49270864 sebenta de biologia molecular

1 ANO

2 SEMESTRE BIOLOGIA MOLECULAR

2006/2007

Jorge Paulos

Biologia Molecular - 1 Ano - FFUP 2006/2007

2 Captulo 1 - Genes |

Biologia Molecular 1 Ano - FFUP 2006/2007

| Captulo 1 - Genes 3

Captulo 1 - Genes

1. Conceito de gene

A vida depende da capacidade das clulas em armazenar, obter e traduzir as instrues genticas

necessrias para manter o organismo vivo. Esta informao hereditria passada de uma clula s suas

clulas-filhas, durante a diviso celular, e de uma gerao de um organismo para outro, por meio das suas

clulas reprodutoras. Essas instrues so armazenadas, em todas as clulas vivas, nos genes, os elementos

que contm a informao que determina as caractersticas de uma espcie como um todo, bem como as de

um indivduo.

A maioria dos genes humanos consiste de longos segmentos de exes e de intres alternados, sendo

que a maior parte do gene consiste de intres. Por outro lado, a maioria dos genes de um organismo com

genomas compactos no possui introes. Isso explica o tamanho bastante menor dos seus genes, bem

como a grande proporo de DNA codificante nos seus cromossomas. Alm dos exes e dos intres, cada

gene est associado s sequncias de DNA reguladoras, as quais so responsveis por garantir que o gene

seja expresso nos nveis, no momento e no tipo celular adequados. No homem, as sequncias reguladoras

de um gene tpico esto dispersas por cerca de dezenas de milhares de pares de nucletidos. Essas

sequncias reguladoras so mais comprimidas em organismos com genoma compacto.

2. Informao gentica em eucariotas e procariotas

Por meio de um microscpio simples, possvel observar claramente que os organismos vivos podem

ser classificados, de acordo com as estruturas internas da clula, em dois grupos: os eucariotas e os

procariotas.

Os eucariotas mantm o seu DNA num compartimento limitado por uma membrana, chamado ncleo.



Os procariotas no possuem um ncleo compartimentado limitado para abrigar o seu DNA. A maioria

das clulas procariticas pequena e simples e, geralmente, vivem como indivduos independentes, tal

como os organismos multicelulares. Os procariotas so tipicamente esfricos ou em forma de bastes,

medindo poucos micrmetros de comprimento. Frequentemente, apresentam uma capa protectora

flexvel, chamada parede celular, seguida da membrana plasmtica que envolve um nico compartimento

citoplasmtico que contm DNA, RNA, protenas e uma grande quantidade de molculas pequenas

necessrias vida.

3. Informao gentica nos eucariotas

As clulas eucariticas, em geral, so maiores e mais elaboradas que as clulas procariticas e,

consequentemente, os seus genomas so maiores e mais elaborados tambm. Esta diferena

acompanhada por diferenas radicais nas estruturas e nas funes celulares. Alm disso, muitas classes de

clulas eucariticas formam organismos multicelulares que atingem um nvel de complexidade que no

alcanado pelos procariotas.

As informaes genticas das clulas eucariticas tm uma origem hbrida. A maior parte dessa

informao armazenada no ncleo, mas uma pequena quantidade permanece dentro da mitocndria e,



em clulas vegetais, dentro dos cloroplastos. O DNA mitocondrial e o DNA dos cloroplastos podem ser

separados do DNA nuclear, analisados e sequenciados individualmente.

Os genes encontram-se no interior dos cromossomas, que contm cromatina que est includa no

ncleo celular. Basicamente, a cromatina pode incluir polmeros de DNA podendo ser eucromatina ou

heterocromatina, ou ento pode incluir apenas protenas histnicas ou no histnicas. Os estudos por

microscopia ptica, distinguiram dois tipos de cromatina no ncleo interfsico de muitas clulas

eucariticas superiores:

Heterocromatina forma altamente condensada, que inclui protenas adicionais e, provavelmente,

um nvel mais compacto de organizao, que est apenas a comear a ser analisado actualmente.

Normalmente, corresponde a 10% do genoma de uma clula e est concentrada em diversas

regies como o centrmero e o telmero. A maior parte do DNA compactado em heterocromatina

no contm genes, mas o que contm resistente expresso, porque a heterocromatina se

encontra compactada de forma no-usual.

Eucromatina restante cromatina menos condensada, composta por tipos de estruturas

cromossmicas como as fibras de 30 nm.

Os cromossomas de um indivduo podem ser cromatdeos irmos (ou cromtidas irms), ou seja,

quando so duas cpias de um dado cromossoma, replicado durante a fase S do ciclo celular, que se

separam durante a mitose. Existem tambm os cromossomas homlogos que emparelham durante a

meiose ou correspondem a cromossomas de espcies diferentes que mantm o mesmo nmero de genes

durante a evoluo.

Os cromossomas de um indivduo encontram-se organizados num caritipo atravs do seu nmero,

tamanho e forma. No caso do caritipo humano, este inclui 23 pares, sendo 22 pares de autossomas (ou

cromossomas somticos) e 1 par de heterossomas (ou cromossomas sexuais).



Tendo em conta estes conceitos, pode definir-se genoma como sendo o conjunto do material gentico

de um determinado conjunto de cromossomas de um organismo. Num genoma, os genes pode encontrar-

se em vrias posies, sendo que cada uma delas se designa locus. Para alm disso, cada forma alternativa

de um determinado gene, designa-se alelo. Os alelos podem ser de dois tipos:

Alelo dominante alelo que expressa o seu fentipo mesmo quando um heterozigtico com um

alelo recessivo presente.

Alelo recessivo alelo que no expresso fenotipicamente num determinado heterozigtico.

Esta informao gentica de um organismo podem ser expressas de duas formas:

Gentipo a composio gentica de um organismo.

Fentipo a expresso fsica de um determinado gentipo (morfologia, comportamento,

fisiologia e relaes ecolgicas).

Quanto aos alelos presentes no genoma, os indivduos podem ser de vrios tipos:

Homozigticos quando os dois alelos so idnticos

Heterozigticos quando os dois alelos so diferentes.

4. Transformaes laboratoriais que envolvem Gentica

Fred Griffit injectou a forma rugosa da bactria num ratinho que morreu de pneumonia e injectou a

forma lisa da bactria noutro ratinho que sobreviveu. Noutra experincia seguinte, inactivou as formas

rugosas com temperaturas elevadas e s depois que as injectou noutro ratinho, o qual sobreviveu pois as

bactrias inactivas, deixam de ter caractersticas patognicas. Numa ltima experincia, utilizou clulas

rugosas inactivas pelo calor e lisas simultaneamente, sendo que como o DNA se encontra presente, entra

para a bactria de forma rugosa, passa a conferir-lhe caractersticas patognicas e o ratinho pode vir a

desenvolver uma pneumonia.



Alfred Hershey um fago quando infecta uma bactria, tem de injectar o seu material gentico, manter-se

no interior da bactria e modificar o DNA. As clulas podem ser marcadas com compostos radioactivos,

sendo o mais comum a utilizao de fsforo-32. Para efectuar esta marcao tambm necessrio utilizar

algo que faa parte da constituio da protena, como o enxofre-35. Quando o fago infecta a bactria, vai

injectar o material e como a replicao do DNA semiconservativa e existem duas cadeias de DNA, vo ser

originadas 4 cadeias, existindo uma cadeia radioactiva e outra no radioactiva, devido utilizao do

fsforo. Desta forma, analisam-se as cadeias das descendncias vricas e consegue concluir-se acerca da

importncia da utilizao destes compostos na infeco de material gentico.



5. Estrutura do DNA

A molcula de DNA consiste de

duas longas cadeias polipeptdicas

compostas de quatro tipos de

subunidades nucleotdicas. Cada uma

dessas cadeias conhecida como

uma cadeia de DNA. As pontes de

hidrognio entre as regies das bases

azotadas mantm as duas cadeias

juntas.

Os nucletidos so compostos de

acares com cinco carbonos, aos

quais um ou mais grupos fosfato

esto ligados, e de uma base

contendo azoto. No caso dos

nucletidos do DNA, o acar uma

desoxirribose ligada a um nico

grupo fosfato (por isso o nome cido

desoxirribonucleico), e a base pode

ser adenina (A), timina (T), guanina

(G) e citosina (C). Os nucletidos esto covalentemente ligados numa cadeia atravs dos acares e dos

fosfatos, os quais permitem formar a estrutura principal alternada de acar-fosfato-acar-fosfato. Cada

cadeia polinucleotdica de DNA semelhante a um colar constitudo por quarto contas diferentes,

correspondentes s quatro bases azotadas, pois apneas as bases diferem nos quatro tipo de subunidades.

Esses mesmos smbolos so usados para representar os quatro diferentes nucletidos, que so as bases

ligadas com os seus grupos fosfato e acar.

A estrutura tridimensional do DNA a dupla hlice decorrente das caractersticas qumicas e

estruturais das suas cadeias polipeptdicas. Uma vez que essas duas cadeias so mantidas juntas atravs de

pontes de hidrognio entre as bases das duas cadeias complementares, todas as bases encontram-se no

interior da dupla hlice, e os acares e os fosfatos encontram-se na regio externa. Em cada um dos casos,

a base mais robusta, com dois anis (purina), emparelha com uma base com um nico anel (pirimidina). A

emparelha sempre com T e G com C. Essa complementaridade de bases permite que os pares de bases

sejam dispostos num arranjo energtico mais favorvel no interior da dupla hlice. Neste arranjo, cada par

de bases apresenta largura similar, mantendo a estrutura de acar-fosfato equidistante ao longo da

molcula de DNA. Para maximizar a eficcia do empacotamento pelo emparelhamento, as duas estruturas

enrolam-se uma em torno da outra para formar a dupla hlice, com uma volta completa a cada 10 pares de

bases.

Os membros de cada par de bases encaixam-se na dupla hlice apenas se as duas cadeias da hlice

estiverem na posio antiparalela, isto , apenas se a polaridade de uma cadeia estiver em orientao

oposta da outra cadeia. A consequncia desta caracterstica que cada cadeia de uma molcula de DNA

contm uma sequncia de nucletidos exactamente complementar da outra cadeia.



