8/6/2019 A Technique for Predicting the Solvent-Producing

1/4

V o l . 5 3 , N o . 1 0

A T e c h n i q u e f o r P r e d i c t i n g t h e S o l v e n t - P r o d u c i n g A b i l i t y o fC l o s t r i d i u m a c e t o b u t y l i c u mHOWARD I . ADLER* AND WELDON CROW

B i o l o g y D i v i s i o n , Oak R i d g e N a t i o n a l L a b o r a t o r y , Oak R i d g e , T e n n e s s e e 3 7 8 3 1R e c e i v e d 1 1 May 1 9 8 7 / A c c e p t e d 2 2 J u l y 1 9 8 7C h a n g e s i n c o l o n y m o r p h o l o g y were a s s o c i a t e d w i t h t h e d e g e n e r a t i o n o f s o l v e n t - p r o d u c i n g s t r a i n s o fC l o s t r i d i u m a c e t o b u t y l i c u m . T h e m o s t e f f i c i e n t s o l v e n t - p r o d u c i n g s t r a i n s gave r i s e e x c l u s i v e l y t o c o l o n i e s w i t hd e n s e c e n t e r s c o n t a i n i n g l a r g e n u m b e r s o f s p o r e s . Many o u t g r o w t h s o f v a r io u s m o r p h o l o g i es d e v el o p ed f r o mt h e p e r i m e t e r o f s u c h c o l o n i e s a f t e r s e v e r a l d a y s o f i n c u b a t i o n . T h e m o s t d e g e n e r a t e c u l t u r e s d i d n o t p r o d u c es o l v e n t s a n d g a v e r i s e t o l a r g e d i f f u s e c o l o n i e s t h a t d i d n o t c o n t a i n s p o r e s . T h e s e d i f f u s e c o l o n i e s d i d n o tp r o d u c e o u t g r o w t h s . I n t e r m e d i a t e c o l o n y t y p e s were a l s o o b s e r v e d . T h e s e c o u l d b e d e r i v e d f r o m l i q u i d c u l t u r e st h a t were r e l a t i v e l y poor s o l v e n t p r o d u c e r s or f r o m t h e o u t g r o w t h s o f c o l o n i e s o f e f f i c i e n t s o l v e n t - p r o d u c i n gs t r a i n s . Some o f t h e s e i n t e r m e d i a t e t y p e s p r o d u c e d s p o r e s b u t d i d so l e s s f r e q u e n t l y t h a n t h e h i g h - s o l v e n t -p r o d u c i n g s t r a i n s . T h e spores o f t h e i n t e r m e d i a t e t y p e s c o u l d n o t b e d i s t i n g u i s h e d f r o m t h o s e o f t h e m o s te f f i c i e n t s o l v e n t p r o d u c e r s on t h e b a s i s o f h e a t s e n s i t i v i t y . T h e r e l a t i o n s h i p o b s e r v e d b e t w e e n c o l o n ym o r p h o l o g y a n d s o l v e n t p r o d u c t i o n p r o v i d e s a m e t h o d f o r p r e d i c t i n g t h e s o l v e n t - p r o d u c i n g p o t e n t i a l o f C .a c e t o b u t y l i c u m c u l t u r e s .

T h e r a p i d d e g e n e r a t i o n o f C l o s t r i d i um a c e t o b u t y l i c u m a n dr e l a t e d s p e c i e s f r o m s o l v e n t - p r o d u c i n g o r g a n i s m s t o onest h a t p r o d u c e o n l y o r g a n i c a c i d s h a s b e e n o b s e r v e d b y manyw o r k er s . T h i s p h e n o m e n o n c o n t r i b u t e d t o t h e p r o b l e m se n c o u n t e r e d i n t h e c o m m e r c i a l a p p l i c a t i o n o f t h e o r g a n i s m sf o r a c e t o n e a n d b u t a n o l p r o d u c t i o n ( 4 , 7 , 1 0 ; E . McCoy a n dE . B . F r e d , J . B a c t e r i o l . 4 1 : 9 0 - 9 1 , 1 9 4 1 ) . T h e l o s s o f s o l -v e n t - p r o d u c i n g a b i l i t y i s u s u a l l y a c c o m p a n i e d b y t h e l o s s o fa b i l i t y t o p r o d u c e spores. T h e r e f o r e , i t i s f r e q u e n t l y p o s s i b l et o p r e d i c t t h e l i k e l i h o o d t h a t a c u l t u r e w i l l p r o d u c e s o l v e n t sb y o b s e r v i n g i t s a b i l i t y t o f o r m spores. H o w e v e r , i t h a s b e e nd e m o n s t r a t e d t h a t some s t r a i n s t h a t f a i l t o p r o d u c e maturespores b u t d o r e a c h t h e c l o s t r i d i a l s t a g e c o n t i n u e t o m a k es o l v e n t s ( 6 , 9 ) . I n t h i s r e p o r t we p r e s e n t d a t a d e m o n s t r a t i n gt h a t c o l o n y m o r p h o l o g y c a n b e u s e d as a r e l i a b l e a n ds e n s i t i v e i n d i c a t o r o f s o l v e n t - p r o d u c i n g a b i l i t y . I n a d d i t i o n ,we e s t a b l i s h e d t h a t d e g e n e r a t i o n c a n o c c ur i n a s e r i e s o fs t e p s a n d t h a t t h e appearance o f d e g e n er a t e t y p e s i s as p o n t a n e o u s e v e n t w h i c h d o e s n o t r e q u i r e i n t e n t i o n a l expo-sure t o c h e m i c a l or p h y s i c a l a g e n t s .

