5 tehnici bio molec
TRANSCRIPT
![Page 1: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/1.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Biologie Celulara si Histologie
Curs 5 – Tehnici de biologie moleculara Curs 5 – Tehnici de biologie moleculara si inginerie geneticasi inginerie genetica
![Page 2: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/2.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
CuprinsCuprins
⇨ The Human Genome project
⇨ Tehnici de genetica moleculara
Secventierea acizilor nucleici
PCR
Clonarea unor gene
Vectori
Transfectii
Animale transgenice; linii knock-out
⇨ Aplicatii ale ingineriei genetice
![Page 3: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/3.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
The human genome projectThe human genome project
![Page 4: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/4.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
The human genome projectThe human genome project
⇨ Proiect desfasurat pe durata a 13 ani: 1990 – 2003
⇨ Initiat de U.S. Dept. of Energy + National Institute of Health
Partener major: Wellcome Trust (UK)
Alte contributii: Japonia, Franta, Germania, China etc
![Page 5: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/5.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
The Human Genome ProjectThe Human Genome ProjectObiectiveObiective
⇨ Identificarea tuturor genelorgenelor din ADN-ul uman (in total 20-25000)
⇨ Determinarea intregii secvente de nucleotidesecvente de nucleotide din ADN-ul uman (aprox. 3 miliarde)
⇨ Crearea unor baze de datebaze de date cu aceste informatii
⇨ Perfectionarea de instrumenteinstrumente pentru analiza and
⇨ Transferul tehnologiilorTransferul tehnologiilor catre sectorul privat
⇨ Identificarea problemelor legale si eticeproblemelor legale si etice care pot aparea si propunerea de solutii
![Page 6: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/6.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Continutul informational al genomului umanContinutul informational al genomului uman
![Page 7: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/7.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Probleme speciale legate de identificarea si localizarea Probleme speciale legate de identificarea si localizarea genelorgenelor
⇨ CentromeriiCentromerii – contin secvente cu grad inalt de repetitivitate, dificil de mapat cu tehnicile actuale
⇨ TelomereleTelomerele – contin la randul lor secvente repetitive, de multe ori sunt incomplete / se pierd partial la replicarea ADN-ului
⇨ Existenta multigenelormultigenelor – locusuri cromozomiale care contin gene multiple, corelate functional si intricate, dificil de identificat individual
⇨ Aprox. 93%93% din ADN a fost efectiv cartografiat in prezent; studiul telomerelor si centromerilor ramane limitat de tehnologia actuala
![Page 8: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/8.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml
![Page 9: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/9.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Cromozomul 1Cromozomul 1
⇨ Cel mai mare dintre cromozomii umani; contine aprox. 8% din informatia genetica
⇨ Boli genetice:
▶ Parkinson
▶ Alzheimer
▶ Charcot-Marie Tooth (neuropatie ereditara)
⇨ In cancer apar frecvent modificari ale regiunilor sale terminale
![Page 10: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/10.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Cromozomii 2 si 4Cromozomii 2 si 4
⇨ Au cea mai mica rata de recombinare dintre cromozomii umani
⇨ Cromozomul 2 – unic prin provenienta (fuziunea a 2 cromozomi ancestrali)
⇨ Cromozomul 4:
▶ Boala Huntington
▶ Boala polichistica
![Page 11: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/11.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Cromozomii 3, 5, 6Cromozomii 3, 5, 6
⇨ Cromozomul 3
▶ Cea mai scazuta rata de duplicare segmentala
