บทท1

บทนำ�

ตอมหมวกไต (Adrenal gland ) เปนตอมไรทออยตรงสวนบนของไต (คลายหมวกทครอบอยเหนอยอดไต) ทงสองขาง ประกอบดวย 2 สวน คอ สวนแกน (medulla) กบสวนนอก(cortex) ตอมหมวกไตสวนแกน มหนาทสรางฮอรโมนแอดรนาลน (adrenaline) กบ นอรแอดรนาลน (nor- adrenaline) ซงจะชวยควบคมการเตนของหวใจ และความดนโลหต การสรางฮอรโมนทงสองชนดจะถกกระตนโดยฮอรโมนจากสมอง สวนตอมหมวกไตสวนนอกจะสรางฮอรโมนสเตยรอยด (steroid hormone) 3 กลม

กลมแรกคอ แอลโดสเตอโรน (aldosterone) มหนาทควบคมระดบเกลอแร เชน โพแทสเซยม โซเดยม ใหอยในภาวะสมดล

กลมทสอง คอ กลมสเตยรอยดทมฮอรโมนไฮโดรคอรตโซนเปนสวนใหญ ซงทำาหนาทสำาคญ ๆ หลายอยางรวมทงการเปลยนคารโบไฮเดรตใหเปนไกลโคเจน ซงเปนแหลงพลงงาน เกบไวในตบ

กลมทสาม ประกอบดวยฮอรโมนเพศชาย ไดแก แอนโดรเจน (androgen) และฮอรโมนเพศหญงไดแก เอสโตรเจน (estrogen) กบ โพรเจสเตอโรน (progesterone) การสรางฮอรโมนสเตยรอยดทกชนด (ยกเวนแอลโดสเตอโรน ซงกระตนโดยสารเรนนทหลงจากไต) อยภายใตการควบคมของตอมใตสมอง

ฮอรโมนสเตยรอยดทมบทบาทสำาคญอยางสงสดในการรกษาภาวะสมดลของรางกาย และความสมบรณของระบบสบพนธ ตวอยาง เชน aldosterone mineralocorticoid adrenal จำาเปนสำาหรบการรกษา สมดลเกลอ และความดนเลอด ขณะท glucocorticoids adrenal ใชสำาหรบควบคมเมทาบอลซมของคารโบไฮเดรต และตอบสนองตอแรงกดดน และสงเราตาง ๆ เมอฮอรโมนสเตยรอยดมบทบาทสำาคญตอสงม

1

ชวตมากมาย การรกษาความเขมขนของฮอรโมนสเตยรอยดในรางกายผานการควบคมการสงเคราะหจงเปนสงสำาคญ สงทนาพจารณาอยางยงคอการควบคมการสงเคราะหฮอรโมนสเตยรอยดทเกดขนใน Hypothalamic-Pituitary-Adrenal/Gonadal Axis โดยการหลงฮอรโมนมาควบคม เมอฮอรโมนตาง ๆ ถกหลงออกมามนจะทำางานรวมกบตวรบทจำาเพาะ (specific receptors) บนเยอหมเซลลของตอมหมวกไต และตอมลกหมาก และผานสอกลางคอ cAMP หรอระบบ Ca2+second messenger ซงจะทำาใหเกดการสงเคราะหฮอรโมนสเตยรอยด ในระดบทเหมาะสมขนอยชนดเนอเยอ และเซลล

ขนตอนทควบคมอตราการสงเคราะหฮอรโมนสเตยรอยด คอ การขนสงโคเลสเตอรอลจากเยอหมชนนอกของไมโตคอนเดรย เขาสเยอหมชนใน และไปยงเอนไซม Cytochrome P450 side chain cleavage (P450scc) ทเยอหมชนในของไมโตคอนเดรยเพอเปลยนโคเลสเตอรอล (cholesterol) เปนเพรกนโนโลน (pregnenolone) ซงขนตอนทควบคมอตราการสงเคราะหนไวตอตวยบยงของการสงเคราะหโปรตน ดวยเหตนจงมการศกษาเพอคนหาโปรตนทเปนตวควบคมขนมากมายโดยเฉพาะโปรตน StAR (Steroidogenic acute regulatory protein)

การสราง steroid hormone ในเซลลของตอมหมวกไต เกดจากการกระตนของฮอรโมนจากสมอง ไดแก ฮอรโมน -MSH, -endorphine และ ACTH ผาน melanocortin 2 receptor (MC2R) และ melanocortin 5 receptor (MC5R) ทเยอหมเซลลตอมหมวกไต และการขนสงโคเลสเตอรอลจากเยอหมชนนอกของไมโตคอนเดรยเขาสเยอหมชนใน และไป P450scc โดยโปรตน StAR แตยงไมเปนเปนททราบแนชดวา ในสภาวะทเกดความเครยดจากโมโนโซเดยมกลตาเมตนน การสรางฮอรโมนสเตยรอยดทตอมหมวกไตมการเปลยนแปลงระดบของโปรตน StAR อยางไร จงทำาใหผวจยมความสนใจทจะศกษาถงการแสดงออกของยน StAR ซงมความสำาคญตอการสรางฮอรโมนสเตย

2

รอยดทตอบสนองตอภาวะเครยดนนมการตอบสนองตอโมโนโซเดยมกลตาเมตเปนเชนไร

โมโนโซเดยมกลตาเมต (monosodium glutamate) ซงเปนเกลอของกรดอะมโนกลตาเมตทไดจากการยอยสลายของโปรตนในธรรมชาต ในกรณทรางกายไดรบกลตาเมตในปรมาณทมากเกนไปจนเกนความตองการ ทำาใหมผลเสยตอสขภาพรางกายได นอกจากนยงมหนาทเปน neurotransmitter ทำาใหเกดการสอสารระหวางเซลลประสาท ในภาวะทมระดบของโมโนโซเดยมกลตาเมตในสมองทสงเกนไปจะสงผลใหมการกระตนของเซลลประสาททมากเกนไปทำาใหเซลลตาย มรายงานการศกษาผลของโมโนโซเดยมกลตาเมตในหนทตงทอง พบวาจะเกดการแทง และยงมรายงานถงผลกระทบตอการทำางานของ hypothalamic pituitary-adrenocortical axis มผลตอการลดลงของตอม pituitary และตอมหมวกไต แตไมมผลตอระดบของ adrenocorticotrophic hormone (ACTH) ทผลตมาจากตอม pituitary และ corticosterone จากตอมหมวกไต งานวจยนจะมการศกษาการเปลยนแปลงระดบการแสดงออกของยน StAR โดยวธ Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) เพอนำาไปสความรความเขาใจตอการเปลยนแปลงการแสดงออกของยน StAR หลงไดรบการกระตนดวยโมโนโซเดยมกลตาเมต

วตถประสงคก�รวจย

3

เพอศกษาการแสดงออกของยน StAR ในเนอเยอตาง ๆ และศกษาการเปลยนแปลงระดบการแสดงออกของยน StAR ในตอมหมวกไต ทมผลมาจากการกระตนของโมโนโซเดยมกลตาเมต

ขอบเขตของก�รดำ�เนนง�นวจยเลยงหนแรท จำานวน 20 ตว โดยแบงเปน 2 กลม คอ กลมทไดรบ

โมโนโซเดยมกลตาเมตในอาหาร (5 mg/100 g of b.w./day) จำานวน 10 ตว และกลมควบคมทไมไดรบโมโนโซเดยมกลตาเมต จำานวน 10 ตว เปนเวลา 30 วน หลงจากนนทำาการผาตดเอาตอมหมวกไต รงไข มาม ไต และตบของหนกลมควบคม มาสกด total RNA แลวสงเคราะห first strand cDNA โดยวธ reverse transcription (RT) และเพมจำานวน DNA ดวยวธ Polymerase Chain Reaction (PCR) โดยใช specific primers ของยน StAR เพอศกษาการแสดงออกของโปรตน StAR ในเนอเยอตาง ๆ โดยตรวจหา PCR product ขนาด 437 คเบส ของยน StAR

จากนนทำาการสกด total RNA จากตอมหมวกไตของหนทงสองกลมมาสงเคราะห first strand cDNA โดยวธ reverse transcription และเพมจำานวน DNA ดวยวธ Polymerase Chain Reaction โดยใช specific primers ของยน StAR แลววเคราะหระดบการแสดงออกของ StAR mRNA ดวยวธ agarose gel electrophoresis โดยตรวจหา PCR product ขนาด 437 คเบส ของยน StAR และทำาการเพมจำานวน DNA ของยน GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydogenase) ขนาด 195 คเบส เพอใชเปน standard control เนองจากการเปรยบเทยบระดบการแสดงออกของยนจำาเปนตองมการปรบปรมาณของ standard control ซงกคอ ยน GAPDH ของกลมควบคม และกลมทดลองใหมขนาด และความเขมของแถบ PCR product ทเกดขนเทากน โดยการปรบปรมาณ

4

ของ cDNA ทใชเปนตนแบบในการเพมปรมาณยน เมอไดปรมาณ cDNA ททำาใหขนาด และความเขมของแถบ PCR product ทเกดขนเทากนของทงสองกลมแลว จงใชปรมาณ cDNA นนในการเพมจำานวนของยน StAR

ผลทค�ดว�จะไดรบสามารถตรวจสอบการแสดงออกของยน StAR ในเนอเยอตาง ๆ

และเปรยบเทยบระดบการแสดงออกของยน StAR ในตอมหมวกไตของหนทงสองกลม เพอนำาไปสความรความเขาใจถงผลของการกระตนดวยโมโนโซเดยมกลตาเมตทมตอการทำางานของตอมหมวกไต

บทท 2

วรรณกรรมและง�นวจยทเกยวของ

1.คว�มรทวไปเกยวกบตอมหมวกไต (adrenal gland)ตอมหมวกไตเปนตอมขนาดเลก จดเปนตอมไรทอทอยเหนอไตทง

สองขาง และมความสำาคญตอการดำารงชวตอยางยง เนองจากฮอรโมนทหลงจากตอมหมวกไต ทำาใหรางกายตอสกบความกดดน (strees) และเหตการณฉกเฉนตาง ๆ ซงประกอบดวยสองสวนคอ ตอมหมวกไตสวนนอก (adrenal cortex) และตอมหมวกไตสวนใน (adrenal medulla) ตอมหมวกไตสวนนอกถาแบงตามลกษณะของเซลลแบงได 3 บรเวณ ไดแก

- zona glomerulosa หลงฮอรโมนสเตยรอยดทควบคมเกลอแร (mineralocorticoids) เชน aldosterone - zona fasciculata หลงฮอรโมนกลโคคอรตคอยด (glucocorticoids) เชน cortisol

5

- zona reticularis หลงฮอรโมนเพศชาย (androgens) ก�รหลงฮอรโมนสเตยรอยดจ�กตอมหมวกไต

ฮอรโมนเพศชาย สวนใหญมาจากตอมหมวกไต หลงโดยการแพรออกจากเซลลเขาสกระแสเลอด หากเกดความผดปกต เชน ขาดสารเรงปฏกรยา ทใชในการสงเคราะหคอรตซอล จะพบวาตอมมขนาดใหญขน ทงนเพราะเมอขาดการยบยงยอนกลบโดยคอรตซอล และ adernocorticotrophic hormone (ACTH) จะถกหลงมากขน จงมากระตนใหตอมหมวกไตใหเพมจำานวนเซลล ก�รควบคมก�รหลงฮอรโมนสเตยรอยด

การทำางานของตอมหมวกไตถกควบคมโดย ACTH ซงเปนโทรฟคฮอรโมน จากตอมใตสมองสวนหนา การหลง ACTH ถกควบคมอกตอหนงโดย corticotrophin releasing hormone (CRH) จาก hypothalamus และการควบคมแบบยบยงยอนกลบ โดยคอรตซอล ก�รออกฤทธของ ACTH ทตอมหมวกไตสวนนอก

