5.10 - 5.50 presentación j rivadeneira

ULTIMOS AVANCES EN LA BIOLIXIVIACIÓN DE

CONCENTRADOS CALCOPIRITICOS

Dr. JUAN RIVADENEIRA H.

LIAP-UAI

[email protected]

Muchas Gracias

Introducción

• Mercado del cobre de acuerdo a su vía de procesamiento.

– Minerales: Óxidos v/s Sulfuros.

– Sulfuros: Molienda- Concentrados- Ánodos-ER- Cátodos.

– Óxidos: Chancado- Lixiviación - SX-EW - Cátodos.

• Bajos costos en procesos de biolixiviación de sulfuros.

– Regeneración de insumos H2SO4

– Plantas de SX-EW amortizadas.

– Baja intensidad de energía.

• Foco actual de lixiviación en bajas leyes.

– Procesos masivos, Botaderos, ROM.

• Ambientalmente amigable v/s Fundiciones.

– No genera gases sulfurosos

• Nuevos minerales

– Refractarios o con As

Introducción

Proceso productivo según el mineral

Cobre Sulfurado

Molienda

Flotación

Fundición

Electro refinación

Cobre oxidado

Lixiviación

Extracción por solventes

Electro obtención

Exploración geológica

Extracción, Carguío y Transporte

Chancado

Introducción

Capacidad de Fusión de Concentrados y Refinación de Cobre en Chile

Fuente: Cochilco, 2009

Introducción

0

1.000

2.000

3.000

4.000

5.000

6.000

7.000

2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020

KT

on

Cu

Fin

o

Producción de Cu en Chile

Capacidad de fundición

Capacidad de Refinación

Cobre en concentrados

total Catodos SxEw

• Mina Subterranea y a rajo

abierto

• Buena ubicación Geográfica

de las faenas

• Tecnología de punta en planta

• Investigación y Desarrollo

• Gobierno y nueva

norma de fundiciones:

Codelco y Enami son

las que deberán realizar

la mayor inversiónConstanza Pérez-Cueto

Introducción

• "Estimamos que son más de US$1.350 millones (de inversión). Las

principales inversiones van a estar en las fundiciones públicas" dijo

a La Tercera, Marcelo Fernández, jefe de la oficina de Asuntos

Atmosféricos del Ministerio de Medio Ambiente.

04/07/2012

Terminología

• Biolixiviación: disolución de minerales de su fuente mineral

por acción microbiana.

• Bio-oxidación: es la oxidación mediante microorganismos

del mineral huésped que contiene el componente metálico

de interés. Tratamiento de minerales refractarios de oro.

• Bio-mineria: movilización de elementos de una materia

sólida mediada por bacterias y hongos.

• Bio-hidrometalurgia: campo interdisciplinario en donde se

da una cruza entre aspectos microbiológicos y en especial

geo-microbiológicos y biotecnológicos con mineralogía,

geología, metalurgia, ingeniería química y ingeniería en

minas.

Directo:

Obteniendo electrones directamente de la

reducción del mineral.

Adhesión celular al sustrato mineral.

Indirecto:

ion férrico como transportador de electrones

No requiere contacto de la célula al sustrato.

Modelos de Mecanismos de Lixiviación

•Contacto celular con el sustrato mineral.

•Excreción celular de exopolímeros.

•Acomplejamiento de iones férricos a residuos de ácido glucurónico presentes en el exopolímero.

•Mecanismo de ataque primario.

•Formación de tiosulfato como intermediario de la oxidación del sulfuro.

•Formación de gránulos de sulfuro o gránulos de politionatoen el espacio peri plasmático o en la pared celular.

Modelos de Mecanismos de Lixiviación

Mecanismo del tiosulfato (FeS2, MoS2, WS2).

FeS2 + 6Fe 3+ + H2O S2O32- + 7Fe 2+ + 6H+

S2O32- + 8Fe 3+ + 5H2O 2SO4

2- + 8Fe 2+ + 10H+

2Fe 3+ + 2S2O32- 2FeS2O 3+ 2Fe 2+ + S4O6

2-

Mecanismo de poli sulfuros (ZnS, CuFeS2, FeAsS, etc.)

