7.patologia mitocondriale 2011

PATOLOGIE DEI PATOLOGIE DEI MITOCONDRIMITOCONDRI

MITOCONDRI: : fosforilazione ossidativa ossidativa

III

IIISpazio

intermembrana

Matrice NADHNAD

H+

succinatofumarato

H+

IVCoQ

Cytc

O2 2H2O

H+

V

ATP

H+

ADP+Pi

COMPLESSO I:NADH deidrogenasi39 polipeptidi 7 polipeptidi mitocondriali

COMPLESSO II:SUCCINATO DEIDROGENASI4 polipeptidi nucleari

COMPLESSO III: CITOCROMO C REDUTTASI10 polipeptidi 1 polipeptide mitocondriale (citocromo b)

COMPLESSO IV:CITOCROMO C OSSIDASI10 polipeptidi 3 polipeptidi mitocondriali

COMPLESSO V:ATP SINTASI14 polipeptidi 2 polipeptidi mitocondriali (ATPasi 6 - 8)

H+ H+ H+H+ H+H+

Caratteristiche mtDNA Singolo anello a doppia elica di 16.569 bp

2 - 10 copie mtDNA/mitocondrio 103 - 104 copie mtDNA/cellula

• 37 geni: 24 RNA per la sintesi proteica

• 22 tRNA• 2 rRNA (12S e 16S)

13 mRNA x polipeptidi, • subunità enzimatiche della

catena respiratoria• regolazione della

fosforilazione ossidativa

• Le polimerasi sono codificate dal DNA nucleare

Mappa del mtDNA

Replicazione bidirezionale ed asincrona

COMPLESSO III - citocromo C reduttasi (citocromo b)COMPLESSO IV - citocromo C ossidasiCOMPLESSO V - ATP sintasi

rRNA (12S e 16S)

37 geniPH

PL

ND1

ND2

ND3

ND4L

ND4

ND5

ND6

ATP6, ATP8

COI

COIII

D-Loop

OL

OH

COII

OH - origine di reolicazione strand H(senso orario)

OL - origine di replicazione strand L(senso anti orario)

D-Loop : regione di controllocontenente 2 promotori

COMPLESSO I - NADH deidrogenasi

Geni del mtDNA• Polipeptidi di NADH deidrogenasi (7)• Polipeptide di citocromo C reduttasi (1)• Polipeptidi di citocromo C ossidasi (3)• Polipeptidi dell’ATP sintasi (2)• rRNA dei ribosomi mitocondriali (2)• tRNA transfer-RNA mitocondriali (22)Mutazioni del mtDNA possono manifestarsi Mutazioni del mtDNA possono manifestarsi

in malattie correlate con la deficienza di in malattie correlate con la deficienza di ATP con sintomi relativi ai distretti ATP con sintomi relativi ai distretti

maggiormente colpitimaggiormente colpiti

Formazione di radicali liberi ed alterazioni mitocondriali

• Il trasporto mitocondriale di elettroni non è perfetto.

• Anche in condizioni ideali, alcuni elettroni vengono “persi” dalla catena respiratoria ed interagiscono con l’ossigeno per formare radicali superossido.

• In caso di alterazioni mitocondriali, questo fenomeno aumenta.

• La vicinanza del DNAmt al flusso di radicali superossido (o idrossilici) e la sua mancanza di protezioni e di meccanismi di riparazione, porta ad aumento dei fenomeni di mutazioni e delezioni.

“Invecchiamento” mitocondriale

• Il fenomeno di “invecchiamento” mitocondriale, con conseguente danno della funzione, è stato proposto come causa di:

• 1) stress da radicali liberi, • 2) malattie degenerative, • 3) malattie metaboliche (diabete

mellito),• 3) alterazioni legate alla vecchiaia.

