4. procesamiento de las muestras para ihq

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA

ESTUDIO INMUNOHISTOQUIMICO

Prof. T.M. Laura Ochoa M.

Objetivos.

• Conservar la inmunoreactividad de células y tejidos.

• Conservar la estructura secundaria y terciaria de las proteínas.

• Conservar la localización de los antígenos.

• Preservar la morfología.

• No provocar interferencia con los inmunoreactivos.


La unión del antígeno (Ag) con el anticuerpo (Ac) se deben a la formación de múltiples enlaces no covalentes (enlaces H, interacciones electrostáticas, de Van der Waals e

hidrófobas)Se establecen múltiples interacciones

Determinantes antigénicos.

• Corresponde al área específica dentro del antígenos que se une al paratopo.

• Pueden ser LINEALES en cuyo caso su formación esta dada por una secuencia aminoacídica o CONFORMACIONALESdada por la estructura secundaria o terciaria de la proteína.

DETERMINANTES ANTIGÉNICOS

Tipos de Muestras para estudioIHQ.

• Células de cultivo.

• Células en suspensión.

• Frotis citológicos

• Frotis sanguíneos.

• Cortes de criostato.

• Cortes en parafina

• Cortes de ultramicrótomo.


Procesamiento de los líquidos.

• Procesar inmediatamente

• Centrifugar durante 5 minutos a 2.500 rpm

• Con el pellet confeccionar varios frotis ( 3-5), secar parcialmente

• Fijadores: etanol 95°, acetona al 80% en PBS mas formalina 1%, Cytospray.

• Lavar en PBS

• ICQ


CITOLOGÍAS


Frotis previamente teñidos.

• Marcar con lápiz diamante al dorso del portaobjeto las zonas sospechosas de mejor celularidad.

• Despegar el cubreobjeto.

• Retirar todo el medio de montaje en xilol

• Decolorar con alcohol ácido

• Hidratar hasta el agua destilada

• ICQ


Cortes por congelación.

• Transporte al laboratorio

– Suero fisiológico (transporte inmediato)

– Hielo / Medio de transporte (horas)

– Congelado en tanque de nitrógeno líquido (días)

• Mejor preservación antigénicas que cortes en parafina.

• Morfología deficiente.



• Congelación: debe ser realizada rápidamente para evitar la formación de cristales de hielo.

• Fijación: Cualquier fijador. Acetona: buena conservación de antígenos de membrana.


Cortes en Criostato.

• CORTE

– De 6 – 10 micrones o lo más delgado que sea posible

– Montaje sobre portaobjetos pretratados.

– Evitar melladuras e irregularidades.

– Fijar en acetona fría por 15 minutos y secar.

• IHQ ó guardar cortes congelados a -70°C


VENTAJAS

• Excelente conservación de reactividad antigénica.

DESVENTAJAS

• Morfología deficiente

• Difícil almacenamiento de tejidos y de inmunotinciones

• Dificultades con enzimas endógenas


Procesamiento de cortes en parafina para IHQ.

• FIJACIÓN

• IMPREGNACIÓN / INCLUSIÓN

• CORTE Y MONTAJE

ETAPAS A CONSIDERAR


Objetivos de la fijación.

• Detener los procesos de autólisis. Especialmente la acción de proteasas y nucleasas

• Conservar la cito-histoarquitectura de la muestra similar a su estado “in vivo”.

• Preparar al tejido para los procedimientos posteriores

• Anti-microbiano


Obtención de la muestra.

• Muestras frescas deben ser cortadas en

un tamaño aproximado de 2cm2 x 4 mm

de grosor.

• Fijadas a la brevedad


Fijador ideal para IHQ.

• No induzca cambios conformacionales en el antígeno (epitopo)

• No enmascare determinantes antigénicos

• No provoque difusión, extracción o desplazamiento de antígenos.

• Permita la penetración de los inmunoreactivos

• Buena morfología

• Baja toxicidad, estabilidad en su almacenamiento, barato.


Fijación con Formaldehido.

• Más popular de los fijadores

• Es un gas y su presentación comercial es en solución acuosa 37 - 40%

• La fijación involucra una interacción con proteínas, específicamente con aminoácidos básicos, con formación de puentes metilénicos.

• En algunos casos se produce un fenómeno de “enmascaramiento” progresivo de epitopos.

• Frecuentemente requiere el uso técnicas de recuperación de inmunoreactividad.

FORMALDEHÍDO HIDRATO DE METILENO


FORMALDEHÍDO


Especies presentes en el

Formaldehido.

• Rompimiento de polímeros a unidades de

hidrato de metileno.

• Proceso dura un par de días si se prepara

en agua. Y es instantáneo cuando se

prepara en buffer a pH fisiológico.

Componentes de la solución de

formaldehido.