MS + Fe 3+ + H+ M 2+ + 0.5 H2Sn + Fe 2+

0.5 H2Sn + Fe 3+ 0.125 S80 + Fe 2+ + H+

0.125 S80 + 1.5 O2 + H2O SO4

2- + 2H+

Precipitación del hierro férrico

4 Fe 3+ + 12 H2O 4 Fe(OH)3 + 12 H+

Mecanismos de Lixiviación

426243234242 SOH6OHSOKFe2OH12SOFe3SOK A)

B)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

TE

MP

ER

AT

UR

A, °

C

pH

Fe3+

Fe2O3

FeO(OH)

Fe(OH)3

Formación de Jarosita potásica. A) formula de la reacción química conducente a la formación de jarositas potásicas. B)

diagrama de temperaturas y pH de estabilidad de compuestos de ión férrico, se muestran los parámetros de formación y

estabilidad de las especies que conforman jarositas y hidróxidos de Hierro ( Geothita y Hematita), en rojo se muestra el

área en que es posible encontrar el ión férrico en solución y las estrellas muestran las condiciones operacionales utilizadas

en las experiencias de biolixiviación llevadas a cavo en esta tesis con microorganismos mesófilas, termófilos Moderados y

termófilos extremos ( 39º, 50º y 70ª C Respectivamente) y en condiciones de iso pH 1,5. Adaptado de G. von Weert and

R.J.M. van Lier, Aqueous Pressure Oxidation of Silver – Bearing Cyamide Refractory Concentrates in Acidic Sulfate and

Sulfate – Iodide Media, TMS – EPD Congress JOM 1994, pp 12.

REACCIONES DE OXIDACIÓN DE MINERALES CUPROSOS

H.R.Watling (2006) “The bioleaching of sulphide minerals with emphasis on copper sulphides” hydrometallurgy 84: 81-108

TRFLP

• Mina Subterranea y a rajo

abierto

• Buena ubicación Geográfica

de las faenas

• Tecnología de punta en planta

• Investigación y Desarrollo

Microorganismos descritos en procesos de Biolixiviación

de calcopirita

H. Huber, K.O.Stetter. (1998) “ Hyperthermophiles and their possible potential in biotechnology” Journal of Biotechnology 64: 39-52.

pH 1,5

Aerobiosis

CuFeS2

Fe2(SO4)3

Fe SO4

H2O

O2

pH 7

NAD(P)H

NAD(P)H+

H+

H+

ADP + PiATP

Fe2(SO4)3

FeSO4+ CuSO4 + S°

H2SO4H2SO4SO4=

K F

e3(S

O4) 2

(OH

) 6

Acidithiobacillus ferrooxidans

O2

O2

O2

O2

O2

O2

O2

Modelo propuesto de ataque indirecto por Fe3+

con oxidación de Fe2+

bacterial y O2 como aceptor de electrones en

Acidithiobacillus ferrooxidans.

Se muestra capa de precipitados de jarosita y precipitados de RISCs que se forma tanto sobre la bacteria como sobre la

partícula a biolixiviar. Se incluye ataque de iòn fèrrico sobre la partícula de calcopirita y la generación de un azufre elemental

como subproducto de la reacción. Modelo propuesto para ataque Indirecto en condiciones Mesofílicas.

pH 1,5

Aerobiosis

S°

S°

S°

S°

S°

CuFeS2

K F

e3(S

O4) 2

(OH

) 6


O2

O2

O2

O2

O2

O2

O2

Modelo propuesto de ataque directo con oxidación de RISCs y O2 como aceptor de electrones en Acidithiobacillus

ferrooxidans. Se muestra capa de precipitados de jarosita y precipitados de RISCs que se forma tanto sobre la bacteria como sobre la partícula a

biolixiviar. Se incluye ataque de la bacteria sobre los precipitados de RISCs en la superficie de la partícula de calcopirita, los compuestos

RISCs al ser extremadamente insolubles en medio acuoso requieren que la bacteria ataque de forma directa la superficie del mineral ( línea

punteada negra). Modelo propuesto para explicar el ataque Directo en condiciones Mesofílicas, Termofílicas moderadas y Termofílicas

extremas, utilizando oxigeno como aceptor final de los electrones.

pH 1,5

Anaerobiosis

S°

S°

S°

CuFeS2

S°

Cu

FeS

2K Fe3(SO4)2(OH)6


Modelo propuesto de ataque directo con oxidación de RISCs y Fe3+

como aceptor de electrones en Acidithiobacillus

ferrooxidans. Se muestra capa de precipitados de jarosita y precipitados de RISCs que se forma tanto sobre la bacteria como sobre la partícula a

biolixiviar. Se incluye ataque de la bacteria sobre los precipitados de RISCs en la superficie de la partícula de calcopirita, los compuestos

RISCs al ser extremadamente insolubles en medio acuoso requieren que la bacteria ataque de forma directa la superficie del mineral ( línea

punteada negra). A la vez al utilizar Fe3+

como aceptor final de los electrones la bacteria genera espacios en su pared celular capaces de unir

precipitados de Fe3+

permitiendo mejorar las capacidades de unirse al sustrato a biolixiviar. Modelo propuesto para explicar el ataque Directo

en condiciones Mesofílicas, Termofílicas moderadas y Termofílicas Extremas con férrico como aceptor final de los electrones.