ACTH มผลกระตนการเจรญเตบโต การสงเคราะหและการหลงฮอรโมนจากตอมหมวกไตบรเวณ fasciculata และ reticularis จะพบวาระดบของคอรตซอล ( cortisol ) และแอนโดรเจน (androgen ) ในเลอดเพมขนภายในไมกนาทหลงจากฉด ACTH การให ACTH เปนเวลานานมผลทำาใหตอมมจำานวนเซลลเพมขนและมขนาดใหญขนดวย ในทางตรงกนขามการขาด ACTH มผลลดการสงเคราะหฮอรโมนสเตยรอยดภายใน 1 ชวโมง และตอมหมวกไตมขนาดเลกลง การตอบสนองของตอมหมวกไตสวนนอก ตอ ACTH มประสทธภาพดขนถาไดรบการกระตนจาก ACTH หลาย ๆ ครงในทางตรงกนขามการตอบสนองจะอยในระดบสงเปน

6

รปท1 แสดงตำาแหนงของตอมหมวกไต และชนของตอมหมวกไต(ทมา : www.bartlebg.com/61/imagepages/A4dreg/html )

7

รปท 2 แสดงสวนประกอบของตอมหมวกไตสวนนอก (cortex) แบงตามลกษณะของเซลลแบงไดเปน 3 สวน ไดแก zona glomerulosa, zona fasciculata, และ zona reticularis (ทมา : www.phych.upenn.edu/courses/psych127_Spring2002/adrenal.jpg )

8

รปท 3 แสดงการแบงตอมหมวกไตสวนนอกตามลกษณะของเซลลเปน 3 สวน ไดแก zona glomerulosa, zona fasciculata, และ zona reticularis(ทมา : www.phych.upenn.edu/courses/psych127_Spring2002/adrenal.jpg)

ชวงๆ เปลยนแปลงตามเวลาในแตละวน และอาจเปลยนแปลงได โดยการเปลยนเวลานอน หรอความยาวของวน หรอเวลาอาหาร

การเกดความกระทบกระเทอนทางรางกาย เชน ถกผาตด หรออดอาหาร เกดความเครยด กมผลเพมการหลงฮอรโมน ACTH ไดอยางเฉยบพลน การควบคมการหลง ACTH ทสำาคญอนหนงคอระบบยบยงยอนกลบ การออกฤทธยบยงการหลงของ CRH จาก ไฮโปธาลามส และ ACTH จากตอมใตสมองโดยคอรตซอล ผลของ ACTH ตอก�รหลงแอนโดรเจน

การสงเคราะหและการหลงแอนโดรเจน ถกควบคมโดย ACTH

9

นอกจากนระดบของแอนโดรเจนยงเพมเมอถกกระตนดวย ACTH และลดลงเมอมการยบยงยอนกลบ โดยกลโคคอรตคอยด ทจรงแลวกลโคคอรตคอยดเปนฮอรโมนทมผลหลายอยางทเซลลเกอบทกชนด ในภาวะปกตอาจบอกไดยากวากลโคคอรตคอยดทำาหนาทอะไรบางแตฮอรโมนนมความสำาคญทสดตอชวต เมอเกดภาวะกดดน อาจกลาวไดวากลโคคอรตคอยด เปนฮอรโมนททำาใหรางกายตอสกบภาวะลำาบากได และชวยควบคมการตอบสนอง ของรางกายตอเชอโรค หรอสงแปลกปลอม จะเหนวาฮอรโมนนมคณสมบตอกอยางคอ อนญาตใหฮอรโมนหลายชนด ออกฤทธได ซงมความสำาคญมาก เพราะหากขาดหรอมกลโคคอรตคอยดมากเกนไป ไมเพยงแตจะเกดความผดปกตทเซลลเปาหมายของ กลโคคอรตคอยดเทานน ยงเกดความผดปกตในการออกฤทธ ของฮอรโมนอนๆ เชน อนซลน และกลคากอน ผลของฮอรโมนทหลงจ�กตอมหมวกไตสวนนอกตอเมตต�บอลซม

- เมต�บอลซมของค�รโบไฮเดรต คอรตซอลไมเพยงแตกระตนการสงเคราะหกลโคสจากสารตงตนอนเทานน แตยงลดการใชกลโคสทเนอเยอตาง ๆเชน กลามเนอ การกระตนการสงเคราะหกลโคส เปนการออกฤทธของฮอรโมน ทระดบนวเคลยส เพอกระตนใหมการสงเคราะห สารเรงปฏกรยาตางๆ ทใชในกระบวนการน สวนการลดการใชกลโคส เปนการออกฤทธโดยตรงทเยอเซลลเพอยบยงกลไกการขนสงกลโคส ดงนนการขาดฮอรโมนคอรตซอล จะเกดภาวะกลโคสในเลอดตำาไดงาย สวนการทมฮอรโมนมากเกนไป จะไมคอยตอบสนองตออนซลน ในการกระตนการนำากลโคสเขาเซลล

- เมต�บอลซมของโปรตน คอรตซอลลดการนำากรดอะมโนไปสรางโปรตน ทกแหงในรางกาย

ยกเวนทตบ ดงนนปรมาณโปรตนในเนอเยออนๆ จงลดลง และระดบกรดอะมโน ในเลอดเพมขน นอกจากนยงมการสลายโปรตนทกลามเนอสวนทตบนนรบเอากรดอะมโน เขามาสงเคราะหเปนโปรตน และกลโคส ซงบางสวน

10

เกบสะสมในรปไกลโคเจน ดงนนคนทมคอรตซอลมากเกนไปจะมการสลายโปรตนจากโครงสรางโปรตนในกระดก

- เมต�บอลซมของไขมน คอรตซอลมผลใหเกดการสลายไขมนใหเปนกลเซอรอล และกรดไขมนซงมระดบในเลอดสงขน กลเซอรอลจงถกนำาไปใชสรางกลโคสในตบ นอกจากจะถกสลายแลว การผลต ไขมนกลดลงดวย ซงสาเหตหนงอาจเนองมาจากมการนำาเขา กลโคสโดยเซลลไขมนนอยลง แตอยางไรกตาม

รปท 4 แสดงแกนควบคมการหลงฮอรโมนจากตอมหมวกไต

11

(hypothalamis-pituitary-adrenal axis) โดย corticotrophin releasing factor (CRF) จะกระตนการหลง ACTH และ - endorphin ทตอมใตสมองสวนหนา (ทมา : swfsc.nmfs.noaa.gov/.../Curry%20Lit%20Review/ Figs.html )

รปท 5 แสดงการควบคมการหลงฮอรโมนจากตอมหมวกไต (hypothalamis-pituitary-adrenal axis)

12

(ทมา : swfsc.nmfs.noaa.gov/.../Curry%20Lit%20Review/ Figs.html)

คอรตซอลไมไดมผลทำาลายไขมนอยางเดยว แตยงทำาใหมความอยากอาหารดวย ในคนทมระดบคอรตซอลสง จะมแขนขาผอมลบ แตจะมการสะสมไขมนบรเวณลำาตวและใบหนา ซงยงไมทราบวาคอรตซอลมผลตอการกระจายไขมนเฉพาะสวนเหลานอยางไร จะเหนวาผลรวมของคอรตซอล กคอสงเสรมใหมการสลายโปรตนและไขมน เพอสงเคราะหกลโคสและไกลโคเจน ซงกลโคสนสำาคญมากสำาหรบระยะทรางกายขาดอาหารหรอภาวะเครยด ทำาใหรางกายมพลงงาน อาจจะกลาวไดวาคอรตซอลเปนฮอรโมนแหงการขาดอาหาร ผลทตามมากคอ การทำาลายโปรตนและไขมน หากรางกายจะตองอยในภาวะนเปนเวลานาน ความผดปกตในการหลงกลโคคอรตคอยด สาเหตมกเนองมาจาก ตอมหมวกไตไมทำางาน เพราะไมมการหลง ACTH ซงมสาเหตไดทงจาก ไฮโปธาลามส ไมหลง CRH หรอตอมใตสมองไมหลง ACTH

2. ฮอรโมนสเตยรอยด (steroid hormone) ฮอรโมนสเตยรอยดมบทบาทสำาคญอยางสงสดในการรกษาภาวะ

สมดลของรางกาย และความสมบรณของระบบสบพนธ ตวอยาง เชน aldosterone mineralocorticoid adrenal จำาเปนสำาหรบการรกษาสมดลเกลอ และความดนเลอด ขณะท glucocorticoids adrenal ใชสำาหรบควบคมเมทาบอลซมของคารโบไฮเดรต และตอบสนองตอแรงกดดน และสงเราตาง ๆ ในเพศหญงฮอรโมนสเตยรอยดทรงไข และรก คอ เอสโตรเจน (estrogen) และ โปรเจสเตอโรน (progesterone) จำาเปนสำาหรบการพฒนา ของฟอลเคล การตกไข การพฒนา และการรกษาลกษณะทสองของเพศหญง (secondary sex characteristic) และ

13

สงเสรมการตงครรภ สวน เทสโทสเตอโรน (testosterone) เปนฮอรโมนเพศชายทมอยมากทสด เปนตวสงเสรมการสราง แอนโดรเจน (androgen) และ ไดไฮโดรเทสโทสเตอโรน (dihydrotestosterone) ซงจำาเปนสำาหรบการสรางอสจ การพฒนา และการรกษาลกษณะทสองของเพศชาย

เมอฮอรโมนสเตยรอยดมบทบาทสำาคญตอสงมชวตมากมาย การรกษาความเขมขนของ steroids hormone ในรางกายผานการควบคมการสงเคราะหจงเปนสงสำาคญ สงทนาพจารณาอยางยงคอการควบคมการสงเคราะหฮอรโมนสเตยรอยดทเกดขนใน Hypothalamic-Pituitary-Adrenal/Gonadal Axis ผานการทำางานของ trophic hormone, releasing hormone และ trophic hormone ของมน ไดแก adrenocorticotrophic hormone (ACTH) LH หรอ FSH ทหลงจากเซลลพเศษเซลลในพทอทารสวนหนา (anterior pituitary) ผานการทำางานของ corticotrophin releasing hormone(CRH) หรอ GnRH หลงจากทฮอรโมนเหลานถกหลงออกมาแลว จะทำางานรวมกบตวรบทจำาเพาะ (specific receptors) บนเยอหมเซลลของตอมหมวกไต และตอมลกหมาก และผานสอกลางคอ cAMP หรอระบบ ca2+second messenger ซงจะทำาใหเกดการสงเคราะหฮอรโมนสเตยรอยดในระดบทเหมาะสมขนอยชนดเนอเยอ และเซลล

ก � ร ค ว บ ค ม ก � ร ส ง เ ค ร � ะ ห ฮ อ ร โ ม น ส เ ต ย ร อ ย ด (steroid hormone)

มการศกษามากมายทแสดงใหเหนวาขนตอนทควบคมอตราการสงเคราะห (late limiting step) ฮอรโมนสเตยรอยด คอการทำางานของเอนไซม Cytochrome P450 side chain cleavage (P450scc) ทเยอหมชนในของไมโตคอนเดรย และการเปลยนโคเลสเตอรอล (cholesterol) เปนเพรกนโนโลน (pregnenolone) ซงเปนขนตอนท

14

ควบคมอตราการสงเคราะหฮอรโมนสเตยรอยดทกตว แตการศกษาลาสดพบวา ขนตอนทควบคมอตราการสงเคราะห ทแทจรงคอ การขนสงโคเลสเตอรอลจากเยอหมชนนอกของไมโตคอนเดรย เขาสเยอหมชนใน และเอนไซม P450scc