Caratteristiche mtDNAEntrambi i filamenti del mtDNA sono trascritti e generano lunghi POLICISTRONI che sono processati per il rilascio di:

tRNArRNAmRNA

MUTAZIONI FREQUENTI > DNA NUCLEARE):- mancanza di ISTONI- mancanza di meccanismi di riparo- danno da radicali liberi

• Replicazione asincrona ed indipendente del mtDNA / DNA nucleare• Distribuzione non omogenea del numero delle molecole di mtDNA nelle cellule figlie• Mancanza di ricombinazione tra molecole di mtDNA• Nuovi alleli --> mutazioni spontanee

Genetica mitocondriale• Le proteine mitocondriali derivano per la maggior

parte da geni del DNA nucleare (nDNAnDNA) e solo in piccola parte dal DNA mitocondriale (mtDNAmtDNA)

• I mitocondri di un organismo derivano dalla cellula uovo: pertanto, il mtDNA è da considerarsi esclusivamente materno

• Al contrario delle proteine codificate dal nDNA, non seguono le regole della genetica mendeliana

• I mitocondri costituiscono una popolazione disomogenea che si può distribuire in maniera disomogenea nelle cellule figlie, dando luogo a mosaicismo mitocondrialemosaicismo mitocondriale.

Patologia genetica mitocondrialeALTERAZIONI --> ampio spettro di patologie molecolari mitocondriali

MUTAZIONI DEL mtDNA

A) RIARRANGIAMENTI

B) MUTAZIONI PUNTIFORMI

C) MUTAZIONI PUNTIFORMI dei popolipeptidi della OXPHOS

Mutazioni:Germinali (eredità materna)Somatiche (casi sporadici di malattia)

MUTAZIONI DEL nDNA (tratto mendeliano)

A) MUTAZIONI Missense / delezioni di geni dei complessi OXPHOSB) MUTAZIONI Missense / delezioni geni di altre proteine mtC) DESTABILIZZAZIONE DEL mt DNA

Delezioni Duplicazioni

tRNAdifetti sintesi proteica

rRNA

difetti sintesi proteica

• MonogenicheMonogeniche:– Neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON)– Sindrome di Leigh, sindrome NARP – MELAS: encefalopatia mitocondriale, acidosi lattica, episodi tipo-

ictus – MERRF: epilessia mioclonica e miopatia a fibre ragged-red – Cardiomiopatie e miopatie ereditarie per via materna– Oftalmoplegia isolata– Sordità indotta da aminoglicosidi – Resistenza al cloramfenicolo

• PoligenichePoligeniche:– Sindrome di Pearson – Sindrome di Kearns-Sayre – Diarrea cronica neonatale + atrofia dei villi

Malattie genetiche del mtDNA

• Esempi di funzioni molto sensibiliEsempi di funzioni molto sensibili (sono inibite al 50-60% del normale CE):– Contrazione muscolare intensa e continua– Conduzione nervosa– Contrazione cardiaca– Aggregazione piastrinica– Alcune secrezioni endocrine ed esocrine

• Esempi di funzioni poco sensibiliEsempi di funzioni poco sensibili (al 10-15% del normale CE non sono ancora inibite):

– Alcune forme di trasporto ionico (ATP-asi citosol: pompa Na/K, pompe del Ca++)

– Trasportatori ABC (es. canale per il cloro della fibrosi cistica)

Le funzioni cellulari sono variamente sensibili alla

diminuzione del carico energetico (CE)

Un numero critico di DNAmt mutato deve essere presente perché si manifestino disfunzioni tessutali e segni clinici apparenti.

La proporzione di DNAmt mutato necessaria perchè si manifesti un fenotipo patologico varia a seconda di individui, organi e tessuti.

Tessuti con elevata richiesta di energia, come muscoli e cervello hanno una soglia di sensibilità relativamente bassa e sono particolarmente vulnerabili alle mutazioni di DNAmt.

La maggior parte dei disordini dei mitocondri si presentano come encefalomiopatie che interessano principalmente i tessuti muscolari e nervosi.

