276 aranzazu da et al. efecto del clorpirifos en tilapia · subletales, causa alteraciones...

Revista Colombiana de Ciencias Pecuarias

ISSN: 0120-0690

[email protected]

Universidad de Antioquia

Colombia

Aranzazu Taborda, Diego A; Rodríguez, Berardo de J; Vieco Durán, Beatriz; Restrepo Betancur, Luis

F

Efecto del Clorpirifos 0,0-dietil 0-(3, 5, 6-tricloro-2-piridil fosforotioato) en machos juveniles de tilapia

(Oreochromis spp)

Revista Colombiana de Ciencias Pecuarias, vol. 25, núm. 2, abril-junio, 2012, pp. 276-291

Universidad de Antioquia

Medellín, Colombia

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Aranzazu DA et al. Efecto del clorpirifos en tilapia276

Rev Colomb Cienc Pecu 2012; 25:276-291

Effect of Chlorpyrifos 0,0-dietil 0-(3, 5, 6-tricloro-2-piridil fosforotioato) in juvenile of tilapia (Oreochromis spp) males ¤

Efecto del Clorpirifos 0,0-dietil 0-(3, 5, 6-tricloro-2-piridil fosforotioato) en machos juveniles de tilapia (Oreochromis spp)

Efeito de Clorpirifós 0,0 dietil-0 - (3, 5 fosforotioato, 6-tricloro-2-piridil) em tilápias juvenis masculinos (Oreochromis spp)

DiegoAAranzazuTaborda1*,MV,Esp,MSc;BerardodeJRodríguez1,MV,Esp,PhD;BeatrizViecoDurán,Bacteriologa2,LuisFRestrepoBetancur3,Estadístico.

1Grupo de Investigación Centauro, Docente, Escuela de Medicina Veterinaria, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia .

2 Laboratorio de Inmunohistoquímica, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia .3 Docente, Escuela de Producción Agropecuaria, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia .

(Recibido: 1 febrero, 2011; aceptado: 22 abril, 2012)

Summary

Chlorpyrifos is a highly toxic insecticide to freshwater organisms and little is known regarding its potential to affect endocrine systems at sublethal concentrations. The induction of vitellogenin (Vtg) is a fairly sensitive marker of the effects of estrogenic compounds in juvenile fish. Objective: to evaluate histological changes and Vtg production in juvenile male tilapia (Oreochromis spp) exposed to sublethal concentrations of the insecticide Lorsban® EC (active ingredient chlorpyriphos). Methods: juvenile tilapia were exposed to 4, 8, and 12 µg/L of chlorpyrifos for 28 days in a semistatic system, with tanks receiving a 50% (v/v) daily water change to maintain nominal concentrations of the insecticide throughout the experiment. Subgroups of 3 animals from each concentration batch were euthanized on days 7, 14, 21 and 28 days, and samples of liver, gonads, gills, kidney and brain tissues were taken for routine histopathology examination. Liver and gonads were also processed by immunohistochemistry using monoclonal anti-killifish vitellogenin Vtg ND – 5F8 to detect Vtg. Results: we found significant statistical difference (p<0.05) for some injuries to the brain (degeneration and gliosis of the optic tectum), kidneys (vacuolar nephrosis and tubular hyaline granules), and liver (karyomegaly, binucleation, and hyaline granules in hepatocytes). Similarly we verified the induction of vitellogenin synthesis in liver and gonads, finding significant difference (p<0.05) in the expression of this protein between the control group and 4 mg / L with respect to treatment of 8 and 12 mg / L. Conclusion: the results obtained on the induction of

¤ Paracitaresteartículo:AranzazuDA,RodríguezBdeJ,ViecoB,RestrepoLF.EfectodelClorpirifos0,0-dietil0-(3,5,6-tricloro-2-piridilfosforotioato)enmachosjuvenilesdetilapia(Oreochromisspp).RevColombCiencPecu2012;25:276-291.