MATERIALS ANDMETHODSB a c t e r i a l s t r a i n s a n d g r o w t h c o n d i t i o n s . C . a c e t o b u t y l i c u mNRRL B 6 4 3 was o b t a i n e d f r o m P . R o g e r s , U n i v e r s i t y o fM i n n e s o t a . C . a c e t o b u t y l i c u m ATCC 4 2 5 9 a n d ATCC 8 2 4

were o b t a i n e d f r o m t h e A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n ,R o c k v i l l e , Md . S e v e r a l o t h e r s t r a i n s u s e d were s o i l i s o l a t e so b t a i n e d i n t h i s l a b o r a t o r y ( 3 ) . E x c e p t when n o t e d , l i q u i dc u l t u r e s were grown i n n u t r i e n t b r o t h ( D i f c o L a b o r a t o r i e s ,D e t r o i t , M i c h . ) s u p p l e m e n t e d w i t h y e a s t e x t r a c t ( 0 . 1 % ) a n dg l u c o s e ( 0 . 4 % ) ( N Y G ) . C u l t u r e s were m a i n t a i n e d i n a potatomedium c o n s i s t i n g o f a p p r o x i m a t e l y 5 g o f d i c e d I d a h op o t a t o , 0 . 1 5 g o f C a C O 3 , a n d 1 2 m l o f water i n a screw-capt u b e ( 1 6 b y 1 1 0 m m ) . The o x y g e n - c o n s u m i n g membranef r a c t i o n p r e v i o u s l y d e s c r i b e d was u s e d t o p r o d u c e a n a e r o b i cc o n d i t i o n s i n l i q u i d c u l t u r e s ( 1 ) . NYG medium was s o l i d i f i e db y t h e a d d i t i o n o f 1 5 g o f B a c t o - A g a r ( D i f c o ) per l i t e r (NYG