•Sistema de Biolixiviación de Concentrados en Pilas

•Aireación e irrigación controlada para conservar el calor y así maximizar la

biolixiviación.

•Especies Biológicas atacan los sulfuros y liberan los metales básicos a la

solución.

•El concentrado es recubierto sobre un sustrato de tamaño controlado

(Roca estéril o mineral de baja ley) y apilado.

•La pila se irriga con solución ácida con nutrientes que se recicla.

•Se emplea aire a baja presión para suplir oxigeno- soplado desde la base

de la Pila.

•SX-EW.

•Fierro y Arsénico se remueven vía precipitación.

•Los metales preciosos pueden recuperarse si están presentes.

PROCESO GEOCOAT ®

clonamientoGEOCOAT®

• Cubierta de concentrado (0.5 –

1.0mm) sobre ripio de soporte

• Ripio de soporte +4mm – 25 mm

• Espacios libres permiten alta

permeabilidad

Flujo de Aire

Flujo de Solucion

clonamientoBalance térmico

GEOCOAT®

La acumulación de calor en la pila es determinada por el balance entre la tasa de lixiviación , la tasa de

riego y la tasa de aireación combinada con las condiciones de borde.

Conducción

RadiaciónConvección Evaporación

Aireación

Soluciónes

Condición de borde

Condición de Borde

Transporte de solución y

aire al interior de la pila

La energía es generada por

las reacciones de lixiviación

Irrigación

Aireación y Evaporación

Las reacciones

generan calor en

la pila

Temperatura C°

Evaporación

condensación

Accumulación de Temperatura

Perdida de calor y calor en soluciones de riego

Temperatura ideal

Aireación

Riego

Sobre irrigación enfríaSobre aireación enfría

Balance térmico GEOCOAT®

Pro

fun

did

ad

m

20 70

0

8

Inóculos microbiológicos

• Obtenidos a partir de Bancos de microorganismos pre adaptados a los concentrados de Pucobre y entregados por el Dr Greg Olsen, Little Bear laboratories, Inc ( Geosynfuels, Golden, CO).

• Campañas de bioprospección realizadas en el norte de Chile. Lugares impactados por la industria minera y seleccionados de acuerdo a su capacidad de biolixiviar concentrados calcopirítico en pruebas de matraces.

• drenajes ácidos de minas.• soluciones ricas de percolación.• tranques de relaves (Chañaral). • rio salado y caleta palitos.• fuentes termales del norte de Chile en particular las

termas de rio Negro y El Tatio.

clonamiento

Zona alta

ZA

Zona

media ZM

Zona baja

ZB

Bio prospección de Inóculos

Concentrado de Calcopirita

Biolixiviación en matraz (1L)

Biolixiviación en tanque agitado (35L)

Biolixiviación en Columnas ( Cuarzo y Ripios , 2 y 6 m de altura)

Prelixiviación ácido/férrica en tanque (50L)

Generación de inóculo para

Generación de inóculo para

Análisis químicos,

granulométricos y

Mineralógicos

Análisis químicos,

granulométricos

Análisis de biodiversidad

y químicos

Análisis de

biodiversidad

y químicos

Análisis de

biodiversidad

y químicosAnálisis comparativos de

diversidad y abundancia

relativa por RFLP, T-RFLP

caracterización de

especies dominantes por

clonamiento y

secuenciación

Análisis químicos

comparativos

Composición mineralógica global ESPECIES % PESO %S %Cu %Fe %Zn %As

CALCOPIRITA 52,68 18,44 18,23 16,02

COVELINA 0,11 0,04 0,08

ENARGITA 0,05 0,02 0,03 0,01

PIRITA 27,73 14,81 12,92

ESFALERITA 0,05 0,02 0,03

MAGNETITA 2,78 2,01

HEMATITA 1,36 0,95

LIMONITA 0,05 0,03

RUTILO 0,05

GANGA 15,12 (*)

TOTAL 100,00 33,32 18,33 31,93 0,03 0,01

Composición mineralógica 100% base minerales sulfurados de cobre ESPECIES % PESO %S %CU %Fe

CALCOPIRITA 99,68 22,87 34,49 30,30

COVELINA 0,22 0,05 0,14

ENARGITA 0,10 0,02 0,05 0,01

TOTAL 100,00 22,94 34,68 30,31

Asociaciones mineralógicas de sulfurados de cobre (por especies)

ESPECIES Libre Asoc. Gn. Asoc. Py

Incluí. Gn.

Inc. Py/Gn TOTAL

CALCOPIRITA 93,09 2,19 3,84 0,77 0,11 100,00

COVELINA 50,00 50,00 100,00

ENARGITA 100,00 100,00

Asociaciones mineralógicas de sulfurados de cobre (% Cu)

ESPECIES Libre Asoc. Gn. Asoc. Py

Incluí. Gn.

