猪精液冷冻保存技术猪精液冷冻保存技术

吉林省农业科学院吉林省农业科学院李兆华李兆华

内 容

猪精液冷冻保存的意义猪精液冷冻技术研究概况猪精液冷冻技术操作流程影响猪精液冷冻效果的因素如何提高冷冻保存后猪精子的繁殖力

1 、延长公猪使用年限；2、获得更大的遗传进展；2、取代活体公猪的引进；3、生物安全的保证。

猪精液冷冻保存的意义

从意大利人 Spallanzani 最早开始研究哺乳动物精液冷冻开始至己有 200 多年的历史 。 猪的精液冷冻研究是从 1949 年英国人 Polge 等发现甘油 (丙三醇 )对牛精子具有抗冻保护作用后开始的。 1956 年，他首次报道了应这个原理进行猪精液的冷冻操作，并进行人工授精。 1957 年 Hess 等将猪冻精经子宫颈输入，并产下仔猪。 1975 年， Pursel 等发明了简便的猪精液冷冻和解冻方法，从此打开猪冷冻精液的商品化之路。（用颗粒状冷冻精液给 23头青年母猪输精 , 48h 后剖检 11头 ,有 5头受孕 ; 25-30d 后剖检另外 12头 ,有 10 头

怀孕）

猪精液冷冻技术研究概况

猪精液冷冻技术研究概况我国从 70年代初期开始对猪精液冷冻技术进行探索。1975 年西安市草滩农场试配了 8头母猪 。1977 年成立了全国猪冻精协作组。 1986 年冷冻精液累计配种母猪 6万余头，近几年：甘肃农业大学 张兆旺教授南京农业大学 芮荣教授西北农林科技大学 李青旺教授四川农业大学 马恒东教授东北农业大学 刘娣教授上海农科院 张德福研究员

猪精液冷冻技术操作流程精液采集

质量检测

第一次稀释

降温、平衡（15℃， 5℃ ）

第二次稀释

平衡

冷冻

保存

猪精液冷冻技术操作流程颗粒法冻精的冷冻程序1) 新鲜精液在常温、等温条件下，用不含甘油的 I液稀释，然后平衡 0.5～ 2h;2)缓慢降温至 15℃维持 4h ，再从 15℃经 1h 降至 5℃;3) 用等温的含甘油的 II液进行稀释。4)稀释后用液氮熏蒸法制作冻精颗粒。 利用广口液氮罐，以聚四氟乙烯板作为冷冻面，冷冻面与液氮面距离为 1～ 2cm，待冷冻面充分预冷后，用预冷的滴冻管在氟板上连续等量滴冻。其始冻温度为 -110～ -125℃，滴冻时间控制在 60s内完成，加盖熏蒸平衡 3～ 4 分钟后，浸入液氮中保存。

细管法和塑料袋法的冷冻程序1) 新鲜精液在室温下，用稀释液将精液按比例等温稀释，然后平衡 0.5～ 2h 。2) 将精液移入 15℃条件下降温平衡 3h。3) 在 15℃条件下离心 (800g ， 10min), 加入无甘油的 I液，缓慢降到 5℃，平衡 2h ，加入含甘油的 II液，然后分装。4)程序冷冻仪冷冻： 初始温度为 5℃，以 3℃／ min 从 5℃降到 -5℃，再于 -5℃条件下保持 1min结晶，然后以 50℃／ min 从 -5℃降到 -140℃，然后投入液氮保存。5) 液氮熏蒸冷冻： 在广口液氮罐内，与液氮面距离 5cm 处，熏蒸 20分钟，然后投入液氮保存。

影响猪精液冷冻效果的因素个体的影响 个体对精液冻后效果影响极大。应用限制性片断长度多态 (AFLP)分析控制精子冷冻能力的基因，没有发现差异。差异的机制仍需要继续研究

冻前处理的影响 冷休克：可能原因是质膜中特别的组成成分所致。 猪精子膜磷脂酰胆碱的含量较牛低，而磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂的含量高 胆固醇 / 磷脂的比例低，且胆固醇的分布不对称，外膜的分布量大于内膜 离心： 800g ， 10min

