3. METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu Dan Tempat Penelitian

Analisis laboratorium dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Hasil

Perairan, Mikrobiologi Hasil Perairan Program Studi THP, Laboratorium

Teknologi Industri Pertanian dan Laboratorium Terpadu Institut Pertanian Bogor.

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus 2010 hingga April 2011.

3.2 Bahan dan Alat

Bahan baku yang digunakan pada penelitian ini adalah telur tambakan

(Helostoma temminckii C.V) segar yang diperoleh dari pasar Pagi Samarinda-

Kalimantan Timur. Bahan pembantu yang digunakan adalah garam rakyat yang

diperoleh dari pasar Segiri-Samarinda. Bahan yang digunakan untuk analisis

adalah kalium khromat 5%, AgNO3 0,1 N, KH2PO4, H2SO4, NaOH, H3BO3, HCl,

NaCl, asam asetat, asam sulfinat, alkohol 96%, H2O2 3%, K2SO4, H3BO3 4%,

pereaksi biuret, violet Kristal, lugol, safranin, akuades, heksana, kertas saring,

tablet kjedhal. Medium agar yang digunakan dalam penelitian ini meliputi

trypticase soy agar (TSA), MIO medium (Motility Indole Ornithine), OF basal

medium (Oxidation Fermentation). Komposisi media agar yang digunakan dalam

penelitian ini dapat dilihat pada Lampiran 1.

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah botol kaca ukuran 500

liter, baskom, timbangan, cawan petri, tabung reaksi, pipet transfer, gelas

erlenmeyer, gelas ukur, gelas piala, gelas pengaduk, labu takar, jarum ose,

Bunsen, autoklaf, water bath, spectrophotometer, vortex, mikroskop, timbangan

analitik, lemari es dan BBL crystal Gram positif kit (BD).

3.3 Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan melalui 4 tahap, yaitu : (1) pembuatan produk

fermentasi telur tambakan, (2) isolasi bakteri, (3) identifikasi bakteri, (4) uji kimia

telur segar dan produk fermentasi telur tambakan.

14

3.3.1 Pembuatan produk fermentasi telur ikan tambakan

Produk fermentasi telur ikan tambakan diperoleh dari pengolah di daerah

Pasar Pagi Samarinda Kalimantan Timur. Dokumentasi proses pembuatan produk

fermentasi telur ikan tambakan dapat dilihat pada Lampiran 2. Pembuatan produk

fermentasi telur tambakan diawali dengan mempersiapkan bahan dan alat yang

digunakan untuk pembuatan produk tersebut. Persiapan bahan dan alat dilakukan

secara higienis untuk mengurangi kontaminasi bakteri patogen dan bakteri

kontaminan lain.

Cara pembuatan produk fermentasi telur tambakan adalah sebagai berikut:

bahan baku telur tambakan segar dibersihkan terlebih dahulu. Telur tambakan

yang telah dibersihkan tersebut kemudian diberi garam rakyat dengan

perbandingan setiap 1 kg telur ikan untuk 250 gram. Campuran antara telur

tambakan dan garam kemudian dimasukkan ke dalam botol kaca yang sudah

bersih kemudian ditutup rapat, dan dimulai proses fermentasi. Proses fermentasi

berlangsung selama setahun dan penghentian proses fermentasi dilakukan dengan

cara penggorengan produk fermentasi telur tambakan pada suhu 100 oC selama 3

menit. Diagram alir proses pembuatan produk fermentasi telur tambakan dapat

dilihat pada Gambar 5.

3.3.2 Isolasi bakteri (BSN 2009)

Telur ikan tambakan yang telah difermentasi selama setahun kemudian

diisolasi bakterinya untuk mendapatkan isolat bakteri yang kemudian akan

diidentifikasi jenisnya. Isolat bakteri murni yang tumbuh dominan selama

fermentasi dipilih berdasarkan jumlah koloni yang paling banyak tumbuh.

Morfologi koloni diamati berdasarkan bentuk koloni, bentuk permukaan, bentuk

kemunculan diatas permukaan agar dan warna koloni.

Uji mikrobiologis dilakukan dengan perhitungan jumlah mikroba (Total

plate count) yang ada dalam sampel dengan pengenceran sesuai keperluan dan

dilakukan secara duplo. Pembuatan larutan contoh dengan cara mencampur

10 gram sampel dengan 90 ml larutan garam 0,85% steril kemudian diblender

hingga homogen. Prosedur total plate count (BSN 2009) dapat dilihat pada

Lampiran 3.