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

a g a r ) . S p o r e s or c e l l s were p l a t e d a f t e r a p p r o p r i a t e d i l u t i o ni n NYG. E x c e p t when n o t e d , p l a t e s were i n c u b a t e d f o r 3 t o5 d a y s a t 3 7 C i n T o r b a l l j a r s ( m o d e l A J - 2 ; T o r s i o n B a l a n c eC o . , C l i f t o n , N . J . ) c o n t a i n i n g a m i x t u r e o f 95% N 2 a n d 5%CO2.D e t e r m i n a t i o n o f c o l o n y m o r p h o l o g y b y m i c r o s c o p i c o b s e r -v a t i o n . NYG agar p l a t e s c o n t a i n i n g 1 0 t o 5 0 c o l o n i e s wereo b s e r v e d w i t h a l o w - p o w e r microscope ( m a g n i f i c a t i o n , x 1 0t o x 1 5 ) . T h e l i g h t source was a r r a n g e d so t h a t l i g h t i m p i n g e do b l i q u e l y on a n opaque s i n t e r e d - g l a s s s u r f a ce b e f o r e b e i n gt r a n s m i t t e d t h r o u g h t h e c o l o n i e s . To a c h i e v e even g r e a t e rc o n t r a s t , a 1% aqueous s o l u t i o n o f C o o m a s s i e b l u e R 2 5 0( M i l e s L a b o r a t o r i e s , I n c . , E l k h a r t , I n d . ) was p i p e t t e d o n t oagar p l a t e s c o n t a i n i n g 3 - t o 5 - d a y - o l d c o l o n i e s . T h e d y e wa sa l l o w e d t o cover t h e c o l o n i e s f o r 1 t o 2 m i n , a n d t h e n t h eexcess was d e c a n t e d .D e t e r m i n a t i o n o f h e a t s e n s i t i v i t y o f spores. S a m p l e s ( 0 . 5 m l )o f s p o r u l a t e d c u l t u r e s i n p o t a t o medium were s p r e a d i ns t e r i l e p l a s t i c p e t r i d i s h e s a n d a l l o w e d t o a i r d r y a t 3 7 C f o r3 t o 5 d a y s b e f o r e b e i n g s u s p e n d e d i n NYG. A s e t o f 0 . 2 - m ls a m p l e s o f t h i s s u s p e n s i o n i n t h i n - w a l l g l a s s t u b e s was p u ti n t o a 9 0 C c i r c u l a t i n g w a t e r b a t h . P e r i o d i c a l l y , s a m p l e swere w i t h d r a w n , d i l u t e d r a p i d l y i n NYG, a n d p l a t e d on t h es u r f a c e o f NYG a g a r .D e t e r m i n a t i o n o f s o l v e n t p r o d u c t i o n . T h e c u l t u r e s werea s s a y e d f o r e t h a n o l , a c e t o n e , b u t a n o l , a c e t i c a c i d , a n db u t y r i c a c i d b y i n j e c t i n g s u p e r n a t a n t s f r o m c e n t r i f u g e d c u l -t u r e s a m p l e s i n t o a S h i m a d z u GC-9A ga s c h r o m a t o g r a p he q u i p p e d w i t h a f l a m e i o n i z a t i o n d e t e c t o r a n d a 2 - m s t a i n l e s ss t e e l c o l u m n p a c k e d w i t h P o r o p a k Q ( 8 0 / 1 0 0 m e s h ) . T h es a m p l e s were a s s a y e d u n d e r t h e f o l l o w i n g c o n d i t i o n s : c o l -umn t e m p e r a t u r e , 1 8 0 C ; i n j e c t o r t e m p e r a t u r e , 2 5 0 C ; d e t e c -t o r t e m p e r a t u r e , 2 5 0 C ; c a r r i e r gas, argon; f l o w r a t e , 5 0m l / c m 2 .

D e t e r m i n a t i o n o f c e l l s i z e b y f l o w c y t o m e t r y . C e l l s i z e wasd e t e r m i n e d w i t h a n O r t h o 50H C y t o f l y o r o g r a p h ( O r t h o D i -a g n o s t i c s , I n c . , W e s t w o o d , M a s s . ) , i n t e r f a c e d t o an O r t h o2 1 5 0 c o m p u t e r , b y p r e v i o u s l y p u b l is h e d m e t h o d s ( 1 2 ) . C e l ls i z e was m e a s u r e d as a f un ct i o n o f l i g h t s c a t t e r e d i n t h ef o r w a r d d i r e c t i o n .2 4 9 6

A P P L I E D AND ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L O G Y , O C t . 1 9 8 7 , p . 2 4 9 6 - 2 4 9 90 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 7 / 1 0 2 4 9 6 - 0 4 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 8 7 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

8/6/2019 A Technique for Predicting the Solvent-Producing

2/4

SOLVENT PRODUCTION AND COLONY MORPHOLOGY 2 4 9 7

F I G . 1 . P h o t o g r a p h s o f C o o m a s s i e b l u e - s t a i n e d 4 - d a y - o l d c o l o n i e s o f C . a c e t o b u t y l i c u m . ( A ) T y p e I ; ( B ) t y p e I I ; ( C ) t y p e I I I ; ( D ) t y p e I V .RESULTS

