ศักยภาพของนํ ามันกานพลูในการ...
TRANSCRIPT
KKU Res J. 2011; 16(5) 504
KKU Res J. 2011; 16(5): 504-516 http://resjournal.kku.ac.th
ศกยภาพของน ามนกานพลในการตานออกซเดชนในหลอดทดลองและปจจยท!มผลตอการเกบกกน ามนกานพลในอนภาคไขมนแขง Potential of Clove Oil on In Vitro Antioxidant Activity
and Factors Affecting Oil Encapsulation Efficiency in
Solid Lipid Particles พนตตา สธนะกล และวชร คณกตต*
Panitta Satthanakul and Watcharee Khunkitti*
คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน
* Correspondent author: [email protected]
Received June 9, 2010 Accepted May 1, 2011
บทคดยอ อนมลอสระอาจทาใหเกดการเส�อมสลายของคอลลาเจนและอลาสตน ซ� งเปนสาเหตหน� งท�กอใหเกดร$ วรอยกอนวย น$ ามนหอมระเหยกานพลมฤทธ* ตานอนมลอสระสง ซ� งนาจะมศกยภาพทางเคร� องสาอางสาหรบลดร$วรอย งานวจยน$ มวตถประสงคเพ�อศกษาฤทธ* ตานอนมลอสระของน$ ามนกานพลโดยวธ thiobarbituric acid reactive substances assay (TBARs) และวธ 2,2-diphenyl-l-1-
picrylhydrazyl (DPPH) test ศกษาคณลกษณะของระบบนาสงชนดอนภาคไขมนแขงของน$ามนกานพลโดยวธ solvent emulsification diffusion method และออกแบบการทดลองแบบ 23 full
factorial design โดยทาการศกษาอทธพลของปจจย 3 ชนด คอ tween 80, benzyl alcohol และ polyvinyl alcohol ตอคณลกษณะของอนภาคไขมนแขงท�เกบกกน$ามนกานพล ไดแก ขนาดอนภาค
zeta potential และเปอรเซนตการเกบกกน$ามน จากการศกษาพบวาในจานวน 8 ตารบท�ศกษา อนภาคไขมนแขงสามารถเกบกกน$ามนกานพลไดสงท�สดคอ รอยละ 96.6 โดยปรมาณ benzyl alcohol และ Tween 80 เปนปจจยหลกท�มผลตอคาขนาดอนภาคไขมนแขง และคา zeta potential อยางมนยสาคญ
Abstract
Free radicals may cause dermal elastin and collagen damages leading to early
wrinkle formation. Clove oil possesses a powerful antioxidant activity which might have a
potential for anti-wrinkle cosmetics. The aims of this study were to investigate on
antioxidant activity of clove oil by thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay
and 2,2-diphenyl-l-1-picrylhydrazyl (DPPH) test and study the characteristics of clove oil
solid lipid particle (SLP) delivery system prepared by solvent emulsification diffusion
method using 23 Full factorial design. The effects of 3 factors which were tween 80, benzyl
alcohol and polyvinyl alcohol on characteristics of SLP including, particle size, Zeta
potential and percent oil entrapment were investigated. Of the 8 tests formula, the maximal
KKU Res J. 2011; 16(5) 505
1. บทนา
อนมลอสระเปนสาเหตท� กอใหเกดร$ วรอยกอนวย โดยอนมลอสระสามารถทาลายเซลลผวหนงทาใหเกดการเส�อมสลายของคอลลาเจนและอลาสตน สงผลใหผวหนงเกบกกความชมช$นไดลดลง ทาใหผวแหงและเกดร$ วรอยไดงาย (1) ในปจจบนมการคนควาวจยเพ�อหาสารชะลอความแกจากธรรมชาต มรายงานวาน$ ามนหอมระเหยจากพชหลายชนด มฤทธ* ตานอนมล อสระท�สามารถนามาใชชะลอความแกและลดเลอนร$วรอยได (2) โดยสารสกดจากพชเหลาน$ สามารถชะลอกระบวนการออกซเดชนอนเปนสาเหตของการเกดร$วรอย (2)
กานพล (Syzygium aromaticum, syn.,
Eugenia aromaticum, Eugenia caryophyllata)
เปนพชในวงศ Myrtaceae กานพลใชในทางอายรเวชและแพทยแผนจน เพ�อใชขบลม กระตนการเคล�อนไหวของทางเดนอาหาร นอกจากน$น$ ามนหอมระเหยกานพลยงใชในการรกษาโรคในทางทนตกรรม ในทางเคร�องสาอางยงมรายงานการใชน$ ามนกานพลในการรกษาสว หด แผลเปน ตลอดจนการใชในอตสาหกรรมการผลตน$ าหอมและสารแตงกล�น รส และใชเปนยาทาภายนอกเพ� อบรร เทาอาการปวดและช วยสมานแผล นอกจากน$น$ ามนกานพลยงมฤทธ* ตานอนมลอสระ ตานการอกเสบ (3-4) น$ ามนกานพลมลกษณะใสถงสเหลองออน ไดจากการกล�นไอน$ า มกล�นฉนเฉพาะตว มคาความถวงจาเพาะท� 1.045 จดเดอดท� 250 องศาเซลเซยส มการศกษาเก�ยวกบความเปนพษของน$ามนกานพลในตวทาละลาย ethanol ตอ diethyl pathalate (1:3) โดยการวเคราะหดวย
local lymph node พบวาน$ามนกานพลในความเขมขน 2.5 และ 5.0 เปอรเซนต ไมกอใหเกดอาการแพ เน�องจากคาดรรชนท�บงช$วาจะกอใหเกดอาการแพมคาต�า (< 3) และคาความเขมขนของน$ามนกานพลท�อาจกอใหเกดอาการแพคอ รอยละ 7.1 (5)
อนภาคไขมนแขงเปนระบบนาสงยาท� เกดจากการเตมสาระสาคญลงผสมกบไขมนท�ถกหลอมเหลวดวยความรอน แลวเปล�ยนสภาพเปนไขมนแขงเม�ออณหภมของสวนผสมลดต�ากวาจดหลอมเหลวของไขมนชนดน$น เทคนคท�นยมใชในการเตรยมอนภาคไขมนแขงใหมขนาดเลกไดแก กา ร ใ ช เ ค ร� อ ง ป� น ล ด ข น า ด แ ร ง ดน ส ง (high
pressure homogenizer) ซ� งตองใชความรอนเปนเวลานานในกระบวนการเตรยม (6) อยางไรกต า ม ก า ร ศ ก ษ า น$ เ ล อ ก ใ ช เ ท ค น ค solvent
emulsification-evaporation ตามวธของ Trotta
et al. (7) เพ�อหลกเล�ยงความรอนในกระบวนการเกบกกน$ามนกานพลในอนภาคไขมนแขงเปนการปองกนการเส�อมสภาพ และลดอตราการระเหยของน$ ามนกานพล โดยการเตรยมอมลชนท�ประกอบดวยน$ ามนกานพลและไขมนแขงละลายในตวทาละลายท�เขากบน$าได มพษต�า เชน benzyl
alcohol เม�อนาอมลชนท�เตรยมไดมาเจอจางดวยน$า ไขมนแขงจะเกบกกน$ามนกานพลทนท เม�อตวทาละลายแพรเขาไปในน$าไดอนภาคไขมนแขง
งานวจยน$ มจดประสงคเพ�อศกษาฤทธ* ตานอนมลอสระของน$ ามนหอมระเหยกานพล โดยศกษาประสทธภาพของน$ามนกานพลในการตานอนมลอสระ และเพ�อศกษาปจจยท�มผลตอระบบนาสงแบบอนภาคไขมนแขงเพ�อชวยเพ�มความคง
percentage of oil entrapment was up to 96.6%. Benzyl alcohol and tween 80 were
significantly affected the particle size of SLP and their zeta potential.
