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Abordagens moleculares no estudo da diversidade microbiana

Teresa Lino Neto

tlneto@bio.uminho.pt

Departamento de Biologia | Universidade do Minho

A vida sem microrganismos não seria possível!

1 – Importantes agentes decompositores

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Participação em diversos ciclos biogeoquímicos (ex: ciclo do azoto, entre outros)

2 – Importantes na reciclagem de nutrientes 3 – Elevada importância na saúde

- como causadores de diversos distúrbios

3 – Elevada importância na saúde

- como produtores de compostos farmacológicos (ex: antibióticos)

- Contribuindo para a normal fisiologia animal (ex: flora intestinal)

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4 – Elevada importância no sector alimentar

- Processos fermentativos para produção de alimentos

- Contaminação de alimentos

(desenvolvimento de medidas de controlo microbiológico)

2

5 – Importantes no desenvolvimento de Engenharia Genética…

… e utilizados em inúmeros processos Biotecnológicos

Infecção com Agrobacterium

Clonagem de DNA

6 – Elevada importância para a agricultura

- como causadores de diferentes patologias

- como agentes de controlo biológico de agentes patogénicos e de pragas

Infecçõesvirais

Infecçõesbacterianas Infecções

fungicas

4 – Elevada importância para a agricultura

- Pelo estabelecimento de associações simbióticas

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Micorrizas (planta-fungo)

Nódulos (planta-bactéria)

4 – Elevada importância para a agricultura

- Aumentam a disponibilidade de nutrientes

- Responsáveis pelo efeito supressor do solo

Como foram identificados os microrganismos?

1. Colheita de amostras

2. Cultura e isolamento em meios apropriados

3. Pesquisa de caracteres fenotípicos 3. Pesquisa de caracteres fenotípicos

Biomedical an d Life Sciences (2008) 93, 407-413

The EMBO Journal (2002) 21, 5448 - 5456

Características culturais

Aspectosmorfológicos

3

3. Pesquisa de caracteres fenotípicos

Estruturas reprodutoras

http://sharon-taxonomy2009-p3.wikispaces.com/file/view/

fungi/100274173/fungi

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Ensaios bioquímicos (testes de sensibilidade e metabolismo)

Teste API

Coloração Gram

Utilização de meios

selectivos

Que problemas podem surgir na identificação “tradicional” da diversidade microbiana?

Os métodos moleculares ultrapassam muitas destas

dificuldades

Apenas 1% dos microrganismos unicelulares são cultiváveis

- Os indivíduos têm primeiro de ser isolados e cultivados em laboratório

- Muitos ensaios bioquímicos só podem ser utilizados em microrganismos com crescimento rápido

- As características fenotípicas e bioquímicas dependem fortemente do ambiente (meio de cultura)

Fusarium oxysporum, em diferentes marcas de PDA

Ribossomas 70S

Subunidade maior 50S

Subunidade menor 30S

Pré-rRNA (30S)

RNA 16S (1541 nt)

RNA 23S (2904 nt)

RNA 5S (120 nt)

A técnica mais comum e simples é a amplificação de zonas variáveis do genoma, recorrendo às suas zonas estáveis

Procariotas

V1 V2 V3 V4 V6 V7 V8 V9

1,542 pb

Menos de 500 pb são hipervariáveis

A técnica mais comum e simples é a amplificação de zonas variáveis do genoma, recorrendo às suas zonas estáveis

Procariotas

A técnica mais comum e simples é a amplificação de zonas variáveis do genoma, recorrendo às suas zonas estáveis

Ribossomas 80S

Subunidade maior 60S

Subunidade menor 40S

Pré-rRNA (45S)

RNA 18S (1900 nt)

RNA 28S (4700 nt)

RNA 5S (120 nt)

RNA 5,8S (160 nt)

Eucariotas

4

A técnica mais comum e simples é a amplificação de zonas variáveis do genoma, recorrendo às suas zonas estáveis