EFFETTO SOGLIA

Malattie e sintomi a livello di organi e tessuti

dipendenti da alterazioni del mtDNA

• Cuore: cardiomiopatie e difetti di conduzione• Muscolo scheletrico: miopatia• Disordini neurologici e psichiatrici• Occhio: retinopatie, cataratta, neurite ottica• Sordità• Endocrine: diabete mellito, bassa statura,

ipoparatiroidismo • Rene: disfunzione nefrone prossimale,

glomerulopatia• Epatopatia, disfunzione pancreas esocrino• Pancitopenia• Aggregazione piastrinica

Manifestazioni sistemiche delle Malattie

mitocondriali (mtDNA)

• I disordini mitocondriali si possono presentare con una varietà di segni clinici e sintomi che riguardano multipli organi e sistemi.

• Quando si presenta una patologia che riguarda tre o più organi, è lecito pensare ad una malattia mitocondriale.

• Sintomi che possono associarsi comunemente sono: ictus, epilessia, marcata astenia, sordità, neuropatia periferica.

Sintomi delle Malattie mitocondriali (mtDNA)

• I disordini mitocondriali possono essere causati da una mutazione di DNA nucleare o DNA mitocondrale.

• Una classificazione su base molecolare è assai difficile, resa più complessa dalla scarsa correlazione tra genotipo e fenotipo.

• Ad es. individui con oflamoplegia esterna clinicamente comparabile possono avere una larga delezione o una mutazione puntiforme (es. A3243G) di DNAmt o una mutazione di DNA nucleare (es. di Ant 1) che causa secondarie anomalie di DNAmt.

• Inoltre la stessa mutazione genetica può causare sindromi cliniche diverse.

Cause delle Malattie mitocondriali (mtDNA)

Sindrome di Kearn-Sayre (KSS) e CPEO(Chronic progressive external ophthalmoplegia)

Oftalmoplegia cronica e progressivaPtosiMiopatia mitocondriale (RRF)

Retinite pigmentosaAcidosi latticaPerdita neurosensoriale dell’uditoAtassiaAttacchi epiletticiDemenzaCardiopatia ipertrofica e dilatativaDifetti di conduzione

CPEOdopo i 20 anni

Sindrome di Kearn-Sayre

prima dei 20 anni


Patologie prevalentemente sporadiche


• Oftalmoplegia: paralisi della muscolatura del bulbo oculare che impedisce i movimenti del bulbo stesso, compresi quelli involontari dell'accomodazione

• 83 % di KSS e 47% CPEO ---> riarrangiamenti del mtDNA

• Prevalentemente, ampie delezioni (con o senza duplicazioni)

• La maggior parte sono nuovi casi di mutazioni spontanee e sporadiche insorte in uno stadio precoce di sviluppo (oocita?)

• Costante la ETEROPLASMIA tra mtDNA normale e mtDNA mutato

•Delezioni / duplicazioni Variano da 2 - 8 Kb. Fiancheggiate da sequenze ripetitive•Gli ADULTI affetti presentano:• - mtDNA deleto prevalentemente nel muscolo e nel cervello • - sviluppo di oftalmoplegia esterna progressiva (PEO) o della • sindrome di KEARNS-SAYRE (forma più severa)•I BAMBINI affetti presentano:• - mtDNA deleto ha una distribuzione tissutale estesa• - gravi disordini multistemici (anemia, insufficienza • pancreatica esocrina, diabete mellito, nefropatia, • epatopatia, eczema, altri disordini endocrini)•Malattie associate con delezioni progrediscono con l’età perché aumenta il rapporto mtDNA mutato/ mtDNA normale

Riarrangiamenti del mtDNA

90%

10%

La delezione più frequente è 4997 bp tra due repeats di 13 basi

Delezioni: Delezioni comuni: 4977 paia di basi da 8488 a 13460; 13 paia di basi ripetute al punto di interruzione delle mutazioni La maggior parte delle delezioni preservano i Promotori della trascrizione dei filamenti pesante e leggero Geni dell'RNA ribosomale 12S e 16S