▶ Zone implicate in diferite cancere
⇨ Cromozomul 5
▶ Redundanta informationala mare, continut genetic scazut
▶ Implicat in atrofia musculara spinala
⇨ Cromozomul 6
▶ Contine cea mai mare secventa de codificare a ARN-t (activitate transcriptionala)
▶ Gene implicate in cancer, schizofrenie, autoimunitate
![Page 12: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/12.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Cromozomii 7, 8, 9Cromozomii 7, 8, 9
⇨ Cromozomul 7
▶ Gena CFTR - implicata in fibroza chistica
⇨ Cromozomul 8
▶ Contine o gena implicata in cresterea dimensiunii creierului la primatele mari
⇨ Cromozomul 9
▶ Gene implicate in transsexualitate spontana (reversie de sex mascul → femela)
▶ Gene tumorale: leucemii, melanoame familiale etc
![Page 13: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/13.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Cromozomii 10, 11, 12, 13Cromozomii 10, 11, 12, 13
⇨ Cromozomul 10
▶ Tumori, boli neurologice
⇨ Cromozomul 11
▶ Unul dintre cei mai bogati in gene
▶ Numarul cel mai mare de gene ptr receptori olfactivi
⇨ Cromozomul 12
▶ Leucemii, limfoame, alte cancere
▶ 2 gene asociate diabetului
▶ Gene implicate in tulburari psihiatrice
⇨ Cromozomul 13
▶ Contine gena cancerului de san (de tip II)
▶ Contine gena asociata retinoblastomului
![Page 14: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/14.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Cromozomii 14, 15, 16, 17Cromozomii 14, 15, 16, 17
⇨ Cromozomul 14
▶ Gene pentru ARNr in bratul scurt
⇨ Cromozomul 15
▶ Unul din cromozomii cu rata mare de duplicare segmentala
⇨ Cromozomul 16
▶ Duplicare segmentala mare
▶ Gene implicate in boala polichistica renala, leucemii acute
⇨ Cromozomul 17
▶ Cea mai mare diferenta de structura dintre un cromozom uman si cromozomi similari mamalieni
![Page 15: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/15.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Cromozomii 18, 19, 20, 21Cromozomii 18, 19, 20, 21
⇨ Cromozomul 18
▶ Translocarea 14-18 este una din cele mai comune cauze genetice de cancer la oameni
⇨ Cromozomul 19
▶ Gene implicate in hipercolesterolemia familiala si diabetul insulino-rezistent
⇨ Cromozomul 20
▶ Contine gene prionice (boala Creutzfeld-Jacob)
▶ Implicat in diabetul zaharat de tip II, obezitate, cataracta, boala Graves
⇨ Cromozomul 21
▶ Cel mai mic cromozom
▶ O copie suplimentara (trisomie) determina sindromul Down
![Page 16: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/16.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Cromozomii 22, X, YCromozomii 22, X, Y
⇨ Cromozomul 22
▶ Implicat in schizofrenie, alte boli psihiatrice
⇨ Cromozomul X
▶ Cromozomul sexual feminin
⇨ Cromozomul Y
▶ Cromozomul sexual masculin
![Page 17: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/17.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Exemplu – cromozomul 21Exemplu – cromozomul 21
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/posters/chromosome/chooser.shtml
![Page 18: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/18.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Baze de dateBaze de date
⇨ NCBI Human Genome Sequencing Progress
▶ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/human/
⇨ University of California (Santa Cruz)
▶ http://genome.ucsc.edu/
⇨ Ensembl Genome Browser (Wellcome Trust Sanger Institute & EMBL-European Bioinformatics Institute
▶ http://www.ensembl.org/
⇨ EMBL-Bank (European Molecular Biology Laboratory's Nucleotide Sequence Database)
▶ http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html
![Page 19: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/19.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
![Page 20: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/20.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