15

Gambar 5 Diagram alir proses pembuatan produk fermentasi telur tambakan.

Campuran diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung berisi

9 ml larutan garam 0,85% steril sehingga diperoleh pengenceran 10-2

. Kemudian

dilakukan prosedur serupa untuk pengenceran 10-3

dan seterusnya hingga

pengenceran 10-5

. Sebanyak 1 ml suspensi sel diteteskan ke dalam cawan kosong.

Media yang masih cair (54 0C) dituang ke cawan kemudian putar cawan untuk

menghomogenkan suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi dengan posisi

terbalik didalam inkubator pada suhu 37 oC selama 24 jam. Jumlah koloni

dihitung berdasarkan rumus :

Ikan tambakan

Dicuci dan dibersihkan dengan air

Diberi garam 25% dan dimasukkan kedalam botol tertutup

Pemeraman selama 1 tahun

Produk fermentasi

telur tambakan

fermentasi

Ikan dibedah lalu telur dikeluarkan dari perut ikan

Penggorengan suhu 100 oC selama 3 menit

untuk menghentikan proses fermentasi

16

Koloni yang terpilih dari hasil kultur bakteri kemudian diisolasi dengan

metode goresan kuadran. Cawan petri yang telah berisi media TSA steril yang

telah padat dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam, untuk mendapatkan

koloni yang terpisah.

3.3.3 Identifikasi Bakteri

Identifikasi pada tahap awal dilakukan pemurnian dan pewarnaan Gram

untuk melihat kemurnian bakteri. Pewarnaan Gram juga dilakukan untuk melihat

bentuk bakteri dan reaksi terhadap pewarnaan Gram. Bakteri yang sudah murni

selanjutnya dilakukan uji biokimia untuk menentukan genus dan spesies dari

masing-masing bakteri (Cowan 1974).

(1) Pewarnaan Gram (BSN 2009)

Pewarnaan Gram pada bakteri dilakukan dengan cara mengamati sel-sel

bakteri yang telah mati dan diwarnai. Dengan cara tersebut, bentuk sel akan

menjadi lebih jelas karena warna sel dibuat kontras dengan medium

disekelilingnya, sehingga lebih mudah dilihat dibawah mikroskop. Bakteri yang

mempunyai sel dengan ukuran relatif kecil akan mudah dilihat. Pada pewarnaan

Gram diperlukan empat jenis larutan yaitu zat warna basa (kristal violet), larutan

iodium (lugol), alkohol dan safranin.

Preparat bakteri ditetesi dengan pewarna kristal violet dan dibiarkan

selama satu menit, kemudian dibilas dengan air. Selanjutnya preparat ditetesi

dengan larutan lugol dan dibiarkan selama satu menit, dicuci dengan air dan

dihilangkan warnanya menggunakan alkohol 96% selama 10-20 detik atau sampai

warna ungu tidak luntur lagi. Setelah dicuci sebentar kemudian diwarnai dengan

larutan safranin dan dibiarkan selama 10-20 detik lalu dibilas dengan air,

kemudian dikeringkan dan diperiksa di bawah mikroskop menggunakan minyak

imersi dan diamati bentuk sel serta reaksi Gram. Sel-sel bakteri yang tidak dapat

melepaskan warna akan tetap berwarna seperti warna violet kristal, yaitu biru

ungu disebut bakteri Gram positif. Sel-sel bakteri yang dapat melepaskan violet

kristal dan mengikat safranin sehingga berwarna merah atau merah muda disebut

bakteri Gram negatif. Prosedur pewarnaan Gram (BSN 2009) secara lengkap

dapat dilihat pada Lampiran 4.

17

(2) Uji motilitas (BSN2009)

Uji motilitas merupakan uji yang digunakan untuk melihat sifat

pergerakan bakteri yang dapat dilihat dengan pergerakan selnya. reaksi positif

ditandai oleh adanya pertumbuhan bakteri yang menyebar sedangkan untuk reaksi

yang negatif menunjukkan bakteri hanya tumbuh pada daerah tusukan saja.

Pengujian ini dilakukan dengan cara sebagai berikut: secara aseptis menggunakan

ose yang lurus bagian ujungnya, isolat bakteri ditusukkan ke dalam MIO media.