Inc. Py/Gn TOTAL

CALCOPIRITA 32,11 0,76 1,32 0,27 0,04 34,49

COVELINA 0,07 0,07 0,14

ENARGITA 0,05 0,05

TOTAL 32,23 0,83 1,32 0,27 0,04 34,68

Grado de liberación de cobre Libre Asociado Ocluido TOTAL

92,91 6,20 0,89 100,00

Análisis mineralógicos concentrado calcopirítico.

TRFLP

LEY

Muestra S

%

Cu

%

Fe

%

As

%

Ag

g/T

Au

g/T

Cl-

%

CaCO3

%

Si

%

Concentrado Rougher 29.93 17.75 26.04 0.02 29.40 3.95 0.08 2.88 3.29

Muestras Pre

Lixiviado

Leyes

S CuT FeT Cl- As Ag Au CaCO3 Si

% % % % % g/T g/T % %

Termófilos (Ripios) 29.66 17.75 25.48 0.081 0.016 34.9 4.09 2.96 3.21

Moderados (Ripios) 29.93 17.05 26.04 0.081 0.019 29.4 3.95 2.88 3.29

Mesófilas (Ripios) 30.1 16.95 25.46 0.081 0.019 31.5 3.74 2.84 2.96

Termófilos(Cuartiza) 29.61 16.95 25.82 0.088 0.018 28.4 3.24 2.87 3.06

Moderados (Cuartiza) 30.04 17.15 26.24 0.075 0.019 28.6 4.24 2.88 2.78

Mesófilas (Cuartiza) 30.1 17.25 26.36 0.075 0.020 30.1 4.08 2.94 2.83

B) pre-lixiviados mediante agitación ácida Férrica (10grL/Fe3+

)

A) Recibido

Caracterización química de los concentrados

calcopiríticos

Vista panorámica del deposito de ripios de biolixiviación dispuesto en Planta Biocobre.

En la actualidad Planta Biocobre dispone de más de 7 Millones de Toneladas de Ripios de biolixiviación en 5 niveles o

bancos superpuestos de 10 mts de altura cada uno. Muestras de estos ripios fueron lavadas y seleccionadas

granulométricamente ( 3 a 12 mm) para ser usadas como matriz soporte en pruebas de biolixiviación en columnas de

concentrados de flotación de mineral de calcopirita.

1

2

3

4

5

clonamiento

Muestra

Roca Soporte

Leyes

S CuT FeT Cl- As Ag Au CaCO3 SiO2

% % % % % g/T g/T % %

Ripios 3.34 0.41 11.39 0.102 0.007 3.3 0.14 1.76 25.01

Cuarzo 0.03 0.00 0.00 0.012 0.002 0.0 0.0 0.27 99.58

Análisis químicos de la fracción utilizada de ripios de

lixiviación (Biocobre) y de las muestras de Cuarzo utilizados

como roca soporte.

Determinación mediante técnica de Digestión ácida y determinación de minerales mediante

espectrometría de Absorción Atómica (AAS)

(a)

(c)

(b)

(d)

Imágenes de muestras de los minerales utilizados en pruebas de biolixiviación.

Como roca soporte (a,b) y del concentrado calcopirítico (c), utilizado en las pruebas de biolixiviación en columnas.

Imágenes del mineral de Ripio lavado del desecho lixiviación de Planta Biocobre (a), de mineral de cuarzo lavado (b), del

concentrado calcopirítico recibido (c). Vista superior del concentrado ya aglomerado sobre roca soporte (d), y cargado en

la columna de biolixiviación.

termocupla

controlador

Aire

CO2

2%

Agitación

300 rpm3 L /min

Pulpa:

•5 % sólidos

•pH < 1,5

•Volumen total 50 L

•Volumen operación 35L

Bafles polipropileno

cinta calefactora

aislante térmico

Reactor

polipropileno

Hélice

Acero inoxidable

burbujeador

Concentrado Aglomerado

12 L /hr/m2

Análisis

pH, Eh, Cu T, Fe T, ácidoSolución percolación

Aire

CO2

2%

Solución riego

Concentrado

calcopirítico

Roca

Soporte

Bomba

peristáltica

bolitas de

polipropileno

bolitas de

polipropileno

Análisis Gas

Consumo O2

Cinta calefactor

Termocupla

Controlador

2 L / min.

Ajuste pH =1,5

Columna polipropileno

1mm

Aislante

clonamiento

La inoculación de las experiencias se realizo en dos etapas:

1.- Inoculación primaria, en la etapa de aglomeración en la pulpa de los

concentrados agregada sobre las distintas matrices de roca soporte a una

densidad de siembra de 1,5 X107 células por gramo de concentrado.