A t y p i c a l 4 - d a y - o l d c o l o n y d e r i v e d f r o m a v i g o r o u s s o l -v e n t - p r o d u c i n g , s p o r e f o r m i n g c u l t u r e o f s t r a i n NRRL B 6 4 3i s s h o w n i n F i g . 1 A . A l l o f t h e c o l o n i e s p r o d u c e d f r o m c e l l so r s p o r e s t a k e n f r o m s u c h a l i q u i d c u l t u r e h a d t h e d a r kc e n t e r s a n d l i g h t e r o u t g r o w t h s s e e n i n F i g . 1 A . I f t h e s ec o l o n i e s w e r e o b s e r v e d a f t e r o n l y 1 t o 2 d a y s o f i n c u b a t i o n ,t h e y a p p e a r e d a s d a r k , r o u g h l y c i r c u l a r s t r u c t u r e s 1 t o 2 mmi n d i a m e t e r . No o u t g r o w t h s w e r e v i s i b l e . When l i q u i d c u l -t u r e s w e r e r e p e a t e d l y t r a n s f e r r e d i n a r i c h medium ( N Y G ) o rw e r e a l l o w e d t o i n c u b a t e f o r many d a y s , c e l l s p r o d u c i n gc o l o n y t y p e s s u c h a s t ho s e s e e n i n F i g . 1 B , C , a n d Da p p e a r e d . T h e s e same s e c o n d a r y c o l o n y t y p e s c o u l d b e

o b t a i n e d f r o m t h e v a r i o u s o u t g r o w t h s o f a c o l o n y s u c h a st h a t s h o w n i n F i g . 1 A . A s i m i l a r r a n g e o f c o l o n y t y p e s w a so b s e r v e d f o r c u l t u r e s o f s t r a i n s ATCC 4 2 5 9 a n d ATCC 8 2 4a n d s e v e r a l i s o l a t e s f r o m s o i l s a m p l e s . T h e c o l o n y t y p ea s s o c i a t e d w i t h v i g o r o u s , s o l v e n t - p r o d u c i n g , s p o r e f o r m i n gc u l t u r e s was d e s i g n a t e d t y p e I , a n d t h e d e r i v e d t y p e s w e r ed e s i g n a t e d t y p e s I I , I I I , a n d I V . Some p r o p e r t i e s o f t h e f o u rt y p e s a r e g i v e n i n T a b l e 1 . I t i s i n t e r e s t i n g t h a t t h e d e g e n e r -a t i o n p h e n o m e n o n a l w a y s o c c u r r e d f r o m t y p e I t o w a r d t y p eI V . No e x a m p l e o f s p o n t a n e o u s r e v e r s i o n wa s o b s e r v e d ,a l t h o u g h many t h o u s a n d s o f t y p e I I , I I I , a n d I V c o l o n i e sw e r e e x a m i n e d f o r o u t g r o w t h t h a t w o u l d i n d i c a t e t h i s .E x c e p t f o r t h e f r e q u e n c y o f s p o r a n g i a , c e l l s f r o m t y p e I ,I I , a n d I I I c o l o n i e s o r t h e i r c o r r e s p o n d i n g l i q u i d c u l t u r e s

V O L . 5 3 , 1 9 8 7

I

8/6/2019 A Technique for Predicting the Solvent-Producing

3/4

2 4 9 8 ADLER AND CROWTABLE 1 . C h a r a c t e r i s t i c s a o f C . a c e t o b u t y l i c u m c o l o n y t y p e s

T y p e ( s ) o fT y p e M o r p h o l o g y o f c o l o n y o u t g r o w t h sp r o d u c e dI D i a m e t e r , 2 - 3 m m ; v e r y d a r k c e n t e r ; many I I , I I I , a n d I Vo u t g r o w t h s p r o d u c e d ( a p p r o x 6 - 8 /c o l o n y )I I D i a m et e r , 3 - 5 m m ; g r a y - b r o w n c e n t e r s ; I I I a n d I Vf e w e r o u t g r o w t h s t h a n t y p e I ( a p p r o x 2 -4 / c o l o n y )I I I D i a m e t e r , 4 - 6 m m ; b r o w n c e n t e r s ; I Vr e l a t i v e l y s m o o t h p e r i m e t e r ; o u t g r o w t h sr a r e ( l e s s t h a n 0 . 0 1 / c o l o n y )I V D i a m e t e r , 4 - 8 m m ; l i g h t b r o w n c e n t e r s , Nonee d g e s i n d e n t e d ; s t r i a e p r e s e n t ,p a r t i c u l a r l y n e a r p e r i m e t e r ; n oo u t g r o w t h s

D e s c r i p t i o n s a p p l y t o 4 - d a y - o l d c o l o n i e s o b s e r v e d b y t h e t e c h n i q u ed e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s b e f o r e C o o m a s s i e b l u e s t a i n i n g . M o r et h a n 2 0 0 c o l o n i e s o f e a c h t y p e w e r e e x a m i n e d .