คาสาคญ: น$ามนหอมระเหยกานพล ฤทธ* ตานอนมลอสระ อนภาคไขมนแขง
Keywords: clove oil, antioxidant, solid lipid particles (SLPs)
KKU Res J. 2011; 16(5) 506
ตวของน$ ามนกานพล ลดอตราการระเหยของน$ ามนกานพล และบดบงกล�น ปจจยท� ศกษาม 3
ปจจย คอ tween 80, benzyl alcohol และ polyvinyl alcohol (PVA) ท� มผลตอขนาดอนภาคไขมนแขง คา zeta potential และประสทธภาพในการเกบกกน$ ามนกานพล โดยออกแบบการทดลองดวย full factorial
experiment และวเคราะหผลโดยเทคนคในการหาพ$นท�การตอบสนอง (response surface
methodology: RSM) ดวยสถต analysis of
variance (ANOVA)
2. วธการวจย
2.1 สารเคม
สารเคมท�ใชในการศกษามดงน$ น$ ามนหอมระเหยกานพล (clove oil) (บรษทเคร�องหอมไทยจน, ประเทศไทย) glyceryl monostearate
(GMS) (เอกตรงเคมภณฑ,ประเทศไทย) ,
polysorate 80 (tween 80) (เอกตรงเคมภณฑ, ประเทศไทย), potassium chloride (KCl) (เอกตรงเคมภณฑ, ประเทศไทย), sodium lauryl
sulphate (SLS) (เอกตรงเคมภณฑ, ประเทศไทย) สารเคมอ�นๆ เปน analytical grade ดงน$ acetic
acid (Scharian, Spain), benzyl alcohol
(Riedel de Haën, Germany), butylated
hydroxytoluene (BHT) (Riedel de Haën,
Germany), 2,2-azole-(2-aminopropane)-dihy
drochloride (ABAP) (Aldrich, Germany),
polyvinyl alcohol (PVA) (Aldrich, Ger-
many), butanol (Lab Scan, Thailand)
dichloromethane (DCM) (Lab Scan,
Thailand), 2,2-diphenyl-l-1-picryl-hydrazil
(DPPH) (Fluka, Germany), ethanol (Merck,
Germany), methanol (BDH, USA), thio-
barbituric acid (TBA) (Sigma Aldrich,
Germany)
2.2 การศกษาองคประกอบของน�ามนกานพลดวยเทคนค gas chromatography/mass spectro-
scopy (GC/MS)
ศกษาองคประกอบของน$ ามนกานพลโดยเคร� อง mass spectrometer (CN 10402086, Agilent, USA) และ gas chromatography (US
35120381, Agilent, China) ดวยคอลมน DB-
5ms (0.25 ไมครอน, 30 เมตร × 0.25 มลลเมตร)
ใช helium (He) เปน carrier gas ดวยอตราเรว 1
มลลลตร/นาท ปรมาณตวอยางท�ฉด 1 ไมโครลตร และใชโปรแกรมควบคมอณหภมดงน$ 70
องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 นาท แลวปรบเปน 120 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 นาท โดยเพ�มอณหภมดวยอตรา 3
องศาเซลเซยส/นาท จากน$นเพ�มเปน 270
ดวยอตรา 5 องศาเซลเซยส/นาท ใชเวลาในการ
วเคราะห 53.67 นาท และใช Software MSD
Chem Station ในการควบคมการทางานและประเมนผล นาผลท� ไดเปรยบเทยบกบ mass
spectra index ของ Wiley 7n.l MS Search และคานวณปรมาณสารจากพ$นท�ใตกราฟ 2.3 การทดสอบฤทธ ตานอนมลอสระของน�ามนกานพล 2.3.1 การทดสอบการยบย $ง lipid peroxidation
ข อ ง น$ า ม น ห อ ม ร ะ เ ห ย ก า น พ ล ด ว ย ว ธ thiobarbituric acid reactive substances (TBARs)
เตมไขแดงความเขมขน รอยละ 10 ในสารละลาย KCL เขมขน รอยละ 1.15 ปรมาณ 0.5
มลลลตร จากน$นเตมน$ ามนหอมระเหยกานพลความเขมขน 10 ไมโครลตร/มลลลตร (ซ� งละลายใน methanol) ปรมาณ 0.1 มลลลตร และน$ากล�น 0.4 มลลลตร แลวตามดวยสารละลาย ABAP (2,2
azobis (2-aminopropane) dihydrochloride)
เขมขน 0.07 โมลาร ปรมาณ 50 ไมโครลตร และสารละลาย acetic acid (pH 3.5) เขมขน 20
เปอรเซนต ปรมาณ 1.5 มลลลตร ผสมใหเขากนแลวเตมสารละลาย TBA (thiobarbituric acid)
เขมขน รอยละ 0.8 ปรมาณ 1.5 มลลลตร แลวนาไปอนในอางองไอน$ าท� อณหภม 95 องศา
KKU Res J. 2011; 16(5) 507
เซลเซยส เปนเวลา 60 นาท หลงจากน$นท$งไวใหเยน สกดดวย butanol นาสวนท�สกดไดไปวดคาการดดกลนท�ความยาวคล�น 523 นาโนเมตร ดวยเคร�องสเปคโตรโฟโตมเตอรเปรยบเทยบกบคาการดดกลนแสงของตวอยางท�ไมเตม ABAP (blank)
และหลอดควบคมท�ไมเตมน$ ามนกานพล ซ� งทาการทดลองในทานองเดยวกน (ทาการทดลอง 3
ซ$ า แลวหาคาเฉล�ย) สาหรบสารมาตรฐาน BHT
และ α-tocopherol acetate ทาการทดลองดงข$ นตอนเดยวกน นาผลท� ไดมาคานวณหาคา เปอรเซนตยบย $งของน$ ามนหอมระเหยกานพล และสารมาตรฐานไดจากสมการท� (1)