EucariotasProcariotas

Fungos

Utilização de bases de dados contendo rDNA de microrganismos para identificação

≈ 100,000 sequências no

GenBank

≈ 65,000 sequências no

GenBank

≈ 1,200 sequências no

UNITE

A identificação baseada em sequências de DNA é rápida e eficaz, mas…

(A)Ainda não existe concordância no locus mais apropriado

(B)Ainda não existem bases de dados de qualidade controlada

(C) Ainda não estão definidos o número de nucleótidos variáveisque definem uma espécie

Para além de rDNA, outras sequências génicas podem ser utilizadas

β-tubulina

RPB2(RNA polimerase II)

Esta estratégia de identificação molecular está na base do “DNA barcoding” para avaliar a diversidade biológica

O género Coprinus pode serfacilmente reconhecido pelo

facto de as lâminas contendo osesporos se dissolverem num

fluído negro, logo após a maturação do esporos

Coprinus comatus

Coprinus bellulus

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Coprinus silvaticus http

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A utilização de novas abordagens conduziram a novas classificações

A análise de DNA demonstrou que nem todospertencem ao mesmo género, muitos dos quais nemsequer pertencem à família Agaricaceae (mas sim à famíliaPsathyrellaceae)

Coprinellus heterothrix(=Coprinus heterothrix)

Coprinopsis picacea(=Coprinus picaceus)

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Coprinellus micaceus(=Coprinus micaceus)

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5

Diversidade Diversidade Diversidade Ecológica Genética de Organismo

Biomassa

Bio-regiões

Paisagem

Ecossistema

Habitat

Nichos

Populações

Populações

Indivíduos

Cromossomos

Genes

Nucleotídeos

Reino

Filo

Família

Género

Espécie

População

Individuo

Existem vários tipos de diversidade…

A diversidade envolve dois componentes:

- Variedade (quem/quais são?)

- Abundância relativa (quantos são?)

variedade genética variedade de espécies variedade de funções

Como pode ser avaliada a diversidade microbiana de um dado habitat?

Recolha da

amostra

Extração de DNA

PCR de 26S rDNAprimer fluorescente

Análise de múltiplos fragmentos (T-RFLP)

Digestão com enzima de

restriçãoElectroforese

capilar

Análise de múltiplos fragmentos (DGGE/TGGE)

Recolha da

amostra

Extração de DNA

PCR de 26S rDNA

Electroforese em condições desnaturantes

Como pode ser avaliada a diversidade microbiana de um dado habitat?

Análise de múltiplos fragmentos (DGGE/TGGE)

Redução da mobilidade electroforética de fragmentos parcialmente desnaturados

Os fragmentos desnaturam em diferentes locais do gel, parando a sua migração

Este tipo de gel (gel perpendicular)

permite determinar o tipo de gradiente a utilizar numa experiência

A amostra é aplicada em toda a extensão do gel

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A optimização do tempo de electroforese é efectuada pela aplicação regular da amostra num gel em gradiente

Zona de desnaturação

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Análise de múltiplos fragmentos (DGGE/TGGE)

Os fragmentos desnaturam em diferentes locais do gel, parando a sua migração

Amostras contendo uma mistura de fragmentos de 26S rDNA, podem ser analisadas simultaneamente

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Análise de múltiplos fragmentos (DGGE/TGGE)

6

Recolha da

amostra

Como pode ser avaliada a diversidade microbiana de um dado habitat?

Uma janela para o Universo Microbiano

Metagenómica

Como pode ser avaliada a diversidade microbiana de um dado habitat?

O poder da análise genética é aplicado a toda a comunidade

microbiana, evitando a necessidade de isolar

individualmente cada espécie.

Uma janela para o Universo Microbiano

Metagenómica

Sequenciação tradicional

> 20,000 clones BAC ≈ 100 kb

subclonado

cada BAC é fragmentado em porções de 2-3 kb

sequenciado

alinhado

O caso do projecto do genoma humano…

Consórcio público

Sequenciação tradicional

sequenciado

alinhado

O caso do projecto do genoma humano…

Celera genomics

A tecnologia de “shotgun”

> 20,000 clones BAC ≈ 100 kb

Sequenciação tradicional

The Scientist 2004, 18(18):44

Método de sequenciação de Sanger

Sequenciação tradicionalSequenciação efectuada em sequenciadores capilares

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dNTPs Terminadores (dideoxinucleótidos)