影响猪精液冷冻效果的因素

冷冻保存承载工具的影响 承载工具：颗粒、 0.25mL、 0.5mL 小型细管和扁平细管； 5mL 的大型细管 5mL 塑料袋。如 FP(Flat-Pack， 300mm×22mm×0.2mm) 和 MFP(a multiple Flat-Pack) 。

冷冻解冻程序的影响 冷冻速率： 30～ 50℃/min 。解冻速率： 1200～ 1800℃/min 冷冻 0.25mL 微型细管： 50℃/min 、 1.5％甘油浓度； 0.5mL 小型细管： 30℃/min 、 3％甘油浓度； 5mL大型细管： 16℃/min 、 3.3％甘油浓度。 解冻 0.25mL、 0.5mL 细管： 50℃， 12s或 37℃， 20s ； 5mL 细管： 50℃， 40s 5mL 塑料袋： 50℃， 13s

影响猪精液冷冻效果的因素稀释液的组成 大体上，包括糖，蛋白质，脂类，缓冲剂，冷冻保护剂和一些添加物质。

渗透压的影响 最佳渗透压： 420～ 580mOsm/Kg为最佳渗透压

糖的影响 双糖（半乳糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、蔗糖等） 顶体完整率； 单糖（尤其是果糖和木糖） 精子冻后活率。 配合使用效果比单一使用好

影响猪精液冷冻效果的因素冷冻保护剂的影响 常用：甘油、二甲基亚砜 (DMSO) 、丙二醇 (PROH) 、乙二醇 (EG) 、木糖醇、乙酰胺、阿东糖醇等。 作用过程： （ 1）冲淡溶液中溶质盐浓度，细胞摄入盐量减少，由抗冻剂代替； （ 2）抗冻剂进入细胞，改变了胞内过冷状态，使胞内压接近胞外压，降低了细胞脱水皱缩程度和速度； （ 3）抗冻剂进入细胞，缓解了精子在解冻时的渗透性肿胀引起的损伤。 效果：甘油保护效果最好，但有毒。 方向：联合使用，最终除去甘油

影响猪精液冷冻效果的因素添加物的影响 缓冲：磷酸二氢钾、柠檬酸钠、 Tris 等； 抗菌：青霉素、链霉素等； 洗涤剂： OEP （氨基 -钠十二烷基硫酸酯）、 SDS （十二烷基硫酸钠）等； 抗氧化：维生素 E、 GSH （谷胱甘肽）等 激素类： PGF2a 其他：透明质酸、 N-乙酰基 -D-氨基葡糖等

影响猪精液冷冻效果的因素抗氧化剂在猪精液冷冻保存上的应用研究

抗氧剂种类 效果

维生素 E 200μmol水溶性 VE提高解冻后精子的活力和线粒体的活性； 200-1000μmol α-VE 能提高解冻后精子的活力， 200μmol能保护精子脂质的氧化

谷胱甘肽（ GSH ） 获能状精子减少，体外受精率提高

二丁基羟基甲苯 （ BHT）

添加 0.2 、 0.4 、 0.8mmolBHT，解冻后精子存活率提高，脂质氧化降低，体外受精的胚胎发育率得到提高（ 16 ： 29 ，囊胚发育率）

过氧化氢酶（ Catalase ）

单独或与 SOD 联合使用能提高解冻后精子存活率。与丙酮酸，巯基乙醇一起添加，显著提高解冻后精子的活力，但是对精子的形态和存活时间无影响。

超氧化物歧化酶（ SOD ）

单独或与过氧化氢酶联合使用，提高解冻后精子存活率。

如何提高冷冻保存后猪精子的繁殖力

选择优良的个体

稀释液中要添加抗氧化的物质 BHT,GSH,SOD,过氧化氢酶， VE等。

输精时间要尽可能和排卵时间吻合

提高输精精子剂量

谢谢大家谢谢大家