Abs control คอ คาการดดกลนแสงของหลอดควบคม
Abs sample คอ คาการดดกลนแสงของน$ามนกานพล หรอสารมาตรฐาน
Abs blank คอ คาการดดกลนแสงของ blank
2.3.2 การทดสอบฤทธ* กาจดอนมลอสระของน$ ามนหอมระเหยกานพล (free radical
scavenging) ดวยวธ 2,2-diphenyl-l-1-picryl
hydrazil (DPPH)
เตมน$ ามนหอมระเหยกานพลท�ความเขมขน 20 ไมโครลตร/มลลลตร ( ซ� งละลายใน methanol) ปรมาณ 50 ไมโครลตร ลงใน microtiter plate 96 หลม จากน$นเตมสารละลาย DPPH (2,2-diphenyl-l-1-picrylhydrazil) เขม
ขน 0.0004 โมลาร ปรมาตร 50 ไมโครลตร ลงในทกหลม ผสมกนในแตละหลมเปนเวลา 5 นาท และนาไปเกบในท�มดเปนเวลา 25 นาท แลวนาไป
วดคาการดดกลนแสงดวย microplate reader ท�ความยาวคล�น 490 นาโนเมตร เทยบกบคาการดดกลนแสงของตวอยางท�ไม เ ตมสารละลาย DPPH และคาการดดกลนแสงของหลอดควบคมท�ไมเตมน$ามนกานพล ซ� งทาการทดลองในทานองเดยวกน (ทาการทดลอง 3 ซ$ าแลวหาคาเฉล�ย) สาหรบสารมาตรฐาน BHT และ α-tocopherol
acetate สามารถทดสอบไดตามข$นตอนเดยวกน นาผลท�ไดมาคานวณหาคาเปอรเซนตการยบย $งอนมลอสระ DPPH ของน$ามนหอมระเหยกานพล และสารมาตรฐาน ไดจากสมการท� (1)
2.4 ศกษาการเตรยม solid lipid particles
(SLP) ของน�ามนหอมกานพล ดวยวธ solvent-
emulsification-diffusion technique
2.4.1 การเตรยมอนภาคไขมนแขง โดยมสวนประกอบในการเตรยมแสดงในตารางท� 1 มข$นตอนดงน$
ช�ง glyceryl monostearate (GMS) ใสในหลอดทดลอง จากน$นเตม benzyl alcohol และ tween 80 จากน$นเตม น$าหรอสารละลาย PVA 10
มลลลตร ตามสตร ผสมใหเขากน จากน$นนาไปอนท�อณหภม 56 องศาเซลเซยส จน GMS หลอมละลาย เตมน$ามนกานพล 200 มลลลตร นาไปผสมกนเปนเวลา 1 นาท จากน$นเตมน$าอยางรวดเรวจนครบปรมาตรเปน 50 มลลลตร
2.4.2 การประเมนลกษณะทางกายภาพของอนภาคไขมนแขง
2.4.2.1 การหาขนาดอนภาค และ zeta
potential ของอนภาคไขมนแขง
นาตวอยางท�เตรยมไดมาวดหาขนาดอนภาคไดดวยเคร�อง Mastersizer 2000 (Malvern, UK)
และคา zeta potential ดวยเคร� อง Zetasizer
(Malvern, UK)
2.4.2.2 การหาปรมาณน$ามนกานพลท�ถกเกบกกในอนภาคไขมนแขง
(1) × 100 % inhibition = Abs
control - (Abs
sample - Abs
blank)
Abscontrol
KKU Res J. 2011; 16(5) 508
% entrapment = Clove oilint – Clove oilfin × 100 (2)
Clove oilint
ปเปตอนภาคไขมนแขงท� เตรยมไดมา 3
มลลลตร เตมสารละลาย CaCl2 เขมขน รอยละ 10 ปรมาตร 0.6 มลลลตร ผสมใหเขากน จากน$นนาไปกรองผานเมมเบรนขนาด 0.22 ไมครอน
แลวนาสารละลายท�กรองไดมา 0.750 มลลลตร
มาเตมใน dichloromethane (DCM) ปรมาตร 15
มลลลตร นาไปผสมใหเขากนนาน 1 นาท ดดสารละลายช$นลางไปวดการดดกลนแสงท�ความยาวคล�น 285.1 นาโนเมตร โดยเปรยบเทยบกบ blank ท�ทาตามข$นตอนเดยวกน คานวณหาปรมาณน$ ามนกานพลท�เหลออยในตารบแลวนาคาท�ไดมาคานวณหาเปอรเซนตการเกบกกน$ ามน ดงสมการท� (2)
โดย Clove oilint คอ ปรมาณน$ ามนกานพลเร�มตนท�ใชในการเตรยมอนภาคไขมนแขง
Clove oilfin คอ ปรมาณน$ามนกานพลท�ไมถกกกเกบในอนภาคไขมนแขง
2.5 การศกษาปจจยท&มผลตอคณลกษณะของอนภาคไขมนแขง โดยใช 23 full factorial
design
ในการศกษาเบ$องตน พบวาปจจยท�นาจะมผลทาใหไดอนภาคไขมนแขงท�มคณลกษณะท�ดม 3 ปจจย คอ tween 80 (x1), benzyl alcohol (x2)
และ PVA (x3) ความเขมขนรอยละ 1 กาหนด
ปรมาณของปจจยท�ศกษา 2 ระดบ ดงแสดงในตารางท� 2 ไดตารบท�ตองศกษา 8 ตารบ โดยมสวนประกอบดงแสดงในตารางท� 3
3. ผลการวจยและอภปราย
3.1 การศกษาองคประกอบของน�ามนกานพลดวยเทคนค GC/MS
จ า ก ก า ร ท ด ล อ ง พ บ ว า น$ า มน ก า น พ ล ม eugenol เปนองคประกอบหลกซ� งมสงถง รอยละ 99.16 สวนผลการศกษาของ Chaieb et al. (8) ซ� งมปรมาณ eugenol รอยละ 88.58 สวน caryophyllene มปรมาณ รอยละ 0.30 ซ� งนอยกวาการรายงานของ Chaieb et al. (8) ท�มปรมาณของ caryophyllene เทากบ รอยละ 1.39 โดยผลท�ไดมคาแตกตางกนอาจเน�องมาจากน$ามนกานพลท�ใ ช ไ ด ม า จ า ก แ ห ล ง ผ ล ต ท� ต า ง ก น ท า ใ หองคประกอบทางเคมแตกตางกน