การแพรของโคเลสเตอรอลทเปนไฮโดรโฟบคผานชองวางระหวางเยอหมชนนอก และชนในของไมโตคอนเดรย (intermembrane space) ทเปนนำา (hydrophillic) เกดขนชามาก (Rennert et al., 1993) เพราะฉะนน การขนสงโคเลสเตอรอลจากเยอหมชนนอกไปยง P450scc จงเปนขนตอนทควบคมอตราการสงเคราะหฮอรโมนสเตยรอยด กลาวโดยงายคอ ผลตภณฑรวมทกอยางของสเตยรรอยดถกควบคมโดยปจจยใด ๆ ททำาใหการขนสงของโคเลสเตอรอลจากของเยอหมชนนอกไมโตคอนเดรยผานชนนำาระหวางเยอหมไดสะดวก มผวจยหลายทานไดสงเกตวาขนตอนทควบคมอตราการสงเคราะหนไวตอตวยบยงของการสงเคราะหโปรตน ดวยเหตน จงมการศกษาเพอคนหาโปรตนทเปนตวควบคมตามสนนษฐานนนขน (Ferguson, 1963; Garren et al., 1965) หนงในบรรดาโปรตนเหลาน ไดแกโปรตน StAR (Steroidogenic acute regulatory protein) ซงเปนโปรตนเดยวเทานนทตรงกบขอสนนษฐานทตงไว

3. Steroidogenic Acute Regulatory (StAR) protein Steroidogenic acute regulatory protein (StAR) คอ

โปรตนทรบผดชอบสำาหรบการควบคมการสงเคราะหฮอรโมนสเตยรอยด โปรตน StAR ของมนษยเปนโปรตนขนาด 37 kDa (precursor) และ 30 kDa (mature) ของไมโตคอนเดรยทพบครงแรกในเซลล ACTH-stimulate adrenocortical (Krueger and Orme johnson, 1983 ) จากลำาดบนวคลโอไทดของ cDNA ขนาด 1456 คเบส ถกแปลรหสเปนโปรตนขนาด 284 กรดอะมโน อยางรวดเรวเมอไดรบการกระตนจากฮอรโมน เพอทำาการเปลยนโคเลสเตอรอลเปนเพรกนโนโลน จากนน ม

15

การคนพบความเกยวพนทเปนบวกระหวางการปรากฎของโปรตนน และการสรางสารสเตยรอยดไดเกดขนมากมาย อยางไรกตาม ขอมลความสมพนธระหวางการแสดงออกของโปรตนเหลานน กบการสรางสารสเตยรอยดยงคงมนอยอย

ความสำาคญของโปรตน StAR ในการควบคมการสรางสารสเตยรอยดไดปรากฏอยางชดเจนในการศกษาโรคแตกำาเนด congenital lipoid adrenal hyperplasia (lipoid CAH) โรค lipoid CAH ทำาใหเสยชวตไดเนองจากทารกเกดใหมไมสามารถทจะสงเคราะหสเตยรอยดได โดย lipoid CAH ขดขวางการสงโคเลสเตอรอลให P450scc คลายกบความบกพรองในการแสดงออก หรอการทำางานของโปรตน StAR เมอศกษาลำาดบ

16

รปท 6 แสดงกลไกการนำาโคเลสเตอรอลเขาสไมโตคอนเดรยของโปตน StAR (ทมา : Stocco, 2000 )

17

รปท 7 แสดงการทำางานของเอนไซมตาง ๆ ในการสงเคราะหฮอรโมนสเตยรอยด โดยเรมจากการทำางานของ P450scc enzyme ในการเปลยนโคเลสเตอรอลเปนเพรกนโนโลน

ของ cDNA ทแปลรหสเปนโปรตน StAR ทเตรยมจาก testicular tissue ของคนไข lipoid CAH (Lin et al., 1995) พบการกลายพนธแบบ nonsense mutation ในลำาดบนวคลโอไทดของยนโปรตน StAR การศกษาดงกลาวชวยยนยนความสำาคญ และบทบาททจำาเปนอยางยงของโปรตน StAR ในการผลตสเตยรอยดกลไกก�รทำ�ง�นของโปรตน StAR

เมอมการกระตนของฮอรโมน โปรตนตนตอของโปรตน StAR ขนาด 37 kDa จะถกสงเคราะหอยางเรว และถกนำาเขาไป และประมวลผลโดยไมโตคอนเดรย ผาน N-terminal signal sequence ดวยการสรางการเชอมตอระหวางเยอหมภายใน และภายนอกของไมโตคอนเดรย (Stocco and Clark, 1996) ชวยในการขนสงโคเลสเตอรอลจากเยอหมชนนอกเขาสเยอหมชนในของไมโตคอนเดรยเพอการสงเคราะหเพรกนโนโลนท P450scc หลงจากการประมวลผล เยอหมจะแยกออกจากกน และไมมการขนสงโคเลสเตอรอลผานเยอหมเกดขนอก โดยปราศจากสงเคราะห และการประมวลผลของโปรตนตนตอของโปรตน StAR อยางไรกตาม จากรายงานของ Arakane et al. (1996) แสดงใหเหนวา แมจะมการตดกรดอะมโนทางปลายดาน N ของโปรตน StAR ออก 62 ตว กไมไดสงผลกระทบตอการผลตภณฑสเตยรอยดในเซลล COS-1 แสดงวาโปรตน StAR ถกนำาเขาไปในไมโตคอนเดรยเพยงสวนหนงเทานน อยางไรกตาม การตดกรดอะมโนทางปลาย C ออก 10 ตว จะสงผลในการลดผลตภณฑของสเตยรอยดลง 50% ขณะทการตดออกกรดอะมโนออก 28 ตว สงผลใหไมมการผลต

18

สเตยรอยดเกดขน (Arakane et al., 1996) ดวยเหตน ปลายดาน C ของโปรตน StAR มความสำาคญสงสดในการขนสงโคเลสเตอรอล

4. คว�มรทวไปเกยวกบโมโนโซเดยมกลต�เมต หรอผงชรส ผงชรส จดอยในกลม flavor enhancer โดยทสารกลมนจะไมมรส

ชาด แตเมอเตมลงในอาหารจะทำาใหอาหารนนมรสชาดดขน ในกลมนจะมหลายชนด ทรจกกนด คอ MSG หรอ monosodium glutamate ซงใชกนมานาน และเปนทนยม ตงแต พ.ศ. 2455 ทำาใหมการเรยก MSG วา ผงชรส ซง MSG เปนเกลอโซเดยมของกรดกลตามค มสตรทางเคม คอ

Na-CO-CH2-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH

ทง MSG และกรดกลตามค ตางมคณสมบตทเปน flavor enhancer ถาหากอยในรปของ free form แตถากรดกลตามคมการเกาะกบกรดอะมโนอน จะกลายเปนโปรตน จะไมมคณสมบตของ flavor enhancer ดงนนจะเหนวาถามการทำาใหโมเลกลของโปรตน แยกออกเปนกรดอะมโน จะเกดกรดกลตามคทเปนอสระ กสามารถทำาใหอาหารมรสอรอยได สำาหรบ monosodium glutamate หรอ MSG หรอ ทเราเรยกวา ผงชรสนน คนพบครงแรก โดยชาวญปน ชอ Kikunae lkeda ไดจากสาหรายทะเล (laminaria japonica) จากการศกษาความเปนพษ โดยหลาย ๆ หนวยงาน ทงภาคผผลตเองและภาครฐในป พ.ศ. 2538 ยงไมพบความ เปนพษทเกดจากการใช MSG ในลกษณะทเปน flavoring โดยการใชจะมในประมาณ 0.1-0.8 % (~1/2 ชอนชา) แตพบวาในผทแพ จะเกดอาการทเรยกวา chinese restaurant syndrome เนองจากผทแพมจำานวนนอย ทำาใหทาง FAO/WHO ยงคงจดให MSG เปนสารทปลอดภยในการใช และไมกำาหนดคา ADI แตเนองจากมองคกร หลายแหงทเหนวาควรมการศกษาและใหขอมลอยางถกตองแกผบรโภค จงควรมการศกษาถงความเปนพษในกลมผทเกดอาการแพ

19

เนองจากทมนกวจยนำาโดยนายฮโรช โอกโระ แหงมหาวทยาลยฮโรซากในญปนทดลองแบงหนออกเปน 3 กลม กลมแรกใหกนอาหารทใสผงชรสมาก ๆ สวนอกกลมกนอาหารใสผงชรสปานกลาง และกลมทสามกนอาหารทไมใสผงชรสเลย ปรากฎวาหนกลมแรกทกนอาหารใสผงชรสมากทสดมปญหาตามองไมเหน และเยอเรตนาหรอเยอชนในสดของสวนหลงลกตาทมหนาทรบภาพจากแกวตานนบางลงไปถง 75% และผลทดสอบการทำาปฏกรยากบแสงปรากฏวาหนมองไมเหนเลย สวนหนกลมทกนอาหารปนผงชรสปานกลางกไดรบความเสยหายเชนกน แตไมมากเทากลมแรก ทงนผงชรสคอกรดอะมโนททำาหนาทเปนสารเคมทชวยสงสญญานสอสารในเซลลสมอง ผลการศกษาหลายรายการกอนหนานพบวา เมอฉดผงชรสเขาไปในตาโดยตรง จะไปทำาลายประสาทเสยหาย

ผลวจยลาสดของโอกโระ นบเปนงานวจยชนแรกทแสดงใหเหนวา อาหารทใสผงชรสอาจทำาใหตาบอดไดเชนกน โดยนกวจยพบผงชรสในปรมาณเขมขนสงอยในของเหลวใสทเปนนำาหลอเลยงเยอเรตนา จงสรปวาผงชรสจะเกาะอยทเซลลเยอเรตนาบางสวน และสามารถถกทำาลายไดในทสด อกทงจะเขาไปกอกวนการทำางานของเซลลทยงเหลออยในการสงสญญานไปยงสมอง นกวจยกลมนระบวา อาหารทมผงชรสเปนสวนประกอบในปรมาณ 20% ถอวาเปนสดสวนสง แมยงไมทราบแนชดวากนผงชรสในปรมาณเทาใดจงจะไมเปนอนตราย แตถงกนในปรมาณนอย กอาจจะสะสมไวนานเปนสบ ๆ ป กอนจะออกฤทธในภายหลงพษภยของโมโนโซเดยมกลต�เมตหรอผงชรส

ไดมการศกษาวจยเกยวกบผงชรสกนมากและพบวาสารเคมตวนมพษภยตอคนและสตวทดลองมากมาย จะขอกลาวถงพษภยของผงชรสทมผลกระทบตอ 3 กลมใหญ ๆ คอ กลมทแพผงชรส กลมทมปญหาเกยวกบไต และกลมทารกและหญงมครรภ ซงมการเรยกรองมาโดยตลอดวา ผงชรสหรออาหารทใชผงชรสควรมคำาเตอนวา ไมควรใชผสมอาหารสำาหรบทารกหรอหญงมครรภหรอคนปวยและผทแพผงชรส