• METANOL 10% :

Disminuye la velocidad de la

polimerización del hidrato de metileno.

Promueve la precipitación del para

formaldehído.

En la reacción entre dos moléculas de

formaldehído, una se reduce a metanol y

la otra se oxida a ácido fórmico.


FORMALINA al 4%

COMPONENTES DEL FORMALDEHIDO EN SOLUCIÓN (FORMALINA)

• Hidrato de metileno Compuesto activo

• Metanol 1%

• Ácido fórmico Compuestos

• Paraformaldehído no deseados


FORMALINA

Equilibrio de la solución

Tiempo/ pH

Compuesto Compuestos

activo no deseados


FIJACIÓN CON FORMALDEHIDOPenetración

Hidrato de Reacción

Metileno con grupos

NH2

Formación de

Puentes Reacción

metilénicos entre NH2

metilados


PROTEÍNA NATIVA

EPITOPOS


PROTEINA FIJADA CON

FORMALDEHIDO


Fijación con Formaldehido.• Solución de fijación: Se debe utilizar en

sus condiciones mas estables

– Neutralizada con carbonato de calcio

– Tamponada en PBS pH 7,2 – 7,4

• Tiempo de fijación

– Desde que la muestra es extraída hasta que es fijada.

– Muestra en el fijador.

• Ojo con los congelamientos previos.


Condiciones de fijación con Formaldehido

• Temperatura / Tiempo de fijación:

– T. A. 6 – 24 hrs

– 4° C 24 – 72 hrs

• Tamaño de la muestra:

– 10 x 10 x 4 mm

• Volumen de fijador:

– 20 – 30 veces el volumen de la muestra


Fijación con Formaldehido.

EN MUESTRAS FIJADAS EN FORMALDEHIDO EN

CONDICIONES ÓPTIMAS SE PUEDEN OBTENER EXCELENTES

RESULTADOS DE INMUNOTINCIÓN PARA LA

MAYORÍA DE LOS ANTÍGENOS


Fijación con Ac. Pícrico.

• Fijador de tipo coagulante, poco

penetrante.

• Se emplea en mezclas fijadoras. La más

usada es la mezcla de Bouin.

• Provee buena morfología.

• Su uso se recomienda para estudio de

inmunoglobulinas, filamentos intermedio y

hormonas.


Fijación con Bicloruro de Mercurio.

• Poco penetrante. Se emplea en mezclas fijadoras: ZENKER; FORMOL SUBLIMADO; B5, etc.

• Aditivo y coagulante

• Excelente morfología

• B5 recomendado especialmente para la fijación de ganglios linfáticos.

• Buena conservación de antígenos intracitoplasmático, pero no de membrana.

• Provee al tejido buena permeabilidad para los inmunoreactivos.


Fijación con etanol.

• Poco penetrante

• Fijador coagulante

• Buena penetración de inmunoreactivos

• Puede inducir a cambios conformacionales

• Endurece los tejidos

• Morfología regular


FIJACIÓN CON ACETONA

• Poco penetrante

• Fijador coagulante

• Principalmente indicado para

frotis sanguíneos y cortes en

congelación.


Deshidratación, aclaramiento e

impregnación. • Agente aclarante en

buen estado

(sin agua)

• Temperatura de las

parafinas de

impregnación entre

56 - 62° C.

• Tiempo de

impregnación entre

30 – 45 minutos en

cada parafina.Prof. T.M. Laura Ochoa M.

PROCESADOR

DE TEJIDOS

AL VACIO


Corte y Montaje.

• Grosor recomendado:4 –5

• Montaje en portaobjetos o cubreobjetos

• Evitar cortes con melladuras, irregularidades, gruesos o desgarrados

• Evitar tocar el agua del baño con las manos con crema


Corte y Montaje

• Medios adhesivos:

– ALBUMINA DE MAYER

– COLA FRÍA 1%

– POLI-L-LISINA ACUOSA

– 3,AMINOPROPYLTRIETHOXI-SYLANE.


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Corte y Montaje.

• Realizar los cortes la misma semana que

se realizará técnica IHQ.

• Mantener guardados en oscuridad y en

refrigerador. Libres del polvo.

• Mantener bloques de parafina

almacenados en lugares frescos.

• La limpieza de los portaobjetos previa a la

silanización, deber ser sin detergentes.


Montaje.

• Medios hidrófobos.

• Medios hidrófilos.


Desparafinación e Hidratación.

• Asegurar remover

total de la parafina,

con agentes de

desparafinación de

buena calidad.

• Cambiar con

regularidad los

reactivos

• Hidratación gradual.


LA ELECCIÓN DEL MÉTODO DE

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DEPENDE DEL

PROPÓSITO DEL ESTUDIO

INMUNOHISTOQUÍMICO.


4. procesamiento de las muestras para ihq

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