3.2 การศกษาฤทธ ตานอนมลอสระของน�ามนกานพล
จากการศกษาฤทธ* ตานอนมลอสระท$ง 2 วธ พบวาน$ามนกานพลมฤทธ* ในการตานอนมลอสระสงกวาสารมาตรฐาน BHT และ α-tocopherol
acetate ซ� งสอดคลองกบการศกษาของ Ruberto
and Baratta (9) ท�พบฤทธ* การการตานอนมลอสระของ eugenol ดงน$นน$ ามนกานพลนาจะมศกยภาพ ในการนามาพฒนาเปนเคร� องสาอางลดร$ วรอยได ซ� งจากการศกษาฤทธ* การตานอนมลอสระของ eugenol ซ� งเปนองคประกอบหลกของน$ามนกานพลท�ความเขมขน 1000, 500 และ 100
ตารางท� 1. สวนประกอบในอนภาคไขมนแขง
สาร ปรมาตร/ปรมาณ ประโยชนในตารบ
น�ามนกานพล 200 ไมโครลตร สารสาคญ GMS 0.25 กรม ผนงแคปซล
Tween 80 0.1 – 0.25 กรม สารกออมลช�น
Benzyl alcohol 1-2 มลลลตร ตวทาละลาย GMS
PVA (รอยละ 1) 0 – 10 มลลลตร สารเพ�มความหนด น�า qs to 50 มลลลตร สารชวยเจอจาง
KKU Res J. 2011; 16(5) 509
ตารางท� 2. แสดงปจจยท�สงผลในการต�งตารบอนภาคไขมนแขงของน�ามนกานพล
ปจจย สาร ระดบต�า (-) ระดบสง (+)
A Tween 80 (x1) 0.1 0.25 B Benzyl alcohol (x2) 1 2 C 1% w/v PVA (x3) 10 20
ตารางท� 3. การออกแบบการทดลองดวย 23 Full factorial experiment layout
ตารบท� Tween 80 Benzyl alcohol PVA
1 - - - 2 + - - 3 - + - 4 + + - 5 - - + 6 + - + 7 - + + 8 + + +
รปท� 1. โครมาโทแกรมสวนประกอบในน�ามนกานพล
ตารางท� 4. แสดงสวนประกอบและปรมาณสาระสาคญในน�ามนกานพล
เวลาท�แสดงตาแหนงของสาร (นาท)
สารประกอบ สตรเคม พ�นท� (รอยละ)
22.97 Eugenol C10H12O2 99.161 25.99 Caryophyllene C15H24 0.295 29.21 Butylated
Hydroxytoluene C15H24O 0.105
(หมายเหต total identification: 99.561)
KKU Res J. 2011; 16(5) 510
ไมโครกรม/มลลลตร มคารอยละการยบย $งอนมลอสระเทากบ 81.2, 67.2 และ 64.7 ตามลาดบ แสดงใหเหนวา น$ ามนกานพลซ� งม eugenol ในปรมาณสงจะมประสทธภาพในการยบย $งอนมลอสระท�ด แตอยางไรกตามในน$ ามนกานพลยงมสารอ�นๆเปน องคประกอบ ซ� งอาจใหผลการทดลองท�แตกตางไปจากการใช eugenol บรสทธ*ในการทดลอง
3.3 การศกษาปจจยท&มผลตอคณลกษณะของอนภาคไขมนแขงโดย 23 full factorial
experiment จ า ก ก า ร ศ ก ษ า เ บ$ อ ง ตน พ บ ว า glyceryl
monostearate (GMS) สามารถเกบกกน$ ามนกานพลไดมากท�สดเม�อเปรยบเทยบกบไขมนแขงชนดอ�น โดยปจจยท�เลอกทาการศกษา ไดแก ผลของปรมาณของ tween 80 ซ� งเปนสารกออมลชน benzyl alcohol เปนตวทาละลาย GMS และ PVA เปนสารเพ�มความหนดใหวตภาคน$าเพ�อชวยลดอตราการเกาะกนของอนภาคน$ามน ทาการผสม
เพ�อใหเ กดอมลชน และเจอจางดวยน$ าเพ�อให benzyl alcohol ท�อ�มตวในน$ าแพรออกมา และ GMS กอตวเปนผนงหมอนภาคของน$ามน ตารางท� 6 แสดงลกษณะทางกายภาพของอนภาคไขมนแขง ซ� งพบวาตารบท� 1 5 และ 6 สามารถเตรยมเปนอนภาคไขมนแขงขนาดเลกละเอยด เม�อพจารณาสวนประกอบในตารบในตารางท� 3 พบวาตารบท�มปรมาณ benzyl alcohol ระดบต�าท$ งหมด เม�อพจารณาคาการละลายของ benzyl
alcohol ในน$าพบวามคา 1 ตอ 25 (10) ซ� งมความ
เขมขนน$ ามากพอท�จะดงตวทาละลายออกหมดทาให GMS จะสามารถเกบกกน$ ามนได ในขณะท�ตารบท� 2 3 4 7 และ 8 ซ� งมปรมาณ benzyl
alcohol ในระดบสงประกอบกบสดสวนของ tween 80 และ PVA ท�ตางกน นาจะสงผลให GMS แยกตวออกมาเปนกอน และเกดการแยกช$นของสวนผสมในตารบ เน� องจากสดสวนของสาร ปร ะก อบใ นตา ร บไ ม เห มา ะส ม benzyl
alcohol ท�มในปรมาณสงไมสามารถแพรออกมาไดหมด จงทาให GMS สรางผนงหมอนภาคของน$ามนกานพลไมสมบรณและแยกตวออกมา
เน�องจากการหารอยละการเกบกกน$ามนกานพลของตารบท�แยกช$นไมสามารถวเคราะหได ดงน$นจงทาการวเคราะหเฉพาะตารบท�มลกษณะการกออนภาคท�ชดเจน ซ� งคณลกษณะของอนภาคไขมนแขง ท�วเคราะหไดแสดงในตารางท� 7 พบวาตารบท�เหมาะสมมคารอยละการเกบกกน$ามนกานพลสงท�สดคอตารบท� 6 ซ� งมคา รอยละ 96.6 และขนาดอนภาคท� d(0.5) เปน 33.42 ไมครอน ซ� งเลกกวาตารบท� 1 (60.58 ไมครอน) และตารบท� 5 (51.95