Selanjutnya diinkubasikan pada suhu 35ºC selama dua hari. Bila pertumbuhan

menyebar, maka bakteri tersebut bergerak atau motil, dan bila pertumbuhan

bakteri tidak menyebar, hanya berupa garis saja, maka bakteri tersebut bersifat tidak

bergerak (non motil). Prosedur uji motilitas (BSN 2009) secara lengkap dapat

dilihat pada Lampiran 5.

(3) Uji katalase (BSN 2009)

Uji katalase digunakan untuk mengetahui adanya enzim katalase pada

bakteri, dimana enzim ini berperan dalam memecah hidrogen peroksida menjadi

air dan oksigen. Uji ini penting dilakukan untuk mengetahui sifat bakteri terhadap

kebutuhan akan oksigen. Secara aseptis diambil satu ose kultur bakteri dari agar

miring dan dipindahkan pada gelas obyek. Kemudian diteteskan 1-3 tetes larutan

H2O2 3%. Keberadaan enzim katalase ditandai dengan terbentuknya gelembung-

gelembung kecil oksigen yang terlihat seperti busa sabun. Prosedur uji katalase

(BSN 2009) secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 6.

(4) Uji oksidase (BSN 2009)

Uji oksidase berfungsi untuk menentukan oksidase sitokrom yang

biasanya terdapat pada mikroorganisme patogen. Secara aseptis diambil satu ose

kultur bakteri lalu digoreskan pada kertas saring yang sudah diberi pereaksi

oksidase atau biasa digunakan juga stik oksidase. Hasil reaksi dinyatakan negatif

jika tidak ada perubahan warna pada kertas saring dan dinyatakan positif jika

terjadi perubahan warna biru keunguan pada goresan dalam waktu singkat.

Prosedur uji oksidase (BSN 2009) secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 7.

18

(5) Uji oksidatif-fermentatif (BSN 2009)

Uji ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme dalam

menggunakan karbohidrat dengan cara fermentasi atau oksidasi. Bakteri yang

akan diuji, secara aseptis dengan menggunakan ose diinokulasikan kedalam

medium tegak yang sudah disiapkan terlebih dahulu. Setiap bakteri yang akan

diuji ditusukkan ke dalam dua tabung yang berisi media OF, tabung pertama

ditutupi dengan parafin 3-5 ml, sedangkan tabung kedua tanpa parafin. Inkubasi

dilakukan pada suhu 30 ºC selama 24 jam. Bila terjadi perubahan warna

(terbentuk warna kuning) pada kedua tabung, maka bakteri bersifat fermentatif.

Bila hanya tabung tanpa parafin yang berubah warna (terbentuk warna kuning)

maka bakteri bersifat oksidatif sedangkan bila tidak terjadi perubahan warna pada

kedua tabung tersebut berarti uji oksidatif-fermentatif bersifat negatif. Prosedur

uji oksidatif fermentatif(BSN 2009) secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 8.

(6) BBL crystal kit system

Bakteri kultur murni yang telah diperoleh, diidentifikasi untuk mengetahui

jenis bakteri pada produk fermentasi telur ikan tambakan. Metode identifikasi ini

menggunakan kit BBL crystal yang di produksi oleh perusahaan BD (Becton,

Dickinson and Company). Kit BBL crystal terdiri dari 29 microplates (mikro

cawan) yang berisi substrat biokimia dan enzim. Pengujian menggunakan kit ini

berdasarkan pada kemampuan mikrobia dalam memanfaatkan dan mendegradasi

substrat spesifik yang dapat dideteksi menggunakan berbagai macam sistem

indikator warna. Prosedur BBL Crystal ID GP secara lengkap dapat dilihat pada

Lampiran 9.

Prinsip dari metode ini adalah menanam bakteri pada microplates (mikro

cawan). Kemampuan bakteri dalam menghidrolisis substrat akan menghasilkan

perubahan warna dalam lubang mikro yang dapat terdeteksi secara visual. Data

warna-warna yang telah diperoleh akan dicocokkan pada tabel warna yang

memiliki nilai tertentu. Nilai-nilai tersebut selanjutnya dimasukkan dalam bank

data (software) BBL crystal dan diperoleh hasil identifikasi bakteri hingga tingkat

spesies. Tahapan pengujian mikrobiologi fermentasi telur tambakan dapat dilihat

pada Gambar 6.

19

Telur tambakan fermentasi

ditimbang 10 gram

digerus + 90 ml pengencer

suspensi

pengenceran secara desimal

(10-2

, 10-3

, 10-4

, 10-5

)

TSA + 0%; 5%; 10% NaCl A

Inkubasi 37 0C (24 jam)

Penghitungan koloni

Isolasi koloni

(bentuk, penampakan, warna)

Pemurnian isolat

(metode gores)

B

Isolat pada agar miring

Uji morfologi dan fisiologi

identifikasi

Gambar 6 Diagram alir pengujian mikrobiologi kuantitatif (A) dan kualitatif (B).