6. Conformaes do DNA

A maior parte do DNA celular encontra-se sob a forma de hlice. A anlise desta molcula atravs de

raios-X informa-nos que as bases azotadas se encontram, geralmente, espaadas de 0.36 nm entre si, ao

longo dos eixos da hlice da molcula de DNA. As trs principais conformaes de DNA conhecidas so:

B-DNA a forma de DNA mais esperada de encontrar nas clulas. o DNA que respeita

completamente as regras de complementaridade de bases azotadas e que conduz existncia de

cadeias complementares e antiparalelas.

A-DNA existe em condies de baixa humidade, onde a estrutura principal bastante mais

compacta, exibindo grandes pores de bases que se encontram a seguir os eixos da hlice de DNA.

Z-DNA inclui pequenas molculas de DNA que alternam nucletidos de purinas e pirimidinas,

adoptando uma estrutura mais instvel que a estrutura em hlice. As bases criam como que um

zig-zag quando visualizadas de lado, sendo que quando o DNA adquire esta conformao particular,

ainda apresenta funo desconhecida.

7. Metilao do DNA

A metilao no DNA vertebrado restrita aos nucletidos de citosina na sequncia CG, que faz o

emparelhamento de bases com a mesma sequncia (na direco oposta), na outra cadeia de DNA de dupla

hlice. Consequentemente, um mecanismo simples permite a existncia de um padro de metilao de

DNA a ser herdado directamente pelas cadeias-filhas de DNA.

Uma enzima designada metiltransferase de manuteno actua preferencialmente nas sequncias CG

referidas anteriormente, que esto emparelhadas com uma sequncia CG j metilada. Como resultado, o

padro de metilao de DNA da cadeia-filha de DNA parental serve como molde para a metilao da

cadeia-filha de DNA, tornando esse padro directamente herdvel aps a replicao do DNA.

Logo aps a fertilizao, ocorre uma ampla onda de desmetilao do genoma, quando a grande maioria

dos grupos metilo so perdidos da cadeia de DNA. Essa desmetilao pode ocorrer tanto pela supresso da

actividade das metiltransferases de manuteno do DNA, resultando numa perda passiva de grupos metilo

durante cada ciclo de replicao de DNA, como por uma enzima especfica de desmetilao.



8. Tautomerismo

Geralmente, durante o enrolamento das cadeias de DNA, estamos perante um emparelhamento A=T e

GC, sendo que as formas tautomricas podem emparelhar com bases que normalmente no emparelham,

como por exemplo A com C e G com T.

Este processo ocorre normalmente no nosso organismo, mas na coexistncia de sistemas que nos

defendem dessas isomerizaes, como os sistemas de reparao de DNA, que quando entram em

funcionamento, removem os emparelhamentos de isomerismo e o DNA volta ao seu estado normal. No

entanto, quando o emparelhamento de isomerismo no retirado por esses sistemas, quando ocorrer a

replicao de DNA seguinte, o erro vai ser corrigido e as bases voltam a emparelhar segundo as regras

normais.

9. Sequncias invertidas - Palindromas

Geralmente, um palindroma entendido como uma sequncia de DNA de cadeia dupla, que lida da

mesma forma quando as duas cadeias so lidas numa direco definida. Formam-se estruturas cruciformes,

apresentando zonas que podem emparelhar por serem perfeitamente idnticas, e quando isso se verifica,

adquirem forma de alfinete, conferindo o aspecto de uma cruz molecula de DNA na sua totalidade.

Este acontecimento tambm pode ocorrer no RNA, sendo que as estruturas formadas se designam por

estruturas secundrias, adquiridas pela paragem da transcrio. Podem tambm adquirir estruturas

tercirias, sendo estas caractersticas de um RNA particular, o tRNA, que geralmente apresenta forma de

folha de trevo, formando um pseudo-lao.



10. Desnaturao e renaturao do DNA

Durante a replicao e a transcrio do DNA, as cadeias de dupla hlice da molcula separam-se para

permitir o emparelhamento das partes internas das bases, com as bases dos nucletidos que vo ser

polimerizadas em novas cadeias polinucleotdicas.

O desenrolamento e a separao do DNA, referido normalmente como desnaturao pode ser induzido

experimentalmente atravs de um aumento da temperatura de uma soluo de DNA. medida que a

energia trmica aumenta, o aumento do movimento molecular resulta numa quebra das pontes de

hidrognio e de outras foras que pudessem estabilizar a dupla hlice. De seguida, as cadeias separam-se e

so conduzidas individualmente atravs da repulso electrosttica do grupo fosfato que est contido nas

desoxirriboses de cada cadeia.

Perto da temperatura de desnaturao, um pequeno aumento da temperatura causa uma perda das

fracas interaces que mantinham as cadeias juntas ao longo de todo o comprimento da molcula de DNA,

conduzindo a uma mudana abrupta na absorvncia de ultravioletas.

A temperatura de fuso (Tm) qual as cadeias de DNA se separam, depende de diversos factores. As

molculas que contm uma maior proporo de pares G-C requerem uma temperatura superior para

desnaturarem devido existncia de trs pontes de hidrognio entre as duas bases, tornando-as mais

estveis que as A-T que apenas apresentam duas pontes de hidrognio nas suas ligaes. No entanto, a

percentagem de bases G-C numa determinada molcula de DNA pode ser estimada atravs da temperatura

de fuso da molcula, sendo que quanto maior a percentagem de pares G-C, maior a temperatura de fuso

Tm.



11. Compactao do DNA

Nucleossomas

As protenas que se ligam ao DNA para formar o cromossoma eucaritico so, tradicionalmente,

divididas em duas classes gerais: as histonas e as protenas cromossmicas no-histnicas. O complexo das

duas classes de protenas com o DNA nuclear conhecido por cromatina. As histonas esto presentes em

enormes quantidades nas clulas, de forma a que a sua massa total de cromatina seja quase igual massa

final de DNA.

As histonas so responsveis pelo primeiro e mais bsico nvel de organizao cromossmica, o

nucleossoma, o qual foi descoberto em 1974. Quando o ncleo interfsico delicadamente rompido e o

seu contedo examinado atravs de um microscpio electrnico, a maior parte da cromatina est na

forma de uma fibra com 30 nm de dimetro.

A organizao estrutural dos nucleossomas foi determinada depois de estes serem isolados, da

cromatina compactada pela digesto com enzimas especficas (nucleases) que quebram o DNA cortando-o

entre os cernes dos nucleossomas. Aps a digesto por um curto perodo, o DNA exposto entre as

partculas dos nucleossomas, o DNA de ligao degradado. Cada partcula do cerne nucleossmico

individual consiste de um complexo de oito protenas histnicas, duas molculas de cada uma das histonas

H2A, H2B, H3 e H4 e a dupla cadeia de DNA, que tem 146 nucletidos de comprimento. O octmero de

histonas forma, ento, um cerne proteico ao redor do qual se enrola a dupla cadeia de DNA. Cada partcula

do cerne do nucleossoma separada por um segmento de DNA de ligao, o qual pode variar em

comprimento desde poucos, at cerca de 80 pares de nucletidos. Este octmero de histonas , finalmente,

selado por uma outra protena histnica, H1.

Digesto com a nuclase do micrococcus

Os nucleossoma so as unidades bsicas de compactao do DNA, sendo que cada um deles ligado a

outro atravs de molculas de DNA linker. O DNA est protegido com protenas e passa a no ser digerido

pelas enzimas de restrio ou exonucleases. Quando cada nucleossoma era constitudo por 200 pares de

bases e o DNA linker tem o seu tamanho, a nuclease do micrococcus corta as molculas de DNA nas zonas

onde o DNA est livre, no estando associado a protenas. Quando a enzima actua durante mais tempo,

digere todo o DNA que corresponde ao DNA linker (8 a 114 pares de bases).



Compactao da cromatina

O DNA dos eucariotas consiste em sequncias nicas e repetidas. Apenas uma percentagem inferior a

5% do DNA humano codifica protenas e RNA funcionais e as sequncias reguladoras que controlam a sua

expresso. O restante maioritariamente constituinte do DNA existente entre os genes e os intres que se

encontram inseridos em genes. Uma grande quantidade deste DNA (cerca de 50% nos humanos) derivado

de elementos mveis de DNA que contriburam para a evoluo dos genomas contemporneos.

Cada cromossoma consiste numa molcula individual e comprida de DNA com um numero de 210 Mb

nos humanos, organizada em nveis sucessivamente superiores de condensao, atravs de protenas

histnicas e no histnicas, com as quais se encontra altamente complexada. As molculas de DNA de

dimenses inferiores encontram-se nas mitocndrias e nos cloroplastos.



12. Cromossoma metafsico

Um cromossoma uma molcula de DNA associada a protenas histnicas e

no histnicas. constitudo por dois cromatdeos ligados pelo centrmero que

se caracteriza por ser uma zona altamente compacta.

Para que um cromossoma seja funcional, tem de possuir:

Origem de replicao local onde se inicia a replicao do DNA;

Centrmero regio especializada e complexa dos cromossomas que

apresenta poucos ou nenhuns genes. o ponto de unio dos cromatdeos irmos

e contm uma estrutura (o cinetocoro) a que as fibras do fuso se ligam durante a

mitose e a meiose, pelo que tem um papel importante no movimento dos

cromossomas em direco aos plos;

Telmero sequncias de DNA existentes nas zonas terminais dos cromossomas, que impedem um

encurtamento de DNA pela aco de uma enzima especfica. O telmero pode ter o comprimento de

algumas centenas de pares de bases e participa na estabilidade e na replicao do cromossoma. Um

cromossoma normal possui dois telmeros. A enzima que protege os telmeros designa-se telomerase,

que j no est presente na maioria das clulas adultas. Nas clulas embrionrias, existe sempre a

telomerase, na medida em que esto em constante desenvolvimento.