*Autor para correspondencia:DiegoAAranzazu. Escuela deMedicinaVeterinaria, Facultad deCienciasAgrarias,Universidad deAntioquia,Medellín,Colombia.Cra75No65-87.Medellín,Colombia.Correoelectrónico:[email protected]

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vitellogenin in males suggest a general effect of blocking concentrations of Chlorpyrifos for the possible induction of this protein. The mechanisms are not known at this time.

Key words: biomarkers, endocrine disruption, immunohistochemistry organophosphate compounds, vitellogenin .

Resumen

Hasta donde se conoce, no hay estudios en tilapias juveniles (Oreochromis spp), que valoren el potencial de disrupción endocrina del Clorpirifos por análisis histológico e inmunohistoquímico de la inducción de la Vitelogenina (Vtg) hepática. Objetivo: determinar los efectos de la exposición subaguda al Clorpirifos en órganos blanco de disrupción en peces juveniles machos de tilapia. Métodos: el experimento de dosis subletal, se realizó en un sistema semiestático, con recambio diario del 50% del volumen de agua manteniendo la concentración nominal en cada grupo experimental mediante la adición de la mitad de la dosis hasta el día 28. Las concentraciones de Clorpirifos para la exposición fueron 4, 8, y 12 μg/L. Con cada concentración se trataron 12 juveniles, con tres replicas para cada concentración. Los 12 peces del grupo control no recibieron tratamiento. Se realizó el estudio anatomopatológico de tres animales por grupo, por cada semana los días 7, 14, 21 y 28 de estudio. Se efectuó la toma de muestras para estudio histopatológico de hígado, gónadas, branquias, riñón y encéfalo y se procesaron por histopatología de rutina. Las muestras de hígado y gónada también se procesaron por inmunohistoquímica. Resultados: el análisis MANOVA encontró diferencia significativa (p<0.05) para lesiones en encéfalo (degeneración tectum óptico), riñón (gránulos hialinos) e hígado (cariomegalia), constituyéndose en órganos de impacto de los efectos del Clorpirifos a bajas dosis. Se verificó la inducción de Vtg en hígado y gónada de los animales expuestos, encontrando diferencia estadística significativa (p<0.05) en la expresión de esta proteína entre el grupo control y de 4 μg/L con relación a los grupos de 8 y 12 μg/L. Conclusión: los resultados obtenidos sobre la inducción de Vtg en machos sugieren un efecto antogonista del Clorpirifos sobre los Receptores Estrogénicos (REs), con una posible disminución en la síntesis de ésta proteína. Los mecanismos no se conocen en el momento.

Palabras clave: biomarcadores, disrupción endocrina, inmunohistoquímica organofosforados, vitelogenina .

Resumo

O clorpirifos é um insecticida altamente tóxico para os organismos de água doce. Porém, pouco se sabe acerca de seu potencial efeito no sistema endócrino em concentrações subletais. A indução de vitelogenina hepática (Vtg) é um marcador bastante sensível do efeito de componentes estrogênicos em peixes juvenis. Objetivo: determinar os efeitos da exposição subaguda ao clorpirifos em órgãos alvo de disrupção endócrina em machos juvenis de tilápia. Métodos: o experimento foi realizado em um sistema semi-estático com recambio diário de 50% do volume de água, com manutenção da concentração nominal em cada grupo experimental mediante a adição da metade da dose de clorpirifos até o dia 28. Três grupos de 12 peixes foram tratados com concentrações de clorpirifos de 4, 8 y 12 μg/L, respectivamente, com três réplicas para cada grupo. Um grupo controle não recebeu nenhum tratamento. Realizou-se o estudo anatomopatológico de rotina do fígado, gônadas, brânquias, rins e encéfalo de três animais por grupo nos dias 7, 14, 21 e 28. As amostras de fígado e gônada foram também processadas por inmunoistoquímica usando um anticorpo monoclonal para detectar Vtg (anti-killifish Vtg ND-5F8). Resultados: mediante análise MANOVA encontrou-se diferença significativa (p<0.05) para lesões no encéfalo (degeneração do tectum óptico), rim (grânulos hialinos) e fígado (cariomegalia), fato que demonstra que estes são os órgãos alvo dos efeitos do clorpirifos a baixas doses. Verificou-se a indução de Vtg no fígado e gônada dos animais expostos, com diferença estatística significativa (p<0.05) na expressão desta proteína entre o grupo controle e o grupo de 4 μg/L com relação aos grupos de 8 e 12 μg/L. Conclusão: os resultados obtidos sobre a indução de Vtg em machos sugerem um efeito antagonista do clorpirifos sobre os receptores estrogênicos, com uma possível diminuição na síntese desta proteína. Os mecanismos ainda são desconhecidos.