20

3.3.4 Analisis kimia

(1) Pengukuran nilai pH (AOAC 1995)

Terlebih dahulu pH meter dinyalakan, kemudian elektroda pH meter

dimasukkan dalam buffer 4,31 dan 6,86 lalu sampel sebanyak 5 gram ditimbang

dan diberi aquades sebanyak 100 ml, setelah itu dihaluskan. Setelah itu elektroda

dicelupkan pada larutan sampel dan dibiarkan beberapa saat sampai diperoleh

pembacaan yang stabil. Nilai yang diperoleh dari pembacaan pada pH meter

sampai angka digital menunjukkan nilai pH tetap.

(2) Kadar garam (Cl) (AOAC 1995)

Penetapan kadar garam sampel yang dilakukan berdasarkan metode Mohr

terdiri dari langkah-langkah berikut ini: sebanyak 5 gram sampel dimasukkan ke

dalam cawan porselin untuk diabukan pada suhu 600 oC selama 12 jam. Abu yang

diperoleh tersebut dilarutkan dengan aquades sampai volumenya mencapai

100 mL dan kemudian disaring. Hasil dari penyaringan tersebut dipipet sebanyak

10 mL kedalam beaker glass 50 ml, kemudian ditambahkan 3 mL K2CrO4 (kalium

khromat) 5%. Selanjutnya kedalam beaker glass dititrasi dengan larutan perak

nitrat (AgNO3) 0,2 N. Titik akhir titrasi tercapai setelah terbentuk endapan perak

khromat (Ag2CrO4) yang berwarna oranye atau jingga.

Rumus yang digunakan untuk menghitung kadar NaCl yaitu :

(k) Pengukuran Nilai pH (AOAC 1995)

(3) Kadar air (AOAC 1995)

Prosedur penentuan kadar air adalah sebagai berikut: Sampel yang sudah

homogen ditimbang 5 gram dan diletakkan di dalam cawan kosong yang sudah

ditimbang beratnya, dimana cawan dan tutupnya sudah dikeringkan di dalam oven

serta didinginkan di dalam desikator. Cawan yang berisi sampel kemudian ditutup

dan dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 100 ºC selama 5 jam atau sampai

beratnya konstan. Cawan lalu didinginkan di dalam desikator dan setelah dingin

cawan ditimbang.

x 100%

Titer x Normalitas AgNO3 x 58,5 x 10

Mg berat sampel Kadar NaCl (%) =

21

Kadar air ditentukan dengan rumus:

(4) Kadar abu (AOAC 1995)

Kadar abu ditentukan dengan prosedur sebagai berikut: Sampel sebanyak 5

gram dimasukkan ke dalam cawan pengabuan yang telah ditimbang dan dibakar di

dalam tanur serta didinginkan dalam desikator. Cawan yang berisi sampel

dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dan dibakar sampai didapat abu yang

berwarna keabu-abuan. Suhu pemanasan dinaikkan secara bertahap sampai suhu

mencapai 550 ºC dan dibiarkan selama 1 jam. Setelah suhu tungku pengabuan

turun sekitar 200 °C, cawan yang berisi abu tersebut didinginkan di dalam

desikator selama 30 menit dan kemudian ditimbang beratnya.

Kadar abu ditentukan dengan rumus:

(5) Kadar protein (AOAC 1995)

Penentuan kadar protein dilakukan dengan metode mikrokjeldahl, dengan

prosedur sebagai berikut: Sampel ditimbang sebanyak 1-2 gram, kemudian

dimasukkan ke dalam labu kjeldahl. Lalu di tambahkan berturut-turut 15 gram

NaSO4, 1 gram CuSO4, satu atau dua butir batu didih dan 25 ml asam sulfat pekat.

Larutan dididihkan sampai cairan menjadi jernih tidak berwarna atau hijau muda

(minimum 2 jam dan tidak kurang 30 menit). Setelah larutan didinginkan,

ditambahkan 200 mL air secara hati-hati. Untuk alat destilasi, 100 mL HCl 0,1 N

dipipet ke dalam erlenmeyer 500 mL. Satu ml indikator Conway ditambahkan

ke dalamnya. Labu dilengkapi dengan kondensor dan diletakkan sehingga ujung

kondensor tercelup ke dalam larutan asam. Labu Kjeldahl yang berisi contoh

yang sudah didestruksi diletakkan di dalam sistem, kemudian ditambahkan NaCl

50 %, kocok hati-hati campuran dengan gerakan memutar. Dipanaskan hingga

semua gelembung ammonia keluar (sampai jumlah destilat kira-kira 150 mL).