![Page 21: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/21.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Aplicatii, beneficii din urma HGPAplicatii, beneficii din urma HGP
⇨ Medicina moleculara:
Diagnostic timpuriu al bolilor / predispozitiilor la o boala
Design rational de medicamente
Terapie genica
Farmacogenomica
⇨ Aplicatii energetice si de ingineria mediului
Aplicatii de genomica microbiana pentru a obtine biocombustibili, sisteme de detectare a poluantilor, tehnici de purificare a mediului
⇨ Bioarheologie si antropologie
⇨ Medicina legala
⇨ Agricultura
Genetically modified foods (GMF)
![Page 22: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/22.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Patentarea genelor, secventelor geneticePatentarea genelor, secventelor genetice
⇨ Se poate face atunci cand:
Este identificata o noua secventa genetica
Este specificat produsul (proteina) secventei genetice respective
Este specificata functia produsului respectiv
Este dezvoltata o metoda de valorificare a produsului genei, care poate fi utilizata de specialisti din domeniu
⇨ Patentele sunt pe o perioada de 20 de ani
⇨ Patentarea prespune si punerea la dispozitie a intregii informatii referitoare la produsul patentat
⇨ Informatii suplimentare (argumente pro/contra, situatia legala in USA etc):http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/elsi/patents.shtml
![Page 23: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/23.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Tehnici de genetica molecularaTehnici de genetica moleculara
![Page 24: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/24.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Secventierea ADNSecventierea ADN
⇨ Reprezinta succesiunea de proceduri utilizate pentru identificarea secventei de nucleotide intr-un lant de and
⇨ Metode de baza:
▶ Secventierea chimicaSecventierea chimica (Maxam – Gilbert)
Bazata pe inducerea unor modificari chimice ale ADN-ului si apoi clivarea lantului la nivelula cestor modificari
Utilizata in prezent doar in domenii restranse (studiul interactiunilor ADN-proteine etc)
▶ Metoda de terminare a lantului Metoda de terminare a lantului (Chain-termination method; metoda Sanger)
Necesita: un lant simplu de ADN (single-stranded), un primer (secventa de ADN care serveste ca punct de plecare a polimerizarii), ADN-polimeraza si nucleotide marcate radioactiv sau fluorescent
Fragmentele sintetizate sunt denaturate termic si separate prin electroforeza pe gel si autoradiografie / fotografie UV
![Page 25: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/25.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
![Page 26: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/26.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Alte metode de secventiereAlte metode de secventiere
Electroforeza capilara
Dye-termination method Clonare in vectori bacterieni
![Page 27: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/27.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Secventierea ADN Secventierea ADN Metoda shotgunMetoda shotgun
⇨ Cromozomii sunt taiati in fragmente mai mici
⇨ Fiecare fragment este folosit ca matrita pentru crearea unor fragmente noi, care difera de original printr-o singura baza (care urmeaza a fi identificata intr-o etapa ulterioara)
⇨ Fragmentele dintr-un set sunt separate prin electroforeza pe gel
⇨ Markeri fluorescenti de generatie noua permit separarea fragmentelor din cadrul aceleiasi benzi de migrare in gel
⇨ Se identifica ultima baza azotata din fiecare fragment – se recreaza astfel secventa originala de A – T – C – G pentru fiecare fragment
⇨ Rezultatele sunt analizate de sisteme de secventiere automate, obtinandu-se o cromatograma in 4 culori, cu varfuri corespunzatoare celor patru baze azotate
⇨ Dupa “citirea” bazelor, secventele scurte sunt reconstituite pe calculator si este analizata structura lor din punctul de vedere al tipului de informatie genetica stocata.