w e r e i n d i s t i n g u i s h a b l e when o b s e r v e d b y p h a s e m i c r o s c o p yo r f l o w c y t o m e t r y . H o w e v e r , c e l l s f r o m t y p e I V c u l t u r e sw e r e r e a d i l y d i s t i n g u i s h e d f r o m t h e o t h e r t h r e e t y p e s , p a r -t i c u l a r l y when o b s e r v e d d u r i n g t h e l a t e l o g o r e a r l y s t a t i o n -a r y p h a s e . T y p e I V c e l l s w e r e r e l a t i v e l y l o n g a n d s l i g h t l yt h i n n e r t h a n c e l l s o f t h e o t h e r t y p e s . No c l o s t r i d i a l o rs p o r a n g i a l f o r m s w e r e o b s e r v e d . T h i s o b s e r v a t i o n , f i r s tm a d e m i c r o s c o p i c a l l y , w a s c o n f i r m e d b y q u a n t i t a t i v e f l o wc y t o m e t r i c d a t a ( F i g . 2 ) . T h e a v e r a g e l a t e l o g , t y p e I V c e l lw a s t w i c e t h e s i z e o f t h e a v e r a g e t y p e I , I I , o r I I I c e l l . I na d d i t i o n , t h e r a n g e o f c e l l s i z e s w a s g r e a t e r f o r t y p e I V c e l l s .When o b s e r v e d b y p h a s e m i c r o s c o p y , t h e s p o r e s p r o -d u c e d b y e i t h e r t y p e I I o r I I I c u l t u r e s w e r e i n d i s t i n g u i s h a b l ef r o m t h o s e p r o d u c e d b y t y p e I c u l t u r e s . T h e y w e r e a l s oi n d i s t i n g u i s h a b l e o n t h e b a s i s o f h e a t s e n s i t i v i t y . A p p r o x i -m a t e l y 90% o f t h e s p o r e s o f e a c h t y p e w e r e i n a c t i v a t e d b yh e a t i n g a t 9 0 C f o r 3 m i n . H o w e v e r , when t y p e I I o r I I Is p o r e s w e r e p l a t e d , t he y g a v e r i s e o n l y t o t y p e I I o r I I Ic o l o n i e s , r e s p e c t i v e l y . T h e y d i d n o t p r o d u c e t y p e I c o l o n i e s .Q u a n t i t a t i v e d a t a o n s o m e p r o p e r t i e s o f l i q u i d c u l t u r e sd e r i v e d f r o m t h e f o u r t y p e s o f c o l o n i e s a r e p r e s e n t e d i nT a b l e 2 . A c o r r e l a t i o n b e t w e e n c o l o n y t y p e , s o l v e n t p r o d u c -

TABLE 2 . S p o r e a n d s o l v e n t p r o d u c t i o n b y s e v e r a l i s o l a t e s o fe a c h o f t h e v a r i o u s c o l o n y t y p e s "C o l o n y t y p e f r o m Am t ( g / l i t e r ) o f s o l v e n tw h i c h l i q u i d p r o d u c e d % S p o r e sc u l t u r e w a si n i t i a t e d A c e t o n e B u t a n o l

I 1 . 4 2 5 6 . 0 1 1 6 15 . 3 2 8 6 . 4 6 9 5 03 . 9 0 1 8 . 9 8 8 4 64 . 0 5 1 7 . 3 7 2 5 24 . 6 1 8 1 0 . 8 0 5 1I I 1 . 0 0 5 2 . 6 2 9 01 . 0 3 1 3 . 9 8 4 00 . 0 0 0 0 . 1 7 6 01 . 1 0 1 3 . 0 8 5 81 . 6 3 0 6 . 9 9 5 1 6I I I 1 . 8 2 2 5 . 1 9 4 1 60 . 3 7 7 2 . 1 6 4 00 . 0 0 0 0 . 6 1 4 < 0 . 11 . 5 4 8 6 . 4 6 2 2 60 . 0 0 0 0 . 0 1 8 0I V 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 00 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0

0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 00 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0R e s u l t s a r e f o r 5 - d a y - o l d c u l t u r e s g r o w n i n p o t a t o m e d i u m a t 3 7 C . T h ep r e s e n c e o f s p o r e s w a s d e t er m in ed b y m i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n o f t h ef r e q u e n c y o f p h a s e - b r i g h t , o v a l s t r u c t u r e s . A t l e a s t 2 0 0 c e l l s a n d s p o r e s w e r es c o r e d f o r e a c h c u l t u r e .

