5. ünite BİYOREAKTÖRLER

Endüstriyel ölçekli üretimlerde biyoreaktör seçimi, kullanılacak mikroorganizmanın

özellikleri, üretim kapasitesi, kullanılacak hammadde ve ürünün özelliklerine göre

değişiklik gösterir.

Tepsili Biyoreaktörler: Kesikli sistemle çalışan biyoreaktörlerin ilk örneği tepsili

biyoreaktörlerdir (Şekil 5.1.) Bu yöntemde mikroorganizma besin ortamının yüzeyinde

Şekil 5.1. Tepsili biyoreaktör.

gelişir. Sitrik asit ve penisilinin aerobik koşullarda üretilmesinde kullanılmıştır. Bu sistemde

tepsiler kültür ortamı ve mikroorganizmayla doldurulduktan sonra hava akımının sisteme

verilmesiyle biyoreaksiyon başlatılmış olur. Reaksiyon tamamlanınca ürün tepsilerden

alınır. Büyük miktarda ticari ürünlerin üretilmesi için uygun bir yöntem değildir. Bundan

dolayı kullanıma başlandıktan kısa bir süre sonra daha yüksek hacimlerde üretime olanak

veren tank tipi biyoreaktörlere yerini bırakmıştır (Şekil 5.2.)

Şekil 5.2.Tank tipi karıştırmalı biyoreaktör (Brock- Biology of microorganisms 11.ed. 2006)

Karıştırmalı Tank Tipi Biyoreaktörler: Bu reaktörler paslanmaz çelikten yapılmış

tanklardır. Sıvı çözelti içinde mikroorganizmaları geliştirmek, ihtiyaç duydukları besin

elementi, sıcaklık ve oksijen gibi gereksinimleri sağlamak için çözeltinin etkin bir şekilde

karıştırılması gereklidir.

Reaktörlerin sterilizasyonu su buharı ile yapılır. Soğutma işlemi su ceketi veya soğutucu

spiraller ile yapılır (Şekil 5.3). Derin kültür yöntemi ile çalışılırken üretimde kullanılacak

hammadde veya diğer tanımla besiyeri ya steril halde fermentere alınır veya fermentere

alındıktan sonra çift yüzeyli silindirik gövdenin yüzeyleri arasından kızgın buhar geçirilerek

sistem tümden sterilize edilir. Sonra çift yüzey arasına buhar yerine soğuk su sevk

edilerek ve karıştırıcı çalıştırılarak etkin ve hızlı bir soğutma sağlanır. Aşılama sıcaklığına

ulaşıldığında, önceden hazırlanmış aşılama kültürü ile aşılanıp üretime geçilir. Üretim

boyunca ortamın sıcaklığı, pH’sı, çözünmüş oksijen konsantrasyonu gibi kritik bilgiler

termometre ve elektronik proplarla izlenir. Köpürme köpük kırıcılar (polietilen glikol, silikon

yağları, bitkisel ve hayvansal yağlar) ilave edilerek veya mekanik olarak (merkezkaç

kuvveti) engellenir. Ekmek mayası, enzim, alkol, organik asitler vb. üretimi bu yöntemle

gerçekleştirilir.

Karıştırmalı tank tipi biyoreaktörler çok yaygındır. Çünkü oldukça esnek işletme

koşullarına sahiptir. İşletme amacına göre modifiye edilebilir. Gelişen mikrobiyal hücrelere

gaz transferi en etkin bu tip reaktörlerde gerçekleştirilir. Bu tip reaktörlerde en büyük

sorun kontaminasyon tehlikesidir. Köpük oluşumu diğer bir sorundur. Fazla köpük filtre ile

dışarı alınabilir veya köpük kırıcı ilave edilebilir. Fakat bu da kontaminasyona yol açan en

büyük nedenlerden birisidir. İlave edilen köpük kırıcılar hücresel bazda bazı enzimleri

inhibe edebilir. Ayrıca oksijen transferini azaltıcı etki gösterir. Ürün verimini azaltır. Ayrıca

köpük kırıcı ilavesi saflaştırma basamaklarını artırmaktadır. Sonuç olarak karıştırmalı tank

reaktörlerde köpük kırıcı ilavesini engellemek için fermantörün üst kısmında boşluk

bırakılır. Bu boşluk reaktör hacminin % 25’inin boş bırakılması ile sağlanır.

Şekil 5.3. Karıştırmalı tank tipi biyoreaktör içinde bulunan soğutucu spiraller.

Tank Tipi Karıştırmalı Biyoreaktörün Bölümleri

Paslanmaz çelik yapı

Paslanmaz çelik gövde, biyoreaktöre düz sert ve korozyona dirençli aynı zamanda

buharla veya kimyasal malzemeyle kolay temizlenebilir bir iç yüzey sağlamaktadır.

