gas (-)

Producción de ácido Sulfhídrico (-)

Degradación de Citratos (-)

(+))

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1. EVIDENCIA FOTOGRAFICA DEL CULTIVO DE LA MUESTRA (SIEMBRA)

2. MORFOLOGÍA COLONIAL OBSERVADATipo de colonia 1: Descripción FOTO 1

Tipo de colonia 2: Descripción FOTO 2

Tipo de colonia 3: Descripción FOTO 3

Crecimiento abundante en el medio de cultivo, las colonias son incoloras y con una morfología de bordes regulares y con una elevación convexa.

La colonia seleccionada tiene un borde ondulante, es incolora y tiene una superficie opaca.

.

Su transmisión de luz es opaca y tiene una consistencia cremosa.

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3. EVIDENCIA FOTOGRAFICA DEL CULTIVO PURO ( RESIEMBRA)FOTO 1 FOTO2

4. MORFOLOGIA COLONIAL OBSERVADA

Descripción

La resiembra resultó muy favorable, esto quiere decir que el medio de cultivo seleccionado para la resiembra si fue el correcto para la bacteria que se deseaba aislar.En la foto 1 se puede observar las colonias aisladas en las dos partes del medio, se puede identificar claramente el estriado que se realizó de una manera correcta, las colonias están un poco pequeñas porque aún les falta crecimiento, esta foto se tomó después de 12 horas de incubación.

En la foto 2 se puede observar que las colonias que ya crecieron un poco más, pues el estriado se alcanza a distinguir claramente.

La foto 3 se tomó después de 24 horas de incubación que necesitan este tipo de bacterias para su crecimiento por lo tanto las bacterias aisladas se alcanzan a ver perfectamente.

FOTO 1

FOTO 2

FOTO 3

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5. EVIDENCIA FOTOGRÁFICA DEL RESULTADO DEL PERFIL BIOQUÍMICO

Nombre de la prueba

Medio de cultivo utilizado

Resultado obtenido (positivo/negativo) Evidencia fotográfica

1. Tinción de Gram Negativo

Fundamento de la prueba

Es un tipo de tinción diferencial empleada en la microbiología para la visualización de bacterias. Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre daño de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el escape del colorante. Una posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente:

El colorante básico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos gram positivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las células gram negativas, los lípidos de la pared (más abundantes que en las células gram positivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo.

2. Prueba de Motilidad

1.- Agar SIM Positivo en el área anaerobia

Fundamento de la prueba

La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde más allá de la línea de inoculación. Esto se debe a la presencia de flagelos que le permiten desplazarse por el medio en busca de alimento. Puede ser en medio aeróbico o anaeróbico.

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3.- Prueba de Cápsula Negativo

La cápsula es una cubierta de grosor variable formada habitualmente por unidades de polisacáridos, proteínas o ambos. Si está bien estructurada y se encuentra bien adherida a la célula, se le denomina cápsula; si por el contrario, tiene estructura mal definida y su adhesión es débil, se le conoce como glicocálix. De acuerdo a su estructura química, puede ser flexible o rígida. La rigidez le confiere la característica de una matriz impermeable. Determina la adhesión a superficies (biopelículas), constituye una barrera de protección contra la fagocitosis y los anticuerpos e impide la desecación y la acción de otros agentes.

4.- Prueba de Catalasa 1.- Agua oxigenada Positivo

Fundamento de la prueba

La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias. Descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indica que el microorganismo posee dicha enzima.

H2O2 + catalasa -------------------H2O + O2

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5.- Degradación de la caseína

1.- Agar leche descremada Negativo

Fundamento de la prueba

Las proteasas son excretadas al medio para la degradación de proteínas, la caseína es la proteína de la leche que le da el color blanco, cuando la caseína es hidrolizada por las proteasas o enzimas que degradan esta proteína, desaparecerá el color blanco alrededor del crecimiento bacteriano.

6.- Producción de Indol 1.- Agua de Peptona Negativo

Fundamento de la prueba

El indol es un compuesto que se genera mediante la desaminación reductiva del triptófano y esta reacción es llevada a cabo por algunas bacterias que poseen las enzimas denominadas en su conjunto triptofanasas. Para detectar la producción de indol se utiliza el medio Caldo triptófano y la lectura de la prueba se realiza con el reactivo de Kovac’s, con el que el indol producido reacciona generando una coloración rosa intensa.