2.- En las soluciones de riego de las columnas a una densidad de inoculación de

1,5 X108 Células por ml de solución. En ambos casos la densidad celular fue

determinada mediante conteo de microorganismos por microscopia de luz en

una cámara de Petroff Houser.

Inoculación de las experiencias

Protocolo de Inoculación:

• 1. Pruebas de lixiviación Batch: Reactor de tanque agitado

• 2. Pruebas en columnas

• 3. Análisis moleculares

Resultados

A)

B)

C)

D)

Resultados de las pruebas de biolixiviación por Agitación a 38º, 49º y 69ºC. (valores promedio de

pruebas en duplicado).

A) % de disolución de Cu en la pulpa; B) Concentración de Fe (gr./l) en la pulpa, C) Variación en el pH en la pulpa, D) Variación del

Potencial Electroquímico (Eh respecto al electrodo de platino) en la pulpa. Condiciones operacionales, de 5% sólidos de

concentrado calcopiritico 17,5 % Cu, 35 lts totales de operación, agitación (300rpm) y efectuadas a temperaturas Mesofílicas,

Termofílicas Moderadas y Termofílicas Extremas ( 38°, 49° y 69° C, respectivamente).

Oxidación de Cu sulfurado (%), a partir de análisis de sólidos en columnas de biolixiviación.

Datos obtenidos a partir de muestras sólidas a 38, 64, 84 y 96 días de operación mediante digestión ácida de minerales

muestreados de pruebas realizadas a temperaturas de operación de microorganismos Termófilos, Moderados y Mesófilos (70°, 50°

y 38° C respectivamente) de concentrado calcopirítico de flotación aglomerado sobre matriz soporte de ripios de lixiviación lavados o

bien sobre mineral de cuarzo lavado.

A)

B)

Concentración de Cu (A) y Fe (B) (gr./l) disuelto en las soluciones de biolixiviación recirculadas por cada columna, medio

mediante AAS.

Concentraciones obtenidas mediante AAS de soluciones de percolación obtenidas de pruebas de biolixiviación de concentrado

calcopirítico aglomerado sobre matriz soporte de ripios lavados de lixiviación o sobre mineral lavado de cuarzo. Experiencias

realizadas a temperaturas de operación características de microorganismos Termófilos, Moderados y Mesófilas (70°, 50° o 38°C

respectivamente).

B)

A) C)

D)

Parámetros Cinéticos de las solubilización de cobre y fierro en experiencias en columnas, en relación a la variación de pH y de Potencial

electroquímico Eh del medio lixiviante.

A) % de disolución de Cu; B) % de disolución de Fierro; C) Variación del pH y D) Variación de Potencial Electroquímico Eh en la solución de

biolixiviación de cada columna. Datos generados partir del análisis de las soluciones de biolixiviación de cada una de las columnas mediante AAS ( A

y B) y mediante medición con electrodo de pH Ag/AgCl (para C) y electrodo de Platino ( para D). Muestras tomadas y o medidas de cada una de las

soluciones percoladas provenientes de las columnas cargadas con concentrados calcopiríticos aglomerados en torno a una partícula soporte de

Ripios o de cuarzo y biolixiviadas a temperaturas propias de microorganismos Mesófilos, Termófilos Moderados y Termófilos Extremos

A)

B)

C)

D)

Resultados de proyecciones de la cinéticas industriales de procesamiento de mineral a partir de los datos de consumos y de disolución

de Cu por columna.

A) consumo de ácido Total por columna; B) Proyección del consumo Neto de ácido; C) Tasa (en % diario) de solubilización de cobre por columna.

D) Proyección tasa diaria de consumo de ácido por tonelada de concentrado al día. Proyección de consumos Netos en plantas de SX-EW a tres

distintas temperaturas de operación del proceso de biolixiviación (Termo, Mod y Meso equivalentes a 70°, 50° y 38°C respectivamente),

concentrados aglomerados sobre matriz de ripios de lixiviación lavados o sobre mineral lavado de cuarzo. Calculado a partir de valores de consumo

total de ácido en pruebas de biolixiviación menos los equivalentes ácidos derivados del crédito estimado de ácido generado en la etapa de electro

depositación del cátodo de cobre. (1,54 kg H2SO4 por kg de cátodo electro depositado).