![Page 28: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/28.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Exemplu (principiu de baza)
![Page 29: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/29.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
![Page 30: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/30.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
PCR = polymerase chain reactionPCR = polymerase chain reaction
⇨ Reactie de copiere si amplificare a informatiei ADN
⇨ Necesita: Fragmentul de ADN-ul care se doreste a fi amplificat
Primeri = secvente de nucleotide complementare celor doua capete ale lantului de ADN
ADN-polimeraza
Nucleotide
Buffer, ioni divalenti
⇨ Utilizare: Secventializarea ADN-ului (“citirea” informatiei genetice)
Clonari
Scopuri diagnostice
Crearea de plasmide, vectori pentru utilizarea in ingineria genetica
Scopuri criminalistice
![Page 31: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/31.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
PCRPCR
![Page 32: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/32.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro15.swf
![Page 33: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/33.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Clonari de geneClonari de gene
![Page 34: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/34.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Clonari de geneClonari de gene
⇨ Clonare moleculara = izolarea unei anumite portiuni de ADN si realizarea de copii multiple ale acesteia
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro10.swf
![Page 35: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/35.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Vectori Vectori
⇨Sunt molecule de ADN utilizate pentru transferarea de material genetic strain intr-o celula
⇨Tipuri de vectori: Plasmide Bacteriofagi, alte virusuri Cromozomi artificiali
⇨Transferul de material genetic intr-o celula = Transfectie
![Page 36: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/36.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
PlasmidePlasmide
⇨ Fragmente de ADN dublu spiralat, de obicei circulare
⇨ Capabile de autoreplicare
⇨ Se pot integra sau nu in genomul celulei gazda
⇨ Origine bacteriana / sinteza in vitro
⇨ Utilizare in transfectii, terapie genica
Wikimedia Commons
![Page 37: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/37.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120082/bio35.swf
![Page 38: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/38.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
⇨ Bacteriofagi – virusuri care infecteaza bacterii
⇨ Retrovirusuri – se integreaza in genom, se replica o data cu celula gazda
⇨ Lentivirusuri (subclasa a Retrovirusurilor)
⇨ Adenovirusuri – nu se integreaza in genom, nu se replica o data cu celula gazda (utilizare limitata; genereaza un raspuns imun puternic → utilizare in crearea de vaccinuri)
CONDITII DE UTILIZARE:CONDITII DE UTILIZARE:
● NepatogeneNepatogene pentru oameni / manipulate genetic pentru a nu fi patogene pentru oameni / manipulate genetic pentru a nu fi patogene● Toxicitate redusaToxicitate redusa pentru celulele pe care le infecteaza pentru celulele pe care le infecteaza● StabilitateStabilitate – sa nu prezinte mutatii frecvente – sa nu prezinte mutatii frecvente● SpecificitateSpecificitate pentru o anumita linie celulara pentru o anumita linie celulara
Vectori viraliVectori virali
![Page 39: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/39.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Vectori viraliVectori virali
Wikimedia Commons
Wikimedia Commons
Bacteriofag
Vector lentiviral
![Page 40: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/40.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Cromozomi artificialiCromozomi artificiali
⇨Cromozomi de drojdie (YAC – yeast artificial chromosome)
⇨Cromozomi bacterieni (BAC)
⇨Cromozomi umani (HAC) – functioneaza ca un cromozom suplimentar (47), sunt multiplicati la diviziunea celulara; pot fi utilizati pentru introducerea in celula de gene noi
![Page 41: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/41.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
TransfectiiTransfectii
⇨ Reprezinta transferul intr-o celula de material genetic strain, cu ajutorul unui vector
⇨ Metode:
✗ Utilizarea unor plasmide + a unei modalitati de destabilizare temporara a membranei celulare, pentru a permite intrarea ADN-ului plasmidic in celula
➔ Metoda fosfatului de calciu (istorica; functioneaza!)
➔ Utilizare de lipozomi in care este inclus plasmidul, si care fuzioneaza cu membranele celulare
➔ Utilizare de polimeri cationici de care se ataseaza ADN-ul, care ulterior sunt introdusi in celule prin endocitoza
➔ Electroporare, ultrasonoporare, magnetoporare, soc termic etc.
✗ Utilizarea de vectori virali:
➔ Transfer mai simplu; are loc infectia celulelor care vin in contact cu virusul modificat genetic, infectie care se propaga rapid in toata cultura de celule
![Page 42: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/42.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Animale transgeniceAnimale transgenice
⇨ Crearea, in scopuri de cercetare, a unor linii de animale de laborator (soareci, sobolani etc), ce prezinta o anumita mutatie a unei gene
⇨ Utilitate:➔ Modele pentru anumite boli
➔ Studierea implicarii anumitor gene in anumite lanturi de control, in aparitia anumitor maladii Expert Reviews in Molecular Medicine, Vol. 5; 7 April 2003
Generation of YAC-transgenic miceKenneth R. Peterson
![Page 43: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/43.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Linii knock-outLinii knock-out
⇨ Linii de organisme modificate genetic (de obicei soareci), la care una sau mai multe gene au fost blocate de la expresie
⇨ Utilizate in studiul patogeniei unor boli
Wikimedia Commons Wikimedia Commons
![Page 44: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/44.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Aplicatii ale ingineriei geneticeAplicatii ale ingineriei genetice
![Page 45: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/45.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Aplicatii ale ingineriei geneticeAplicatii ale ingineriei genetice
⇨ Screening genetic
⇨ Vaccinuri
⇨ Sinteza de proteine in vitro (ex: insulina!)
