VI. TEZ ARA RAPORU

BAZI ORGANOKLOROİD BİLEŞİKLİ İNSEKTİSİDLERİN SOMATİK HÜCRELER ÜZERİNDEKİ OLASI GENOTOKSİK ETKİLERİNİN KUŞBURNU (Rosa canina L. ) BİTKİSİNE AİT EKSTRELER İLE GİDERİLMESİ

Çalışmamızın amacı

Çözeltilerin Hazırlanması

Somatik Mutasyon ve Rekombinasyon Testi (SMART)

LD 50 Değerleri ve Uygulama Konsantrasyonları

Drosophila kanat benek testinden (SMART) elde edilen bulgular

Mikronükleus testinin uygulaması ve elde edilen değerler

Kardeş kromatit değişimi (KKD) testinin uygulaması ve elde edilen

değerler

Çalışmamızında Profenofos, sipermetrin, fenvalerat ve lufenuron gibi

organokloroid bileşikli insektisitlerin genotoksik etkisinin olup olmadığı araştırılmıştır. Bu amaçla SMART, MN ve KKD testleri kullanılmıştır.

Rosa canina (Kuşburnu) bitkisinin meyvelerine ait su ve etanol ekstrelerinin antigenotoksik etkisi belirlenmeye çalışılmıştır.

İnsektisidler ve Çözeltilerin Hazırlanması İnsektisidler Çözücüler Profenofos %1’lik DMSO

Cypermethrin %1’lik DMSO

Fenvalerate %1’lik DMSO

Lufenuron %2,5’lik aseton

Tetradifon %2,5’lik aseton

Somatik Mutasyon ve Rekombinasyon Testi

Çalışmamızda Çalışmamızda flr3flr3 / TM3, Bds hattının / TM3, Bds hattının dişi dişi bireyleri ile mwh bireyleri ile mwh erkeklererkekler çaprazlanmıştır. çaprazlanmıştır.

flr3flr3 / TM3, Bds / TM3, Bdsmwh / mwhmwh / mwh

XX

Somatik Mutasyon ve Rekombinasyon Testi72 saat sonra çıkan 3. evre transheterozigot larvalar belirlenen konsantrasyonlarda insektisit içeren Drosophila İnstant Medium’a aktarılmıştır.

Somatik Mutasyon ve Rekombinasyon TestiPupadan çıkan ergin bireylerin kanat preparatları ışık mikroskobunda10X40 büyütmede incelenerek mutant klonlar belirlenmiştir.

XX

mwh / mwhmwh / mwh flr3flr3 / TM3, Bds / TM3, Bds

Transheterozigot larvalarda mutasyon

LD 50 Değerleri ve Uygulama Konsantrasyonları

LD50 değeri bir popülasyondaki bireylerin yarısını ölürden

doz olarak kabul edilmektedir.

Çalışmamızın Somatik mutasyon ve rekombinasyon testi uygulamalarında LD50 ve daha düşük konsantrasyonlar

kullanılmıştır.

LD 50 Değerleri ve Uygulama Konsantrasyonları

Profenofos ve R.canina bitkisine ait ekstrelerinin uygulaması sonucu kanat benek testinden elde edilen değerler

Sipermetrin ve R.canina bitkisine ait ekstrelerinin uygulaması sonucu

kanat benek testinden elde edilen değerler

Fenvalerat ve R.canina bitkisine ait ekstrelerinin uygulaması sonucu kanat benek testinden elde edilen değerler

Lufenuron ve R.canina bitkisine ait ekstrelerinin uygulaması sonucu kanat benek testinden elde edilen değerler

Mikronükleus Testi Mikronükleuslar (MN) hücrenin mitoz bölünmesi sırasında

ortaya çıkan, esas çekirdeğe dahil olmayan, tam kromozom veya asentrik kromozom fragmanlarından köken alan oluşumlardır.

MN sayısındaki artış, çeşitli ajanların hücrelerde oluşturduğu sayısal ve yapısal kromozom düzensizliklerinin göstergesi olarak değerlendirilmektedir.

Mikronukleus Testi Kromozom mediumuna heparinize edilmiş

kan eklendi. Hücre kültürü 370C’de 72 saat inkübe edildi. İnsektisitler ve bitki ekstreleri inkübasyonun

başlanmasından 24 saat sonra kültür tüplerine konuldu.

İnkübasyonun başlangıcından 48 saat sonra siklokalasin B eklendi.