20

ก�รแพผงชรสมขอมลจากหลาย ๆ แหลงยนยนวาการกนอาหารทมผงชรสผสมอย

ทำาใหเกดอาการแพหรอ Chinese Restaurant Syndrome ไดซงจะมอาการชา และรอนวบวาบท ปาก ลน ใบหนา โหนกแกม ตนคอ หนาอก บางคนมผนแดงเกดขนตามตว แนนหนา อก หายใจไมสะดวก เปนตน เปนทร กนวาการกนเคมสมพนธกบโรคความดนเลอดสง เรองนเปนคำายนยนจากการศกษางานวจยใน 24 ประเทศทวโลกในผคนถง 47,000 คน วาถาลดปรมาณการบรโภคโซเดยมไดจะลดระดบความดนเลอดได และแนนอนวาความดนเลอดสงนาน ๆ ทำาใหเกดภาวะไตวายดวย เนองจากโมโนโซเดยมกลตาเมตหรอ ผงชรส เปนสารทมโซเดยมสงแตไมเคม ดงนนผงชรสจงยงมอนตรายสงเพราะถามความเคมผบรโภคจะยบยงตวเองได แตโซเดยมในผงชรสไมมรสเคม เพยง หวาน ๆ กวาจะรตววากนโซเดยมจากผงชรสเขาไปเยอะ เมอกนอาหารมอนนอมแลว ทำาใหเกดอาการกระหายนำาอยางหนกอนตร�ยทเกดจ�กผงชรส

อาการแพผงชรส ซงจะมอาการชา และรอนวบวาบท ปาก ลน ใบหนา โหนกแกม ตนคอ หนาอก บางรายมผนแดงเกดขนตามตว แนนหนาอก หายใจไมสะดวก เปนตน จนเปนทรจกและขนานนามอาการแพผงชรสวา กลมอาการโรคภตราคารจน หรอ Chinese Restaurant Syndrome ประชากรทวโลกมอาการแพผงชรสดวยอาการ ตางๆ ดงตอไปน

- ทำาลายสมองสวนหนาทเรยกวา ไฮโปทาลามส (hypothalamus) ซงเปนสวนสำาคญในการควบคมการเจรญเตบโต และระบบสบพนธของรางกาย ทำาใหการเจรญเตบโตชา ปญญาออน ระบบสบพนธผดปกต เปนหมน

- ทำาลายระบบประสาทตา สายตาเสยหรอเกดตาบอดได โดยเฉพาะอยางยงในสตวทดลอง ยงอายนอยจะยงเกดผลรายมาก

- ทำาลายกระดกและไขกระดก ซงเปนสวนทผลตเมดเลอดแดงในรางกาย อาจทำาใหเกดโรคโลหตจางได

21

- ทำาใหวตามนในรางกายลดลง โดยเฉพาะอยางยง วตามนบ-6 ทำาใหรางกายผดปกตและเปนโรคผวหนงไดงาย (การคนพบนทำาใหวตามนบ-6 แกโรคภมแพผงชรสได)

- เกดโรคมะเรง โดยเฉพาะ อยางยงผงชรสทผานความรอนสงๆ ผงชรสทถกความรอนสงจด เชน การ ป ง ยาง เผา จะเปลยนโครงสรางทางเคมเปนสารกอมะเรง กลพ 1 และกลพ 2 อาจเกดอนตรายตออวยวะภายในไดหลายแหง เชน ลำาไสใหญ ตบ และสมอง เปนตน

- ทำาลายระบบประสาทสวนกลาง (Central Nervous System) ทำาใหเปนโรคประสาทไดงายขน ในปจจบนมผปวยดวยโรคประสาทกนมากขนเรอยๆ นาศกษาวาเกดจากผงชรสจรงหรอไม

- เปลยนแปลงโครโมโซม ทำาใหรางกายเกดผดปกต ปากแหวง หแหวง แขนขาพการ เปนตน

- ถากนมากผงชรสจะผานเยอกนระหวางรกภายในรางกายของผเปนมารดากบทารกในครรภได ทำาใหทารกในครรภไดรบผลกระทบจากผงชรสได

- ผบรโภคไดรบโซเดยมมากเกนความจำาเปน เพมภาระแกไต อาจทำาใหเกดอาการไตวายได

5. ง�นวจยทเกยวของมการนำาโมโนโซเดยมกลตาเมต (monosodium glutamate) มา

ใชในการประกอบอาหารเพอชวยเสรมรสชาตอาหารใหดขน โมโนโซเดยมกลตาเมตเปนเกลอของกรดกลตามค ซงเปนกรดอะมโนชนดหนงทพบในธรรมชาต เชน ในพชทะเล ถวเหลอง หวพช ในกรณทรางกายไดรบกลตาเมตในปรมาณทมากเกนไปจนเกนความตองการ อาจจะทำาใหมผลเสยตอสขภาพรางกายของผบรโภค

กลตาเมตนอกจากจะเปนกรดอะมโนททำาหนาทในการเปนหนวยยอยของโปรตนแลว กลตาเมตยงเปนสารสอประสาท (neurotransmitter)

22

ทำาใหมการสอสารระหวางเซลลประสาท ในสตวเลยงลกดวยนม จดเปน excitatory transmitter ทสำาคญ โดยเฉพาะในซรเบลลม ถาใสกลตาเมตโดยตรงทเยอหมเซลล จะกระตนเซลลประสาทไดทกชนด และจดเปน neurotoxic ถาฉดในปรมาณมากเขาในสตวแรกเกด จะทำาให สมองสวน hypothalamus ถกทำาลาย ผลของโมโนโซเดยมกลตาเมตทมตอการเจรญเตบโต ลกษณะโครงสราง ขนาดและจำานวนเซลล ประสาทบรเวณ barrel ของ cerebral cortex ในหน (mice) พบวาการฉดโมโนโซเดยมกลตาเมต เขาใตผวหนง ในขนาดทเพมจาก 2.2 mg/g of b.w. ไปจนถง 5.0 mg/g of b.w. เปนเวลา 10 วน จะทำาใหจำานวนแมหนตายกอนคลอดเพมขน จำานวนลกหนตอแมหนลดลง อตราการตายของลกหนเพมขน พบความผดปกตของลกหนแรกเกด คอ ปากแหวง ไมมตา และมสมองอยนอกกะโหลกศรษะ นำาหนกตวและนำาหนกสมองในลกหนแรกเกดลดลงอยางมนยสำาคญ สำาหรบการเจรญเตบโตของ barrel ของสมองไมพบมความผดปกต แตพบวาพนทของ barrel และจำานวนของเซลลประสาทใน barrel ตำากวากลมควบคมอยางมนยสำาคญ และถาใชกระตนเซลลประสาทอยางรนแรงอาจทำาใหเซลลประสาทถกทำาลายได ดงนนจงมการนำากลตาเมตมาใชเปน exitatotoxin ซงจะไมทำาลายเซลลขางเคยง มการตงสมมตฐาน ทวาการขาดเลอดไปเลยงสมองบางสวน เชน อาจเกดจากการอดตน ของหลอดเลอดไปเลยงสมอง จะทำาใหมการหลง กลตาเมต ออกมามาก ซงทำาใหมการทำาลายเนอสมองอยางมาก เนองจากฤทธของกลตาเมตซงเปน excitotoxin ผลนจะมากกวาการขาดเลอดไปเลยงสมองมการศกษาผลของโมโนโซเดยม กลตาเมตตอภาวะการเกดโรคทางสมองทมสาเหตมาจากการทำาลายของระบบประสาท เชน การเกดโรคสมองเสอม หรอการเกดอาการปวดชนดเฉยบพลน (stroke) ซงโรคเหลานเปนทเชอกนวาอาจจะมสาเหตมาจากการมระดบของโมโนโซเดยมกลตาเมตในสมองทสงเกนไป และเกดอาการแพตางๆ เชน Chinese Restaurant Syndrome (CRS) สามารถพบไดในกลมคนทมความไวตอโมโนโซเดย

23

มกลตาเมตจากงานวจยทผานมาไดมการทดสอบและแสดงใหเหนวา การฉดโมโน

โซเดยมกลตาเมตเขาไปในหนทอยในระยะ postnatal (ประมาณ 4 เดอนหลงคลอด) ทำาใหเกดโรคทางระบบประสาท (neurotoxic lesions) ของสมองสวน hypothalamus และสมองสวน circumventricular ogan (Olney, 1969; Burde et al., 1971 และ Lemke-Johnson and Reynolds, 1974) และยงมการรายงานถงความผดปกตของการทำางานของระบบตอมไรทอและขบวนการมตาบอลซม ในระหวางทหนอยในระยะตวเตมวย (adult rats) ผลของโมโนโซเดยมกลตาเมตในหนตอการทำางานของระะบบประสาทนนกยงสงผลทำาใหเกดความผดปกตตางๆ อกมากมาย เชน ทำาใหหนมการเจรญเตบโตทชากวาปกต เนองจากระดบของ growth hormone ลดลง การมความเสยงสงตอการเปนหมนเนองจากการลดลงของระดบฮอรโมนสเตยรอยดทผลตจากตอมเพศ (gonadal steriods ) การเกดโรคอวน (obesity) และความผดปกตของระดบไทรอยดฮอรโมน (Redding et al., 1971; Bakke et al., 1978; Nemeroff et al., 1977 ; Rodriguez-Si-erra et al., 1980 and Nemeroff et al., 1981)

จากการวจยของ Skultetyova et al. (1998) พบวาการทระดบของ corticosterone hormone ไมมการเปลยนแปลงและมแนวโนมทจะสงขนเปนผลมาจากระดบความเครยดของสตวทเพมขน เนองมาจากระดบของโมโนโซเดยมกลตาเมตในกระแสเลอดทสงกวาปกตและอตราการกำาจดออกของ corticosterone ของเซลลตบทลดชาลง

การศกษาผลกระทบทเกดขนจากการใชโมโนโซเดยมกลตาเมตเปนสารปรงแตงในอาหาร พบวาโมโนโซเดยมกลตาเมตมผลโดยตรงตอการทำาลายของเซลลประสาท ซงในปจจบนความรความเขาเกยวกบผลเสย ของโมโนโซเดยมกลตาเมต ทอาจมผลตอสขภาพนนไดรดหนาไปตามลำาดบ อยางไรกตามการศกษาผลเสยของโมโนโซเดยมกลตาเมต ตอระบบการ

24

ทำางานของระบบตอมไรทอ จากการวจย (Bakke et al., 1978) พบวาโมโนโซเดยมกลตาเมต มผลในการขดขวางการทำางานของระบบตอมไรทอเปนผลใหพฤตกรรมการแสดงออกของหนผดปกต ซงงานวจยนสามารถใชยนยนการศกษาของ (Rodriguez -Sierr et al., 1971) ทไดทำาการศกษาพฤตกรรมและการขดขวางการทำางานของระบบตอมไรทอในหนตวเมย ทมสาเหตอนเนองมาจากโมโนโซเดยมกลตาเมต

นอกจากนยงมการศกษาผลของโมโนโซเดยมกลตาเมต ในหนแรกเกดตอ activity และ sensitivity ของ central nervous system-pituitary -adrenal axis (Magarinos et al.,1988) และ hypothalamic-pituitary-axis (Larsen et al.,1994) โดยผลเสยของโมโนโซเดยมกลตาเมต ตอการทำางานของระบบประสาทจะเกดขนจากการกระตนของเซลลประสาททมากเกนไป ทำาใหเกดการตายของเซลล และยงพบวาการควบคมการหลงของฮอรโมนทสรางมาจากตอม pituitary ( ไดแก ฮอรโมน -MSH, -endorphine และ ACTH) และการควบคมการทำางานของตอมหมวกไต (การหลงของฮอรโมน glucocorticoids ) นนผดปกตไปดวย (Conte-Devolx et al., 1981) ซงการทำางานทผดปกต ของตอมหมวกไตเปนสาเหตหลกของความผดปกตของการผลต ฮอรโมนสเตยรอยดททำาหนาทควบคมพฤตกรรมการแสดงออกทสำาคญ