Delezione geni tRNA e proteine della OXPHOS

Riduzione sintesi proteica

Riduzione OXPHOS

Pochi casi di KSS/CPEO dipendono da mutazioni di tRNA mitocondriale

Sindrome di Kearn-Sayre (KSS) e CPEO

Sindrome di Pearson

Anemia, Neutropenia, ed Acidosi lattica Anemia, Neutropenia, ed Acidosi lattica

Patologia prevalentemente sporadica

Disordine multisistemico caratterizzato da:Pancitopenia (midollare)Fibrosi pancreatica ---> diabeteAtrofia splenicainsufficenza epatica e renale

-Colpisce nell’infanzia ed è spesso letale

-Gli individui che sopravvivono progrediscono ---> fenotipo KSS

Sindrome di Pearson

Cause molecolari: difettoso funzionamento dell OXPHOS dovuta a ridotta

attività del COMPLESSO IVarie delezioni: 2461 bp 1036 - 12828

fiancheggiata da sequenze GCCLa delezione/duplicazione del mtDNA è OMOPLASMICA nelle cellule del sangue ------> pancitopeniaDifetto nelle subunità ND3, ND4L, ND4, ND5 del complesso IDifetto nei tRNA (Arg His Ser Leu)

Sindrome di Pearson

MELAS (Mitochondrial encephalomyopathy

lactic acidosis stroke)Mutazioni puntiformi dei tRNA del mtDNA

Malattia neurodegenerativa progressiva caratterizzata da:Episodi ischemici cerebrali prima dei 40 anni (tra 5 e 15)

(da vasculopatia mitocondriale)miopatia mitocondrialeacidosi lattica e/o ragged red fibers

Sintomi associati:affaticabilitàdiabete mellitocardiomiopatiasordità bilateraleretinopatia pigmentosaatassia

Trasmissione materna ma anche forme sporadiche

MELAS (Mitochondrial encephalomyopathy lactic acidosis stroke)

Mutazioni puntiformi dei tRNA del mtDNA

Basi molecolari Mutazioni puntiformi dei tRNA del mtDNA: Mutazioni eteroplasmichetRNALeu(UUR) 3243A --> G loop di diidrouridina:

alterazioni della struttura terziariastabilità del tRNAcapacità di interazione con aa LEUcapacità di assemblaggio tRNA con i ribosomi

RIDUZIONE SINTESI PROTEICA MITOCONDRIALE > 85% mtDNA ---> MELAS 5 - 35% mtDNA ---> diabete mellito di tipo II ad eredità

materna e sorditàtRNALeu(UUR) 3271T --> C nucleotide terminale dell’anticodone: tRNALeu(UUR) 3251A --> G loop di diidrouridinaAltre mutazioni non caratterizzate del mtDNAMutazioni del DNA nucleare

MELAS (Mitochondrial encephalomyopathy lactic acidosis stroke)

MERRF (Myoclonic Epilepsy and Ragged Red Fiber)

Mutazioni puntiformi dei tRNA del mtDNA:

Encefalomiopatia ad eredità materna• Epilessia mioclonica progressiva• Demenza lentamente progressiva• Miopatia mitocondriale - fibre rosse ruvide (Ragged red fibers)

Le fibre muscolari sono caratterizzate da accumulo di mitocondri sub-sarcolemmali (RRF).

La proliferazione mitocondriale rappresenta, probabilmente, una risposta compensatoria al difetto metabolico della cellula



-Sintomi frequentemente associati

- Perdita dell’udito - Atassia

•Comparsa della sintomatologia tra tarda infanzia ed età adulta•Si può verificare la riduzione del metabolismo del SNC attraverso la PET•Positività alla RMN del SNC, con degenerazione dei nuclei della base•Mutazione eteroplasmica: variabilità individuale