LIAP

Laboratorio de Investigación Aplicada

1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8

Consorcio de Cultivos Mesófilos (25-45ºC)

- 5 gr. Calcopirita- 5 gr. Rougher

- 1 gr. Azufre

- 400 ml Medio Basal + 25g/L sulfato ferroso

33ºC

Cultivo precipitado durante 30 min. Cultivo homogenizado

4 semanas

de cultivo

Se toma solo el sobrenadante Se toma del Homogenizado

50 ml

por tubo

50 ml

por tubo

4000 rpm 90 min 4000 rpm 90 min

El pellet fue lavado

con agua ácida ( X3)

El pellet fue lavado

con agua ácida ( X3)

El pellet fue lavado con

PBS-Tween 20 ( X3)El pellet fue lavado con

PBS-Tween 20 ( X3)

Centrifugar en Speed Vac para

secar el pellet, 40 minCentrifugar 13.000 rpm 3 min

0.5 gr para Kit MoBioPellet para

Kit Wizard

OBTENCIÓN DNA GENÓMICO

Pellet para

Kit MoBio

Extracción de DNA metagenómico

1000 pb

1500 pb

Marc

ador

Mesófilo

s (

MoB

io)

Term

ófilo

s M

odera

dos (

MoB

io)

Term

ófilo

s E

xtr

em

os (

MoB

io)

Term

ófilo

s E

xtr

em

os (

Wiz

ard

)

Term

ófilo

s E

xtr

em

os (

Baño)

Acid

ithio

bacill

us f

err

ooxid

ans

Marc

ador

500 pb

Una vez estandarizada las

condiciones de PCR se procedió a

amplificar el gen 16S rDNA para los

distintos consorcios bacterianos

mesófilos, termófilos moderado y

termófilos extremo.

Electroforesis en gel de agarosa 1%.

1 2 3 4 5 6 7

1000 pb

1500 pb

Marc

ador

(100 p

b)

Mesófilo

s (

MoB

io)

Term

ófilo

s M

odera

dos (

MoB

io)

Term

ófilo

s E

xtr

em

os (

MoB

io)

Term

ófilo

s E

xtr

em

os (

Baño)

Term

ófilo

s E

xtr

em

os (

Wiz

ard

)

Acid

ithio

bacill

us f

err

ooxid

ans (

MoB

io)

Reacción en cadena de la polimerasa

PCR

500 pb

Acidithiobacillus ferrooxidans aportado por C. Jerez

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

M M M MTM TM TM TMHae III MspI AluI HhaI Leader (bp)

50 100

Visualización de los patrones de RFLP de productos de PCR del 16s

rDNA de mesófilos (M) y termófilos moderados (TM) extraídos de

pruebas de tanque agitado y digeridos con cuatro enzimas distintas

Gel de acrilamida teñido con plata. Líneas (1) leader 50bp, 2) HaeIII mesófilo, 3) HaeIII t. moderado, 4) MspI mesófilo,

5) MspI t. moderado, 6) AluI mesófilo, 7) AluI t. moderado, 8) HhaI mesófilo, 9) HhaI t. moderado, 10) leader 50bp, 11)

leader 100bp. En círculos rojos se muestran las bandas que parecieran ser compartidas entre los distintos

tratamientos (mesófilas y termófilos moderados).

Estudio de las comunidades biolixiviantes

Clonamiento y secuenciación.

Muestra de algunos de los patrones de RFLP

digeridos con HaeIII de muestras de los 16S rDNA

clonadas.

Los patrones de RFLP obtenidos fueron utilizados para determinar el factor de cobertura de la biblioteca de

clones creada. Patrón leader de 50 pb en primera y última banda , imágenes muestran el número de placa de petri

chequeada y número del clon de la respectiva placa , se incorpora letra que adjudica el patrón de corte a un ribotipo

específico de acuerdo a la placa chequeada.

TABLA VI:

Caracterización de las secuencias de 16S rRNA clonales de acuerdo a su similitud

con las secuencias de bases de datos para bacterias de NCBI.

INOCULOS T_RFLP in silico

Tratamiento N Clon Organismo Relacionado % Identidad E N Acceso Hae III HhaI AluI

Inoculo Meso 2-.28 Sulfobacillus disulfidooxidans 99,5 0 U34974 152 225 232

Inoculo Meso 2-.42 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,5 0 DQ909079 308 262 289

Inoculo Meso 2-.43 Sulfobacillus thermosulfidooxidans 93,1 0 AB089844 137 71 239

Inoculo Meso 2-.8 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,5 0 CP001132 170 206 275

Inoculo Meso 2-.82 Uncultured Sulfobacillus 95,7 0 EF612379 217 149 318





Inoculo T. Ext 9-.39 Sulfobacillus thermosulfidooxidans 99,4 0 AB089845 130 140 178

Inoculo T. Ext 11-.17 Sulfobacillus thermosulfidooxidans 99,8 0 AB089844 130 140 177

Análisis comparativo de secuencias de 16SrDNA obtenida de los clones mediante secuenciación de los 16SrDNA amplificados

a partir de muestras de DNA genómico de pulpas de experiencias de lixiviación en matraces, 5% p/v concentrado

calcopirítico.

TABLA VI:

Caracterización de las secuencias de 16S rRNA clonales de acuerdo a su similitud

con las secuencias de bases de datos para bacterias de NCBI.