Palavras chave: biomarcadores, disrupção endócrina, inmunoistoquímica, organosfosforados, vitelogenina .



Introducción

El organofosforado Clorpirifos es el plaguicidamás aplicado en Colombia, con un volumende producción de 776.824 kg (Arboleda et al ., 2000; Loaiza et al., 2000). Si bien su tiempo dedegradaciónyvidamediaenelaguade53díasesbreve (De Silva y Samayawardhena, 2005), puedeafectar de forma crónica a las especies de vidacorta (Arboleda et al ., 2000) y particularmentea los peces, cuando la exposición coincide conetapas claves para la reproducción (De Silva ySamayawardhena,2005).

LasensibilidaddelasdiversasespeciesacuáticasalClorpirifosesmuyvariable, (Giesyet al.,1999)y los escasosestudiosque sehan realizadoanivelmundial para determinar sus efectos en peces,se han focalizado en la intoxicación aguda enlarvas de tilapia (Gul, 2005) y guppy (De Silva ySamayawardhena,2005;Mahmutet al.,2005).

En guppys (Poecilia reticulata) expuestos aconcentraciones de Clorpirifos entre 0.002 µg/Ly 2 µg/L, se observó disminución significativa enel número de empujes gonadopodiales, de críasproducidasydesusupervivenciaalcompararseconpeces no expuestos (De Silva y Samayawardhena,2005); esto sugiere unposible efectodisruptivodeesteplaguicidasobreelrendimientoreproductivo.

La Vtg es el precursor de la proteína delvitelo del huevo en peces teleósteos, utilizadacomo biomarcador de la exposición a químicosestrogénicos en el ambiente acuático (Arukwe et al., 2003;Canapa et al., 2007). Los pecesmachosposeen los genes para Vtg, pero normalmenteno sintetizan cantidades medibles de la proteína;sin embargo, cuando los machos son expuestos axeno-estrogénos, son capaces de producir nivelesdetectables de Vtg, en concentración igual o superiora lospeceshembras(Arukweet al., 1999; Carballo et al., 2005; Örn et al.,2003).

Debido a que algunas investigaciones previassugieren un probable efecto Disruptor Endocrino(DE) del Clorpirifos en los peces (De Silva ySamayawardhena, 2005) y que hasta donde seconoceenlaactualidad,nohayestudiosentilapias

juvenilesquevalorensuefectopotencial,utilizandobiomarcadores anatomopatológicos, y evaluandolaexpresión tisulardeVtg; se formuló la siguientehipótesis:laexposiciónsubagudadetilapiasmachosjuveniles al insecticida Clorpirifos utilizando dosissubletales, causa alteraciones morfológicas enórganosblancoseinducelaexpresióndeVtg.Paracomprobarestahipótesisseplanteocomoobjetivo,determinar el efecto de la exposición subagudaa Clorpirifos sobre órganos blanco y sobre laexpresiónhepáticaygonadaldeVtg.

Materiales y métodos

Animales experimentales

Se utilizaron 120 peces machos juveniles detilapia (Oreochromis spp), con longitud corporalde 15.9 ± 1.5 cm, peso 89.1 ± 10.2 gramos, clínicamentesanos,obtenidosdeunmismodesovey criados en estanques de la estación piscícola delPolitécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid, en el municipio de San Jerónimo departamento deAntioquia,Colombia.