ไมครอน) เม�อพจารณาสดสวนของปจจยท�ศกษาพบวาตารบน$ มปรมาณ tween 80 และ PVA ในระดบสง และปรมาณ benzyl alcohol ในระดบต�า อธบายไดวาปรมาณสารกออมลชนท�มากทาใหสามารถลดขนาดของวตภาคน$ามนไดด และการม PVA ในระดบสงจะเพ�มความหนดใหกบวตภาคน$ าทาใหอนภาคน$ ามนรวมตวกนชาลงในขณะท� benzyl alcohol สามารถแพรออกมารวมกบน$าไดหมดทาให GMS สรางผนงหมน$ ามนกานพลได
ตารางท� 5. เปอรเซนตการยบย �งอนมลอสระของน�ามนกานพลดวยวธ TBARS และ DPPH
สาร % inhibition (mean ±±±± SD)
TBARS DPPH
Clove oil 65.8 ± 1.62 91.1 ± 0.97
BHT 61.8 ± 2.05 74.8 ± 1.56
α-tocopherol acetate 39.6 ± 3.50 48.3 ± 7.14
KKU Res J. 2011; 16(5) 511
อนภาคไขมนแขงท� มขนาดเลก อยางไรกตาม เน�องจากการเตรยมโดยวธน$ ไมไดใชเคร�องมดป�นลดขนาดสมรรถนะสง จงทาใหขนาดอนภาคมคาการกระจายตวท�สง
จากผลการทดลองท�ไดเม�อนามาวเคราะหผล
โดยใชเทคนคในการหาพ$นท�การตอบสนองดวยสถต ANOVA เพ�อหาความสมพนธระหวางปจจย3 ชนด คอ tween 80 (x1), benzyl alcohol (x2) และ PVA (x3) กบคาสงเกต ไดแก ขนาดอนภาค
ไขมนแขงท� d(0.5) (Y1), d(0.9) (Y2) และ zeta
potential (Y3) โดยใชสมการท�วไปแบบ polynomial ในการทานายคา Yi ดงแสดงในสมการท� (3) (11-12)
Yi = β0 + β1x1 + β2x2 + β3x3 + β11x12 + β22x22 +
β33x32 + β12x1x2 + β13x1x3 + β23x2x3 (3)
เม�อคา Yi คอ คาพารามเตอรท�ทานาย
β0 คอ คาคงท�
ตารางท� 6. แสดงลกษณะทางกายภาพของอนภาคไขมนแขงท�เตรยมได
ตารบท� ลกษณะทางกายภาพ
1 ลกษณะคอนขางใส มตะกอนละเอยดสขาวนอนกน
2 มตะกอนละเอยดปนหยาบและมกอนแวกซขนาดใหญนอนกน มลกษณะแยกช�นอยางชดเจน 3 มตะกอนหยาบสขาวนอนกน มบางสวนลอยบนผวหนา มลกษณะแยกช�นอยางชดเจน
4 มตะกอนคลายกอนแวกซหยาบจบกนเปนกอน มลกษณะแยกช�นอยางชดเจน
5 ขาวขน มตะกอนละเอยดนอนกน
6 มตะกอนละเอยดนอนกน
7 มตะกอนหยาบนอนกน มบางสวนลอยบนผวหนา มลกษณะแยกช�นอยางชดเจน
8 มตะกอนหยาบปนกอนแวกซขนาดใหญนอนกน มลกษณะแยกช�นอยางชดเจน
ตารางท� 7. ขนาดอนภาคท� d(0.5), ขนาดอนภาคท� d(0.9), Zeta potential และรอยละของการเกบกกน�ามนในอนภาคไขมนแขง
ตารบ
ท� ขนาดอนภาคท� d (0.5) (Y1)
ขนาดอนภาคท� d (0.9) (Y2)
span Zeta potential
(Y3) เปอรเซนต
Entrapment (Y4)
1 60.580 ± 10.100 248.520 ± 3.662 4.094 ± 0.749 -36.6 ± 1.077 80.47 ± 0.08 2 23.680 ± 1.309 208.288 ± 0.911 8.730 ± 0.533 -17.1 ± 0.775 ND 3 14.281 ± 1.753 274.800 ± 22.314 19.458 ± 3.734 -39.9 ± 2.769 ND 4 18.639 ± 2.383 276.452 ± 18.760 14.822 ± 1.147 -37.4 ± 0.560 ND 5 51.954 ± 5.497 319.798 ± 12.412 6.120 ± 0.806 -29.3 ± 0.550 71.42 ± 0.09 6 33.424 ± 2.015 233.207 ± 6.612 6.908 ± 0.232 -15.9 ± 0.371 96.59 ± 0.07 7 21.514 ± 4.261 115.849 ± 57.801 5.763 ± 4.049 -40.1 ± 0.809 ND 8 11.045 ± 1.102 277.699 ± 47.296 24.942 ± 1.736 -25.4 ± 0.222 ND
หมายเหต
Y1 : ขนาดอนภาคท� d(0.5) หมายถงคากลางของขนาดของอนภาคท� รอยละ 50 ของตวอยาง (Volume median diameter)
Y2 : ขนาดอนภาคท� d(0.9) หมายถงคากลางของขนาดของอนภาคท� รอยละ 90 ของตวอยาง
Y3 : zeta potential คอคาความตางศกยทางไฟฟาบรเวณ shear plane ของอนภาค
Y4 : เปอรเซนตการเกบกก (Entrapment)
Span : คาความกวางของการกระจายตวของขนาดอนภาค ND : not determination
KKU Res J. 2011; 16(5) 512
β1, β2 และ β3 คอ สมประสทธ* การถดถอยของ linear term
β11 , β22 และ β33 คอ สมประสทธ* การถดถอยของ quadratic term
β12 , β13 และ β23 คอ สมประสทธ* การถดถอยของ interaction term
x1, x2 และ x3 คอ ตวแปรอสระ
จากการว เคราะหดวยโปรแกรม Design
Expert V.7.1 (Stat-Ease, USA) เพ�อใหไดแ บ บ จา ล อ ง โ ค ร ง ส ร า ง ท� ใ ช ใ น ก า ร ทา น า ยความสมพนธของตวแปรตนกบคาสงเกตหรอพาพารามเตอรท�วด ซ� งใชอธบายปจจยท�เปนอทธพลหลก (main effect) และปจจยท�เปนอทธพลรวม (interaction effect) แสดงคาความสมพนธร ะ ห ว า ง ป จ จย ท� ศ ก ษ า กบ ค า ส ง เ ก ต ดว ย ค าสมประสทธ* สหสมพนธ เ ชงพห (R2) คาสมประสทธ* สหสมพนธเชงพหท�นามาปรบเพ�อใหสมพนธกบจานวนตวแปรตนในรปแบบจาลอง (adjusted R2) และคาสมประสทธ* สหสมพนธเชงพหระหวางขอมลชดใหมกบ รปแบบจาลอง