TANQUE AGITADO T_RFLP in silico

Tratamiento N Clon Organismo Relacionado % Id E N Acceso Hae III HhaI AluI

Batch Meso 30A Acidithiobacillus caldus 98,2 0 DQ470072 215 563 231

Batch Meso 33A Leptospirillum ferriphilum 96,4 0 DQ 534052 190 376 218

Batch Meso 34A Thermophilic bacterium 97 0 EF199989 216 563 230

Batch Meso 35A Uncultured Leptospirillum 88,7 2,43E-120 FJ890907 143 328 171

Batch Mod 15B Leptospirillum ferriphilum 93,7 0 DQ 534052 145 329 172

Batch Mod 40B Sulfobacillus thermosulfidooxidans 95,4 0 EU499919 130 140 177

Batch Mod 50B Curvibacter lanceolatus 95,6 0 GU368379 220 207 368

Batch Mod 19B Cupriavidus metallidurans 98,1 0 CP000352 203 70 157

Batch T.Ext 46C Cupriavidus metallidurans 98,5 0 CP000353 203 70 157

Batch T.Ext 56C Leptospirillum ferriphilum 96,7 0 NR_028818 127 137 202

Batch T.Ext 58C Leptospirillum ferriphilum 96,9 0 DQ534052 190 563 230

Batch T.Ext 59C Leptospirillum ferriphilum 98,1 0 AF356830 197 328 224

Batch T.Ext 68C Acidithiobacillus caldus 97,7 0 EU499920 216 503 230

Análisis comparativo de secuencias de 16SrDNA obtenida de los clones mediante secuenciación de los 16SrDNA

amplificados a partir de muestras de DNA genómico de pulpas de experiencias de lixiviación en tanques agitados 5% p/v

concentrado calcopirítico.

TABLA VI:

Caracterización de las secuencias de 16S rRNA clonales de acuerdo a su similitud con las

secuencias de bases de datos para bacterias de NCBI.

COLUMNAS CONCENTRADO CALCOPIRITICO T_RFLP in silico

Tratamiento N Clon Organismo Relacionado % Identidad E N Acceso Hae III HhaI AluI

Ripio Meso 1-.29 Acidithiobacillus ferrooxidans 97,5 0 FN400770 251 203 232

Ripio Meso 1-.33 Acidithiobacillus ferrooxidans 100 0 DQ676505 251 203 232

Ripio Meso 1-.38 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,9 0 AM502931 251 203 232

Ripio Meso 4-.24 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,5 0 CP001132 170 206 275

Ripio Meso 4-.39 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,9 0 CP001219 251 203 232

Ripio Mod 14-.16 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,4 0 CP001132 170 206 275

Ripio Mod 14-.23 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,4 0 DQ909079 308 262 289

Ripio Mod 14-.65 Acidithiobacillus ferrooxidans 98,8 0 CP001219 251 203 232

Ripio Mod m75 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,8 0 DQ676505 251 203 232

Ripio Mod m77 Acidithiobacillus albertensis 99,3 0 NR_028982 251 203 274

Ripio Mod m78 Acidithiobacillus ferrooxidans 100 0 AM502931 232 186 212

Cuarzo Mod 3-.40 Acidithiobacillus thiooxidans 97,2 0 EU084706 226 181 207

Cuarzo Mod 3-.41 Acidithiobacillus thiooxidans 99,8 0 EU084705 226 180 207

Cuarzo Mod 8-.11 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,6 0 CP001219 251 203 232

Cuarzo Mod 8-.41 Acidithiobacillus albertensis 99,9 0 NR_028982 251 203 232

Ripio T. Ext 12-.49 Acidithiobacillus ferrooxidans 97,7 0 AM502931 251 203 232

Ripio T. Ext 12-.64 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,6 0 CP001132 170 206 275

Análisis comparativo de secuencias de 16SrDNA obtenida de los clones mediante secuenciación de los 16SrDNA

amplificados a partir de muestras de DNA genómico de sólidos de experiencias de lixiviación en Columnas 20 % p/p

concentrado calcopirítico.

2.- Amplificación

por PCR de genes

16S rRNA3.- Digestión con enzimas de

restricción

1.- Toma de muestras y extracción de DNA

4.- secuenciación y detección de

fragmentos marcados 5.- Ploteo de resultados

6.-Asignación de acuerdo a TRFLP in

Silico.