MERRF(Myoclonic Epilepsy and Ragged Red Fiber)


tRNALys 8344A --> G nel Tloop: nucleotide molto conservatomut. 80-100% presente

funzionalmente recessiva, alterata interazione con il ribosoma sintesi proteica funzionalità dei complessi I e IV

tRNALys 8356T --> C stem Tloop: - nucleotide molto conservatomut. meno frequente

funzionalmente recessiva, sintesi proteica

8356

8344


S. DI LEIGH:

Sindrome di LEIGH e NARPSindrome di LEIGH e NARP(Neurogenic muscle weakness, Ataxia, Retinite

Pigmentosa)

S. DI LEIGH: patologia prevalentemente ereditaria (mutazioni di nDNA e mtDNA)encefalomiopatia subacuta necrotizzante con esordio

intorno a 1,5 anni con exitus intorno ai 5 anni clinica: Miopatia neurogena

Atassia NARPRetinite Pigmentosa

atrofia otticaoftalmoplegiadifetti respiratorinistagmoipotoniaritardi di sviluppo

Il quadro clinico-metabolico è caratteristicamente precipitato dalle infezioni

necrosi dei gangli della base ed angiopatia

Sindrome di LEIGH e NARPSindrome di LEIGH e NARP(Neurogenic muscle weakness, Ataxia, Retinite

Pigmentosa)

Mutazioni puntiformi del mtDNA più frequenti:MTATP6*NARP - T8993---> Leu 156 ---> ArgMTATP6*FBSN - 9176 ---> Leu 217 ---> Pro

blocco traslocazione dei protoni - canale complesso V

Trasmissione materna con costante ETEROPLASMIA: correlazione tra i livelli di mtDNA mutato e severità dei sintomi

Alti livelli >95%: severa S. di Leigh con insorgenza infantileBassi livelli <75% NARP con insorgenza più tardiva

8933

Sindrome di LEIGH e NARP

8993

alterazione della ATP sintasi

• Neuropatia ottica di Leber Neuropatia ottica di Leber (LHON)(LHON)

• Patologia prevalentemente ereditaria (mutazioni puntiformi del mtDNA)• Neuropatia ottica ad esordio acuto con perdita progressiva, rapida e bilaterale della vista (cecità completa) tra adolescenza e età adulta (20-24 anni), per degenerazione del nervo ottico.• Vasculopatia retinica associata (microangiopatia e teleangectasia)• Frequenti le disritmie cardiache; assenza di miopatia• Trasmissione tipicamente materna • 80% degli individui affetti sono di sesso maschile.

• Nonostante l’OMOPLASMIA delle mutazioni sia evidenziabile nei PBL dei pazienti, la presentazione clinica è di solito confinata alla retinopatia con penetranza ed espressività delle mutazioni molto variabili ---> multifattorialità?

14% casi sporadici --> ETEROPLASMIA FAMILIARE % mtDNA mutato --> generazione successiva --> OMOPLASMIA

Neuropatia ottica di Leber Neuropatia ottica di Leber (LHON)(LHON)

Neuropatia ottica e cecità in età più precoce Distonia: insorgenza precoce di disordini

generalizzati del movimentoalterazioni della parolaritardo mentalebassa staturadegenerazione dei gangli della base (frequente)

LHON - DISTONIALHON - DISTONIA

Basi molecolari e Fisiopatologia

- 18 mutazioni puntiformi del mtDNA codificante per le proteine del COMPLESSO I (NADH deidrogenasi) (90% dei casi)

- Bassa efficienza di fosforilazione ossidativa (OXPHOS)

- Deficit di ATP per neuroni nervo ottico che giungono a morte

apertura canale mtPTP ---> apoptosi- inoltre ROS

inibizione rilascio di NO --> vasocostrizione e vasculopatia

- Sono state riscontrate anche nuove mutazioni “primarie” sul mtDNA del Complesso IV subunità III: citocromo C ossidasi- e MUTAZIONI SECONDARIE: associate alle mutazioni primarie:

azione sinergistica

Neuropatia ottica di Leber Neuropatia ottica di Leber (LHON)(LHON)