t i o n , a n d t h e a b i l i t y t o f o r m s p o r e s w a s o b s e r v e d . I t i s t h i sc o r r e l a t i o n t h a t f o r m s t h e b a s i s o f t h e m e t h o d f o r p r e d i c t i n gs o l v e n t p r o d u c t i o n b a s e d o n c o l o n y m o r p h o l o g y . A s i m i l a rc o r r e l a t i o n w a s o b s e r v e d f o r a l l s t r a i n s o f C . a c e t o b u t y l i c u mt e s t e d .DISCUSSION

C h a n g e s i n b a c t e r i a l c o l o n y m o r p h o l o g y a s s o c i a t e d w i t ha l t e r e d b i o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s h a v e b e e no b s e r v e d f r e q u e n t l y . A t o n e t i m e , t h i s p h e n o m e n o n , u s u a l l yr e f e r r e d t o a s d i s s o c i a t i o n , o c c u p i e d t h e a t t e n t i o n o f many1 9 9 8

CELLNUNBER

1

AcELLNUNBER

B

I * --29 8 4 0 8 698 8 6 8 e lo9e 29 9 49 669 se8 l 9 e 9RELATIVE CELL SIZE RELRTIVE CELL SIZEF I G . 2 . R e l a t i v e c e l l s i z e d i s t r i b u t i o n f o r t y p e I ( A ) a n d t y p e I V ( B ) c e l l s a s d e t e r m i n e d b y f l o w c y t o m e t r i c a n a l y s i s . A t o t a l o f 7 7 ,8 8 5 c e l l sw e r e a n a l y z e d f o r t y p e I , a n d 7 4 , 4 9 1 c e l l s w e r e a n a l y z e d f o r t y p e I V .