Bandeamento dos cromossomas

Os cromossomas so submetidos a um tratamento proteoltico para depois serem colocados em

contacto com reagente de Giemsa, produzindo bandas distintas em locais caractersticos. Anlises

microgrficas dos cromossomas 4 e 5, mostram condies em locais onde as bandas surgem em locais

levemente assinalados de forma microgrfica.

Geralmente, as bandas G apresentam colorao violeta, sendo que as regies assinaladas a verde no

cromossoma 4 apresentam comprimento varivel e so mais comuns na regio do centrmero. Por

conveno, a regio p delimita o brao curto do cromossoma e a regio q , o brao longo. Cada um deles

est dividido em seces de maiores dimenses (1, 2, etc.) e subseces.

Existem ainda outros tipos de bandas de cromossomas:



O bandeamento de cromossomas permite revelar a existncia de determinadas sequncias importantes,

mas tambm se o cromossoma contm eucromatina ou heterocromatina em determinadas regies.

13. Tipos de DNA

Existem trs principais tipos de molculas de DNA:

Sequncias nicas contm os genes integrados na eucromatina.

Sequncias muito repetitivas encontram-se maioritariamente no centrmero e no telmero,

existindo sob a forma de uma sequncia simples de DNA designada DNA satlite.

Sequncias moderadamente repetitivas caractersticas dos elementos de DNA mveis. Estas

sequncias terminam, geralmente, com pequenas sequncias repetidas invertidas, sendo capazes

de gerar outras pequenas sequncias no local de insero. So responsveis por rearranjos do

genoma e no podem viver fora dele, sendo designadas por parasitas moleculares e por selfish

DNA. Podem ser de dois tipos: transposes e retrotransposes.

Sequncias moderadamente repetitivas

Depois de pesquisas sucessivas acerca destes elementos mveis, puderam ser maioritariamente criadas

duas categorias: aqueles que transpem directamente o DNA e os que transpem atravs de um

intermedirio de RNA, transcrito do elemento mvel por uma RNA polimerase, para depois ser convertido

numa molcula de DNA de cadeia dupla por uma transcriptase reversa.

Os elementos mveis que transpem atravs de um intermedirio de DNA so os transposes. Os

elementos mveis que transpem para novos locais do genoma atravs de um intermedirio de RNA so os

retrotransposes porque o seu movimento anlogo ao do processo infeccioso dos retrovrus. Isto

acontece porque os retrovrus podem ser identificados como retrotransposes que evoluram genes

atravs da codificao de capas virais, permitindo, consequentemente, a sua transposo entre as clulas.



Transposes a regio central relativamente comprida, que corresponde a um elemento IS, que

codifica uma ou duas enzimas necessrias para a transposio, est bloqueada por uma sequncia

repetitiva invertida em cada extremidade. Estas sequncias so aparentemente idnticas, mas

esto orientadas em direces opostas, sendo que cada uma delas caracterstica de um elemento

IS em particular. As sequncias de 5 para 3 no so transpostas com o elemento de insero,

sendo consideradas como sequncias que vo ser duplicadas, com uma cpia em cada

extremidade, durante a insero do elemento mvel. O comprimento destas sequncias 5- 3

constante para um determinado elemento IS mas a sua sequncia depende do locl de insero e

ainda varia com cada transposio do elemento IS.

Retrotransposes podem ser divididos em vricos e no vricos:

Vricos a regio central que codifica protenas est delimitada por duas sequncias

terminais de grande comprimento, as sequncias LTR, que so especficas. Tal como outros

elementos mveis, os retrotransposes vricos apresentam sequncias de destino bastante curtas

em cada extremidade. Estes retrotransposes contribuem com cerca de 4% para a constituio do

DNA humano, sendo que a replicao feita via transcriptase reversa e DNA polimerase. Para alm

disso, nestes retrotransposes tambm intervm uma protease, uma Rnase H e uma integrase que

permite a integrao do DNA de cadeia dupla no genoma da clula hospedeira.

No vricos contrariamente aos vricos, no possuem sequncias LTR, mobilizam-se na

forma de RNA, repetem-se bastantes vezes no genoma e no esto agregados como o DNA satlite.

So de dois tipos principais:

LINEs (long interspersed elements) o comprimento da sequncia de destino 5- 3

varia de acordo com as cpias do elemento em diferentes locais do genoma. Ainda que a

sequncia L1 apresente aproximadamente 6 kb de comprimento, quantidades variveis na

extremidade esquerda esto ausentes em 90% dos locais onde este elemento mvel

encontrado. A ORF (open reading frame) mais pequena, a ORF1, codifica uma protena

RNA-binding protein e a maior, a ORF2, codifica uma protena bifuncional, que pode actuar

tanto como transcriptase reversa ou como DNA endonuclase. Este retrotransposo no

vrico forma-se a partir dos transcriptos de RNA polimerase II, sendo o mais comum, o L1



LINE. Apresenta regies ricas em A/T e se houver um elemento L1, ento ele vai assegurar a

transposio dos restantes.

SINEs (short interspersed elements) constituem aproximadamente 13% do DNA

humano, apresentando um comprimento compreendido entre 100 e 400 pb. Estes

retrotransposes no codificam protenas, mas a maior parte deles contm uma sequncia

rica em A/T na extremidade 3, tal como os LINEs. Os SINEs so transcritos pela RNA

polimerase III, a mesma que transcreve genes que codificam tRNAs e outras pequenas

categorias de RNAs. De todos os locais do genoma huamno em que existem SINEs, uma

grande quantidade so os Alu que adquirem esta designao pois contm um nico sinal de

reconhecimento para a enzima de restrio Alu-I. Os elementos Alu apresentam uma

homologia considervel com o 7SL RNA que um componente de uma partcula de

reconhecimento sinal (SRP).

Transposio mediada por DNA Transposio mediada por RNA

Elementos IS da bactria

- cerca de 50bp nas repeties invertidas a ladear a transposase;

- fazem a exciso ou copiam o DNA e a insero no local alvo;

- IS1 e IS10.

Retrotransposes vricos

- cerca de 250 a 600bp nas sequncias repetidas directas (LTR), que ladeiam a transcriptase reversa, integrase e protenas retrovricas tipo Gag;

- saltam via intermedirio de RNA feito a partir da RNA polimerase II, que se liga ao do promotor de LTR esquerdo, e inserem-se no local alvo na forma de DNA de cadeia dupla (transcriptase reversa);

- elemento Ty (levedura) e elemento copia (Drosophila).

Transposes bacterianos

- contm gene que confere resistncia a antibiticos entre os elementos IS;

- copiam o DNA e a insero do local alvo;

- Tn9.

Transposes eucariotas

- tm repeties invertidas a ladear a regio codificante que contm intres;

- exciso do DNA e insero no local alvo;

- elementos P (Drosophila) e elementos Ac e DS (milho).

Retrotransposes no vricos

- comprimento varivel com regies ricas em A/T, codificam para a transcriptase reversa;

- transcrio para RNA a partir de promotor interno, transcriptase reversa forma DNA de cadeia dupla e insero no local alvo;

- elementos F e G (Drosophila), elementos LINEs e SINEs (mamferos), sequncia Alu (humanos).


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Captulo 2 Cdigo gentico

O cdigo gentico o conjunto de regras atravs das quais a informao codificada no material

gentico (sequncias da DNA ou RNA) traduzida para protenas (sequncias de aminocidos) por clulas

vivas. Mais especificamente, o cdigo gentico define uma correspondncia entre codes e aminocidos:

cada tripleto de nucletidos numa sequncia de cido nucleico especifica apenas um aminocido.

1. Caractersticas do cdigo gentico

Degenerado O cdigo altamente degenerado na medida em que mais do que um codo pode

especificar o mesmo aminocido (excepo feita metionina e ao triptofano, que so ambos especificados

por um nico codo). Os diferentes codes que especificam o mesmo aminocido so designados por

sinnimos. Devido degenerescncia do cdigo, podem ocorrer vrias alteraes num gene (mutaes)

que no tero qualquer efeito na composio do produto gnico (mutaes silenciosas ou mutaes com o

mesmo sentido).

Universal O cdigo gentico parecia inicialmente aplicar-se a todos os genes, quer em

procariotas, quer em eucariotas. Foi, portanto, considerado um cdigo universal. Contudo, mais tarde,

foram encontradas algumas excepes no DNA mitocondrial de alguns organismos, que sero

desenvolvidas em 2.4.

No tem vrgulas O cdigo gentico lido seguido, na totalidade, desde o codo de iniciao at

um dos codes de terminao.

Codo especfico de iniciao A iniciao da traduo d-se sempre com o codo AUG e com um

tRNA iniciador que transporta o aminocido metionina (logo, todas as protenas vo ter a metionina como

primeiro aminocido).

Codes especficos de terminao Existem trs codes que no so reconhecidos por nenhum

tRNA: UAA (ochre), UAG (amber) e UGA (opal). So designados por codes sem significado, codes de

terminao ou codes de paragem, porque actuam como o ponto final no fim duma frase, isto ,

constituem parte do sinal de que a sntese da protena dever parar nesse ponto.

64 codes 61 deles codificantes, 3 deles codes de terminao

20 aminocidos e 4 nucletidos so necessrios trs grupos de quatro bases diferentes para se

constiturem os 20 aminocidos existentes.


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2. Constituio do cdigo gentico

8 famlias de codes em que os dois primeiros nucletidos so idnticos e tm o mesmo

significado e o terceiro no tem qualquer significado na especificao do aminocido.

7 pares de codes que representam o mesmo aminocido independentemente do terceiro

nucletido poder ser qualquer uma das pirimidinas.

5 pares de codes em que qualquer purina pode preencher o terceiro nucletido sem que haja

alterao do aminocido codificado.

3 codes cujo significado determinado pela presena de uma base particular na terceira

posio: AUG (met), UGG (trp) e UGA (stop).

3. Conceito de wobble

Se o emparelhamento de bases perfeito de Watson-Crick fosse exigido entre codes e anticodes, as

clulas conteriam exactamente 61 espcies diferentes de tRNA, uma para cada codo que especificasse um

aminocido.