C11H12N2O2+ triptofanasa ---------- C8H7N + NH3 + C3H4O3 + energía

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7.-Prueba RM-VP 1.-Caldo RN-VP Negativo

Fundamento de la prueba

La prueba de rojo de metilo detecta la fermentación acido-mixta, donde se acumulan acido relativamente fuertes (acético, fórmico, láctico, etc.) bajando así el pH del medio hasta 4-5. Dicho cambio de pH se detecta añadiendo un indicador (rojo de metilo) al medio de cultivo

C6H12O6 + fermentación + rojo de metilo ------ ácidos + cambio de color

8.- Vogues Proskauer

1.- Caldo RM-VP

Negativo

Fundamento de la prueba

Detecta la fermentación butanodiólica. En esta fermentación se producen menor cantidad de ácidos que en la fermentación ácido-mixta, y una gran cantidad de butanodiol. Mediante un reactivo (alfa-naftol y KOH) se detecta la presencia de un precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o acetoÍna). La acetoÍna en presencia de oxigeno se oxida a diacetilo. El diacetilo origina una coloración roja al reaccionar con los restos guanidÍnicos de algunos aminoácidos de la peptona del medio

C6H12O6 ---->C4H10O2 + C10H8O + KOH ----> C3H6O + O2 -- C4H6O2 + aminoácidos -- coloración roja

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9.- Producción de gas CO2 y H2

1.- Caldo Lactosado

Negativo

Fundamento de la prueba

El extracto de carne y la peptona son la fuente de carbono y nitrógeno mientras que la lactosa es el hidrato de carbono a fermentable. Por la fermentación de la lactosa se produce ácido y gas (CO2 y H2), el cual se evidencia al utilizar campanas Durham).

C6H12O6 C3H4O3 + NADH + H+ C3H3O3 + CO2

10.- Producción de Ácido Sulfhídrico

1.- Agar Kliger de Hierro Negativa

Fundamento de la pruebaEn el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance asmótico. Por fermentación de azucares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio acido. El Tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrogeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionado el típico sulfuro de hierro de color negro.

Na2S2O3 + Tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa H2S + FeSO4 (sal de hierro) Fe2S3Azucares + rojo de fenol Ácidos + color amarillo

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11.- Prueba de degradación de Citrato.

1.- Agar Citrato de Simmons Negativo

Fundamento de la prueba

En esta prueba se determina si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de Carbono para su metabolismo y crecimiento. El medio de cultivo Citrato de Simmons incluye; citrato de Sodio, un anión como única fuente de Carbono y Fosfato de Amonio como fuente de Nitrógeno. La citrato permeasa permiten el transporte de citrato al interior de las células y la enzima citrasa convierte el citrato en ácido pirúvico y CO2. El CO2 liberado se combina con el sodio y agua y forman carbonato de sodio que es alcalino cambiando el bromotimol de verde a azul intenso.

Citrato ---------------- Oxalacetato + Acetato

Piruvato + Acetato Reacción en pH ácido

2 Piruvato ----------------- Acetato + CO2 + Lactacto

2 Piruvato -- ---------------- Acetoína + 2 CO2

Reacción en pH básico

Citrato ------------------- CO2 + Ácido Fórmico + 2 Ácido Acético

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IDENTIFICACIÓN DEL MICROORGANISMO AMBIENTAL

EN LA MATRIZ DE ESTUDIO: AGUA

1.- Nombre científico del microorganismo identificado de acuerdo a los resultados del perfil bioquímico planteado ( genero y especie)

Shigella flexneri

2. Taxonomía del o los microorganismo identificadosSon Bacterias Anaerobias y Anaerobias facultativas.

Dominio: Bacteria Filo: Proteobacteria Clase: Grammproteobacteria Orden: Enterobacteriales

3. Características generales

Shigella es un género bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, integrado por bacterias de forma bacilar, no esporulados, inmóviles, pero animados de movimiento pendular (oscilación) in situ.

Son gram negativos, aerobios-anaerobios facultativos. Citocromo-oxidasa negativos. Fermentan la glucosa sin producción de gas; no obstante, se han encontrado algunos biotipos que producen gas de la glucosa. No descarboxilan la lisina. No fermentan la lactosa. No utilizan el citrato como única fuente de carbono. No crecen en el medio cianuro potásico. Su actividad bioquímica es muy reducida.

4. Conclusión parcial sobre las interacciones bacterianas en la matriz estudiada y la importancia de la microbiología en el área ambiental

El perfil bioquímico de la bacteria que fue aislada de la muestra de la planta tratadora de aguas residuales de la Universidad Tecnológica de León UTL, corresponde a una bacteria patógena (Shigella Flexneri), esta es una entero bacteria Gram negativa, no esporulada, sin cápsula en su estructura celular, tiene una baja actividad bioquímica,. Sus enzimas son muy específicas, pues bajo esta serie de pruebas sólo fue identificada la catalasa pues pudo descomponer el peróxido en agua más oxígeno, no hacen fermentaciones, algunas de ellas la de la lactosa, y la ácido-mixta, motivo por el cual las pruebas de RM-VP resultaron negativas, por otro lado tampoco ocupa el citrato como única fuente de carbono para su crecimiento pues sólo creció en el agar TSI el cual fue el seleccionado para su aislamiento.

Familia: Enterobacteriaceae Género: Shigella Especie: S.flexneri