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

8/6/2019 A Technique for Predicting the Solvent-Producing

4/4

SOLVENT PRODUCTION AND COLONY MORPHOLOGY 2 4 9 9b a c t e r i o l o g i s t s ( 2 ) . A t h e o r e t i c a l t r e a t m e nt o f t h e d e v e l o p -m e n t o f c o l o n y o u t g r o w t h s b a s e d o n d i f f e r e n t i a l g r o w t h r a t e so f i n d i v i d u a l c e l l s a n d t h e i r p r o g e n y h a s b e e n p r e s e n t e d ( 1 1 ) .O u r c u r r e n t o b s e r v a t i o n s a r e a n e xt e ns i on o f e a r l i e r w o r ka n d p r o v i d e a p r a c t i c a l m e t h o d f o r p r e d i c t i n g t h e s o l v e n t -p r o d u c i n g p o t e n t i a l o f C . a c e t o b u t y l i c u m c u l t u r e s . T h eo b s e r v a t i o n s a l s o p r o v i d e a wa y o f m o n i t o r i n g t h e d e g e n e r -a t i o n o f c u l t u r e s a n d may e v e n t u a l l y b e u s e f u l i n e f f o r t s t oe x p l a i n a n d c o n t r o l t h i s p h e n o m e n o n .L i q u i d c u l t u r e s o f C . a c e t o b u t y l i c u m t h a t p r o d u c e d o n l yt y p e I c o l o n i e s c o n s i s t e n t l y p r o d u c e d h i g h l e v e l s o f a c e t o n ea n d b u t a n o l , w h e r e a s c u l t u r e s t h a t y i e l d e d o n l y t y p e I Vc o l o n i e s p r o d u c e d l i t t l e o r n o s o l v e n t s . O f t h e c u l t u r e s t h a tp r o d u c e d t y p e I I o r I I I c o l o n i e s , s o m e p r o d u c e d s i g n i f i c a n tl e v e l s o f s o l v e n t s , w h e r e a s o t h e r s d i d n o t . L i q u i d c u l t u r e st h a t c o nt a i n ed m i x t ur e s o f t h e c o l o n y t y p e s p r o d u c e d i n t e r -m e d i a t e l e v e l s o f a c e t o n e a n d b u t a n o l .I n a t l e a s t o n e p r e v i o u s r e p o r t , a n o u t g r o w t h f r o m a C .a c e t o b u t y l i c u m c o l o n y , p r o b a b l y c o r r es p o n d i n g t o o u r t y p eI V , w a s n o t e d ( 5 ) . H o w e v e r , i t w a s n o t r e c o g n i z e d t h a ts e v e r a l t y p e s o f o u t g r o w t h s o c c u r a n d t h a t t h e y r e p r e s e n tv a r i o u s s t a g e s i n t h e d e g e n er a t i on o f a c u l t u r e . T h e u s e o fc o l o n y t y p e t o p r e d i c t s o l v e n t - f o r m i n g e f f i c i e n c y w a s n o ts u g g e s t e d . E a r l i e r w o r k e r s h a v e a l s o r e p o r t e d t h e i s o l a t i o no f s p o r u l a t i o n a n d s o l v e n t " m u t a n t s " a f t e r t r e a t m e n t w i t hm u t a g e n i c a g en t s b u t f a i l e d t o n o t e t h a t t h e s e s a m e m u t a n t sc a n b e i s o l a t e d f r o m t h e e d g e s o f a l l m a t u r e t y p e I c o l o n i e s( 8 , 9 ) . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e c h e m i c a l a g e n t s u s e d a sm u t a g e n s w e r e a c t i n g o n l y a s s e l e c t i v e a g e n t s i n t h e s e e a r l i e re x p e r i m e n t s .I n a d d i t i o n t o t h e u s e o f c o l o n y m o r p h o l o g y t o p r e d i c ts o l v e n t - f o r m i n g e f f i c i e n c y , o u r r e s u l t s h e l p i n p r e d i c t i n g t h el i k e l i h o o d t h a t s p o r e s e l e c t i o n w i l l " r e g e n e r a t e " a g o o ds o l v e n t p r o d u c e r . I f a l i q u i d c u l t u r e c o n t a i n s s p o r e s t h a t g i v er i s e t o a m i x t u r e o f t y p e I , I I , a n d I I I c o l o n i e s , i t w i l lp r o b a b l y n o t b e p o s s i b l e t o r e e s t a b l i s h a n e f f i c i e n t s o l v e n t -p r o d u c i n g s t r a i n b y r e p e a t e d h e a t t r e a t m e n t o r o t h e r s e l e c -t i o n f o r s p o r e s . T h i s i s b e c a u s e t h e h e a t s e n s i t i v i t y o f a l lt h r e e t y p e s o f s p o r e s i s e q u i v a l e n t a n d t h e y w i l l e a c hc o n t i n u e t o p r o d u c e t h e i r r e s p e c t i v e c e l l t y p e s . I t w o u l d ,h o w e v e r , b e p o s s i b l e t o s e l e c t a n e f f i c i e n t s o l v e n t p r o d u c e rb y p l a t i n g t h e s p o r e m i x t u r e a n d e s t a b l i s h i n g a l i q u i d c u l t u r ef r o m t h e c en t er o f a n i m m a t u r e t y p e I c o l o n y .T h e d e t a i l e d m e c h a n i s m a c c o u n t i n g f o r d e g e n e r a t i o n i sy e t t o b e d e s c r i b e d . I t p r o b a b l y i n v o l v e s s p o n t a n e o u s e v e n t sa f f e c t i n g t h e e f f i c i e n c y o f s p o r u l a t i o n . I n a n u t r i e n t - r i c ha n a e r o b i c e n v i r o n m e n t , t h e c e l l s w i t h t h e l e a s t t e n d e n c y t os p o r u l a t e w i l l e v e n t u a l l y p r e d o m i n a t e . We h o p e t h a t t h e

a b i l i t y t o c o r r e l a t e s o l v e n t p r o d u c t i o n , c o l o n y m o r p h o l o g y ,a n d s p o r e p r o d u c t i o n w i l l e v e n t u a l l y l e a d t o f u r t h e r u n d e r -s t a n d i n g o f d e g e n e r a t i o n .ACKNOWLEDGMENTS

We g r a t e f u l l y r e c o g n i z e t h e c o n t r i b u t i o n s made b y R u s s e l l H a n d ,wh o o b t a i n e d t h e f l o w c y t o m e t r y d a t a p r e s e n t e d , a n d R i c h a r dM a c h a n o f f , wh o c o n t r i b u t e d e x p e r i m e n t a l l y t o t h e e a r l y s t a g e s o ft h i s w o r k a n d h a s c o nt i nu e d t o b e a v a l u a b l e d i s c u s s a n t .T h i s r e s e a r c h w a s s p o n s o r e d b y t h e O f f i c e o f H e a l t h a n d E n v i -r o n m e n t a l R e s e a r c h , U . S . D e p a r t m e n t o f E n e r g y , u n d e r c o n t r a c tD E - A C 0 5 - 8 4 0 R 2 1 4 0 0 w i t h M a r t i n M a r i e t t a E n e r g y S y s t e m s , I n c .