Condiciones experimentales

El experimento se realizó en el Laboratoriode Bioensayos del Politécnico ColombianoJaime Isaza Cadavid (San Jerónimo, Antioquia,Colombia) ubicado a una altura de 750 msnm,con una temperatura promedio de 25 °C. Losanimalesexperimentalessealojaronenacuariosdevidrio, con capacidad para 64 litros, con aireaciónconstante y filtro XY - 380; se alimentaron conconcentradocomercial(34%deproteína)dosveces/día con un suministro del 2% de la biomasa totaldecadagrupotantodurantelafasedeaclimataciónde una semana de duración, como de la faseexperimentalsubletalde28díasdeduración.

Durante el período de aclimatación y duranteel transcurso de la fase experimental, se midierondiariamente los parámetros de calidad del agua:temperatura (Termómetro estándar de varilla -10a 150 ºC BRAND), oxígeno disuelto (oxímetroLCDHQ10)ypH(pH-metroPINPOINT).Elaguautilizada provenía del acueducto municipal delmunicipiodeSanJerónimo.



El experimento de dosis subletal, se realizóen un sistema semiestático, con recambio diario del 50% del volumen de agua manteniendo laconcentración correspondiente en cada grupoexperimentalmediante laadiciónde lamitadde ladosishastaeldía28.Lospecessesometieronaunperíododeaclimataciónde7días.Previoalperíododeaclimatación,lospecessesometieronaunbañoen 10 g/L de sal no yodada durante una hora paraeliminarectoparásitos.

Sustancia experimental

El Clorpirifos utilizado (0,0-dietil0-3,5,6-tricloro-2-piridil fosforotioato), 480 g/Lde formulación a 20 °C se adquirió de una fuentecomercialLorsban*4EC.DowAgroSciences.Lasdiluciones requeridas se realizaron en el agua deacueducto utilizada en los acuarios.

Exposición subaguda

Las concentraciones para la exposición fueronde 4µg/L, 8µg/L y 12µg/L, teniendo comobaselos estudios previos de toxicidad con Clorpirifosrealizados por Pathiratne yAthauda, 1998; en losque se determinó que estas son concentracionessubletales y corresponden entre el 4 y el 10% dela Concentración Letal (CL) 50 estimada para elestadio de dedinos de tilapia nilótica. Con cadaconcentración se trataron 12 juveniles, con tresreplicasparacadatratamiento.Elgrupode12pecesestablecido como control no recibió dosificacionesconClorpirifos.

Anatomopatología

El número de animales vivos y muertos, asícomo los signos clínicos de los individuos semonitorearon todos los días, por un período de12 horas hasta la culminación del experimentoal día 28. Tres animales por grupo, por cadasemana, considerando los peces muertos y losvivos, los días 7, 14, 21 y 28, se sometieron aevaluación macroscópica, y se tomaron muestrasde tejido de cada animal para realizar estudiohistopatológico. De los animales que murierondurante el experimento, no se tomaron muestraspara histopatología, ya que presentaron cambiosautolíticosevidentes.

Las necropsias se realizaron según el protocolodescrito por Reimschuessel et al (1998). Para lahistopatología branquial se tomó el segundo arcobranquial izquierdo. Se tomaron adicionalmentemuestras de hígado, gónadas, encéfalo y riñón.Se evaluaron los índices gonadosomático yhepatosomático luegode removidos losórganosenelprocedimientodenecropsia.

Elíndicehepatosomático(IHS)secalculócomo:IHS=HW(W-HW)-1x100,dondeHWeselpesodelhígado (g)yWeselpesohúmedodelpez (g).El índice gonadosomático (IGS) se calculó como:IGS=GW(W-GW)-1x100,dondeGWeselpesodelagónada(g)yWeselpesohúmedodelpez(g)(Sindhe,2004).

Las muestras se procesaron por técnicas dehistopatología convencional, así: se fijaron enformalina tamponada al 4%, se incluyeron enparafina, se cortaron a 4 µm de espesor y secolorearonconhematoxilina-eosina.LaevaluaciónhistopatológicaserealizóconunmicroscopioópticoLeica DLM. Para la denominación de las lesiones se utilizaron criterios establecidos previamente porotros investigadores (Bernet et al., 1999; Ferguson, 2006;Roberts,2001).