Contudo, muitas clulas contm menos de 61 tRNAs (tm, na realidade, 32). A explicao para o

pequeno nmero assenta na capacidade de um nico anticodo de tRNA reconhecer mais do que um (mas

no necessariamente todos) codo correspondente a um dado aminocido. Este reconhecimento pode

ocorrer devido ao emparelhamento no regular entre bases na que conhecida por posio wobble

(terceira base do codo de mRNA, correspondendo primeira no seu anticodo). A primeira e segunda

bases do codo formam, normalmente, pares de bases Watson-Crick com a terceira e segunda do

anticodo correspondente, respectivamente.


20 Captulo 2 Cdigo gentico |

Particularmente importante o par das bases G-U,

que estruturalmente adapta-se to bem como o par G-C.

Portanto, um dado anticodo em tRNA com G na primeira

posio (wobble) pode corresponder aos dois codes que

tenham qualquer pirimidina na terceira posio, desde

que as outras duas correspondam.

Apesar de a adenina raramente ser encontrada na

posio wobble do anticodo, muitos tRNAs de plantas e

animais contm inosina (I), um produto desaminado da

adenina, nessa posio. Esta pode formar pares no

regulares com A, C e U. Assim, um tRNA com inosina na

posio wobble pode reconhecer os codes

correspondentes de mRNA com A, C ou U na terceira

posio (wobble). Por esta razo, tRNAs contendo inosina

so largamente utilizados na traduo de codes sinnimos que especificam um nico aminocido.

4. Cdigo gentico mitocondrial

O cdigo gentico usado nas mitocndrias diferente do cdigo padro usado em genes nucleares

procariticos e eucariticos, diferindo, at dentro dos vrios tipos de mitocndrias.

As principais alteraes so:

Metionina iniciadora codificada por AUG, AUA, AUU e AUC Metionina interna codificada por AUG e AUA Codes de terminao UAA, UAG, AGA, AGG Os tRNAs tm estruturas diferentes, nomeadamente na haste D e T Existem 22 tRNAs Todos os tRNAs tm na posio wobble um resduo de U que pode emparelhar com qualquer outra

das quatro bases passveis de estar na terceira posio no codo correspondente.


| Captulo 3 Replicao do DNA 21

Captulo 3 Replicao do DNA

A replicao do DNA genmico um processo de grande complexidade que assegura ao organismo a

passagem das suas caractersticas especficas descendncia atravs da replicao do material gentico.

Este processo est intimamente ligado ao ciclo celular e alvo de uma estrita regulao, de modo a

assegurar que cada clula se divide s o nmero de vezes necessrio ao desenvolvimento e crescimento do

organismo.

1. Dogma central da Biologia Molecular

2. Ciclo celular e replicao

O tipo mais simples de reproduo envolve a

diviso de uma clula-me em duas clulas-filhas, Isto

ocorre como parte do ciclo celular, uma srie de eventos

que preparam a clula para se dividir, seguido da prpria

diviso, chamada mitose. O ciclo da clula eucaritica

normalmente representado em 4 fases. Os cromossomas e

o DNA que contm so copiados durante a fase S (sntese).

Os cromossomas replicados separam-se durante a fase M

(mittica), com cada uma das clulas-filhas a receber uma

cpia de cada cromossoma durante a diviso da clula. As

fases M e S so separadas por duas fases G, a fase G1 e a

fase G2, durante as quais os mRNAs e as protenas so

sintetizados.


22 Captulo 3 Replicao do DNA |

3. Caractersticas da replicao

3.1. Semi-conservativa

Cada cadeia parental serve de modelo para a sntese de uma cadeia filha que lhe complementar,

processo que culmina com a obteno de duas molculas filha idnticas ao duplex inicial.

3.2. ARS

Qualquer segmento de DNA que tenha uma origem deve conseguir replicar-se. Ento, apesar de os

plasmdeos serem raros nos eucariotas, pode ser possvel constru-los a partir de manipulao in vitro. At

agora foi conseguido nas leveduras. Um fragmento transformante de alta frequncia possui uma sequncia

que confere a capacidade para replicar eficientemente nas leveduras, sequncia essa denominada ARS

(autonomously replicating sequence), que deriva de origens de replicao.

3.3. Replicao bidireccional e unidireccional

A origem pode ser usada para se iniciar replicao unidireccional ou bidireccional. O tipo de evento

determinado determinado pela quantidade (um ou dois) de forquilhas de replicao que partem da

origem. Na replicao unidireccional, uma forquilha de replicao parte da origem e continua ao longo do

DNA. Na bidireccional, duas forquilhas de replicao so formadas e continuam a partir da origem em

direco opostas.

4. Replices

Replico uma molcula de DNA ou RNA, ou uma regio no DNA ou RNA que replica a partir de uma

nica origem de replicao. o local onde se d um acto individual de replicao. O replico definido pela

sua posse no controlo de elementos necessrios replicao, e tem uma origem na qual a replicao

comea. Pode tambm ter um local de terminao, onde a replicao pra.

Para a maior parte dos cromossomas procariotas, o replico um cromossoma completo. Plasmdeos e

bacterifagos tambm so replicados como replices nicos.



Para os cromossomas eucariotas, h mltiplos replices por cromossoma.

5. Protenas necessrias replicao



6. Replicao em procariotas

6.1. Incio da replicao

Nos procariotas, a iniciao da replicao o nico evento, envolvendo um nico local no

cromossoma bacteriano, e o processo de diviso conseguido atravs do desenvolvimento de um septo

que cresce a partir da clula e a divide em dois.

Antes da replicao, o local-alvo palindromtico metilado nas adeninas de cada cadeia. A

replicao insere as bases normais nas cadeias-filhas, dando origem a DNA hemimetilado, no qual s uma

cadeia metilada. Ento, a replicao converte locais-alvo da Dam metilase de totalmente metilados para a

condio de hemimetilados.

Qual a consequncia para a replicao? A capacidade de um plasmdeo poder replicar a partir do

oriC depende do estado de metilao. Se o plasmdeo est metilado, inicia um ciclo de replicao, e quando

est hemimetilado os produtos acumulam-se, da que uma regio hemimetilada no possa ser usada para

iniciar um ciclo de replicao.



A replicao do DNA em E. coli bidirecional e originada numa nica origem do replicao (OriC). A

iniciao da replicao mediada pela DnaA, uma protena que se liga a uma regio da origem conhecida

como a DnaA box. Na E. coli, h 5 DnaA boxes, cada qual contm uma sequncia altamente conservada 5 ' -

TTATCCACA - 3 ' do consenso 9bp. A ligao da DnaA a esta regio faz com que se torne negativamente

superenrolada. Depois desta, uma regio de OriC acima das DnaA boxes separa-se. H trs destas regies, e

cada uma tem o comprimento de 13bp, e so ricas em AT (que facilita obviamente a quebra, porque

requerida menos energia para quebrar as duas ligaes do hidrognio que se formam entre nucletidos de

A e de T). Esta regio tem a sequncia 5 ' - GATCTNTTNTTTT - 3 do consenso. A quebra das DnaB boxes

requer ATP (que hidrolisado pela DnaA). Depois da quebra, a DnaA recruta um hexmero de helicases

(seis protenas de DnaB) s extremidades opostas do DNA quebrado. Este o local onde a forquilha de

replicao se formar. O recrutamento da helicase requer seis protenas de DnaC, cada uma unida a uma

subunidade da helicase. Uma vez que este complexo formado, cinco protenas adicionais de DnaA ligam-

se s cinco protenas originais de DnaA para formar cinco dmeros de DnaA. A DnaC , ento, liberta e o

complexo prepriming est completo. Para que a replicao continue, necessrio SSB para impedir que as

duas cadeias de DNA originem estruturas secundrias e se religuem, e DNA girase para aliviar o stress

(criando superenrolamentos negativos) criado pela aco da helicase de DnaB. O desenrolar do DNA pela

helicase de DnaB permite que a primase (DnaG) e a polimerase do RNA preparem cada molde do DNA de

modo que a sntese do DNA possa comear.

6.2. Protenas e enzimas requeridas



Origem de replicao activa sequncia particular de DNA na qual a replicao iniciada. A partir

deste ponto a replicao pode proceder-se unidireccionalmente ou bidireccionalmente.

Helicases II e III (5-3) e Rep (3-5) - quebram as pontes de hidrognio entre bases

complementares das duas cadeias.

Protenas que se ligam ao DNA: SSB (ligam-se cadeia de modo a que no se restabelea a dupla

hlice, enquanto as outras enzimas no esto ainda a actuar), DnaA (factor de iniciao da replicao que

promove a desnaturao do DNA no local de replicao activa) e DnaC (protena reguladora da DnaB).

Primer ou iniciador - sequncia de bases de RNA que vo iniciar a sntese.

Primases (forma de RNA polimerase que se liga DNA helicase, formando o primossoma) e

protenas associadas: DnaB (enzima que abre a forquilha de replicao durante a replicao), DnaT, DnaC,

priA, priB, priC

DNA polimerases I, II e III I, de 5 para 3 apresenta actividade de DNA polimerase, de 3para 5

apresenta actividade de exonuclease, estando envolvida na correco e reparao de erros, sintetiza nos

locais em que a RNase H removeu o primer; II est envolvida na reparao de erros de 5 para 3 e tem a

funo de exonuclease de 3 para 5; holoenzima DNA polimerase III o principal complexo enzimtico

envolvido na replicao de DNA procaritico e trabalha em conjunto com outras DNA polimerases,

reparando erros, sintetiza a partir do primer.

Ribonuclease H (RNase H) endonuclease no especfica que cataliza a quebra a ligao 3-O-P do

RNA, transformando num duplex DNA/RNA para levar a produtos 3-hidroxilados e 5-fosfatados.

Topoisomerases I e II (girase) I hidrolisa uma cadeia de cada vez, II hidrolisa duas cadeias de cada

vez. Removem (decatenizao) ou induzem (catenizao) o superenrolamento da cadeia cortando-a em

locais estratgicos.

DNA ligase liga os nucletidos de modo a formar-se uma cadeia.

6.3. Replissoma

O replissoma constitudo por duas DNA polimerase III que, por sua vez, so constitudas por trs

subunidades: uma com actividade de polimerizao, uma com capacidade de detectar erros e uma que

estimula a procura de erros.