(predicted R2) ผลการวเคราะหแสดงในตารางท� 8 และตารางท� 9
3.3.1 การวเคราะหขนาดอนภาคท& d (0.5)
จากการวเคราะหความสมพนธระหวางปจจยท�ศกษากบขนาดอนภาคท� d(0.5) พบวาความ
สมพนธเชงเสนตรงท� มอทธพลรวม โดยเลอกแบบจาลองชนด 2 factorial interaction (2FI)
reduced model พบวามคา adjusted R2 และคา predicted R2 เทากบ 0.8925 และ 0.7542 ตาม
ลาดบ ซ� งจะแสดงถงความสามารถของแบบจาลองในการทานายผลท�ไดใกลเคยงความจรงถง รอยละ
75.42 และพบวาปจจยท�มอทธพลตอขนาดอนภาคท� d(0.5) ซ� งมนยสาคญ (p <0.05) มากท�สดคอ benzyl alcohol (x2) รองลงมาคอ tween 80 (x1) และอทธพลรวมระหวาง tween 80 และ benzyl
alcohol (x1x2) ตามลาดบ ซ� งจากการวเคราะหได
สมการแสดงความสมพนธของแบบจาลองดงแสดงในสมการท� (4)
Y1 = 31.31–5.77x1–14.56x2+4.62x1x2 (4)
จากสมการสามารถอธบายไดวาอทธพลของ benzyl alcohol มผลตอขนาดอนภาคท� d(0.5)
มากท�สดโดยปรมาณ benzyl alcohol จะเปนสดสวนผกผนกบขนาดอนภาคท� d(0.5) หมายถงหากในตารบม benzyl alcohol สง จะทาใหอนภาคมขนาดเลกลง และหากม benzyl alcohol นอย จะทาใหอนภาคมขนาดใหญข$น เชนเดยวกบอทธพลของ tween 80 ซ� งมผลตอขนาดอนภาค
รองลงมาจาก benzyl alcohol แตมอทธพลรวม
ระหวาง benzyl alcohol และ tween 80 จะเปนสดสวนโดยตรงตอขนาดอนภาคอยางมนยสาคญ
โดยสามารถแสดงรปของการทดลองแบบพ$นท�การตอบสนองของอทธพลรวม ระหวาง tween 80
และ benzyl alcohol ในรปท� 2
3.3.2 การวเคราะหขนาดอนภาคท& d (0.9)
จากการวเคราะหแบบจาลองชนด 2 factor
interaction (2FI) reduced model พบวามคา
adjusted R2 และคา predicted R2 เทากบ -0.3974 และ -11.7761 ตามลาดบ ซ� งมคาตดลบ แสดงใหเหนวาแบบจาลองของขนาดอนภาคท� d
(0.9) ไมสามารถใชในการทานายได ท$งน$ อาจเน�องมาจากขนาดอนภาคท� d(0.9) น$ เปนคาการวดขนาดอนภาคท� รอยละ 90 ของอนภาคท$งหมด ซ� งมอนภาคจานวนมาก ทาใหมการกระจายของขนาดอนภาคกวาง
3.3.3 การวเคราะห zeta potential
จากการวเคราะหพ$นท�การตอบสนองพบวาม
ความสมพนธกนเชงเสนตรงชนด reduced linear
model มคา adjusted R2 และคา predicted R2
เทากบ 0.8099 และ 0.7338 ตามลาดบ ซ� งแสดงถง
ความสามารถของแบบจาลองวา หากนาไปทานายผลท�ไดจะใกลเคยงความจรงถง รอยละ 73.38
KKU Res J. 2011; 16(5) 513
และพบวาปจจยท�มอทธพลตอ zeta potential ท�มนยสาคญ (p < 0.05 ) มากท�สดคอ tween 80 (x1) รองลงมาคอ benzyl alcohol (x2) สวน PVA (x3)
ไมมผลตอคา zeta potential ซ� งจากการวเคราะหจะไดสมการแสดงความสมพนธของแบบจาลองดงแสดงในสมการท� (5)
Y3 = -31.78 + 4.70x1 – 5.49x2 (5)
คา zeta potential เปนคาความตางศกด* ทางไฟฟาของอนภาคบรเวณ shear plane ซ� งข$นกบปรมาณประจไฟฟาบนผวของอนภาค หากมคาสงจะมแรงผลกกนระหวางประจของอนภาคมากทาใหอนภาคสามารถแขวนลอยโดยไมเขามาเกาะกลมกน หรอระบบการกระจายตวของอนภาคมความคงตวดในสภาวะแวดลอมเปนน$าปราศจากอออน pH 7 และมคา zeta potential อยระหวาง -40 ถง -50 mV ระบบจะคงตวอยไดอยางนอย 2 ป
ตารางท� 8. คา Regression coefficient, R2, adjusted R2 และ predicted R2 ของคาสงเกต
Regression coefficient
ขนาดอนภาคท� d(0.5) (µµµµm, Y1)
ขนาดอนภาคท� d(0.9) (µµµµm, Y2)
Zeta potential (mV, Y3)
β0 31.31 243.18 -31.78
β1 -5.77 3.44 4.70
β2 -14.56 -17.20 -5.49
β3 - -11.25 -
β12 - - -
β22 - - -
β32 - - -
β12 4.62 27.22 -
β13 - 10.67 -
β23 - -31.74 -
R2 0.9385 0.8004 0.8099 R2 (adj) 0.8925 -0.3974 0.7338
R2 (pred) 0.7542 -11.7761 0.5133 p-value 0.0069 0.7329 0.0158
ตารางท� 9. การวเคราะห ANOVA แสดงคา p-value และ F-ratio ของแบบจาลอง
variables Main effects Interaction effects
x1 x2 x3 x1x2 x1x3 x2x3
Particle size d(0.5) (Y1) p-value 0.0212 0.0025 - 0.0419 - - F-ratio 13.56 45.71 - 8.71 - - Particle size d (0.9) (Y2) p-value 0.8881 0.6348 0.7455 0.3937 0.6793 0.4348 F-ratio 0.032 0.42 0.18 1.98 0.30 1.51 Zeta potential (Y3) p-value 0.0178 0.0287 - - - - F-ratio 12.05 9.25 - - - -