Kanatçık

Bunlar tankın ortasında bir şafta bağlanmakta, şaftın bir elektrik motoru ile dönmesiyle

birlikte kanatçıklar hareket ederek biyoreaktör de bulunan içeriğin daha iyi karışmasını

sağlamaktadır.

Biyoreaktörde mikroorganizmalar çoğaldıkça substrat vizkositesi artmaya ve hücreler

kanatçıklara ve tankın iç çeperlerine yapışmaya başlamaktadır. Bundan dolayı iç yüzeyin

bu yapışmayı önleyecek materyalden yapılması gerekmektedir.

Biyoprosesin özelliğine göre geliştirilmiş hem kanat sayısı hem de kanat konfigürasyonu

farklı olan bir çok pervane sistemi geliştirilmiştir (Şekil 5.4).

Şekil 5.4. Karıştırmalı tank tipi biyoreaktörlerde kullanılan pervene örnekleri

Dağıtıcı

Aerobik mikroorganizma kültürlerinde, oksijen en önemli sınırlayıcı faktörlerden bir

tanesidir. Biyoreaktör boyutu arttıkça, saf oksijen veya daha çok filtre edilmiş havanın

sisteme pompalanması gerekmektedir. Substratta daha fazla oksijenin çözülmesi için

hava, küçük deliklere sahip disk şeklinde dağıtıcılara pompalanmaktadır. Bu işlem küçük

hava kabarcıklarının sisteme verilmesi böylece yüzey/hacim oranının artmasına neden

olmaktadır.

Saptırıcılar

Saptırıcılar fermantörün iç kısımlarına aşağıda görüldüğü gibi yerleştirilirler. Saptırıcılar

tank içinde türbülans oluştururlar. Bu oksijenin sıvı içinde daha iyi çözünmesine olanak

sağlar.

Şekil 5.5. Tank tipi karıştırmalı biyoreaktörlerde türbülans oluşturan saptırıcı plakalar.

Saptırıcı plakalar

Elektronik problar

Bu problar sıcaklık, pH, çözünmüş oksijen konsantrasyonu, köpük oluşumu gibi

parametrelerin fermantasyon süresince izlenmesine olanak sağlar. Tank içinde bu

parametrelerin ölçülebilmesi için prob girişleri olmalıdır.

Köpük önleyici ajanlar

Aerobik fermantörlerde potansiyel problemlerden biriside oksijenin küçük kabarcıklar

şeklinde verilmesi ve karıştırma sonucu oluşan köpüktür. Bu problem fermantörün üst

kısmının köpükle dolmasına neden olur. Bazı ticari fermantörlerde bu olayı görebilme ve

izleyebilmek için küçük pencereler konmuştur. Daha da önemlisi köpük sistemden hava

ile beraber çıkarak fermantör hacminin azalmasına ve kontaminasyona yol açabilir.

Köpük önleyici ajanlar kimyasal maddeler olup köpük düzeyini kontrol ederler

(kabarcıkların patlamasına neden olurlar)

Su ceketi

Su ceketi fermantörün etrafını çevirir içinden geçen soğuk su sayesinde fermantör

soğutulmuş olur. Su ceketi gereklidir, çünkü fermantasyon sonucu ısı üretilir ve sıcaklık

yükselir. Su ceketi olmazsa aşırı ısınmadan dolayı hücreler ölebilir.

Hava filtresi

Biyoreaktöre hava verilmesi gerektiği zaman hava kaynaklı mikroorganizmaların kültürü

kontamine etmesini engellemek için hava girişine mutlaka filtre takılmalıdır. Aksi taktirde

sisteme giren yabancı mikroorganizmalar istenmeyen ürünlerin oluşmasına neden olabilir

Basınç ayar vanaları

Mikrorganizmalar fermentör içinde gaz üretiyorsa bu sistemde iç basıncın artmasına

neden olur. Bundan dolayı sistemin iç basıncı takip edilmeli ve gerektiğinde uygun düzeye

ayarlanmalıdır.

Güvenlik valfleri

Eğer basınç patlamaya neden olacak kadar çok yüksek bir seviyeye ulaşacak olursa

güvenlik valfleri devreye girer ve açılarak tanktan gazın çıkmasına olanak vererek

basıncın düşmesini sağlar.