Setelah selesai, rangkaian destilasi dibongkar hati-hati, ujung kondensor dicuci

%100(g)contoh berat

(g) keringcontoh berat - (g)contoh berat (%)air Kadar

% 100 (g) sampelberat

(g)abu berat (%)abu Kadar

22

dengan akuades, dan kelebihan larutan HCl dititrasi dalam destilat dengan larutan

NaOH standar. Kadar protein ditentukan dengan rumus:

(6) Kadar lemak (AOAC 1995)

Penentuan kadar lemak dilakukan menggunakan metode ekstraksi soxhlet.

Cara penentuannya adalah dimasukkan sebanyak 5 g sampel yang sudah

dibungkus dengan kertas saring kedalam alat soxhlet, kemudian 50 mL pelarut

dietil eter dituang ke dalam labu lemak. Selanjutnya direfluks selama minimum

5 jam sampai pelarut yang turun kembali ke labu lemak berwarna jernih. Pelarut

yang ada di labu lemak tersebut didestilasi, labu yang berisi hasil ekstraksi

dipanaskan dalam oven pada suhu 100 ºC selama 60 menit atau sampai beratnya

tetap. Setelah didinginkan dalam desikator, labu lemak tersebut ditimbang sampai

memperoleh berat yang konstan. Kadar lemak ditentukan dengan rumus:

(7) Analisis logam berat (AOAC 1995)

Sampel ditimbang sebanyak 5 gram lalu dimasukkan ke dalam cawan

kemudian ditambahkan 5 mL MgNO3 10 % dalam etanol lalu dikeringkan dalam

oven selanjutnya diabukan pada suhu 600 0C. Hasil pengabuan kemudian

ditambahkan 2 mL HNO3, lalu dipanaskan kembali sampai kira-kira volume

tinggal 1 mL setelah itu dinginkan. Setelah dingin kemudian tambahkan 10 mL

HCl 3N dan dipanaskan lagi sampai kira-kira volume tinggal setengahnya. Setelah

itu didinginkan kembali, dan diencerkan dengan aquades sampai 50 mL dan

disaring, hasil saringan kemudian diukur dengan Spektroskopi serapan atom

(SSA).

6,25 N % protein Kadar

% 100 sampel mg

14,007 HCl N blanko ml - HCl ml N %

% 100 (g) sampelberat

(g)lemak berat (%)lemak Kadar

23

(8) Analisis mineral (AOAC 1995)

Metode ini dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer absorpsi

atom untuk menentukan kadar mineral yang terdapat didalam bahan pangan.

Prinsip alat ini adalah sesudah penghilangan bahan-bahan organik dengan

pengabuan kering atau basah, residu dilarutkan dalam asam encer. Larutan

disebarkan dalam nyala api yang ada didalam alat SSA sehingga absorpsi atau

emisi logam dapat dianalisis dan diukur pada panjang gelombang tertentu.

Sampel ditimbang sebanyak 5 gram lalu dimasukkan ke dalam cawan

kemudian ditambahkan 5 mL MgNO3 10 % dalam etanol. sampel dikeringkan

dalam oven, selanjutnya diabukan pada suhu 600 0C. Hasil pengabuan kemudian

ditambahkan 3 mL HNO3, dipanaskan kembali sampai kira-kira volume tinggal

1 mL setelah itu dinginkan. Setelah dingin kemudian tambahkan 10 mL HCl 3N

dan dipanaskan lagi sampai kira-kira volume tinggal setengahnya. Setelah itu

dinginkan kembali, dan diencerkan dengan aquades sampai 50 mL dan disaring,

untuk pengujian Mg, Ca, Na dan K, pipet larutan yang telah disaring sebanyak

25 mL lalu ditambahkan 1 mL lantannum 5% dan diencerkan hingga 50 mL

setelah itu di ukur dengan SSA.