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DNA a sequenciar

7

Sequenciação tradicional

Sequenciação efectuada em sequenciadores capilares

Sequenciação pelo método de Sanger

Tecnologia de sequenciação de nova geração

• Utilização de técnicas de sequenciação massivas em paralelo (ex: plataforma 454, Solexa, SOLiD)

• Preparação mais directa das amostras a sequenciar

O DNA genómico é fragmentado (não há clonagem)

São ligados adaptadores

São seleccionados os fragmentos com ambos os adaptadores (A e B)

Tecnologia de sequenciação de nova geração

• Amplificação dos fragmentos a sequenciar por PCR de emulsão

É mantida uma proporção para que cada microesfera de agarose se ligue a uma única sequência de DNA

As microesferas são capturadas individualmente em micelas onde ocorre o PCR em emulsão

São seleccionados os fragmentos com ambos os adaptadores (A e B)

Tecnologia de sequenciação de nova geração

• Aplicação dos fragmentos nos poços da placa

Cada microesfera (28 µm) é capturada em poços (44 µm) na placa de sequenciação (PicoTiterPlate – PTP)

Pequenas esferas contendo os componentes da reacção são adicionados

Tecnologia de sequenciação de nova geração

• A polimerização ocorre no pirosequenciador (Roche/454 FLX)

Podem ser sequenciadas 400,000 sequências em paralelo

Tecnologia de sequenciação de nova geração

• O princípio da sequenciação

A sequenciação é realizada por ciclos TCAG

1 nt ligado = 1 PPi liberto

1 PPi liberto = 1 ATP produzido (acção da ATP sulfurilase)

1 ATP produzido = 1 oxiluciferina(acção da luciferase)

Degradação de dNTP não-incorporado por apirase

APS - adenosine 5´phosphosulfate

8

Tecnologia de sequenciação de nova geração

• O princípio da sequenciação

Recolha da

amostra

Como pode ser avaliada a diversidade microbiana de um dado habitat?

Extração de DNA

PCR de 26S rDNA

Sequência de todos os 26S rDNApresentes na

população microbiana

Como pode ser avaliada a diversidade microbiana de um dado habitat?

Sequência de todos os 26S rDNApresentes na

população microbiana

Bases de dados de sequências

Potencial identificação de todas as bactérias presentes

no habitat

A diversidade microbiana está actualmente a ser explorada em diferentes ambientes

No solo

No mar e no ar

Em animais e no homem

Ártico

Solos contaminados

Em plantas

Descargas de águas residuais

A diversidade recentemente descoberta do picoplankton (< 2µm) nos oceanos, elevou de forma surpreendente as

estimativas de diversidade dos microrganismos

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(x10

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30 -

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A proporção dos organismos ainda poderá sofrer alterações

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nº

30 -

2007

9

Agradecimentos

Paula Baptista (ESAB - IPB)

Sandra Chaves (Fac. Ciências da Universidade de Lisboa)

Ivo Oliveira (ESAB - IPB)

PTDC/AGR-AAM/099556/2008

Mestrado em Biologia Molecular, Biotecnologia

e Bioempreendedorismo em Plantas

Mestrado 3BP

Fisiologia Molecular de

Plantas

Biotecnologia e Bio-Empreendedorismo em Plantas Aromáticas e

Medicinais

UNIDADES CURRICULARESÁREA

CIENTÍFICAECTS

Biorreactores e Processos de Separação ENGBIO 6

Bioempreendedorismo G 6

Opção I /Cursos Avançados* BMP/BV 6

Opção II /Cursos Avançados* BMP/BV 6

Opção III /Cursos Avançados* QA 6

Mestrado 3BPUm mestrado – Dois perfis

UNIDADES CURRICULARES ÁREA CIENTÍFICA ECTS

Bioquímica e Fisiologia Molecular BMP 6

Metabolismo Secundário e Compostos Bioactivos BV 6

Biotecnologia Vegetal BV 6

Engenharia Genética de Plantas e Bioinformática BMP 6

Estratégia e Marketing de Biotecnologia G 6

* Pela frequência das opções, o aluno poderá escolher um percurso com um carácter mais biotecnológico e aplicado ou mais científico