หมายเหต : x1 คอ tween 80 , x2 คอ benzyl alcohol และ x3 คอ 1% w/v PVA
KKU Res J. 2011; 16(5) 514
(13) จากสมการท� (5) แสดงใหเหนวาปจจยท�มผลตอคา zeta potential มากท� สดคอ benzyl
alcohol ซ� ง เ ปนสดสวนผกผนกบคา zeta
potentialsหมายค วามว า หากตา รบม benzyl
alcohol มาก (ตารบท� 3 4 7 และ 8) จะทาใหคา
zeta potential มคาเปนลบมากกวาตารบท� 1 2
5 และ 6 (ตารางท� 3 และ 7) ท$งน$อาจเปนไปไดวา benzyl alcohol ในระดบสงนอกจากจะทาใหสวนผสมไมคงตวเกดการแยกช$นแลว อนภาคไขมนแขงท�เตรยมไดมขนาดเลกซ� งมพ$นท�ผวมากพอท�จะแสดงประจลบบนอนภาคมากข$ นมแรงผลกกนระหวางอนภาคมากข$ น ในทางตรงขามปรมาณ tween 80 จะเปนสดสวนโดยตรงตอคา zeta potential น�นคอหากมปรมาณ tween 80 สง
ดงตารบท� 2 4 6 และ 8 ขนาดของอนภาคไขมนแขงจะมขนาดเลกกวาตารบท�ม tween 80 ในระดบต� า เม�อเปรยบเทยบในระหวางตารบท� มสวนประกอบอ�นคลายกน เน�องจาก tween 80
เปนสารกออมลชนท�ไมมประจ เม�อมปรมาณมากจงอาจสงผลใหอนภาคไขมนแสดงประจลบไดนอยลง สงผลใหคา zeta potential แสดงคาลบซ� งต�ากวา ตารบท�ม tween 80 ในระดบ
3. 4 Verification of the models
ค ว า ม เ ห ม า ะ ส ม ข อ ง ส ม ก า ร แ ส ด งความสมพนธของแบบจาลองท� ได สามารถตรวจสอบไดจากการเปรยบเทยบความแตกตางระหวางคาท�ไดจากการทดลองและ คาท�ไดจากการทานาย (Y0–Yi) ซ� งแสดงในตารางท� 10 พบวา
Design-Expert® Software
P 0.560.5833
11.0453
X1 = A: Tween 80X2 = B: BA
Actual FactorC: PVA = 7.50
0.10
0.14
0.17
0.21
0.25
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
15
25.5
36
46.5
57
P 0
.5
A: Tween 80 B: BA
รปท� 2. พ�นท�การตอบสนองระหวาง Tween 80 และ Benzyl alcohol
ตารางท� 10. แสดงคาจากการทดลองและคาจากการทานายของคาพารามเตอรท�ตองการวด
ตารบ
ท�
ขนาดอนภาคท� d(0.5) (µµµµm, Y1)
ขนาดอนภาคท� d(0.9) (µµµµm, Y2)
Zeta potential (Y3, mV)
Y0 Yi Y0- Yi Y0 Yi Y0- Yi Y0 Yi Y0- Yi
1 60.583 56.269 4.315 248.520 274.340 -25.820 -36.600 -30.988 -5.613 2 23.680 28.552 -4.872 208.288 182.468 25.820 -17.100 -18.463 1.363 3 14.281 17.897 -3.617 274.803 248.983 25.820 -39.900 -41.963 2.063 4 18.639 14.842 3.797 276.452 302.272 -25.820 -37.400 -29.438 -7.963 5 51.954 56.269 -4.315 319.798 293.978 25.820 -29.300 -30.988 1.688 6 33.424 28.552 4.872 233.207 259.027 -25.820 -15.900 -18.463 2.563 7 21.514 17.897 3.617 115.849 141.669 -25.820 -40.100 -41.963 1.863 8 11.045 14.842 -3.797 277.699 251.879 25.820 -25.400 -29.438 4.038
KKU Res J. 2011; 16(5) 515
คาอนภาคท� d(0.9) คอนขางแตกตางกนเน�องจากขนาดอนภาคมการกระจายตวสง หาความสมพนธไดยากดงท�กลาวมาแลว สาหรบแบบจาลองของขนาดอนภาคท� d(0.5) และ zeta potential มคาท�ไดจากการทดลองและคาจากการทานายใกลเคยงกน ดง น$ น ส ม ก า ร แ ส ด ง ค ว า ม ส ม พน ธ ข อ งแบบจาลองสาหรบ d(0.5) และ zeta potential
สามารถใชในการทานายไดถกตอง 4. สรป
จากผลการทดลองพบวาน$ ามนกานพลมปรมาณ eugenol เปนองคประกอบสงถงรอยละ 99.16 รองลงมาคอ caryophyllene โดยมปรมาณ รอยละ0.30 ในการศกษาฤทธ* ตานอนมลอสระของน$ามนกานพลพบวาน$ามนกานพลประสทธภาพในการอนมลอสระสงกวาสารมาตรฐานท$ง 2 วธ ในการศกษาปจจยท�มผลตอการเกบกกน$ ามนกานพลและลกษณะทางกายภาพของอนภาคไขมนแขง โดยออกแบบการทดลองแบบ 23 full factorial
experiment พบวาสตรตารบท� เหมาะสมมประสทธภาพในการเกบกกน$ ามนกานพลสงท�สดคอ ประกอบดวย GMS รอยละ 0.5, tween 80 รอยละ0.6, benzyl alcohol รอยละ 2.0 และสาร
ละลาย PVA เขมขนรอยละ 1 ในปรมาณ รอยละ40 ในตารบ และในการวเคราะหขนาดอนภาคท� d(0.5) ไดแบบจาลองแบบ reduced 2FI model
และไดสมการความสมพนธทางคณตศาสตรท�แสดงใหเหนวา benzyl alcohol และ tween 80
จะเปนสดสวนผกผนกบขนาดอนภาคท� d(0.5)