İnokulasyon ve örnekleme delikleri

Başlangıçta fermantöre steril besinin ve starter kültürün ilave edilmesi aseptik koşullarda

yapılmalıdır. Benzer şekilde, fermentasyon sırasında örnek alınması (kontaminasyon

kontrolü/üremenin kontrolü/ürün kontrolü) kontaminasyona neden olmayacak şekilde

yapılmalıdır. İnokulasyon ve örnekleme işlemi genellikle buhar vanalarının yardımıyla

sterilize edilen paslanmaz çelikten yapılmış borularla yapılır.

Ürün tahliyesi

Fermantörde, ürünün toplanması ve sistemden alınması için sistemden tahliyesine olanak

verecek şekilde tasarlanmış borular bulunur.

Şekil 5.6. Karıştırmalı tank tipi biyoreaktörün bölümleri.

Hava Kaldırmalı Biyoreaktörler: Bunlar yüksekliği fazla çapı dar silindirik tanklardır.

Uygun mikroorganizma aşılanan ortama kule dibinden sürekli taze hammadde verilir.

Gerekirse hava da verilir. Sıvı ve hava hareketi ile hücreler sıvı içinde yüzer duruma kalır.

Reaktörün üzerinden ürün ve substrat alınırken, alt kısmına da taze hammadde verilir.

Günümüzde birçok çeşidi kullanılmaktadır. Hava kaldırmalı biyoreaktörlerde hava

dağıtıcılar tarafından reaktörün alt tabanından verilir. Havanın reaktör içinde dolaşma

şekline göre, internal çevrime sahip olan ve eksternal çevrime sahip olanlar olmak üzere

iki tiptir. İnternal çevrime sahip olan hava kaldırmalı reaktörlerde, hava reaktör içindeki

tüplerden dolaşırken reaktöre hava verilir. Karıştırma hava ile yapılır. (Şekil 5.7). Eksternal

çevrimli olanlarda ise hava bir dış çeper içinde dolaşır Şekil 5.8.)

Şekil 5.7. İnternal çevrime sahip hava kaldırmalı biyoreaktör

Hava kaldırmalı biyoreaktörde alttan verilen ve tüplerden geçen hava yukarı doğru

çıkarken oluşan ürün aşağı doğru iner ve tankın tabanından alınır.

Hava kaldırmalı reaktörler günümüzde büyük ölçekli reaktörlerde kullanılmaktadır.

Karıştırmanın hava ile yapıldığı bu reaktörlerde mekanik bir karıştırma olmadığı için enerji

tasarrufu gerçekleşmekte ayrıca anaerobik mikroorganizmalar içinde bu reaktörler

kullanılmakta ve reaktörün içine giren ilave bir karıştırma mekanizması olmadığı için

kontaminasyon riski azalmaktadır. Ayrıca mekanik karıştırmalı reaktörlere göre hava ile

karıştırılan reaktörlerde kesici kuvvet oluşumu daha azdır. Özellikle genetiği değiştirilmiş

mikroorganizmalar kesici kuvvetlere maruz kaldıkları zaman lizize daha uyarlı

olmaktadırlar. Çünkü organizmanın yabancı proteini sentezlemek için ekstra enerji

üretmesi hücre çeperinde bir zayıflama meydana getirmektedir. Kesici kuvvetlerle

karşılaşan mikroorganizmalarda bir hücresel tepki olarak protein sentezinde bir

yavaşlama meydana geldiği bilinmektedir.

Şekil 5.8. Eksternal çevrime sahip hava kaldırmalı biyoreaktörler

Şekil 5.9. Hava kaldırmalı biyoreaktör. Reaktör kurulurken dikey pozisyona getirilecektir.

Dolgulu Yatak Tipi Reaktörler: Dolgulu yatak tipi reaktörleri atık su arıtımında, sirke ve

enzim eldesinde kullanılır. Sisteme yüzey artırıcı dolgu materyali konmuştur.

Mikroorganizmalar bu alanlara tutunur. Fermantasyon sıvısı bu alandan geçerken,

mikroorganizma tarafından kullanılır ve ürün oluşur (Şekil 5.9)

Şekil 5.9. Dolgulu yatak tipi biyoreaktörler

Tapa Akışlı Reaktörler: Tapa akışlı reaktörlerde uygun mikroorganizma ile aşılanan

çözelti boru içinde sürekli olarak ilerler. Reaktörün her kesiti ayrı bir reaktör gibi çalışır. Bir

yandan ürün alınırken bir yandan da sisteme sürekli taze besin ortamı ve kültür verilir.

Kabarcıklı Kolon Reaktörleri: Mekanik karıştırıcılar yoktur. Alttan gaz girişi ile

kabarcıklar oluşur. Bu şekilde karıştırma yapılır. Hava kabarcıklı reaktörlerde kabarcıklar

alttan yukarıya doğru çıktıkça büyür. Bu istenmeyen bir durumdur. Alttan sıkıştırılmış hava

verildiği için üstte köpük oluşur. Sonuç olarak bu tür fermantörlerin kullanımı sınırlıdır.