O objectivo destas subunidades ou protenas replicar o genoma do organismo correcta e

rapidamente.

6.4. Enzima Klenow

A enzima Klenow o fragmento maior (C-terminal) da DNA polimerase I. Apresenta actividade de

polimerase 5-3 e actividade de exonuclease 3-5, removendo nucletidos pr-codificados.



usada em laboratrio para sntese de DNA in vitro por um processo designado por nick translation

(com incorporao de nucletidos radioactivos).

6.5. Sntese do DNA

Devido ao antiparalelismo da cadeia de DNA parental, das duas cadeias filhas a sintetizar, s um a

poder ser feita de modo contnuo na direco 5 para 3 a partir da regio da cadeia principal

imediatamente adjacente origem de replicao esta ser a cadeia avanada (cadeia contnua ou

leading).

A outra cadeia filha no poder ser sintetizada de

forma contnua, pois estar condicionada pelo facto da

DNA polimerase ter um a nica direco de sntese (de 5

para 3). Assim, esta cadeia atrasada (cadeia descontnua

ou lagging) ir ser sintetizada na direco oposta ao avano

da forquilha de replicao, atravs da sntese e posterior

ligao de mltiplos segmentos de DNA, todos iniciados por

um pequeno fragmento de RNA iniciador colocado pela

primase os fragmentos de Okazaki.

O processo de juno de dois fragmentos de Okazaki implica a remoo do RNA iniciador existente

no fragmento de Okazaki a partir da sua extremidade 5 por uma enzima do tipo RNAse com actividade

exonuclesica 5-3.

Ao mesmo tempo, para preencher esse espao, so adicionados novos nucletidos na extremidade

3 do fragmento de DNA que lhe fica adjacente, com a ajuda de uma das DNA polimerases que constituem

o complexo de replicao.

Os dois fragmentos de DNA so finalmente ligados um ao outro pela DNA ligase, que estabelece a

ligao fosfodiester final entre o grupo 3-OH do ltimo nucletido do primeiro fragmento de Okazaki e o

alfa-P da extremidade 5 do fragmento de Okazaki adjacente que acabou de ser sintetizado.

De modo a aliviar a tenso de toro das cadeias durante o seu desenrolar pela helicase, as

topoisomerases vo igualmente actuar neste processo.



7. Replicao em eucariotas

7.1. Protenas e enzimas requeridas

Helicases - quebram as pontes de hidrognio entre bases complementares das 2 cadeias.

Protenas que reconhecem os locais de origem e que fazem parte do complexo de pr-replicao

Protenas que se ligam cadeia simples de DNA (RPA replication protein A)

Primases - sintetizam uma pequena molcula de RNA (primer).

Exonuclease MF1 remove o primer.

DNA polimerases eucariotas

7.2. DNA polimerases

Localizao Nucl. Nucl. Mit. Nucl. Nucl.

Replicao Sim no sim sim (no)3

Reparao No sim no no sim

Funes:

5-3 polimerase sim sim sim sim Sim

3-5 exonuclease No No sim sim sim

5-3 exonuclease1

No No No No No

Primase sim No No No No

Associada com PCNA2 No No No Sim No

Prossessivity Baixa Alta

Sntese de cadeias Lagging

Leading

Leading

Lagging

1 actividade presente nas protenas associadas

2 Proliferanting Cell Nuclear Antigen

3 envolvida na reparao relacionada com a transcrio



7.3. Protenas da forquilha de replicao em humanos

Protenas SSB (single stranded binding proteins) ligam-se cadeia de modo a que no se

restabelea a dupla hlice, enquanto as outras enzimas no esto ainda a actuar.

PCNA desloca a DNA polimerase alfa e permite a ligao da DNA polimerase delta nas duas

cadeias.

RFC (replication factor C) estimula a actividade de DNA polimerase alfa

7.4. Incio da replicao

ORC (origin-recognition complex) determina onde ocorre o incio de replicao. Requer as protenas

ORC2-6 e ORC1.

1 Durante o incio da fase G1, os factores de

iniciao de replicao desfoforilados fazem

com que o ORC se ligue a uma origem de

replicao para gerar um complexo de pr-

replicao.

2 na fase S, as CDKs da fase S complexam e o

DDK fosforila componentes do complexo de

pr-replicao?

3 Isto faz com que o Cdc45 se ligue,

activao das helicases Mcm, que desenrolam

as cadeias de DNA e libertao de Cdc6

fosforilado e factores de iniciao Ctd1. RPA

liga-se s cadeias simples resultantes.

4 Um complexo de DNA polimerase Pol e -

primase inicia a sntese das cadeias-filhas.

5 DNA polymerase e os seus factores

acessrios (PCNA e Rfc) elongam as cadeias filhas iniciadas pela Pol--primase. ORC liga-se sequncia de

origem na cadeia dupla de DNA resultante, mas os factores de iniciao fosforilados no podem montar um

complexo de pr-replicao no local. Complexos da ciclina CDK do tipo B mantm os factores de iniciao

num estado fosforilado durante a fase S e G2 e no incio da anafase. Estes factores no podem iniciar novos

complexos at que as ciclinas sejam degradadas.



7.5. Telmeros e telomerase

Telmeros:

Parte terminal dos cromossomas

Mantm a estabilidade dos cromossomas

Repeties em srie de 5-26 bps

O tamanho varia muito, mas controlado de forma

especfica

Implicados no envelhecimento, cancro e variao antignica

Telomerase:

necessria para a manuteno do tamanho dos telmeros da linha germinativa

Actividade de transcriptase reversa

Clulas somticas no tm telomerase

Clilas germinativas e embries tm telomerase

Stem cells e clulas cancergenas tm telomerase, o que pode explicar a capacidade de diviso

contnua

8. Defeitos na replicao e reparao do DNA

Esto todas associadas a uma grande frequncia de mutaes gnicas e cromossmicas, a maior parte

est tambm associada a predisposio para cancro (especialmente leucemia).

Sndrome de Werner - provocado por mutaes na DNA polimerase

Ataxia telangiectasia - maior risco de raios-X, associado ao aumento de cancro da mama em

grvidas

Sndrome de Cockayne - provocado por um defeito na reparao de DNA associada transcrio,

causa sensibilidade luz solar, mas no predispe ao cancro

Sndrome de Bloom - provocado por mutaes no gene da helicase, induz um maior risco de raios-

X e uma maior sensibilidade luz solar

Pigmentose Xeroderma - provocado por mutaes em genes relacionados com a reparao de

cortes de nucletidos, estando associada a um grande aumento de cancro induzido pela luz solar e

com outros tipos de cancro, como o melanoma.

Anemia Fanconi causa sensibilidade luz solar e maior risco de raios-X



9. Tipos de replicao

9.1. Replicao tipo olho

Ocorre na bactria

Ao M.E. forma uma estrutura tipo

9.2. Replicao em crculos rolantes

Ocorre no rDNA de ocitos de Xenopus e em alguns bacterifagos

Corte na origem de replicao numa das cadeias do DNA

A cadeia deslocada serve de molde para a sntese da cadeia complementar atravs de

fragmentos de Okazaki

9.3. Replicao atravs de formas replicativas

Ocorre em certos vrus de cadeia de DNA simples (M13, 174)

Cadeia de DNA (+) serve de molde para sintetizar a cadeia de DNA (-) DNA de cadeia

dupla (RF I)

Protena A (codificada pelo genoma do vrus) corta o DNA no local de origem de replicao

RF II

Protena Rep = helicase


32 Captulo 4 Transcrio |

9.4. Replicao tipo D-loop

Ocorre na mitocndria

H dois locais de origem de replicao

No h formao de fragmentos de Okazaki

Sntese comea no local de origem da cadeia H

Sntese na cadeia L comea quando cerca de 2/3 da cadeia H j replicou

Alteraes ou mutaes neste tipo de replicao conduzem a citopatias mitocondriais.


| Captulo 4 Transcrio 33

Captulo 4 Transcrio

1. Sntese do RNA

A transcrio comea com a abertura e despiralizao de uma pequena poro da dupla hlice de DNA,

para expr as bases em cada cadeia de DNA. Uma das duas cadeias da dupla hlice de DNA age, ento,

como um molde para a sntese de uma molcula de RNA. Tal como no processo de replicao do DNA, a

sequncia de nucletidos da cadeia de RNA determinada pela complementaridade do emparelhamento

de bases entre os nucletidos a serem incorporados e o DNA-molde.

A cadeia de RNA produzida por transcrio o transcrito , portanto, aumentanda num nucletido

por processo e possui uma sequncia de nucletidos exactamente complementar cadeia de DNA utilizada

como molde.

1.1. Diferenas entre DNA e RNA

O primeiro passo executado pela clula para ler a informao necessria das suas instrues

genticas a cpia de uma parcela especfica da sequncia de

nucletidos de DNA um gene sob a forma de uma sequncia de

nucletidos de RNA. A informao na forma de RNA, embora copiada

de uma forma quimicamente distinta, tambm escrita essencialmente

na mesma linguagem do DNA, ou seja, a linguagem de uma sequncia

de nucletidos, de onde deriva a designao do processo de

transcrio.

Tal como o DNA, o RNA um polmero linear composto por

quatro tipos diferentes de subunidades nucleotdicas unidas entre si

por uma ligao fosfodister. O RNA difere quimicamente do DNA em

dois aspectos principais:

Os nucletidos do RNA so ribonucletidos, isto , contm o

acar ribose em vez de desoxirribose;

Embora, assim como o DNA, o RNA contenha as bases adenina,

guanina e citosina, ele contm a base uracilo (U), em vez da timina,

que ocorre no DNA. Uma vez que o uracilo, tal como a timina,

pode formar pares com estabelecimento de pontes de hidrognio

com a adenina, as propriedades de complementaridade por

emparelhamento de bases descritas para o DNA anteriormente, tambm se aplicam ao RNA. No

entanto, no raro encontrar outros tipos de emparelhamento de bases no RNA, como por exemplo a

guanina a emparelhar com o uracilo, ocasionalmente.



