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Instituto de Ciências BiológicasDepartamento de Morfologia

Citologia e Histologia Geral

Profa Valéria Ruiz de Souza

Técnicas Histológicas

O termo “Técnicas Histológicas” refere-se ao

conjunto de metodologias empregadas para a

obtenção de material biológico

para estudo ao microscópio.

Seqüência de etapas

Preparação do material para estudo aos microscópios de luz e eletrônicos

8. Coloração

9. Montagem

Remoção do órgão ou parte dele

Fragmentação do órgão em porções menores

Fixação

Desidratação

Inclusãoa. Em parafina para a MLb. Em plástico para a ME

Microtomiaa. Com navalha de aço para a MLb. Com navalha de vidro ou diamante para a ME

Colocação do cortea. Sobre lâminas de vidro para a MLb. Sobre grades e redes metálicas para a ME

Coleta de Material

Consiste na obtenção do fragmento de órgão a ser estudado

O órgão é retirado do animal anestesiado e recortado em fatias

de no máximo 3 mm de espessura.

• Deixar o fragmento coletado no líquido fixador, por tempo determinado, de acordo com a solução utilizada.

• Os líquidos fixadores variam desde uma substância química isolada, como o álcool, o formol, até as misturas fixadoras, como o Bouin.

Fixação

Processo que se destina a “matar” as células, procurando manter sua estrutura preservada, o mais próximo possível do que seria no animal vivo.

• Desidratação - O material é imerso em vários banhos de álcool, em ordem crescente de concentração, até o álcool absoluto.

• Diafanização – O material é imerso em xilol, para clareamento.

• Imersão em parafina – O material é mantido em parafina líquida, a 58 graus (em estufa), por tempo determinado.

InclusãoA inclusão consiste em colocar o corte em fôrma, cobrindo-o com parafina líquida, que se fundirá à temperatura ambiente. Antes de incluir é necessário desidratar a peça, diafanizá-la e mergulhá-la em parafina líquida.



8. Coloração

9. Montagem



Fixação

Desidratação




O bloco de parafina contendo o fragmento é colocado no suporte do micrótomo; após regular a espessura dos cortes em micrômetros, são retiradas fitas de parafina contendo o material.

Microtomia

Consiste na obtenção de cortes finos, que serão corados para observação

Planos de observação das células(Dependentes do corte)

(Cedido pela Profa. Gleydes G. Parreira)

Desenho esquemático da organização microscópica do fígado.

Corte histológico do fígado, observado ao microscópio de luz.

.... são retiradas fitas de parafina contendo o material.

Microtomia

Consiste na obtenção de cortes finos, que serão corados para observação

A colocação da fita de parafina em “banho-maria” a 40oC distende os cortes, que são recolhidos em lâminas de vidro.

Coloração

É necessário corar para que células e tecidos possam ser identificados. Antes de corar é necessário desparafinizar e hidratar o corte.

Consiste em mergulhar a lâmina contendo o corte no(s) corante(s), de acordo com o que se deseja corar;

Na montagem, uma gota de resina é colocada sobre a lamínula e esta é pressionada sobre a lâmina, protegendo o corte histológico.

Coloração e Montagem

Corantes

Microscopia

Observação de células e tecidos ao microscópio

A lâmina deve ser colocada na platina do microscópio, com a lamínula voltada para a objetiva.

O foco deve ser ajustado para cada lente objetiva, utilizando-se os parafusos macro ou micrométrico.