(9) Analisis asam amino (AOAC 1995)

Prosedur analisis asam amino terdiri dari beberapa tahap yang secara rinci

dapat dilihat pada Lampiran 10, tahapan prosedur analisis asam amino tersebut

yaitu: (1) preaparsi sampel, (2) pembuatan pereaksi OPA, (3) pembuatan buffer

sebagai fase mobil, (4) pengaturan alat HPLC, (5) analisis asam amino, (6)

perhitungan asam amino. Hasil analisis asam amino bisa ditingkatkan dengan

memanfaatkan reaksi pra kolom gugus amino dengan pereaksi tertentu

membentuk suatu derivat yang dapat menyerap sinar UV atau berflouresensi.

Salah satu pereaksi pra kolom yang sangat populer dalam analisis asam amino

adalah ortoftalaldehida (OPA). Pereaksi OPA akan bereaksi dengan asam amino

primer dalam suasana basa yang mengandung merkaptoetanol membentuk

senyawa yang berfluoresensi, sehingga deteksinya dapat dilakukan dengan

detektor flouresensi.

Analisis asam amino dilakukan dengan cara melarutkan sampel yang telah

dihidrolisis dalam 5 mL HCl 0,01 N kemudian saring dengan kertas milipore.

24

Buffer Kalium Borat pH 10,4 ditambahkan dengan perbandingan 1:1. Lalu

kedalam vial kosong yang bersih dimasukkan 10 µL sampel dan ditambahkan

25 µL pereaksi OPA, dibiarkan selama 1 menit agar derivatisasi berlangsung

sempurna. sebanyak 5 µL diinjeksikan ke dalam kolom HPLC kemudian ditunggu

sampai pemisahan semua asam amino selesai. Waktu yang diperlukan sekitar 25

menit. Konsentrasi asam amino (dinyatakan dalam µmol AA) dalam sampel.

Prosedur analisis asam amino (AOAC 1995) secara lengkap dapat dilihat pada

Lampiran 10.

Konsentrasi asam amino (dinyatakan dalam µmol AA) dalam sampel

Persen asam amino dalam sampel adalah:

= µmol AA x Mr. AA x 100

µg sampel

(10) Analisis asam lemak (AOAC 1995)

Analisis dengan kromatografi gas didasarkan pada partisi

komponen-komponen dari suatu cairan di antara fase gerak berupa gas dan fasa

diam berupa zat padat atau cairan yang tidak mudah menguap yang melekat pada

bahan pendukung inert. Komponen-komponen yang dipisahkan harus mudah

menguap pada suhu pemisahan yang dilakukan, sehingga suhu operasi biasanya

lebih tinggi dari suhu kamar dan biasanya dilakukan derivatisasi untuk contoh

yang sulit menguap. Dalam hal analisis asam lemak, maka mula-mula

lemak/minyak dihidrolisis menjadi asam lemak, kemudian ditransformasi menjadi

bentuk esternya yang bersifat lebih mudah menguap. Dalam metode ini,

transformasi dilakukan dengan cara metilasi sehingga diperoleh metil ester asam

lemak (FAME). Selanjutnya FAME ini dianalisis dengan alat kromatografi gas.

Identifikasi tiap komponen dilakukan dengan membandingkan waktu

retensinya dengan standar pada kondisi analisis yang sama. Waktu retensi

dihitung pada kertas rekorder sebagai jarak dari garis pada saat muncul puncak

25

pelarut sampai ke tengah puncak komponen yang dipertimbangkan.Penentuan

kandungan komponen dalam contoh dapat dilakukan dengan teknik standar

eksternal atau internal standar. Luas puncak dari masing-masing komponen adalah

berbanding lurus dengan jumlah komponen tersebut dalam contoh. Untuk

meminimalkan kesalahan akibat volume injeksi, preparasi sampel, pengenceran

dan sebagainya, lebih baik digunakan teknik standar internal. Disamping itu

koreksi terhadap respon detektor dan interaksi antar komponen dalam matrik

contoh selama melewati kolom juga harus dilakukan. Prosedur analisis asam

lemak (AOAC 1995) secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 11. Metode

internal standar, jumlah dari masing-masing komponen dalam sampel dapat

dihitung dengan cara sebagai berikut :

Keterangan :

Cx = kosentrasi komponen x

Cs = kosentrasi standar internal

Ax = luas puncak komponen x

As = luas puncak standar internal

R = respon detektor terhadap komponen x relatif terhadap standar.

Pada metode standar, dilakukan preparasi yang sama, hanya contoh dan

standar dilakukan secara terpisah, tidak ada penambahan larutan standar ke dalam

contoh. Jumlah kandungan komponen dalam contoh dihitung sebagai berikut :