6. หลกก�รของเทคนค Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

เปนเทคนคทรวมเอาเทคนค 2 อยาง มาใชรวมกน คอ Reverse Transcription (RT) ซงเปนการถอดรหสผนกลบจาก RNA เปน cDNA โดยใชเอนไซม Reverse Transcriptase หลงจากนนจงเพมจำานวนโดยใช cDNA เปนแมแบบ (template) ดวยวธ Polymerase Chain Reaction (PCR) โดยใชเอนไซม Taq /Tfl DNA

25

polymerase การเรมตนสงเคราะห cDNA จาก mRNA มวธทนยมทำากนอย 3 วธ ไดแก

1. เรมตนการสงเคราะหโดย 3’ (antisense) gene–specific primer เขาไปจบคสม(anneal) กบ mRNA แลวตอลำาดบนวคลโอไทด (extend) ดวยเอนไซม Reverase Transcriptase โดยใช mRNA เปนแมพมพสงเคราะหได cDNA ซงจะเปนแมพมพสำาหรบ 5’ (sense) primer สงเคราะห DNA สายใหมทเปนคสมกบ cDNA แลวจงเรมตนปฏกรยา PCR

2. เรมตนการสงเคราะหโดยใช oligo (dT) เปน primer ไปจบกบสวน poly A ทปลาย 3’ของ mRNA ทกๆ โมเลกล จากนนสงเคราะห cDNA โดยใชเอนไซม reverse transcriptase จากนนใช gene –specific PCR primers ในการเพมขยายดวยปฏกรยา PCR กบสวนของ cDNA ทจำาเพาะตามตองการ

3. เรมตนการสงเคราะหโดยใช random hexamers ไปจบกบหลายๆ ตำาแหนงบน mRNA จากนนสงเคราะห cDNA ดวยเอนไซม reverse transcriptase จงเรมตนปฏกรยา PCR โดยใช gene-specific primres เพมขยายสวนของ cDNA ทตองการตอไป

สวนเทคนค PCR เปนการเพมขยายจำานวนสารพนธกรรมททำาไดงายโดยปฏกรยาในหลอดทดลอง (in vitro) และในเซลล (in situ) มหลกการพนฐานเลยนแบบธรรมชาตของขบวนการ DNA replication โดยใชปฏกรยาลกโซของเอนไซม DNA polymerase (in vivo DNA replication) ททำาใหมการเพมจำานวนอณของ DNA เปน 2 เทา ในทกๆ รอบของปฏกรยา ซงจะม 3 ขนตอนในแตละรอบ ไดแก

1. Denaturation เปนขนทมอณหภมสงประมาณ 90 0C – 95

26

0C ทำาให DNA แมพมพ(template) ทเปนเกลยวค (double stranded DNA) แยกออกจากกนเปนสองสาย (two single strand) และทำาหนาทเปนแมพมพในการเกด DNA replication

2. Annealing เปนขนทม primers 2 สาย ทถกสงเคราะหใหมลำาดบนวคลโอไทดเปนคสมกบปลาย 3’ (3’ –end) ของ DNA แมพมพแตละสายเขาไปจบตรงลำาดบนวคลโอไทดทเปนคสมบนสาย DNA แมพมพ (annealing sites) ซงจะเกดขนเมอมอณหภมเหมาะสมในชวง 40 0C –60 oC

3. Extension เปนขนตอนการเพมขยายจำานวน DNA เกดขนโดยใชเอนไซม DNA polymerase เชน Taq DNA polymerase ซงทำาหนาทตอลำาดบนวคลโอไทด 5’ 3’

ลำาดบนวคลโอไทดของยน GAPDH ทใชในการเพมจำานวน(ขดเสนใต) ใชเปน standard control ในการเพมจำานวนยน StAR มขนาด 195 คเบส

บทท 3

วธก�รดำ�เนนก�รวจย

ก.วสดและอปกรณ และส�รเคม1.สตวทดลอง

ในการทดลองนใชหนแรท (rat) จำานวน 20 ตว โดยแบงเปน 2 กลม คอกลมทไดรบโมโนโซเดยม กลตาเมต (monosodium glutamate) ในอาหารจำานวน 10 ตว และกลมควบคมจำานวน 10 ตว

2.อปกรณ1. เครองชงทศนยม 2 ตำาแหนงและ 4 ตำาแหนง

27

2. เครอง Spectrophotometer (Shimazdu รน UV 1201, Japan)

3. เครอง Thermal Cycler (Techne, England)4. เครอง homogenizer ขนาด A5. ต freezer -20 C และ –70 C ยหอ (Harris, U.S.A.)6. ชดทำาเจล agarose electrophoresis (BIO-RAD, U.S.A.)7. Automatic pipet ขนาด 0.5-2, 2-10, 20-200 และ 100-1000

l (JENCONS, Finland) 8. Cuvette ขนาด 1ml9. Refrigerated Superspeed centrifuge (Sorvall รน RC-5B)10. Beaker ขนาด 10, 100, 500 และ 1000 ml11. Cylinder ขนาด 10 และ 100 ml12. Flask ขนาด 250 ml 13. Microtube ขนาด 200 ul, 500 ul และ 1500 ul 14. Blender15. เครองนงความดนไอ (autocrave)16. microwave

3.ส�รเคม1. สารเคมสำาหรบสกด total RNA โดยใช TRI REAGENT kit

(Sigma) ซงประกอบดวย guanidine thiocyanate และ phenol- chloroform - Isopropanol - 75% Ethanol- diethylpyrocabonate-treated water (DEPC-water)

28

2. สารเคมสำาหรบการทำา Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) โดยใช Promega’ Access RT- PCR Sytemประกอบดวย : - Backward primer (B1) (GAPDH)(5' ATTCTCAGCCTTGACTGTGCCG 3')- Forward primer (F1)(5' ATAGACAAGATGGTGAAGGTCG 3')- Backward primer (B2) (StAR)(5' AGGTCAATACTGAGCAGCCACG 3')- Forward primer (F2)(5' CAGGAGAATGGAGATGAAGTGC 3')

- Nuclease- Free Water - AMV/Tfl 5X Reaction Buffer- dNTP mix - 25 mM MgSO4 - 25 mM MgCl2- AMV Reverse Transcriptase- Tfl DNA Polymerase- Taq DNA polymerase- RNA sample / control

3. สารเคมอน ๆ- Agarose (Sigma )- DNA marker- Ethedium bromide- TAE buffer pH 8.0- Loading dye

ข. วธก�รทดลอง1.ก�รเลยงสตวทดลอง

เลยงหนแรทจำานวน 20 ตว โดยแบงเปน 2 กลม คอ กลมทไดรบโมโนโซ

29

เดยมกลตาเมตผสมในอาหารและกลมควบคมทไมไดรบโมโนโซเดยมกลตาเมต ซงหนทง 2 กลมทนำามาทดลองจะมอายระหวาง 3-4 สปดาห

หนทไดรบโมโนโซเดยมกลตาเมตจะผสมโมโนโซเดยมกลตาเมตในอาหารในอตราสวน 5 mg/100 g of body weight/day เปนเวลา 30 วน และชงนำาหนกตว จากนนทำาการผาตดเอาตอมหมวกไตของหนทง 2 กลมมาสกด total RNA และเกบไวทอณหภม -70C จนกวาจะนำามาทำาการทดลองตอไป

2. ก�รเตรยมอปกรณทปร�ศจ�ก Rnaseประเภทเครองแกว ลางอปกรณตางๆ เชน ขวดแกว และ

homogenizer ใหสะอาด ปลอยไวใหแหง แลวนำาไปหมดวยอลมเนยมฟลอยด นำาไปอบในตอบทอณหภม 161C 3 ชวโมง

ประเภททเปนพล�สตก ลางอปกรณใหสะอาด ปลอยไวใหแหง แลวนำาไปหมดวยอลมเนยมฟลอยด นำาไป autoclave ทอณหภม 121C 15 นาท

3. ก�รศกษ�ก�รแสดงออกของโปรตน StAR ในเนอเยอต�ง ๆ3.1 ก�รสกด total RNA จ�กเนอเยอต�ง ๆ

เนอเยอทนำามาศกษาในครงน ไดแก รงไข ตอมหมวกไต ตบ มาม และไต จากหนแรทปกต โดยสกด total RNA ตามวธของ Chomczynski (1987) และใช TRI REAGENT kit (Sigma) ทประกอบดวย gaunidine thiocyanate และ phenol วธการทดลอง

นำาเนอเยอตาง ๆ ของหนมาบดใน TRI REAGENT ใหละเอยดโดยใชเนอเยอ 1 กรม ตอ TRI REAGENT kit (Sigma) 1 ml แลวตงทงไวทอณหภมหอง 5 นาท หลงจากนนเตม chloroform จำานวน 0.2 ml และเขยาประมาณ 15 วนาท แลวตงทงไวทอณหภมหอง 15 นาท หลงจากนนนำาไปเซนตรฟวจ ท 12,000 g ทอณหภม 4C เปนเวลา 15 นาท แลวเกบ aqueous phase ชนบนสดซงเปนชนนำาทม total RNA หลงจากนนเตม

30

isopropanal จำานวน 0.5 ml ตงทงไวทอณหภมหอง 5 – 10 นาท แลวนำาไปเซนตรฟวจท 12,000 g ทอณหภม 4C เปนเวลา 10 นาท RNA จะตกตะกอนอยทกนหลอด เทสวนทเปน supernatant ทง แลวลางตะกอน RNA ดวย 75 % ethanol จำานวน 1 ml แลวนำาไปเซนตรฟวจท 7,500 g ทอณหภม 4C เปนเวลา 5 นาท หลงจากนนเกบ pellet แลวปลอยให ethanol ระเหยออกจนหมดทอณหภมหอง ใชเวลาประมาณ 5 – 10 นาท และละลาย pellet ดวย RNase free water 20 ul

3.2 ก�รวเคร�ะห total RNA3.2.1 การวเคราะหดวยวธ spectrophotometryการวเคราะหหา total RNA และตรวจสอบความบรสทธดวยวธ

spectrophotometry เปนการวดคา Absorbance ท 260 nm และ 280 nm โดยใชเครอง Spectrophotometer และทำาการตรวจสอบความบรสทธ ดงน

A260 = 1.0 จะเทากบ 40 ug ของ RNA ตอ ml A280: A260 1.7 จะถอวา RNA มความบรสทธสง

3.2.2 การตรวจสอบความบรสทธดวยวธ agarose gel electrophoresis

เตรยม agarose โดยละลาย agarose ใน 1X TAE buffer อนสารละลาย agarose ใน microwave

กวนเปนครงคราว จน agarose ละลายหมด ตงทงไวใหเยนลงประมาณ 60 0C จงเทลงบนแผนกระจกทม comb เสยบไวเรยบรอยแลว หลงจากนนทงเจลใหแขงตวทอณหภมหองอยางนอยประมาณ 30 นาท เมอเจลแขงตวดแลวคอยๆ ถอด comb ออก จะทำาใหเกดชองวางในเนอเจล เพอใสสารตวอยาง แลววางแผนเจลลงใน chamber แลวเตม electrophoresis buffer ลงใน chamber ใหทวมแผนเจลโดยประมาณ ระวงอยาใหมฟองอากาศในชองใสตวอยาง หลงจากนนผสมตวอยางกบ loading dye ในอตราสวน 5:1

31

แลว load ลงในชองใสสารตวอยาง (well) และใส DNA standard marker เพอเปนตวเปรยบเทยบขนาดดวย จายกระแสไฟทความตางศกยคงท 100 volt โดยใหดานทมสารตวอยางเปนขวลบ และสงเกตตำาแหนงส bromophenol blue วงไปจนเกอบถงขอบเจล จงปดเครองจายกระแสไฟ แลวนำาแผน agarose gel ไปยอมดวย ethidium bromide ประมาณ 30 นาท ดผลการทดลองภายใตแสง UV และบนทกผลโดยการถายภาพดวยกลองดจตอล