⇨ Terapie genica
⇨ GMF/O
![Page 46: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/46.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Screening geneticScreening genetic
⇨ Analiza informatiei genetice din ADN-ul unei persoane
⇨ Aplicatii:
Screening al purtatorilor (identificarea persoanelor care poseda o gena din doua necesare transmiterii unei boli genetice)
Diagnostic prenatal
Teste in perioada presimptomatica la persoanele cu risc pentru boli genetice (Coree Huntington, Alzheimer, cancer de san, etc)
Medicina legala
![Page 47: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/47.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Terapie genicaTerapie genica
⇨ Introducerea in genom a unei gene normale (clonata), care sa inlocuiasca gena cu defect cauzatoare a unei boli genetice
⇨ Cum se introduce gena?
Vectori: Retrovirusuri Adenovirusuri Virusuri herpes simplex
![Page 48: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/48.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Terapia genicaTerapia genica
⇨ Probleme actuale de rezolvat:
Durata scurta a efectului – in prezent, integrarea genei in genom este de scurta durata, fiind necesare sedinte multiple de terapie
Controlul raspunsului imun – declansat de prima sedinta de terapie, accentuat la repetarea sedintei
Probleme speciale legate de vectorii virali – efecte adverse nedorite (raspuns inflamator, toxicitate, declansarea raspunsului imun, posibilitatea redobandirii virulentei odata incorporat in genomul gazdei)
Bolile multigenice – dificultati in identificarea tuturor genelor implicate, ale tipului de intricare functionala; dificultati in inlocuirea tuturor regiunilor de genom implicate
![Page 49: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/49.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
Terapia genicaTerapia genica
⇨ Rezultate semnificative in prezent:▶ 2008: UCL Institute of Ophthalmology and Moorfields Eye Hospital NIHR Biomedical
Research Centre – ameliorarea vederii in urma terapiei genice a unei forme ereditare de cecitatececitate
▶ 2007: University of Texas M. D. Anderson Cancer Center and the University of Texas Southwestern Medical Center - un studiu pe soareci, cu o combinatie de terapie genica + tehnici nanotehnologice de introducere a genelor au indus scaderea semnificativa a volumului unor tumori pulmonaretumori pulmonare
▶ 2006: National Cancer Institute (NCI) – au obtinut limfocite modificate genetic care ataca cu succes celule tumorale de melanom malignmelanom malign
▶ 2006: tratarea cu succes prin terapie genica a unor pacienti suferind de sindroame sindroame mieloidemieloide
▶ 2005: tratata cu succes surditateasurditatea datorata distrugerii celulelor cohleare, la hamsteri, prin introducerea unei gene care a determinat cresterea de noi celule cohleare
▶ Alte rezultate promitatoare – deocamdata neconfirmate prin studii pe animale de laborator sau studii clinice: tratamentul Coreei Huntington, bolii Parkinson, talasemiei, fibrozei Coreei Huntington, bolii Parkinson, talasemiei, fibrozei chistice, anumitor forme de cancer, leucemii, sicklemie chistice, anumitor forme de cancer, leucemii, sicklemie etc
![Page 50: 5 Tehnici Bio Molec](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022013121/5571f8a649795991698dd53d/html5/thumbnails/50.jpg)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
FarmacogenomicaFarmacogenomica
⇨ Studiul felului in care bagajul genetic al unui individ afecteaza raspunsul organismului la medicamente
⇨ Informatii suplimentare: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/pharm.html
http://www.freewebs.com/pharmacogenomics/impactonyou.htm