Apesar destas pequenas diferenas qumicas, o DNA e o RNA diferem drasticamente nas suas

estruturas como um todo. Enquanto o DNA ocorre sempre nas clulas como uma cadeia de dupla hlice, o

RNA apresenta-se com uma cadeia simples. Portanto, as cadeias de RNA podem dobrar-se sob diversas

formas, do mesmo modo que uma cadeia de polipptidos pode dobrar-se, resultando na conformao final

de uma protena.

1.2. Enzimas que realizam transcrio

As enzimas que realizam a transcrio so denominadas de RNA polimerases. Assim como a DNA

polimerase catalisa a replicao do DNA, as RNA polimerases catalisam a formao de pontes fosfodister

que ligam os nucletidos entre si para formar uma cadeia linear.

A libertao quase imediata da cadeia de RNA do DNA, conforme a primeira est a ser sintetizada,

significa que muitas cpias de RNA podem ser produzidas a partir do mesmo gene num perodo de tempo

relativamente pequeno; a sntese de molculas de RNA adicionais pode ser iniciada antes que a do primeiro

RNA tenha terminado. Quando vrias molculas de RNA polimerase usam a mesma regio como molde,

deixando um pequeno intervalo entre si, cada uma sintetizando aproximadamente 20 nucletidos por

segundo, podem ser sintetizados mais de mil transcritos numa hora, a partir de um nico gene.

Apesar de a RNA poliermase catalisar essencialmente a mesma reaco qumica que a DNA

polimerase, existem algumas diferenas importantes entre estas duas enzimas:

A RNA polimerase catalisa a ligao de ribonucletidos e no de desoxirribonucletidos como a

DNA polimerase.

Ao contrrio das DNA polimerases envolvidas na replicao de DNA, as RNA polimerases podem

comear a sintetizar uma cadeia de RNA sem um iniciador. Isto pode acontecer porque a

transcrio no precisa de ser to precisa quanto a replicao.

O RNA no mantm permanentemente a informao gentica nas clulas. As RNA polimerases

realizam aproximadamente um erro em cada 104 nucletidos copiados no RNA, enquanto que a

DNA polimerase comete um em cada 107 nucletidos.

As consequncias de um erro na transcrio do RNA so muito menos significativas do que aquelas

que ocorrem na replicao do DNA.



1.3. Tipos de RNA

A maioria dos genes transportados no DNA das clulas especifica a sequncia de aminocidos de

protenas:

RNA mensageiro (mRNA) molculas de RNA que so copiadas a partir desses genes de DNA que

especificam a sequncia de aminocidos das protenas.

RNA de transferncia (tRNA) formam os adaptadores que seleccionam aminocidos e os colocam

no local adequado dos ribossomas para serem incorporados em protenas.

RNA ribossmico (rRNA) formam o cerne dos ribossomas.

RNA nuclear (snRNA) direccionam o splicing do pr-RNA para formar o mRNA.

RNA nucleolar (snoRNA) utilizados para processar e modificar quimicamente os rRNAs.

Outros RNA no codificantes actuam em diversos processos celulares, incluindo a sntese de

telmeros, a inactivao do cromossoma X e o transporte de protenas para o retculo endoplasmtico.

1.4. Hibridizao

Quando uma soluo aquosa de DNA aquecida at 100C ou exposta a um pH muito alto (pH

13), a complementaridade de bases, que normalmente mantm as duas cadeias da dupla hlice unidas,

rompida, e a dupla hlice dissocia-se rapidamente em duas cadeias simples. Este processo, designado de

desnaturao de DNA, foi considerado irreversvel por vrios anos. Em 1961, entretanto, foi descoberto

que cadeias simples complementares de DNA reconstituam prontamente duplas hlices atravs de um

processo designado hibridizao ou renaturao de RNA, se fossem mantidas por um perodo prolongado

de tempo a 65 C. Podem ocorrer reaces similares de hibridizao entre quaisquer duas fitas simples de

cadeias de cidos nucleicos (DNA/DNA, RNA/RNA ou DNA/RNA), desde que tenham sequncias de

nucletidos complementares.

Hibridizao DNA-RNA cada transcrito de RNA complementar para uma nica cadeia da

molcula parental de DNA. Cada uma das cadeias simples de DNA transcrita de forma assimtrica,

ou seja, apenas uma cadeia transcrita num local em particular. Desta forma, a direco de

transcrio diferente e oposta nas duas cadeias simples de DNA.



Hibridizao RNA-RNA processo maioritariamente utilizado em mecansimos de terapia gnica.

Depois de ocorrer a transcrio da molcula de DNA e se ter formado a molcula de mRNA

subsequente, este colocado em conjunto com uma molcula de RNA anti-sense. Com isto, a

molcula de RNA final com as duas cadeias sense e anti-sense no vai ser traduzida e deixa de

originar protenas que realizam processos celulares normais.

2. Transcrio nos procariotas

2.1. RNA polimerase bacteriana

Nas clulas procariotas, a transcrio dos RNA celulares, quer sejam ribossomais (rRNA),

mensageiros (mRNA), de transferncia (tRNA) ou outros, processa-se sob catlise de uma nica RNA

polimerase. A RNA polimerase bacteriana apresenta uma estrutura oligomrica, em que cada uma das

subunidades constituintes confere propriedades bioqumicas especficas, inerentes complexidade da

funo desempenhada pela enzima.

A holoenzima da E. Coli formada por cinco subunidades, constitudas por entidades proteicas

diferentes, designadas , , e , que na enzima activa se apresentam organizadas num complexo

constitudo por duas cadeias , uma cadeia , uma cadeia e uma cadeia . A core enzyme, de estrutura

2, tem a propriedade de catalizar a elongao das cadeias de RNA, mas depende da subunidade para

poder iniciar a transcrio. A iniciao da transcrio condicionada pela ligao do complexo aos stios

especficos do DNA, que correspondem ao incio de cada gene, inscrito no genoma celular sem solues de

continuidade fsica.

Na RNA polimerase da E. Coli:

A cadeia responsvel pela fixao dos nuclesidos trifosfato da ribose, precursores do RNA,

propriedade experimentalmente demonstrada mediante utilizao de anlogos radioactivos destes

substratos.

A cadeia apresenta carcter bsico acentuado, e determina a ligaao do complexo enzimtico ao

DNA molde, que como se sabe tem carcter cido.

O factor determina o reconhecimento da regio promotora de cada gene, sendo portanto

essencial iniciao correcta da transcrio dos genes bacterianos. A ligao do factor modifica a

conformao da core enzyme, conferindo-lhe a capacidade de reconhecer o DNA quele nvel especfico. O

factor da RNA polimerase DNA dependente que actua normalmente na transcrio de todos os genes

bacterianos designado por 70, devido sua massa molecular de 70 kDa.



A subunidade intervm tambm no reconhecimento dos promotores, como indica o facto de

alteraes estruturais desta subunidade resultar na diminuio da afinidade da holoenzima para os

elementos promotores do DNA.

2.2. Regio promotora

Os elementos promotores da transcrio ou cis-acting elements de cada gene activo, que

correspondem ao stio de ligao da RNA polimerase ao DNA genmico da clula, podem ser identificados

pelo mtodo de footprinting.

A anlise de um nmero elevado de genes procariticos, e a caracterizao dos respectivos

promotores revelou a existncia de motivos estruturais comuns, localizados a montante do stio de

iniciao da transcrio, que foram designados consensus, elementos cannicos ou elementos de

consenso. Foram encontrados elementos constitudos por seis pares de bases, com predomnio dos

resduos A e T, e por isso designados por TATA box. Estes elementos promotores, tambm conhecidos por

sequncia de Pribnow, situam-se de modo geral na posio -10 dos genes bacterianos. Um outro elemento

de consenso designado por sequncia de reconhecimento, situando-se na posio -35.

Constata-se que os promotores fortes de E. Coli, mais eficazes por permitirem uma frequncia

elevada da transcrio do gene adjacente, so constitudos por sequncias de estrutura muito prximas da

dos elementos cannicos. Em contrapartida, os promotores fracos, que determinam a iniciao da

transcrio de um gene a taxas muito inferiores, apresentam substituies de nucletidos a nvel das

sequncias localizadas a -10 e a -35.

Este facto demonstra-se por experincias de mutagnese dirigida, em que so introduzidas, in

vitro, modificaes a nvel de uma ou de vrias bases dos elementos de consenso da regio promotora,

quer na sequncia -10, quer na sequncia -35. A substituio de uma nica base pode produzir uma baixa

importante, ou mesmo uma perda completa, da actividade promotora do elemento.



2.3. Footprinting

O ensaio de footprinting consiste em submeter o fragmento de DNA, que contm a regio

promotora do gene, - previamente marcado a nvel de uma extremidade de uma das cadeias e ligado

enzima , a uma hidrlise controlada. Da

resulta o corte de todas as ligaes

fosfodister acessveis, logo que exclui os

segmentos de DNA que se encontram

protegidos pela ligao RNA polimerase.

A ausncia de cortes nesta regio

traduz-se na ausncia de bandas

correspondentes aos nucletidos do

segmento no hidrolisado, na

autorradiografia, definindo desta forma a

marca da protena sobre o DNA. Os

resultados dos ensaios de footprinting, a

par da sequenciao dos segmentos de

DNA, permitem determinar a posio e a

estrutura nucleotdica do stio de fixao da

protena ao DNA. Estes mtodos

experimentais permitem tambm

demonstrar as diferenas entre o papel de

cada uma das duas cadeias de DNA no

processo, em que apenas uma dela se

encontra protegida pela polimerase, facto

perfeitamente compatvel com a assimetria

da transcrio do DNA.

Atravs desta tcnica, foi possvel

observar-se que o stio de fixao

protena/DNA corresponde aproximadamente regio entre -50 e +20, facto ainda comprovado atravs de

estudos de proteco do DNA, que delimita a regio promotora dos genes bacterianos, ao segmento

delimitado pelas posies -44 a +20.



1 amostras incubadas separadamente, na presena e na ausncia de RNA polimerase. (ou outra protena

de ligao ao DNA).