3.3 ก�รเพมจำ�นวนยน glyceraldehyde –3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) เพอใชเปน standard control ดวยวธ RT-PCR 3.3 A. การทำา Reverse Transcriptionนำา total RNA ทสกดไดมาใชเปน template ในการสงเคราะห first

strand cDNA จาก mRNA โดยใช Oligo (dT) primer และนำาไปใชในการเพมจำานวน DNA ดวยวธ PCR โดยใช specific primers ตอไป โดยเตรยมสวนผสมของสารละลายดงตอไปน (สำาหรบ 1 reaction )

RNA sample 1 ulAMV buffer 5 ul10 mM dNTPs mix 0.5 ulOligo ( dT ) primer 0.5 ul ( 1uM )25 mM MgSO4 1 ul ( 1mM )AMV reverse transcriptase 0.5 ul ( 0.1U/ ul )Add water to 25 ul

หลงจากนนนำาสวนผสมทเตรยมแลวเขาเครอง PCR โดยตงอณหภมสำาหรบ reverse transcription ท อณหภม 48 C เปนเวลา 45 นาท

32

3.3 B การเพมจำานวน DNA โดยวธ PCRนำา cDNA ทไดจากการทำา reverse transcription มาเพมจำานวนดวย

PCR โดยใช specific primers และเตรยม mixture ดงตอไปน (สำาหรบ 1 reaction)

cDNA 1 ulMg-free buffer 2.5 ulBackward primer (B1) 0.5 ulForward primer (F1) 0.5 ul10 mM dNTPs 0.5 ul

MgCl2 1 ulTaq DNA polymerase 0.5 ulAdd water to 25 ul

หลงจากนนนำาสวนผสมทเตรยมแลวเขาเครอง PCR โดยตงอณหภมดงตอไปน

ตงอณหภมสำาหรบ initial denaturation step ท 95 C2 นาท ตงอณหภมสำาหรบ denaturation step ท 95 C1 นาท ตงอณหภมสำาหรบ primer annealing step ท 68 C1 นาท

30 cycleตงอณหภมสำาหรบ extension step ท 72 C1 นาท

ตงอณหภมสำาหรบ final extension step ท 72 C7นาทตงอณหภม ท 4 C soak time

หลงจากนนตรวจหา PCR product ดวยวธ agarose gel electrophoresis โดย PCR product ของยน GAPDH มขนาด 195 bp ดงน

33

Forward GAPDH 5’ ATAGACAA GATGGTGAAGGTCG 3’ (33)

Backward GAPDH 5’ ATTCTCAGCCTTGACTGTGCCG 3’ (227)

GAPDH sequence 1 cgcatcttct tgtgcagtgc cagcctcgtc tcatagacaa gatggtgaag 51 gtcg gtgtga acggatttgg ccgtatcgga cgcctggtta ccagggctgc 101 cttctcttgt gacaaagtgg acattgttgc catcaacgac cccttcattg 151 acctcaacta catggtctac atgttccagt atgactctac ccacggcaag 201 ttcaa cggca cagtcaaggc tgagaatggg aagctggtca tcaacgggaa 251 acccatcacc atcttccagg agcgagatcc cgctaacatc aaatggggtg 301 atgctggtgc tgagtatgtc gtggagtcta ctggcgtctt caccaccatg 351 gagaaggctg gggctcacct gaagggtggg gccaaaaggg tcatcatctc 401 cgccccttcc gctgatgccc ccatgtttgt gatgggtgtg aaccacgaga 451 aatatgacaa ctccctcaag attgtcagca atgcatcctg caccaccaac 501 tgcttagccc ccctggccaa ggtcatccat gacaactttg gcatcgtgga 551 agggctcatg accacagtcc atgccatcac tgccactcag aagactgtgg 601 atggcccctc tggaaagctg tggcgtgatg gccgtggggc agcccagaac 651 atcatccctg catccactgg tgctgccaag gctgtgggca aggtcatccc 701 agagctgaac gggaagctca ctggcatggc cttccgtgtt cctaccccca 751 atgtatccgt tgtggatctg acatgccgcc tggagaaacc tgccaagtat

34

801 gatgacatca agaaggtggt gaagcaggcg gccgagggcc cactaaaggg 851 catcctgggc tacactgagg accaggttgt ctcctgtgac ttcaacagca 901 actcccattc ttccaccttt gatgctgggg ctggcattgc tctcaatgac 951 aactttgtga agctcatttc ctggtatgac aatgaatatg gctacagcaa 1001 cagggtggtg gacctcatgg cctacatggc ctccaaggag taagaaaccc 1051 tggaccaccc agcccagcaa ggatactgag agcaagagag aggccctcag 1101 ttgctgagga gtccccatcc caactcagcc cccaacactg agcatctccc

1151 tcacaattcc atcccagacc ccataacaac aggaggggcc tggggagccc

1201 tcccttctct cgaataccat caataaagtt cgctgcaccc tc

3.4 ก�รเพมจำ�นวนยน StAR โดยใช specific StAR primers ดวยวธ RT-PCRใช cDNA ทไดจากการทำา reverse transcription จากขอ 3.3. A มาใช

เปน template ในการเพมจำานวนยน StAR โดยใช specific StAR primers และเตรยมสวนผสมดงตอไปน

cDNA sample 5 ulMg-free buffer 2.5 ulBackward primer (B2) 0.5 ulForward primer (F2) 0.5 ul10 mM dNTPs 0.5 ul25 mM MgCl2 1 ulTaq DNA polymerase 0.5 ulAdd water to 25 ul

35

หลงจากนนนำาสวนผสมนนเขาเครอง PCR โดยตงอณหภมอณหภมดงตอไปน

ตงอณหภมสำาหรบ initial denaturation step ท 95 C2 นาท ตงอณหภมสำาหรบ denaturation step ท 95 C1 นาท ตงอณหภมสำาหรบ primer annealing step ท 60 C1 นาท

30 cycleตงอณหภมสำาหรบ extension step ท 72 C1 นาท

ตงอณหภมสำาหรบ final extension step ท 72 C7นาทตงอณหภม ท 4 C soak time

หลงจากนนตรวจหา PCR product ดวยวธ agarose gel electrophoresis โดย PCR product ของยน StAR มขนาด 437 bp ดงน

Forward StAR 5’ CAGGAGAATGGAGATGAAGTGC 3’ (421)

Backward StAR 5’ AGGTCAATACTGAGCAGCCACG 3’ (857)

StAR sequence 1 tgaagcattt aaggcagagc acttgctttg agccagctgc aggactcagg accttgaaag 61 gctctggaag aacaaatccc tgggagcagc agcagcaact gcagcactac cacagaaagc

36

121 atgttactag ctacattcaa gctgtgtgct gggagctcct acagacatat gcggaacatg 181 aaaggactga ggcatcaagc tgtgctagcc attggccaag agctgaaccg gagagcccta 241 ggggacccca gtcctgggtg gatgggtcag gtccggcgtc ggagctctct acttggttct 301 caactggaag caacactcta cagtgaccag gagctgtcct acatccagca aggagaggaa 361 gctatgcaaa aggccttggg catactcaac aaccaggaag gctggaagaa ggaaagccag 421 caggagaatg gagatgaagt gc taagtaag gtggtgccag gtgtgggcaa ggtgttccga 481 ctggaggtgc tgctagacca gcccatggac agactctatg aagaactggt ggaccgcatg 541 gaggccatgg gagagtggaa cccaaatgtc aaggaaatca aggtcctgaa gaagattgga 601 aaagacacag tcatcaccca tgagctggct gcagcagcag caggcaacct ggtggggccc 661 cgagacttcg taagcgtacg ctgtaccaag cgtagaggtt ccacctgtgt gctggcaggc 721 atggccacac actttgggga gatgcctgag caaagcggtg tcatcagagc tgaacacggt 781 cccacctgca tggtgcttca tccactggct ggaagtccct caaagaccaa actca cgtgg 841 ctgctcagta ttgacctcaa ggggtggctg ccaaagacca tcatcaacca agtcttatca 901 cagacccaga tagagttcgc cagccacttg cgcaagcgct tggagtccag ccctgcctct 961 gaggcccagt gttaaggact gcccaccaca tctacctgca cgccattgga agttctcaca 1021 ggaagtctgc aagtctgttc accttcagcc aaggacaacg agaggggtag tagtcattag 1081 acactaggac tgactggtaa aaacgtacta caggaaaaca gaactgaggc ttagaataaa 1141 ggttctgcag tgtctg

37

4. ก�รศกษ�ก�รแสดงออกของโปรตน StAR ในตอมหมวกไตหลงไดรบโมโนโซเดยมกลต�เมต4.1 ก�รสกด total RNA จ�กตอมหมวกไต

นำาตอมหมวกไตของหนทงสองกลมมาบดใน TRI REAGENT ใหละเอยดโดยใชตอมหมวกไต 1 ตอม ตอ TRI REAGENT kit (Sigma) 1 ml แลวทำาการทดลองตามขอ 3.1

4.2 ก�รวเคร�ะห total RNA วเคราะหหา total RNA และตรวจสอบความบรสทธของ RNA จากหน

ทงสองกลม ดวยวธ spectrophotometry โดยการวดคา Absorbance ท 260 nm และ 280 nm และวธ agarose gel electrophoresis เชนเดยวกบขอ 3.2.

4.3 ก�รเพมจำ�นวนยน GAPDH เพอใชเปน standard control

เนองจากการเปรยบเทยบระดบการแสดงออกของยนนน จำาเปนตองมการปรบปรมาณของ standard control ซงกคอ ยน GAPDH ของกลมควบคม และกลมทดลองใหมขนาด และความเขมของแถบ PCR product ทเกดขนเทากนเสยกอน โดยการปรบปรมาณของ cDNA ทใชเปนตนแบบในการเพมปรมาณยน เมอไดปรมาณ cDNA ททำาใหขนาด และความเขมของแถบ PCR product ทเกดขนเทากนของทงสองกลม แลว จงใชปรมาณ cDNA นนในการเพมจำานวนของยน StAR

4.3 A. การทำา Reverse Transcriptionนำา total RNA ทสกดจากตอมหมวกไตทง 2 กลม มาใชเปน template

ในการสงเคราะห first strand cDNA จาก mRNA โดยใช Oligo (dT) primer เพอใชเปนตนแบบในการเพมปรมาณ DNA โดยเตรยมสวนผสมดงตอไปน (สำาหรบ 1 reaction )

38

RNA sample 1 ulAMV buffer 5 ul10 mM dNTPs mix 0.5 ulOligo ( dT ) primer 0.5 ul ( 1uM )25 mM MgSO4 1 ul ( 1mM )AMV reverse transcriptase 0.5 ul ( 0.1U/ ul )Add water to 25 ul

หลงจากนนนำาสวนผสมทเตรยมแลวทง 2 tube เขาเครอง PCR โดยตงอณหภมสำาหรบ reverse transcription ท อณหภม 48 C เปนเวลา 45 นาท

4.3 B การเพมจำานวน DNA ของยน GAPDH โดยวธ PCRทำาการปรบปรมาณของ cDNA ทใชเปนตนแบบในการเพมปรมาณ

DNA ของยน GAPDH ของทงสองกลม ใหสามารถเพมปรมาณยนไดขนาด และความเขมของแถบ PCR product ทเกดขนเทากนของทงสองกลม เพอใชเปนปรมาณ cDNA อางองในการเพมจำานวนของยน StAR โดยนำา cDNA ทไดจากการทำา reverse transcription มาเพมจำานวนดวย PCR โดยใช specific primers และเตรยมสวนผสมดงตอไปน (สำาหรบ 1 reaction)

cDNA X ulMg-free buffer 2.5 ulBackward primer (B1) 0.5 ulForward primer (F1) 0.5 ul10 mM dNTPs 0.5 ul

