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A IMPORTÂNCIA DA COLORAÇÃO A IMPORTÂNCIA DA COLORAÇÃO DE GRAM NA TRIAGEM DE DE GRAM NA TRIAGEM DE AMOSTRAS BIOLÓGICASAMOSTRAS BIOLÓGICAS

Keite Nogueira

GRAM: POR QUÊ?

• Diagnóstico rápido• Direcionar terapia• Necessidade de cultura• Avaliação de microbiota• Monitoramento da cultura• Suspeita de anaeróbios• Interpretação da resposta inflamatória

Preparo do Esfregaço

1. Lâminas limpas e novas2. Espessura do esfregaço: mediana3. Fixação4. Amostras:

Swab: rolar gentilmente sobre a lâminaAspirados, exsudatos, escarro, fezes,etc.

Selecionar porções purulentasMaterial espesso emulsionar em salina

Preparo do Esfregaço

Líquor e outros fluidosCentrifugar e processar o sedimento

Urina: gota não centrifugadaMaterial seco ou em pouca quantidadeBiópsias e tecidosCultura em caldoColônia de meio sólido

Métodos

• Corante– Cristal violeta

• Descorante * Hucker´s– Álcool * Carbol-fucsina– Acetona * Kopeloff´s– Álcool-acetona

• Contracorante– Fucsina fenicada– Safranina

Fucsin

COLORAÇÃO DE GRAM

• INTERPRETAÇÃO:

– GRAM POSITIVO: parede com peptideoglicano e ác. teicoico, retém coloração violeta

– GRAM NEGATIVO: parede com fina camada de peptideoglicano ligada a um fosfolipídio- polissacáride assimétrico

Classificação

• Tamanho e Morfologia

• Arranjo

• Afinidade aos corantes

Interferentes

• Fantasma• Descoloração• Tempo de ação do corante• Uso de lâminas sujas e engorduradas• Análise de campos isolados• Aquecimento excessivo na fixação• Esfregaço fino ou espesso

Controle de Qualidade

• Verificar os reagentes diariamente:– Precipitação do cristal violeta– Evitar a evaporação

• Cepa padrão corada diariamente e a cada novo lote– E. coli ATCC 25922– S. epidermidis ATCC 12228 ou– S. aureus ATCC 25923

Controle de Qualidade

GRAM

• AMOSTRA CLÍNICA:

– Qualidade da amostra

– Diagnóstico presuntivo

– Diagnóstico definitivo

Triagem /Diagnóstico Presuntivo

• Anaeróbio

• Bactérias Fastidiosas

• Urocultura

– Bacterioscopia da urina não centrifugada

Triagem - Anaeróbios

Triagem – Bactérias Fastidiosas

Triagem de URINA Gram da Gota Não Centrifugada

• Considera-se como “positivo” o esfregaço que contiver pelo menos uma bactéria ou leucócito por campo de grande aumento (1.000x), em urinas não-centrifugadas e bem homogeneizadas.

Triagem – Gram da Gota de Urina Não Centrifugada

Diagnóstico Definitivo Uretrite masculina - Neisseria gonorrhoeae

Diagnóstico Definitivo Vaginose bacteriana - Gardnerella e

Mobiluncus

BACTÉRIAS N.º DE BACTÉRIAS

SCORE

Lactobacilos >30 5-30 1-4 <1 0

0 1 2 3 4

Mobiluncus >5 1-4 0

2 1 0

Gardnerella / Bacteroides

>30 5-30 1-4 <1 0

4 3 2 1 0

Score Interpretação0-3 Normal4-6 Intermediário, rep.7-10 Vaginose bact.

CRITÉRIOS DE NUGENT

Qualidade da Amostra - Feridas

/CAMPO SCORE

Leucócitos 0 1-9

10-24 >25

0 +1 +2 +3

Células Epiteliais 0 1-9

10-24 >25

0 -1 -2 -3

INTERPRETAÇÃOQ3: Cultura aeróbia e anaeróbiaQ2 ou Q1: Cultura aeróbiaQ0 ou Inferior: Cultura aeróbia, contaminação ou colonização

MÉTODO DO SCORE Q (Qualitativo)

Qualidade da Amostra – Feridas e Secreções em Geral

Qualidade da Amostra – Escarro e Amostras Respiratórias

Avaliação da Amostra-Escarro

• Exame macroscópico• Preparo da amostra

• Análise microscópica• Células epiteliais e leucócitos• A amostra ideal é aquela que contém pouca ou nenhuma célula epitelial

(menos de 10 células epiteliais por campo) e leucócitos (mais de 25 leucócitos por campo).

• Macrófagos alveolares e células colunares ciliadas • Bactérias: relatar aquelas que estão entre os

leucócitos e macrófagos, no meio do muco.

Avaliação Bacteriológica do Escarro

Coleta de Escarro

• Seguir as instruções correntes• Evitar secreções do trato

respiratório alto (principalmente pós-nasal)

• Enviar imediatamente ao laboratório

• Processar o quanto antes

Avaliação Macroscópica Secreções Respiratórias•Serosa: Água + Eletrólitos + Mucoproteínas +células

• Mucóide: Água + Eletrólitos + Mucoproteínas + Células

•Purulenta:Componentes anteriores + Leucócitos em grande quantidade

•Hemática:Componentes anteriores + sangue

Preparo da Amostra

Parte purulenta (grumos de pus) ou mucóideLavagem com salina estéril (técnica original)Técnica adaptada:

Os grumos devem ser retirados (palito de madeira) e arrastados sobre uma superfície estéril (placa de petri). O excesso de saliva fica aderido à superfície. O material purulento é então utilizado para a confecção do esfregaço e inoculação nos meios de cultivos.

Sistema de graduação de Murray e Washington

Classificação Células Epiteliais

Leucócitos

Grupo 1 25 10 Grupo 2 25 10-25 Grupo 3 25 25 Grupo 4 10-25 25 Grupo 5 <10 >25

Avaliar no mínimo 10 campos, em aumento de 100X

Avaliação Microscópica

Considerações

•A análise microscópica deve ser feita em áreas onde há menor número de células epiteliais.• Avaliar a presença de bactérias levando em consideração quantidade, predomínio, fagocitose e morfologia sugestiva de anaeróbios.

•Macrófagos alveolares e células colunares ciliadas: são indicativos de trato respiratório inferior.

ACHADOS EVENTUAIS

VALE LEMBRAR

• O preparo do esfregaço deve ser cuidadoso, procurar áreas representativas

• Gram: cor, tamanho, forma e arranjo

• A triagem pela pesquisa de células epiteliais e leucócitos pode ser utilizadas para diversos materiais clínicos

• Pacientes neutropênicos ou infecção por bactérias que lisam leucócitos, outros parâmetros devem ser levados em consideração

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