Neuropatia ottica di Leber (LHON)

• 1. MTND4*LHON - G11778A ---> Arg 340 ---> Hys (subunità ND4)• più frequente penetranza variabile e alcuni fenotipi normali• 2. MTND1*LHON - G3460A ---> Ala 52 --> Thr (subunità ND1)• seconda per patogenicità• 3. MTND6*LHON - A14484C ---> Met 64 --> Val • (dominio altamente conservato del gene ND6)• più benigna talvolta recupero della visione • 4. MTND6*LDYT- A14459G ---> Ala 72 --> Val (subunità ND6)• più frequentemente eteroplasmica più patogenetica, associata a distonia

11778

34601448414459

alterazione dellaNADH deidrogenasi

1.Maternally inherited diabetes mellitus and deafnessè una rara forma ereditaria

2. Circa il 6% di oftalmoplegia, ptosi e miopatia mitocondriale sono trasmesse con tratto autosomico dominante (AD-PEO)

I pazienti hanno molteplici riarrangiamenti del mtDNA la cui stabilità è evidentemente compromessa dall’alterazione di uno/più geni nucleari

Riarrangiamenti del mtDNA:FORME ALTERNATIVE

Altre malattie associate ad anomalie del DNA mitocondriale

Malattie neurodegenerative, diabete mellito, cardiomiopatie, sordità, demenza, AlzheimerCAUSE: predisposizione genetica, formazione di radicali liberi,Declino della OXPHOS legato all’etàMutazioni somatiche del mtDNA ---> tessuti postmitotici ad alta richiesta di

ATP (muscolo e cervello)

Es. Delezione 4977 (5 Kb) si accumula nei gangli basali e in varie regioni corticali del cervello dopo i 75

Dannoossidativo

Morbo di ParkinsonI mitocondri di questi pazienti spesso mostrano delle

alterazioni. La più caratterizzata consiste in un difetto di attività

della NADH deidrogenasi (complesso I) nel cervello, muscoli e piastrine.

Questa alterazione porta ad una diminuita produzione di ATP, aumentata “perdita” di elettroni ed aumentata produzione di radicali superossido (aumento dello stress ossidativo)

Altre molecole• Cardiolipina ed Acetil-L-carnitina

• Uno dei componenti mitocondriali implicato nell’invecchiamento dei mitocondri è la cardiolipina, un fosfolipide della membrana interna che fornisce un supporto strutturale alla catena di traporto degli elettroni.

• La carnitina è necessaria per trasportare acidi grassi che servono come combustibile e per la produzione della cardiolipina, all’interno dei mtocondri.

• I livelli di cardiolipina e l’efficienza mitocondriale diminuisconi con l’età, ma vengono ristimolati dalla somministrazione di Acetil-L-carnitina

Altre molecole

• Coenzima Q (ubiquinone)

• è una molecola probabilmente mobile critica per il trasporto di elettroni dal complesso I e II al III.

• La sua deficienza è associata a cardiomiopatia.

Altre molecole• Acido lipoico

• L’Acido lipoico è strettamente associato, come cofattore degli enzimi del ciclo dell’acido citrico che generano NADH, come anche la tiamina difosfato (derivato della vit B1) e FAD (derivato di riboflavina).

• Inoltre l’acido lipoico è un potente antiossidante che agisce come scavenger di radicali liberi, completando l’azione di altri antiossidanti come vit C ed E.

Threshold hypothesisOXPHOS Capacity vs. mtDNA DamageOXPHOS Capacity vs. mtDNA Damage

TumoriMutazioni somatiche del mtDNA identificate in

tumori- delezioni intragenetiche

missense- mutazioni puntiformi nonsense

frameshiftEffetti:

Queste mutazioni potrebbero contribuire alla trasformazione neoplastica modificando le capacità energetiche della cellula, aumentandone lo stress ossidativo mitocondriale e/o modulando l’apoptosi

7.patologia mitocondriale 2011

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