MgCl2 1 ulTaq DNA polymerase 0.5 ulAdd water to 25 ul

39

หลงจากนนนำาสวนผสมทเตรยมแลว ทงสอง tube เขาเครอง PCR โดยตงอณหภมตามขอ 3.3 B แลวตรวจหา PCR product ดวยวธ agarose gel electrophoresis

4. 4 ก�รเพมจำ�นวนยน StAR โดยใช specific StAR primers

ใช cDNA ทไดจากการทำา reverse transcription ตามปรมาณทไดจากขอ 4.3 B ของแตละกลม มาใชเปน template ในการเพมจำานวนยน StAR โดยใช specific StAR primers และเตรยมสวนผสมดงตอไปน

cDNA sample (ทงสองกลม)X ulMg-free buffer 2.5 ulBackward primer 0.5 ulForward primer 0.5 ul10 mM dNTPs 0.5 ul25 mM MgCl2 1 ulTaq DNA polymerase 0.5 ulAdd water to 25 ul

หลงจากนนนำาสวนผสมนนเขาเครอง PCR โดยตงอณหภมตามขอ 3.4 และตรวจหา PCR product ขนาด 437 bp ดวย agarose gel electro phoresis

40

บทท 4

ผลก�รวจย

1.ผลก�รศกษ�ก�รแสดงออกของยน StAR ในเนอเยอต�ง ๆ จากการสกด total RNA จากเนอเยอตาง ๆ ไดแก รงไข ตอมหมวก

ไต ตบ มาม และไต ของหนปกตโดยใช TRI REAGENT kit (Sigma) ทประกอบดวย gaunidine thiocyanate และ phenol ตามวธของ Chomczynski (1987) จากนนนำา total RNA ทไดไปตรวจสอบความบรสทธดวยวธ spectrophotometry ทคาการดดกลนแสง 260 nm และ 280 nm ไดผลดงตารางท 1 และเมอนำามาตรวจสอบดวยวธ agarose gel electrophoresis พบแถบ RNA ทชดเจน 2 แถบ คอ แถบของ ribosomal RNA ขนาด 28s และ 18s ซงเปน RNA ทพบมากทสดในเซลลยคารโอตกเซลล (รปท 8 ) แสดงวา total RNA ทสกดไดมความบรสทธ และสมบรณเพยงพอทจะใชในการสงเคราะห cDNA เพอใชเปนตนแบบในการเพมปรมาณยนตอไป

เมอนำา total RNA ทสกดไดมาใชเปน template ในการสงเคราะห first strand cDNA โดยใช Oligo (dT) primer และนำาไปใชในการเพมจำานวนยนดวยวธ PCR โดยใช specific primers ของยน GAPDH และ StAR แลวตรวจสอบ PCR product ทไดดวยวธ agarose gel electrophoresis พบแถบของ DNA ขนาด 437 คเบสของยน StAR ในเนอเยอจากรงไข ตอมหมวกไต ตบ มาม และไต (รปท 10 ) แสดงวารงไข ตอมหมวกไต ตบ มาม และไต มการแสดงออกของยน StAR โดย

41

เปรยบเทยบกบการเพมปรมาณยน GAPDH ซงพบแถบของ DNA ขนาด 195 คเบส ในทก ๆ เนอเยอดงกลาว (รปท 9)

ต�ร�งท 1 แสดงผลการวดคา Absorbance ท 260 nm และ 280 nm ของ total RNA จากเนอเยอตาง ๆ

A260 A280 A260/280

ความเขมขน (ug/ul)

รงไข 0.056 0.035 1.60 2.24ตบ 0.048 0.029 1.65 1.92

ตอมหมวกไต

0.052 0.032 1.63 2.08

ไต 0.049 0.030 1.63 1.96มาม 0.041 0.024 1.71 1.64

หมายเหต ความเขมขนของ total RNA = A260 x 0.04 x dilution factor (1:1000)

42

รปท 8 แสดงผลการสกด total RNA จากเนอเยอตาง ๆ ของหนปกตโดยใช TRI REAGENT kit แลววเคราะหผลดวย agarose gel electrophoresis

1 = total RNA ทสกดจากตอมหมวกไต2 = total RNA ทสกดจากไต3 = total RNA ทสกดจากรงไข4 = total RNA ทสกดจากตบ5 = total RNA ทสกดจากมาม

43

รปท 9 ผลการวเคราะหการแสดงออกของยน glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) จากเนอเยอตาง ๆ โดยวธ RT-PCR และตรวจหา PCR product ขนาด 195 bp ดวยวธ agarose gel electrophoresis

1 = PCR product ของยน GAPDH จากตอมหมวกไต 2 = PCR product ของยน GAPDH จากไต 3 = PCR product ของยน GAPDH จากรงไข4 = PCR product ของยน GAPDH จากตบ5 = PCR product ของยน GAPDH จากมาม

44

437 bp

รปท 10 ผลการวเคราะหการแสดงออกของยน Steroidogenic Acute Regulatory (StAR) Protein จากเนอเยอตาง ๆ โดย วธ RT-PCR และตรวจหา PCR product ขนาด 437 bp ดวยวธ agarose gel electrophoresis

1 = PCR product ของยน StAR จากตอมหมวกไต 2 = PCR product ของยน StAR จากไต 3 = PCR product ของยน StAR จากรงไข4 = PCR product ของยน StAR จากตบ5 = PCR product ของยน StAR จากมาม

2.ผลก�รศกษ�ก�รเปลยนแปลงระดบก�รแสดงออกของยน StAR ในตอมหมวกไตทมผลม�จ�กก�รกระตนของโมโนโซเดยมกลต�เมต

เมอสกด total RNA จากตอมหมวกไตของหนปกต และหนทไดรบโมโนโซเดยมกลตาเมตในอาหารโดยใช TRI REAGENT kit (Sigma) ทประกอบดวย gaunidine thiocyanate และ phenol ตามวธของ Chomczynski (1987) แลวนำา total RNA ทสกดจากตอมหมวกไตทง 2 กลม ไปตรวจสอบความบรสทธดวยวธ spectrophotometry ทคาดดกลนแสง 260 nm และ 280 nm ไดผลดงตารางท 2 และตรวจสอบดวยวธ agarose gel electrophoresis พบแถบ RNA ทชดเจน 2 แถบ คอ แถบของ ribosomal RNA ขนาด 28s และ 18s ซงเปน RNA ทพบมากทสดในเซลล (รปท 11 ) แสดงวา total RNA ทสกดไดมความบรสทธ และสมบรณเพยงพอทจะใชในการสงเคราะห cDNA เพอใชเปนตนแบบในการเพมปรมาณยนตอไป

45

เมอนำา total RNA ทสกดไดมาใชเปน template ในการสงเคราะห first strand cDNA โดยใช Oligo (dT) primer และนำาไปใชในการเพมจำานวนยนดวยวธ PCR โดยใช specific primers ของยน GAPDH เมอทำาการปรบปรมาณของ cDNA ทใชเปนตนแบบในการเพมปรมาณ DNA ของยน GAPDH ของทงสองกลม ใหสามารถเพมปรมาณยนไดขนาด และความเขมของแถบ PCR product ทเกดขนเทากนของทงสองกลม เพอใชเปนปรมาณ cDNA อางองในการเพมจำานวนของยน StAR พบวากลมควบคม และกลมทไดรบโมโนโซเดยมกลตาเมตตองใชปรมาณ cDNA เทากบ 8 l และ 4 l ตามลำาดบ เมอนำาปรมาณ cDNA ดงกลาวไปเพมปรมาณยน StAR ดวยวธ PCR แลวตรวจสอบ PCR product ทไดดวยวธ agarose gel electrophoresis พบแถบของ DNA ขนาด 437 คเบสของยน StAR ในหนกลมทไดรบโมโนโซเดยมกลตาเมตมความเขม และขนาดของแถบ DNA ขนาดใหญกวากลมทไมไดรบโมโนโซเดยมกลตาเมต (รปท 13) แสดงวาโมโนโซเดยมกลตาเมตมผลตอการแสดงออกของยน StAR ในตอมหมวกไตโดยเปรยบเทยบกบการเพมปรมาณยน GAPDH ในหนทงสองกลม (รปท 12)

ต�ร�งท 2 แสดงผลการวดคา Absorbance ท 260 nm และ 280 nm ของ total RNA จากตอมหมวกไตของหน ปกต และหนทไดรบโมโนโซเดยมกลตาเมต

A260 A280 A260/280

ความเขมขน (ug/ul)

MSG 0.048 0.029 1.66 1.92No-MSG

0.042 0.025 1.68 1.68

หมายเหต ความเขมขนของ total RNA = A260 x 0.04 x dilution factor (1:1000)

46

รปท 11 แสดงผลการสกด total RNA จากเนอเยอตอมหมวกไตของหนปกต และหนทไดรบโมโนโซเดยมกลตาเมตโดยใช TRI REAGENT kit แลววเคราะหผลดวย agarose gel electrophoresis

1 = total RNA ทสกดจากตอมหมวกไตของหนกลมควบคม2 = total RNA ทสกดจากตอมหมวกไตของหนกลมทไดรบ

MSG

47

รปท 12 แสดงผลการหาปรมาณ cDNA ของกลมควบคม และกลมทไดรบ MSG ทให PCR product

ของยน GAPDH มขนาด และความเขมของแถบ PCR product เทากน

control = 8 lMSG treated = 4 l

48

รปท 13 แสดงผลการวเคราะหระดบการแสดงออกของยน StAR ในตอมหมวกไต

1 = PCR product ของยน StAR จากตอมหมวกไตของหนกลมควบคม

2 = PCR product ของยน StAR จากตอมหมวกไตของหนกลมทไดรบ MSG

บทท 5

49

สรป และวจ�รณผลก�รวจย

1. ก�รศกษ�ก�รแสดงออกของยน StAR ในเนอเยอต�ง ๆจากการศกษาการแสดงออกของยน StAR ในเนอเยอตาง ๆ ของหนปกต ไดแก รงไข ตอมหมวกไต

ตบ มาม และไต ดวยวธ Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) โดยสกด tota RNA จากเนอเยอตาง ๆ ดงกลาวมาใชเปน template ในการเพมปรมาณ DNA ของยน StAR โดยเรมจากการสงเคราะห cDNA สายแรกจาก total RNA ทสกดไดดวยวธ reverse transcription แลวจงนำาไปเพมปรมาณ DNA ดวยวธ PCR โดยใช specific StAR primer แลวตรวจสอบ PCR product ขนาด 437 คเบสของยน StAR พบแถบดเอนเอขนาด 437 คเบสจากทกเนอเยอดงกลาว แสดงวาในรงไข ตอมหมวกไต ตบ มาม และไต มการแสดงออกของยน StAR เมอเปรยบเทยบกบรายงานของ Bauer et al. (2000) และ Kusakabe et al. (2002) ทรายงานวาการแสดงออกของยน StAR จะพบในเนอเยอทมการสงเคราะหฮอรโมนสเตยรอยด (steroidogenic tissues) เชน รงไข อณฑะ และตอมหมวกไต นอกจากนจะพบการแสดงออกของยน StAR ไดบางในระบบทางเดนอาหาร มาม กลามเนอ และผวหนง แตการแสดงออกของยน StAR ทตบซงพบในการศกษาครงนยงไมปรากฏรายงาน

2.ก�รศกษ�ก�รเปลยนแปลงระดบก�รแสดงออกของยน StAR ในตอมหมวกไตทมผลม�จ�กก�รกระตนของโมโนโซเดยมกลต�เมต