2 hidrlise pela DNase, em condies controladas, de modo a assegurar o corte sequencial da cadeia. O

segmento de DNA que se encontra ligado protena protegido da degradao pela nuclease.

3 desnaturao dos complexos DNA/protena.

4 anlise dos fragmentos de DNA produzidos em 2, por electroforese seguida de autorradiografia. No gel

de sequenciao, observa-se a ausncia do segmento de DNA protegido pela protena, na amostra (pista da

esquerda). A respectiva sequncia nucleotdica lida na pista da direita.

2.4. Iniciao da transcrio

A iniciao da transcrio implica a identificao da regio promotora do DNA molde de cadeia

dupla, e a formao do complexo de pr-iniciao com a polimerase.

o factor que modifica significativamente a afinidade da RNA polimerase para o DNA,

reconhecendo especificamente os promotores dos genes potencialmente activos para a transcrio. Nas

bactrias existe o factor major que designado vegetativo, de que so exemplo o 70 de E. Coli ou o

43 de B. Subtilis, a par de uma srie de outros factores especializados. As subunidades conferem

holoenzima a propriedade de reconhecer os stios de ligao a nvel do incio dos genes, aos quais se fixam

com maior ou menor afinidade, na dependncia da estrutura nucleotdica dos elementos promotores e da

identidade do factor em presena.

A fixao da RNA polimerase multimrica rpida, pois que a deteno dos promotores dos

diferentes genes se d sem que seja necessria a abertura da dupla hlice do DNA. Subsequentemente, e

devido desnaturao pontual induzida no DNA, a enzima ligada desloca-se ao longo do DNA molde, sem

ter que se fixar e libertar a cada passo. O nucletido que marca o stio de iniciao da transcrio

corresponde posio +1 do gene respectivo, designando-se os nucletidos situados imediatamente a

montante (5) pelos nmeros -1, -2, etc., e os resduos a jusante (3) no DNA do locus, nucletidos +2, +3,

etc.



2.5. Elongao da transcrio

O complexo binrio constitudo pela holoenzima ligada ao promotor do gene converte-se

rapidamente aps formao da primeira ligao fosfodister, no complexo ternrio DNA-enzima-cadeia

nascente de RNA. Seguidamente, o factor liberta-se do complexo, e a core enzyme que prossegue a

polimerizao e a elongao da cadeia de RNA nascente. A libertao do factor faz diminuir a estabilidade

do complexo de iniciao, ao mesmo tempo que permite o deslizamento da core enzyme sobre a cadeia

molde do DNA, atravs de um mecanismo em que a regio aberta da dupla hlice acompanha esta

deslocao.

Durante este processo, a enzima ocupa um segmento de cerca de 70 pares de bases de DNA, mas

apenas numa extenso de 17 pares de bases se d a desnaturao pontual da hlice. Por outro lado, o

hbrido corresponde ao segmento da cadeia molde de DNA e ao RNA transcrito tem apenas existncia

transitria, sendo limitado apenas a uma extenso de cerca de 12 pares de bases. Aps a passagem da

enzima, a cadeia de RNA nascente destacada da sua ligao cadeia molde, dando lugar imediata

reconstituio da dupla hlice do DNA, na sua forma nativa.

O complexo constitudo pela RNA polimerase, pelo segmento de DNA contendo a pequena regio

em que a dupla hlice se encontra desnaturada, e pela cadeia nascente de RNA designado transcription

bubble. Em E. Coli, a transcrio um processo muito rpido, que para a sntese dos mRNA, a 37 C, ocorre

velocidade calculada de 40 a 50 nucletidos polimerizados por segundo.

2.6. Terminao da transcrio

2.6.1. Terminao dependente do

factor

O factor constitudo por uma protena hexamrica.

Quando a terminao dependente de si, ele liga-se sem que

seja necessria a formao de quaisquer estruturas secundrias

da cadeia nascente, e induz ruptura da ligao RNA/DNA molde

complementar. O factor dotado de actividade ATPsica RNA-

dependente, pelo que se desloca de forma activa sobre a cadeia

do RNA nascente, em direco extremidade 3, seguindo de

perto o percurso da RNA polimerase. Quando, devido a uma

pausa ou atraso da transcrio, a RNA polimerase alcanada

pelo factor , o segmento de RNA ainda hibridado com o DNA

molde dissocia-se, com libertao da RNA polimerase da sua

anterior ligao ao DNA.



Contrariamente aos sinais de iniciao presentes no promotor dos genes bacterianos, os sinais de

terminao se encontram no prprio RNA em vias de transcrio e no directamente no DNA molde, quer

sejam do tipo dependente ou independente.

2.6.2. Terminao independente do factor

A terminao da sntese das molculas de RNA nos

procariotas muitas vezes determinada pela presena de

elementos de estrutura palindrnica no DNA. o caso de uma

sequncia de nucletidos, rica em G-C, que se encontra numa

das cadeias de DNA, e que aparece repetida em posio

invertida na regio imediatamente adjacente da cadeia

complementar.

Foi observado que estes elementos palindrnicos so

seguidos de uma regio de DNA constituda maioritariamente

por A e T.

A sequncia palindrmica vai dar origem a que a

cadeia de RNA em formao adquira uma estrutura secundria

em gancho, resultante do emparelhamento dos dois segmentos

de estrutura complementar e antiparalela, perante a qual a RNA

polimerase sofre atraso ou mesmo paragem. O hbrido DNA

molde RNA nascente imediatamente a jusante deste elemento

estrutural menos estvel por ser formado por

emparelhamentos dA-rU, da resultando a ruptura da ligao do

RNA nascente ao DNA molde. O imediato re-emparelhamento

das duas cadeias complementares do DNA nativo leva libertao da core enzyme, at a ligado ao molde,

e da molcula do RNA transcrito.

3. Transcrio nos eucariotas

3.1. RNA polimerases

Nos ncleos das clulas eucariotas, encontram-se trs tipos de RNA polimerases DNA

dependentes:

RNA polimerase I responsvel pela sntese de cerca de 80% da totalidade do RNA celular, localiza-

se no nuclolo, transcrevendo os genes dos RNA ribossomais, que conduzem produo dos rRNA

18S; 5.8S e 28S. Esta polimerase insensvel inibio pela -amanitina.



RNA polimerase II responsvel pela sntese de cerca de 2% do RNA celular, localiza-se no

nucleoplasma, e catalisa a sntese dos produtos primrios precursores dos RNA mensageiros, que

do origem ao hnRNA. A RNA polimerase II inibida pela -amanitina a baixa concentrao.

RNA polimerase III responsvel pela sntese de cerca de 20% dos RNA celulares, est igualmente

localizada no nucleoplasma, e catalisa a sntese dos RNA de transferncia tRNA e outros pequenos

RNA, que incluem o rRNA 5S, o snRNA ou small nuclear RNA e snoRNA ou small nucleolar RNA. A

RNA polimerase III animal sensvel inibio pela -amanitina a concentraes relativamente

elevadas, mas a RNA polimerase III de levedura e a de insecto so insensveis a este inibidor.

3.2. Regio promotora

Os primeiros genes a serem sequenciados em transcries in vitro foram genes virais e genes

codificantes de protenas que so activamente transcritos tanto em alturas particulares do ciclo celular

como em tipos especficos de clulas diferenciadas.

Em todos estes genes, uma sequncia altamente conservada designada TATA box encontrada

aproximadamente 25 a 35 pares de bases acima do local de iniciao.

Para alm da TATA box existem outras regies promotoras como a CAAT box, que contm uma

citosina na posio -1 e uma timina na posio +1, com duas adeninas pelo meio, e que se encontra cerca

de 75 a 80 pares de bases acima do local de iniciao.

Por fim, existem outros genes que no contm TATA box nem CAAT box, apresentando uma

sequncia rica em C e G com aproximadamente 40 nucletidos, situada 100 pares de bases acima do local

de iniciao. O dinucletido CG estatisticamente menos representativo em DNA, sendo considerado

como uma regio genmica de DNA que indica que existe uma regio de iniciao da transcrio.



3.3. Enhancers

A transcrio de vrios genes eucariotas pode ser estimulada por elementos de controlo

localizados vrios milhares de pares de bases acima do local de iniciao. Os mais encontrados so

designados por enhancers e raramente so encontrados fora de genomas eucariotas.

Os enhancers contm um conjunto de elementos proximamente unidos entre si que condicionam

a ligao de diversos factores de transcrio que estejam ligados a alguns milhares de pares de bases de

distncia. Desta forma, o DNA pode sofrer um rearranjo de tal forma que os factores de transcrio na

regio do promotor e do enhancer interajam para formar um complexo proteico de grandes dimenses.

3.4. Iniciao da transcrio

3.4.1. Complexo de iniciao com promotores contendo TATA box

A primeira enzima que se liga no vai ser a RNA polimerase, porque vai ser puxada para a

regio promotora por outros factores de transcrio q uese ligam anteriormente. Em conjunto com uma

das RNA polimerases I, II ou III, h uma protena que reconhece e que se liga TATA box, a TBP que

tambm necessria para iniciar o complexo de transcrio. Em todos os casos, consoante a RNA

polimerase em causa, ela vai estar presente para depois chamar outros factores adicionais, como o SL1 no

caso da RNA polimerase I, TFIIB na RNA polimerase II e TFIIIB na RNA polimerase III.



3.4.2. Complexo de iniciao da RNA

polimerase I

Os elementos reguladores que comandam a

iniciao com a RNA polimerase I esto localizados

relativamente perto do local de iniciao da transcrio. Um

core element estende-se sobre o local de iniciao desde -40 a

+5, sendo essencial para a transcrio. Um elemento de avano

na cadeia estende-se tambm desde -155 a -60, estimulando a

transcrio in vitro pela RNA polimerase I.

A formao de um complexo de iniciao

totalmente activo com a RNA polimerase I comea com a

ligao de um factor multimrico de activao (UAF). Duas das

seis subunidades que compem o UAF so histonas que

provavelmente participam na ligao do DNA. Seguidamente,

um elemento trimrico liga-se ao elemento central com a TBP,

que cria contacto tanto com o UAF como com o factor central.