Fermentasyon Verimine Etki Eden Faktörler

Kültürlerin Havalandırılması ve Karıştırılması: Aerob mikroorganizmalar ile

gerçekleştirilen tüm üretimlerde havalandırma üretimi belirleyici en önemli etkendir.

Oksijen gazının 25°C’de çözünürlüğü litrede 0,00849 gramdır. Bu yüzden oksijenin kültür

ortamına devamlı verilmesi gerekir. Kabarcıklar büyük olursa oksijen transferi

azalmaktadır. Bu nedenle fermantasyon etkinliğinin artırılmasında en önemli nokta

kültürün çözünmüş oksijen seviyesinin ayarlanmasıdır. Yüzey kültür yönteminde

havalandırma doğal olarak gerçekleşir ve çoğu kez yeterli düzeydedir. Ancak derin kültür

yöntemlerinde bunun yapay olarak gerçekleştirilmesi gerekmektedir. Örneğin asetik asit

bakterilerinin etil alkolü Asetik Asite, küflerin şekerleri sitrik asite okside edebilmesi,

mayaların biyolojik artışı sağlayabilmesi ve bazı bakterilerin enzim üretebilmesi yeterli

havalandırma ile mümkündür. Mikroorganizmaların oksijene duyarlılığı farklıdır. Örneğin

S. cerevisiae hücresel artış için üretilmek istenir ve oksijen yeterli değilse hemen alkol

fermantasyonuna yönelir ve verim düşer. Buna karşın Acetobacter’lerde oksijenin yeterli

olmaması yalnızca verimin düşmesiyle kalmaz, mikroorganizmanın ölümüne de yol açar.

Bu nedenle üretim sırasında bir an için havanın azalması tüm işlemi olumsuz etkiler.

Ortamdaki çözünmüş oksijen düzeyi ayarlanırken şu etkenler dikkate alınmak zorundadır.

Genç hücreler yaşlı hücrelere göre daha fazla oksijen tüketirler.

Rekombinant genler için konakçı olarak kullanılan mikroorganizma hücreleri,

diğerlerine göre(yabani tipler) daha fazla oksijene ihtiyaç duyarlar.

Çoğu uygulamada oksijen ihtiyacı logaritmik üreme döneminde en yüksek

düzeydedir.

Oksijen ihtiyacında hücrenin şekli belirleyici etkiye sahiptir. Yüksek hücre

yoğunluğunda oksijen tüketimi artar.

Misel varlığında oksijen alımı düşer

Biyoreaktörlerde önemli işlemlerden biride karıştırmadır. Fermantörün uygun bir şekilde

karıştırılması ile besin maddeleri homojen bir şekilde dağılmakta, mikroorganizmalar

tarafından oluşturulan toksik maddeler homojen bir şekilde dağılmaktadır. Karıştırma

homojen yapılmazsa toksik maddeler belirli bölgelerde birikerek verimi azaltabilir. Ayrıca

karıştırma ısının homojen bir şekilde dağılmasını sağlar. İlave edilen besin maddeleri,

köpük kırıcılar, asit ve bazların homojen karışımı için iyi bir karıştırma şarttır. Küçük ölçekli

biyoreaktörlerde karıştırmada sorun yaşanmaz. Ancak büyük ölçekli reaktörlerde bir takım

sorunlar karşımıza çıkabilir. Fermantasyon sıvısının karıştırma ile çalkalanması gaz

kabarcıklarından oksijenin sıvı ortama transfer oranını etkilemekte, aynı şekilde ortamdaki

besin maddelerinin hücrelere transferini de artırmaktadır. Fakat aşırı karıştırma da

hücreler üzerinde hidromekanik strese yol açarak büyük mikrobiyal hücrelerde ve memeli

hücrelerinde ölüme neden olabilir.

pH: Mikroorganizmaların çoğu optimum 5,5- 8,0 pH değerleri arasında hücresel

metabolitlerini sentezler. pH’nın tüm fermentasyon boyuca takip edilemsi ve pH

değişikliklerine karşı asit veya baz ilavesi ile önlem alınması son derece önemlidir.

Sıcaklık: Mikroorganizmalar eğer optimum büyüme sıcaklığının altında tutulursa büyüme

de yavaşlama olur. Verimlilik azalır. Veya sıcaklık optimum değerlerinin üzerine çıkarsa

hedef proteinin repressiyonunun indüksiyonu vaktinden önce meydana gelir. Veya ısı

şoku proteinleri üretilebilir.