จากการศกษาการแสดงออกของยน StAR ในเนอเยอตอมหมวกไตของหนกลมทไดรบโมโนโซเดยม กลตาเมตในอาหารเปรยบเทยบกบกลมควบคมทไมไดรบโมโนโซเดยมกลตาเมตในอาหารดวยวธ Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) โดยสกด total RNA จากเนอเยอตอมหมวกไตของหนทงสองกลมมาใชเปน

50

template ในการเพมปรมาณ DNA ของยน StAR โดยเรมจากการสงเคราะห cDNA สายแรกจาก total RNA ทสกดไดดวยวธ reverse transcription แลวจงนำาไปเพมปรมาณ DNA ดวยวธ PCR โดยใช specific StAR primer แลวตรวจสอบ PCR product ขนาด 437 คเบสของยน StAR พบแถบดเอนเอขนาด 437 คเบสของกลมทไดรบโมโนโซเดยมกลตาเมตในอาหารมขนาด และความเขมของแถบขนาดใหญกวากลมควบคม แสดงวาแสดงวาโมโนโซเดยมกลตาเมตมผลตอการแสดงออกของยน StAR ในตอมหมวกไตในลกษณะการกระตนใหมการแสดงออกเพมขน ซงอาจเปนผลโดยตรงของโมโนโซเดยมตอตอมหมวกไต หรอเปนผลโดยออมผานการกระตนของฮอรโมนจากตอมใตสมอง จากรายงานของ Reinhart et al. (1999) ทกลาวถงปจจยตาง ๆ ทมผลตอการแสดงออกของยน StAR ทำาใหมการแสดงออกเพมขนโดยกระตนใหมการถอดรหสของดเอนเอเพมขนไดแก LH GH IGF-1 FSH ACTH และ Ca 2+ สวนปจจยทลดระดบการแสดงออกของยน StAR ไดแก LPS Heat shock TGF PGF2 TNF AMP และ IF นอกจากน รายงานของ Wang and Stocco (1999) ยงกลาวถงปจจยทกระตนการแสดงออกของยน StAR คอ กรดอะแรชโดนก (arachidonic acid) ผาน cAMP pathway สวน Achermann et al. (2002) กลาววา SF-1 กระตนการแสดงออกของยน StAR เชนกน

จากการศกษาผลของโมโนโซเดยมกลตาเมตตอการแสดงออกของยน StAR ในตอมหมวกไตในครงน ซงพบวาโมโนโซเดยมกลตาเมตนน มผลตอการเพมขนของยน StAR ในตอมหมวกไต แตกยงไมสามารถสรปไดวาการแสดงออกของยน StAR ทเพมขนน เกดจากผลของโมโนโซเดยมกลตาเมตโดยตรง หรอเปนผลโดยออม แตการเพมขนของการแสดงออกของยน StAR นาจะเกยวของกบการตอบสนองตอภาวะแรงกดดนทเกดจากโมโนโซเดยมกลตาเมตโดยผานการสรางฮอรโมนสเตยรอยดซงเปนฮอรโมนทตอบสนองตอแรง กดดนตาง ๆ ทเกดขนกบรางกาย

51

หากพจารณาระดบการแสดงออกของยน StAR ทเพมขนนในแงของการรกษาสมดลของรางกาย (homeostasis) ยอมแปลผลไดวาผลของโมโนโซเดยมกลตาเมตทมตอตอมหมวกไตนนจะเปนไปในรปแบบของการเพมการทำางานของตอมหมวกไตใหทำางานไดดขน หรอทำางานมากขนในการสรางฮอรโมน สเตยรอยด และนาจะชวยทำาใหรางกายสามารถรกษาสมดลไดดขน แตหากพจารณาในแงของการทำางานทเพมขนของตอมหมวกไตยอมหมายถงภาวะทรางกายอยภายใตแรงกดดนมากขน จงมการแสดงออกของยน StAR เพมมากขนเพอลดแรงกดดนจากโมโนโซเดยมกลตาเมตทไดรบเขาไปในรางกาย นนคอโมโนโซเดยมกลตาเมตมผลตอรางกายในแงลบ และเปนผลเสยตอสขภาพ ดงนนการรบประทานอาหารทมโมโนโซเดยมกลตาเมตเปนสวนประกอบมากเกนไปยอมสงผลรายตอรางกาย จงมรายงานการศกษาเกยวกบพษภยของโมโนโซเดยมกลตาเมตเผยแพรอยมากมายจากอดตจนถงปจจบน

เอกส�รอ�งอง

Achermann JC, Ozisik G, Ito M, Orun UA, Harmanci K, Gurakan B Jameson JL. 2002. Gonodal

detemination and adrenal development are regulated by the orphan nuclear receptor steroidogenic factor-1, in a dose-de[pendent manner. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 84(4): 1829-1833.

52

Arakane F, Sugawara T, Nishino H, Liu Z, Holt HA, Pain D, Stocco DM, Miller WL & Strauss III JF.

1996. Steroidogenic acute regulatory protein (StAR) retains activity in the absence of its

mitochondrial import sequence: Implications for the mechanism of StAR action. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93:13731–13736.

Bauer MP, Bridgham JT, Langenau DM, Johnson AL, Goetz FW. 2000. Conservation of steroidogenic

acute regulatory (StAR) protein structure and expression in vertebrates. Molecular and Cellular Endocrinology. 168:119–125.

Bakke JZ, Lawerence N, Bennett J, Robinson S, Bowers CY. 1978. Late endocrine effects of

administrating monosodium glutamate to neonatal rats. Neuroendocrinology. 26:220-228.

Burde RM, Scheinker B, Keyes J. 1971. Acute effect of monosodium glutamate on the arcuate

nucleus of hypothalamus in mice and rats.Nature. 233:58-60.Ferguson JJ. 1963. Protein synthesis and adrenocorticotropin responsiveness. Journal of Biological

Chemistry. 238:2754–2759.Garren LD, Ney RL, Davis WW. 1965. Studies on the role of protein synthesis in the regulation of

corticosterone production by ACTH in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 53:1443–1450.

Krueger RJ, Orme-Johnson NR. 1983. Acute adrenocorticotropic hormone stimulation of adrenal

corticosteroidogenesis. Journal of Biological Chemistry. 258:10159–10167.

53

Kusakabe M, Todo T, McQuillan J, Goetz F, Young G. Characterization and expression of

steroidogenic acute regulatory protein and MLN64 cDNAs in trout. Endoc. (in press).Larsen PJ, Mikkelsen JD, Jessop D, Lightman SL, Chowdrey HS. 1994.Neonatal monosodium

glutamate treatment alters both the activity and the sensitivity of the rat hypothalamo-pituitary-

adrenocortical axis. J Endocrinol.141(3):497-503.Lemke-Johnson N, Reynolds WA. 1974. Nature and extend of brain lesion in mice related to

ingestion of monosodium glutamate. J neuropath Exp Neuol. 33:74-97.Lin D, Sugawara T, Strauss III JF, Clark BJ, Stocco DM, Saenger P, Rogol A & Miller WL. 1995. Role

of steroidogenic acute regulatory protein in adrenal and gonadal steroidogenesis.

Science. 267:1828–1831.Magarinos AM, Estivariz F, Morado MI, De Nicola AF. 1988.Regulation of the central nervous system-

pituitary- adrenal axis in rats after neonatal treatment with monosodium glutamate. Neuroendocrinology. 48(2):105-11.

Nemeroff CB, Konkol RJ, Bissette G, Youngblood W, Martin JB, Brazeau P, Rone MS, Prange

AJ, Breese GR, Kizer JS. 1977.Anlysis of the disruption in hypothalamic –pituitary regulation in rats

treatment neonatally with monosodium glutamate (MSG): evidence for involvement of tuberoinfundibular cholinergic and dopaminergic systems in neuroendocrine regulation. Endocrinology. 101:613-622.

Nemeroff CB, Lamartiniere CA, Mason GA, Squibb RE, Hong JS, Bondy SC. 1981. Marked reduction in

54

gonadal steroid hormone levels in rats treated neonatally with monosodium-L-glutamate: further evidence for disruption of hypothalamic-pituitary-gonadal axis regulation. Neuroendocrinology. 33:2265-267.

Olney J. 1969. Brain lesion, obesity and other disturbances in mice treated with monosodium

glutamate. Science. 164:719-721.Redding TW, Schally AV, Arimura A, Wakabayashi I. 1971. Effect of monosodium glutamate on some

endocrine function. Neuroendocrinology. 8:245-255.Reinhart AJ, Williams SC, Clark BJ, Stocco DM. 1999. SF-1(Steroidogenic Factor 1) and C/EBP

(CAAT Enhancer Binding Protein) cooperate to regulate the murine StAR (Steroidogenic

Acute Regulatory Protein) promoter. Molecular Endocrinology. 13:729–741.Rennert H, Chang YJ, Strauss III JF. 1993. Intracellular cholesterol dynamics in steroidogenic

cells: a contemporary view. In The Ovary. Pp.147–164. Eds EY Adashi and PCK Leung. Raven Press, New York

Rodriguez-Sierra JF, Sridaran R, Blake CA. 1971. Monosodium glutamate disruption of behavioral and

endocrine function in the female rat. Neuroendocrinology. 31:228-235.Skultetyova I, Kiss A, Jezova D. 1998. Neurotoxic lesion in duced by monosodium glutamate result in

increased adrenopituitary proopiomelanocortin gene expression and decressed corticosterone clearance in rats. Neuroendocrinology. 67:412-420.

Stocco DM. 2000. The role of the StAR protein in steroidogenesis: challenges for the future.

55

Journal of Endocrinology. 164:247–253Stocco MD, Clark B. 1996. Regulation of the acute production of steroids in steroidogenic cells.

Endocrine Reviews. 17 (3):221–244.Takasaki Y, Sekine S, Matsuzawa Y, Iwata S, Sasaoka M. 1979. Effects of parenteral and oral

administration of monosodium L-glutamate (MSG) on somatic growth in rats.

Toxicol Lett. 4:327-343.Trentini GP, Botticelli A, Botticelli CS. 1974. Effect of monosodium glutamate on the endocrine

glands and on the reproductive function of the rat. Fertil Steril. 25:478-483.Tschop M, Lahner H, Feldmeier H, Grasberger H, Morrison KM, Janssen OE, Attanasio AF,

Strasburger CJ. 2000. Effect of growth hormone replacement therapy on levels of cortisol and cortisol-binding globulin in hypopituitary adults. Eur J Endocrinol. 143(6):769-773.

Wang XJ, Stocco DM. 1999. At the Cutting Edge Cyclic AMP and arachidonic acid: a tale of two

pathways. Molecular and Cellular Endocrinology. 158:7–12Witthuhn BA, Quelle FW, Silvennoinen O. 1993. JAK2 associates with the erythropoietin receptor and

is tyrosine phosphorylated and activated following stimulation with erythropoietin.

Cell. 74:227-36.

56

ภ�คผนวก

1. การเตรยม tracking dye โดยผสมสาร ดงตอไปน bromophenol blue 0.025 gxylene cyanol 0.025 gsucrose 4 gadd water to 10 ml

2. การเตรยม TAE buffer pH 8.0 50X TAE buffer : 1000 ml ( pH 8.0 ) ประกอบไปดวยtris base 242 gglacial acetic acid 57.1ml0.5 M EDTA 100 ml

วธเตรยม 50X TAE buffer : 50 ml ดงนช ง tris base 12.1 g นำามาละลายนำาบางสวน หลงจากนนเตม EDTA (disodium salt dehydrate) จำานวน 0.93 g และ glacial acetic acid จำานวน 2.86 ml แลวปรบ pH ใหได 8.0 ดวย acitic acid หลงจากนน ปรบปรมาตรนำาใหครบ 50 ml

57