T-RFLP

Análisis de los polimorfismos de los fragmentos

Terminales por electroforesis capilar

Estudio de las comunidades biolixiviantes

(e)

(b)

(g)

(d)

(a) (c)

(f)

(i)(h)

A. ferrooxidans 251 nt..

A. tiooxidans 226 nt. A. ferrooxidans 203 nt.

A. ferrooxidans 232 nt.

A. albertensis 274 nt.S. disulfooxidans 230 nt.

L. ferriphillum 376 nt.

C. matalidurans 157. nt

A. ferrooxidans sp 170.


Representación de los perfiles de T-RFLP de las secuencias de 16S rDNA extraídas de los consorcios crecidos en las

pruebas de biolixiviación en columnas aglomeradas en torno a Ripios de biolixiviación como roca soporte.

Abundancia relativa (%) de T-RFLP de 16S rDNA obtenidos utilizando las endonucleasas HaeIII (a,d,g), Hha I (b,e,h) y Alu I ( c,f,i).

Perfiles de T-RFLP obtenidos de experiencias en condiciones de operación Mesofílicas (a,b,c) , Termofílicas Moderadas (d,e,f) y

Termofílicas Extremas ( g,h,i). Flechas rojas corresponden a asignación de Grupo según TRFLP in silico con cada endonucleasa

estudiara y fueron obtenidos mediante secuenciación de 16S rDNA clonales.

(a)

(c)

(e) (f)

(d)

(b)A. ferrooxidans 251 nt.

A. ferrooxidans 170 nt..

A. tiooxidans 226 nt.

A. caldus 215 nt.

L. Ferriphillum 145 nt.

S. termosulfooxidans 130 nt.

C. metalidurans 203 nt.L. Ferriphillum 190 nt.


A. tiooxidans 232 nt.

Representación de los perfiles de T-RFLP de las secuencias de 16S rDNA extraídas de los consorcios

crecidos en las pruebas de biolixiviación.

Abundancia relativa (%) de T-RFLP de 16S rDNA obtenidas de Tanques agitados (a,c,e) y de columnas aglomeradas en

torno a Ripios de biolixiviación como roca soporte (b,d,f). Perfiles de T-RFLP obtenidos utilizando endonucleasa Hae III.

Perfiles de T-RFLP obtenidos a partir de experiencias en condiciones de operación Mesofílicas (a,b) , Termofílicas

Moderadas (c,d,) y Termofílicas Extremas ( e,f). Flechas rojas corresponden a asignación según TRFLP in silico para HaeIII

obtenidos mediante secuenciación de 16S rDNA clonales.

(a) (b) (c)

(d) (e) (f)

Imágenes (SEM) Muestras de cuarzo recubierto a 90 días de operación.

Micrografía electrónica de barrido (SEM) de la superficie de cuarzo recubierto en concentrado calcopirítico al final del periodo

de biolixiviación en columna (90 días). Imágenes obtenidas de los biofilms a distinta magnificación ( de acuerdo a escala en

cada imagen) generados en condiciones Mesofílicas 38º ( a,d), Termofílicas Moderadas 50 º (b,e) y Termofílicas Extremas 69º

C (c,f).

•Las recuperaciones de Cobre están relacionadas con la

temperatura de operación de los reactores sean estos de tanque

agitado o de concentrados aglomerados sobre distintas matrices

minerales.

•En las pruebas de biolixiviación en columna a temperaturas

hipertermofílicas las recuperaciones de cobre se correlacionan con

potenciales electroquímicos moderados en relación a los

alcanzados en condiciones mesofílicas y termofílicas moderadas.

•Las diferentes temperaturas de operación pueden alterar

significativamente tanto la riqueza de especies como su

abundancia pero no causan una fuerte alteración en la estructura

de las comunidades bacterianas presentes, sobretodo al tratarse

de experiencias en columnas.

Recapitulando

•Independientemente de las temperaturas de operación las

comunidades que provienen de experiencias en columnas tienden

a mantenerse estables, pero las comunidades provenientes de

experiencias en tanques agitados y matraces presentan fuertes

cambios en su composición dependiendo de la temperatura de

operación.

•Las comunidades estaban mayormente dominadas por bacterias

del genero Acidithibacillus y Sulfobacillus no importando la

temperatura de operación aplicada.

•Los compuestos de iones férricos precipitados sobre las partículas

de mineral en condiciones hipertermofílicas y termofílicas

moderadas actúan como estructurador de los biofilms efecto que

no se aprecia al trabajar en condiciones mesofílicas.

Recapitulando

H2O

pH 7

NAD(P)H

NAD(P)H+

H+

H+

ADP + Pi

ATP

FeSO4+ CuSO4 + S°

+ H2SO4

H2SO4SO4=

Fe SO4

H+

Cu

FeS

2

Fe3+

SO4

Fe2(SO4)3

pH 1,5

Temperatura 70°C

pH 7

O2

O2

O2

O2

O2

O2

O2


Muchas Gracias.

Dr. Juan Rivadeneira H

LIAP SpA.

[email protected]

5.10 - 5.50 presentación j rivadeneira

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