MICROSCOPIA ÓPTICA

Ampliação total = aumento da objetiva + aumento da ocular

Resolução: separação de detalhes

Limite de resolução: menor distância que deve existir entre dois pontos para que eles apareçam individualizados

Limite de resolução do microscópio óptico: 0,2µm

MÉTODOS HISTOQUÍMICOS PARA EVISENCIAR SUBSTÂNCIAS PRESENTES NAS CÉLULAS

COLORAÇÕES DE ROTINA: HE,Tricrômico de Gômori

COLORAÇÕES ESPECÍFICAS:Intensidade de cor proporcional à concentração

DNA: feulgenPolissacarídeos (glicogênio): PASRNA: ribonucleaseCatecolaminas: formaldeído (fluorescente)Proteínas: milton (tirosina) diaminoazobenzeno (triptofano)

TÉCNICAS HISTOLÓGICAS (rotina)

CORANTES BÁSICOS: azul de toluidina, hematoxilina

CORANTES ÁCIDOS: eosina, orange G, fucsina ácida

Outros corantes: impregnação pela prata e ouro

100m100m

EEP P

EE

EE

CI

CI

C

Tecidos epitelial e conjuntivoCorante: hematoxilina e eosina

100m

E

EE

P

P

P

PP

Tecidos epitelial e conjuntivoCorante: tricrômico de gômori

P

P

E

CC

100m

C

V

Tecidos epitelial e conjuntivoCorante: periodic acid shiff (PAS)

TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS

CONCEITO: substância, radical, grupamentos químicos

PRINCÍPIOS:compostos não difusíveis – bom fixadorprodutos insolúveis – não se difundem nos reagentesEspecificidade e sensibilidade

CROMÓFORO E FLUORÓFOROFixação insolúvel corada ou fluorescente(histoquímica)

SUBSTÂNCIAS IDENTIFICÁVEIS:

a)ìons: Fe+3 – ioniza Fe preso à proteínas

ferrocianeto de K + Fe+

fosfato – nitrato de prata

b) lípides: sudam IV – vermelho sudam negro


c) Carboidratos

•Radical vic-glicol – •glicogênio, glicoproteína neutra, sialomucina

•Radical carboxila – •glicosaminoglicana(GAG) ácido carboxilada, sialomucina

•Radical sulfato – •GAG ácido sulfatada


d) Ácidos nucléicos: DNA, Feulgen, RNA

e) Proteínas: aa, imunocitoquímica, ag/ac fluorescente

EXEMPLOS1.PAS (periodic acid shiff)

*obtenção do reativo de shiff (fucsina básica + ác. Sulfuroso = shiff)

*Oxidação do vic-glicol carb. com vic-glicol + ácido periódico aldeído

*Reversão da cor do shiff – shiff + aldeído = PAS +

Problema: e os outros carboidratos?

Teste: amilase salivar – enzima gliconeolítica PAS-

(?) PAS + : Alcian Blue AB + = sialomucina, também PAS +AB- = glicoproteína neutra, somente PAS+

Microscopia de fluorescência

ANTIGEN

epitope

100m100mHematoxilina e eosina

P

PVV

100m100m

Imunolocalização de colágeno VIMicroscopia de fluorescência

VV

P

PEE

EE

Microscopia Eletrônica

Microscópio Eletrônico de Transmissão

Microscópio Eletrônico de Varredura

MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE TRANSMISSÃO

Alta resolução!



8. Coloração

9. Montagem



Fixação

Desidratação




Preparação de material para observação ao ME

Glutaraldeído e Tetróxido de ósmio

Fixação

Inclusão

A inclusão de material biológico para observação ao ME é feita em resinas como epon, araldite.

Ultra-microtomia

O micrótomo deve ser regulado para obtenção de cortes semi-finos e finos.

Cortes semi-finos

Telinhas contendo os cortes finos

Coloração/Contrastação

Aquecimento de um cátodo

Liberação de elétrons

Focalização dos elétrons

Reflexão dos elétrons pelo objeto

IMAGEM

Imagem observada

Micrografia eletrônica de núcleo celular

NN

C

CC

1m

C

N

LC

2m

MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA

Análise em 3D

Aquecimento de um cátodo

Liberação de elétrons

Focalização dos elétrons

Bobina de varredura

Desvio dos elétrons

IMAGEM

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