อยางมนยสาคญ สาหรบการว เคราะหขนาดอนภาคท� d(0.9) ซ� งมคาดรรชนการกระจายตวของอนภาคมากจงไมสามารถหาความสมพนธกบแบบจาลองได การวเคราะหคา zeta potential
ไดแบบจาลองแบบ reduced linear model โดยปจจยท�มผลตอ zeta potential คอ tween 80 ซ� งเปนสดสวนโดยตรง และb alcohol จะเปนสดสวนผกผนตอคา zeta potential อยางมนยสาคญ จากการทดลองน$ สามารถใชทานายคา
ขนาดอนภาคท� d(0.5) และคา zeta potential ไดความถกตองถง รอยละ89.25 และ รอยละ73.38
ตามลาดบ อยางไรกตามขนาดของอนภาคท�เตรยมไดโดยวธน$ มขนาดมากกวา 10 ไมครอน ดงน$นระบบนาสงน$ นาจะใชในการลดการระเหยของน$ามนกานพล แตไมสามารถนาสงน$ามนผานรขมขนได ดงน$นจงตองพฒนาใหอนภาคมขนาดเลกเพยงพอท�จะนาสงน$ ามนไปในช$นหนงแทไดมากข$น ขณะเดยวกนตองทาการศกษาถงความคงตวทางเคมของอนภาคไขมนแขงน$ ามนกานพลและการปลดปลอยสารสาคญตอไป
5. กตตกรรมประกาศ งานวจยน$ ไดรบงบประมาณสนบสนนจาก
บ ณ ฑ ต ว ท ย า ล ย แ ล ะ ค ณ ะ เ ภ ส ช ศ า ส ต ร มหาวทยาลยขอนแกน 6. เอกสารอางอง
(1) Lelapornpisit P. Cosmetics for skin.
Chiangmai: Department of Pharmaceu-
tical Technology, Faculty of Pharmacy,
Chiangmai University; 2001. Thai.
(2) Kim BJ, Kim JH, Kim HP, Heo MY.
Biological screening of 100 plant
extracts for cosmetic use (II): anti-
oxidative activity and free radical
scavenging activity. Int J Cosmet Sci
1997; 19: 299-307.
(3) Fu Y, Chen L, Zu Y, Liu Z, Liu X, Liu Y,
et al. The antibacterial activity of clove
essential oil against Propionebacterium
acnes and its mechanism of action.
Arch Dermatol 2009; 145: 86-8.
(4) Saeed S, Tariq P. In vitro antibacterial
activity of clove against Gram-negative
bacteria. Pak J Bot. 2008; 40: 2157-60.
(5) Lalko J, Api AM. Investigation of the
dermal sensitization potential of
various essential oils in the local lymph
KKU Res J. 2011; 16(5) 516
node assay. Food Chem Toxico. 2006;
44: 739 - 46.
(6) Müller RH, Runge SA. Solid lipid
nanoparticles (SLN®) for controlled
drug delivery. In: Benita S, editor.
Submicron emulsion in drug targeting and
delivery. The Netherlands: Harwood
Academic Publishers; 1998. p. 219–34.
(7) Trotta M, Debernardi F, Caputo O.
Preparation of solid lipid nanoparticles
by solvent emulsification-diffusion
technique. Int J Pharm. 2003; 257: 153-
60.
(8) Chaieb K, Hajlaoui H, Zmantar T,
Kahla-Nakbi AB, Rouabhia M,
Mahdouani K, et al. The chemical
composition and biological activity of
clove essential oil, Eugenia caryo-
phyllata (Syzigium aromaticum L.
Myrtaceae): a short review. Phytother
Res. 2007; 21: 501-6.
(9) Ruberto G, Baratta MT. Antioxidant
activity of selected essential oil
components in two lipid model sys-
tems. Food Chem Toxico. 2000; 69: 167-
74.
(10) Wade A, Weller PJ. Handbook of
pharmaceutical excipients. 2nd ed.
London: The American Phamaceutical
Association; 1994.
(11) Mirhosseini H, Tan CP, Hamid NSA,
Yusof S. Effect of Arabic gum, xanthan
gum and orange oil contents on zeta
potential, conductivity, stability, size
index and pH of orange beverage
emulsion. Colloids Surf A Physicochem
Eng Asp. 2008; 315: 47-56.
(12) Mirhosseini H, Tan CP, Hamid NSA,
Yusof S. Optimization of the contents of
arabic gum, xanthan gum and orange
oil affecting turbidity, average particle
size, polydispersity index and density
in orange beverage emulsion. Food
hydrocol. 2008; 22: 1212-23.
(13) Washington C. Zeta potential in phar-
maceutical formulation. Department of
Pharmacy, Nottingham: Malvern
Instruments; 2003.