LITERATURE CITED1 . A d l e r , H . I . , W. D . C r o w , C . T . H a d d e n , J . H a l l , a n d R .M a c h a n o f f . 1 9 8 3 . New t e c h n i q u e s f o r g r o w i n g a n a e r o b i c b a c t e -r i a . B i o t e c h n o l . B i o e n g . S y m p . 1 3 : 1 5 3 - 1 6 1 .2 . B r a u n , W. 1 9 4 7 . B a c t e r i a l d i s s o c i a t i o n . A c r i t i c a l r e v i e w o f ap h e n o m e n o n o f b a c t e r i a l v a r i a t i o n . B a c t e r i o l . R e v . 1 1 : 7 5 - 1 1 4 .3 . C r o w , W. D . , R . M a c h a n o f f , a n d H . I . A d l e r . 1 9 8 5 . I s o l a t i o n o fa n a e r o b e s u s i n g a n o x y g e n r e d u c i n g m e m b r a n e f r a c t i o n . J .M i c r o b i o l . M e t h o d s 4 : 1 3 3 - 1 3 9 .4 . F i n n , R . K . , a n d J . E . N o w r e y . 1 9 5 9 . A n o t e o n t h e s t a b i l i t y o fc l o s t r i d i a w h e n h e l d i n c o n t i n u o u s c u l t u r e . A p p l . M i c r o b i o l .

7 : 2 9 - 3 2 .5 . J o n e s , D . R . , J . R . W e b s t e r , a n d D . R . W o o d s . 1 9 8 0 . T h ef o r m a t i o n o f s i m p l e f r u i t i n g b o d y - l i k e s t r u c t u r e s a s s o c i a t e d w i t hs p o r u l a t i o n u n d e r a e r o b i c c o n d i t i o n s i n C l o s t r i d i u m a c e t o b u t y l -i c u m . J . G e n . M i c r o b i o l . 1 1 6 : 1 9 5 - 2 0 0 .6 . J o n e s , D . T . , A . v a n d e r W e s t h u i z e n , S . L o n g , E . R . A l l c o c k ,S . J . R e i d , a n d D . R . W o o d s . 1 9 8 2 . S o l v e n t p r o d u c t i o n a n dm o r p h o l o g i c a l c h a n g e s i n C l o s t r i d i u m a c e t o b u t y l i c u m . A p p l .E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 3 : 1 4 3 4 - 1 4 3 9 .7 . K u t z e n o k , A . , a n d M. A s c h n e r . 1 9 5 2 . D e g e n e r a t i v e p r o c e s s e s i na s t r a i n o f C l o s t r i d i u m b u t y l i c u m . J . B a c t e r i o l . 6 4 : 8 2 9 - 8 3 6 .8 . L a r g i e r , S . T . , S . L o n g , J . D . S a n t a n g e l o , D . T . J o n e s , a n d D . R .W o o d s . 1 9 8 5 . I m m o b i l i z e d C l o s t r i d i u m a c e t o b u t y l i c u m P 2 6 2m u t a n t s f o r s o l v e n t p r o d u c t i o n . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 0 :4 7 7 - 4 8 1 .9 . L o n g , S . , D . T . J o n e s , a n d D . R . W o o d s . 1 9 8 4 . T h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e n s p o r u l a t i o n a n d s o l v e n t p r o d u c t i o n i n C l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m P 2 6 2 . B i o t e c h n o l . L e t t . 6 : 5 2 9 - 5 3 4 .1 0 . P r e s c o t t , S . C . , a n d C . G . D u n n . 1 9 5 9 . I n d u s t r i a l m i c r o b i o l o g y ,p . 2 6 2 - 2 6 3 . M c G r a w - H i l l Book C o . , New Y o r k .1 1 . S h i n n , L . E . 1 9 3 9 . F a c t o r s g o v e r n i n g t h e d e v e l o p m e n t o fv a r i a t i o n a l s t r u c t u r e s w i t h i n b a c t e r i a l c o l o n i e s . J . B a c t e r i o l .3 8 : 5 - 1 2 .1 2 . T y n d a l l , R . L . , R . E . H a n d , J r . , R . C . M a n n , C . E v a n s , a n d R .J e r n i g a n . 1 9 8 5 . A p p l i c a t i o n o f f l o w c y t o m e t r y t o d e t e c t i o n a n dc h a r a c t e r i z a t i o n o f L e g i o n e l l a s p p . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l .4 9 : 8 5 2 - 8 5 7 .

VOL. 5 3 , 1 9 8 7