Finalmente, um complexo pr-formado com RNA polimerase I e

Rrn3p associa-se com protenas de ligao, posicionando a RNA

polimerase I junto aos locais de iniciao. Em clulas humanas,

o TBP estavelmente ligado a outros trs polipptidos, formando o factor de iniciao SL1 que liga o

promotor central e funcionalmente equivalente ao TBP.

3.4.3. Complexo de iniciao da RNA polimerase II

Para iniciar a transcrio, a RNA polimerase II necessita de vrios factores gerais de

transcrio (denominados TFIIA, TFIIB, e assim por diante). O promotor contm uma sequncia de DNA

denominada de TATA box, a qual est localizada a 25 nucletidos do stio no qual a transcrio iniciada. A

TATA box reconhecida e ligada pelo factor de transcrio TFIID, o qual permite a ligao adjacente do

TFIIB. Os restantes factores gerais de transcrio, assim como a prpria RNA polimerase, associam-se junto

ao promotor. Seguidamente, o TFIIH usa ATP para separar a dupla hlice de DNA, no ponto inicial de

transcrio, permitindo que a transcrio se inicie. O TFIIH tambm fosforila a RNA polimerase II,

modificando a sua conformao, de tal modo que libertada dos factores gerais de transcrio e pode

iniciar a fase de elongao da transcrio.



3.4.4. Complexo de iniciao da RNA polimerase III

Ao contrrio dos genes codificantes de protenas e genes de pr-mRNA, as regies

promotoras do tRNA e do 5S-RNA contradizem inteiramente a sequncia transcrita. Dois elementos

promotores internos, designados por A-box e B-box, esto presentes em todos os genes do tRNA. Estas

sequncias altamente conservadas no s funcionam como promotores como tambm codificam duas

pores invariantes de tRNA eucariota que so necessrias para a sntese proteica. Nos genes do 5S-RNA,

apenas existe uma sequncia promotora interna, a C-box.

Existem trs factores de transcrio que so necessrios para a RNA polimerase III iniciar a

transcrio do tRNA e do 5S-RNA in vitro. Dois factores multimricos, TFIIIC e TFIIIB participam na iniciao

do promotor do tRNA e do 5S-RNA; um terceiro factor, o TFIIIA necessrio para a iniciao dos

promotores do 5S-RNA exclusivamente. Tal como acontecia nos complexos de iniciao da RNA polimerase



I e II, os factores de transcrio da RNA polimerase III ligam-se ao promotor do DNA em sequncias

especficas.

A metade terminal-N de uma subunidade do TFIIIB, denominado BRF, semelhante

sequencialmente ao TFIIB (um factor de transcrio da RNA polimerase II). Esta semelhana sugere que o

BRF e o TFIIB apresentem tambm funo semelhante na iniciao, nomeadamente, para direccionar a

polimerase para o local de iniciao correcto. Assim que o TFIIIB esteja ligado a um gene de tRNA ou 5S-

RNA, a RNA polimerase III pode ligar-se e iniciar o processo de transcrio na presena de trifosfatos

ribonucleosdicos.

A subunidade BRF do TFIIIB interage especificamente com uma das subunidades da

polimerase, tendo em conta a iniciao para esta RNA polimerase especfica.

Outra das trs subunidades que constituem o TFIIIB o TBP que surge aqui como

componente principal dos factores de transcrio para as 3 RNA polimerases eucariticas.

3.5. Terminao da transcrio

Nos eucariotas, os mecanismos para a terminao da transcrio diferem para cada uma das trs

RNA polimerases. A transcrio dos genes de pr-RNA pela RNA polimerase I terminada por um

mecanismo que requer um factor de terminao especfico da polimerase. Esta protena de ligao do DNA

liga-se a uma sequncia especfica no fim da unidade de transcrio. Uma terminao eficiente necessita

que o factor de terminao se ligue ao DNA modelo na orientao correcta. A polimerase III pura termina

depois de polimerizar uma srie de resduos de U. O hdrido desoxi(A)-ribo(U)-DNA-RNA, que resulta

quando uma extenso de Us sintetizada, particularmente instvel comparado com todas as outras

sequncias de pares de bases. A facilidade com que este hdrido pode ser fundido provavelmente contribui

para o mecanismo de terminao da RNA polimerase III.

Na maioria dos genes que codificam protenas de transcritos nos mamferos pela polimerase II,

assim que a polimerase transcreve cerca de cinquenta bases, a elongao progressiva altamente

susceptvel de ser processada e no termina at que uma sequncia que leve ao corte e segmentao do

RNA na sequncia que forma o fim da 3 do mRNA codificado. A RNA polimerase II pode ento terminar

num elevado nmero de locais localizados a mais de 0,5 2 kb alm deste local de adio poly(A).


| Captulo 5 RNA e processamento 47

Experincia bioqumicas e de imunoprecipitao de cromatina sugerem que o complexo proteico que corta

e poliadenila o mRNA nascente transcreve em sequncias especficas associadas a domnios de terminais

carboxlicos fosforilados (CTD) de RNA polimerase II a seguir iniciao. Este complexo de

corte/poliadenilao pode suprimir a terminao pela RNA polimerase II at que a sequncia que assinala o

corte e poliadenilao seja transcrita pela polimerase.

Enquanto que alguma terminao da transcrio no regulada para a maior parte dos genes, para

alguns especficos, uma escolha feita entre elongao e terminao ou pausa entre algumas dezenas de

bases do local do incio da transcrio. Esta escolha pode ser regulada; contudo, a expresso da protena

codificada controlada no s pela iniciao da transcrio, mas tambm pelo controlo antecipado na

elongao da unidade de transcrio.

4. Inibidores da transcrio

Rifamicina holoenzima que actua na transcrio dos procariotas que inibe a iniciao.

-Amanitina enzima que actua na transcrio dos eucariotas. Nunca inibe a RNA polimerase I,

inibe a polimerase II e apenas inibe a RNA polimerase III em algumas espcies.

Actinomicina D primariamente utilizada atravs da sua ligao ao DNA no complexo de

iniciao da transcrio, inibindo a elongao atravs da RNA polimerase.

Streptolidigina enzima central que actua sobre a transcrio dos procariotas, inibindo a sua

elongao.


48 Captulo 5 RNA e processamento |

Captulo 5 RNA e processamento

1. RNA mensageiro procariota

1.1. Caractersticas do mRNA

Policistrnico os mRNAs procariotas podem variar relativamente ao nmero de protenas que codificam.

Alguns mRNAs representam apenas um nico gene, sendo monocistrnicos, enquanto que outros (a

maioria) transportam sequncias codificantes para vrias protenas, ou seja, so policistrnicos. Nestes

casos, uma molcula de mRNA transcrita a partir de um grupo de genes adjacentes.

Colinear atraves da comparaao da sequencia nucleotidica de um gene com a sequencia de aminoacidos

de uma proteina, pode determinar-se directamente se o gene e a proteina so colineares. Assim, isto

acontece quando a sequencia de nucleotidos no gene corresponde exactamente sequncia de a.a na

proteina. Ou seja, o rna formado a partir do dna igual.

Cistro o teste de complementao usado pra determinar se duas mutaes existem no mesmo gene

ou em genes diferentes. Consiste na comparao da localizao das duas mutaes, sendo que seelas

existem no mesmo gene, ir existir uma diferena nos fentipos das configuraes cis e trans. Assim, a

configurao trans mutante porque cada alelo transporta uma mutao, mas a configurao cis apresenta

umalelo com duas mutaes e outro alello sem mutao. Desta forma, o mrna um cistro pois a

unidade definida pelo teste de complementao.

Polaridade o factor rho segue um percurso que estabelece uma relao entre a trancrio e a traduo,

que explica um fenmeno de ligao entre os dois processos. Nalguns casos, uma mutao nonsense num

gene de uma unidade de transcrio impede a expresso dos genes subsequentes nessa mesma unidade. A

principal causadesta caracterstica a falta de mrna correspondente s partes mais distantes da unidade.

1.2. Componentes bsicos do gene procariota

Um gene procariota constituinte do mRNA designado por opero e contm as seguintes

estruturas:

Promotor actua como iniciador da transcrio para o gene ou genes fisicamente ligados a si no

mesmo fragmento de DNA. Pode apresentar um ou mais locais reguladores sendo o mais comum a

existncia de duas sequncias consenso.

Repressor esta protena impede um determinado gene de ser expresso.

Operador localiza-se junto do promotor actuando como alvo da protena repressora. Quando

ocorre a ligao entre estes dois elementos, a RNA polimerase nao inicia a transcrio e a expresso

gnica interrompida (no caso de operes de controlo negativo).


| Captulo 5 RNA e processamento 49

Factor de transcrio factor necessrio para auxiliar a RNA polimerase na iniciao da transcrio

junto do promotor.

Genes estruturais quaisquer genes que codifiquem para protenas. Representam uma enorme

variedade de estruturas e funes proteicas, incluindo protenas estruturais, enzimas com actividade

cataltica e protenas reguladoras.

Gene regulador descreve um gene estrutural que codifica para a protena envolvida na regulao

da expresso de outros genes. Um gene regulador codifica para uma protena que controla a transcrio

atravs da ligao a locais particulares do DNA.

1.3. Constituio do mRNA

Regio codificante consiste num conjunto de codes que representa a sequncia de

aminocidos da protena iniciando, normalmente, com AUG e terminando com um codo de

terminao.

5 leader regio extra presente na extremidade 5 que precede o incio da regio codificante,

ou seja, o codo de iniciao (sequncia nao traduzida).

3 trailer sequncia adicional que existe depois do sinal de terminao, constituindo a

extremidade 3 (sequncia no traduzida).

Regio intercistrnica existe entre as vrias regies codificantes que podem variar em

tamanho, podendo apresentar cerca de 30 nucletidos nos mRNAs de bactrias ou apenas 1 a 2

nucletidos separando o codo de terminao de uma protena do codo de iniciao da seguinte.


50 Captulo 5 RNA e processamento |

S

49270864 sebenta de biologia molecular

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