Mikronukleus Testi Preparatlar kuruduktan sonra 13 dakika giemsa

boyasında tutulmuş, sürenin sonunda musluk suyunda yıkanarak kurumaya bırakılmıştır.

Boyama işleminden sonra preparatlar entellanla kaplanmış ve üzerlerine lamel kapatılarak incelemeye hazır hale getirilmiştir.

Bu preparatların ışık mikroskobunda 10X40

büyütmede incelenmesine devam edilmektedir.

Mikronukleus Testi

İnkübasyonun bitiminden sonra çıkarılan kültür tüpleri 10 dakika 1000 rpm’de santrifüj edilmiş ve süpernatantlar

atılmıştır.

Daha önceden hazırlanmış hipotonik çözelti kültür tüplerine katılarak 370C’de 5 dk. bekletilmiştir.

Kültür, asetik asit /metanol (1/3) karışımından oluşan tespit solüsyonundan üç kez geçirilmiştir.

Profenofos ve R.canina bitkisine ait ekstrelerinin uygulaması sonucu oluşan MN ve NBİ değerleri

Sipermetrin ve R.canina bitkisine ait ekstrelerinin uygulaması sonucu oluşan MN ve NBİ değerleri

Sipermetrin uygulama gruplarında gözlenen mikronükleusa sahip binükleuslu hücre

Fenvalerat ve R.canina bitkisine ait ekstrelerinin uygulaması sonucu oluşan MN ve NBİ değerleri

Fenvalerat uygulama gruplarında gözlenen mikronükleusa sahip binükleuslu hücre

Lufenuron ve R.canina bitkisine ait ekstrelerinin uygulaması sonucu oluşan MN ve NBİ değerleri

Lufenuron uygulama gruplarında gözlenen mikronükleusa sahip binükleuslu hücre

Kardeş Kromatit Değişim (KKD) Testi KKD testi, 1957 yılında Taylor ve arkadaşları tarafından

geliştirilen ve en fazla kabul gören kısa süreli mutajenite testlerinden birisidir.

Timin baz analoğu 5-bromodeoksiüridin (brdU) kullanılmasıyla bir kromozomun kardeş olan kromatitleri

arasında parça değişiminin gözlenmesi esasına dayanır.

KKD Testi Heparinize edilmiş periferik kan, içerisinde

BrdU bulunan kromozom B mediumuna ilave edilmiş,

Hücre kültürü 370C’de 72 saat inkübasyona bırakılmıştır.

KKD Testi İnkübasyonun 24. saatinde insektisit, 70. saatte ise kolsişin çözeltisi ilave edilmiştir

KKD TestiKültür tüpleri Hipotonik çözeltiden Asetik asit/metanol (1:3) solüsyonundangeçirilmiş Her işlemden sonra 1000 rpm’de 10 dk.

santrifüj edilmiş ve süpernatantlar atılmıştır.

KKD Testi Santrifüj işleminden sonra dipte kalan çözelti lamın üzerine

yayılmış ve kurumaya bırakılmıştır. Üç gün sonra preparatlar 15 dk fosfat tamponu (PBS

solusyonu) içinde bekletilmiştir. Daha sonra aynı şaleye Hoechst 33258 fluoresan boyası

eklenmiş ve 20 dk. preparatların boyanması sağlanmıştır.

KKD Testi Preparatlar, içerisinde Mc II Vaine tamponu bulunan tepsiye dizilerek 60 dk UV ışınına (366nm) maruz bırakılmış, 2xSSC (saline-sodium citrate) çözeltisi bulunan şalelere dizilmiş ve 65ºC’ye ayarlanmış su banyosunda 60 dk

bekletilmiştir.

KKD Testi Giemsa boyasında 13 dk bekletilmiş

Preparatlar ışık mikroskobunda immersiyon objektifi ile 1000 büyütmede incelenmiştir.

Profenofos uygulaması sonucu oluşan kardeş kromatit değişimi ve replikasyon indeksi değerleri

Sipermetrin uygulaması sonucu oluşan kardeş kromatit değişimi ve replikasyon indeksi değerleri

Fenvalerat uygulaması sonucu oluşan kardeş kromatit değişimi ve replikasyon indeksi değerleri

Lufenuron uygulaması sonucu oluşan kardeş kromatit değişimi ve replikasyon indeksi değerleri

Profenofos insektisitinin uygulaması sonucu gözlenen M1 hücresi

Profenofos insektisitinin uygulaması sonucu gözlenen M2 hücresi

Profenofos insektisitinin uygulaması sonucu gözlenen M3 hücresi