Las variables identificadas se categorizaronpor medio de una escala ordinal de valores segúnelgradode severidad,deacuerdoa losparámetrospropuestos por Bernet et al (1999), como sepresentaenla(Tabla1).

Tabla 1. Valores establecidos para la severidad y distribución de las lesiones.

Nivel Grado de lesión Distribución0 Ausencia No aplica

1 LeveHasta el 30% del tejido en 10 campos de 400X de distribución focal.

2 ModeradaHasta el 60% del tejido afectado en 10 campos de 400X de distribución multifocal.

3 SeveraMás el 60% del tejido afectado en 10 campos de 400X de distribución difusa

Las imágenes de lesiones representativas de losdiferentesórganossetomaronconcámaradigitalunacámara para microscopía digital instantánea LeicaEC3(Leicamicrosystems,Heerbrugg,Switzerland).



Inmunohistoquímica

La detección de Vtg se realizó tanto para elgrupo control como para los grupos tratadoscon concentraciones variables de Clorpirifos,utilizando la técnica de inmunohistoquímicaAdvance (Biocompare, 2008) de acuerdo alprotocolo recomendado por Laboratorios Dako. Elprocedimiento se describe a continuación: para lainmunomarcación de Vtg, las muestras de hígadoygónadadetodoslospecessefijaronenformalinabufferada neutra (4% de concentración final), seincluyeronenparafina,serealizaroncortesdetejidode 4 µm, posteriormente se colocaron en láminascubiertasconpoli-L-lisina(SlideTech.®CA.USA)ysesecaronenestufadurantetodalanochea58°C.

Loscortessedesparafinaron,hidrataronylavaronen agua destilada. Luego se realizó la recuperaciónantigénicadeloscortessumergidosenbuffercitratoapH6durante30minutos,utilizandounvaporizadora100°Caproximadamente.Posteriormentesedejaronreposar en la solución buffer durante 30 minutosy se estabilizaron en PBST (Solución phosphatebuffered salinewhith tween 20) (MerckChemicals.Darmstad.Alemania),durante5minutos.Después,sebloqueó la actividadde laperoxidasa endógena conlaaplicacióndeperóxidodehidrógenoH2O2/40%enmetanol(MerckChemicals.Darmstad.Alemania)por10 minutos.

Los cortes se inmunocolorearon con el anticuerpomonoclonal anti-killifish vitellogenin Vtg ND –5F8 (Biosense Laboratorios AS, Bergen, Noruega)a diluciones de 1/100 por una hora a temperaturaambiente. Este anticuerpo es recomendado por lacasa productora para su uso enOreochromis spp. Las diluciones se realizaron en PBS conteniendo 1% deBSA (Sigma-Aldrich. Saint LouisMO. USA). Luegodelaincubaciónconesteanticuerpoprimario,loscortesse lavaronconPBSTdurante5minutos, se incubaroncon AdvanceTM HRP Link durante 30minutos (Dako.SanAntonio.USA), seguido de un lavado con PBSTdurante 5 minutos. Luego se incubaron con la enzima Advance 30 minutos, para posteriormente hacer unlavadoconPBSTdurante10minutos.

Los cortes se colorearon durante 5 minutos utilizando diaminobenzidina (Sigma-Aldrich.

Saint Louis MO. USA) y se realizó contratincióncon hematoxilina de Harris durante 60 segundos. Posteriormente los cortes se lavaron con agua corriente y se colocaron 3 segundos en aguaamoniacal. Se lavaron nuevamente en agua corriente para finalmente realizar deshidratación,aclaración en xilol y el montaje en resina. Comocontrolespositivosseutilizaronhígadoyovariodetilapia hembra sexualmente madura. Para verificary controlar la ocurrencia dede tinción inespecíficaalgunos cortes no se procesaron con el anticuerpoprimario.Paralaevaluacióndelainmunomarcaciónse empleo un microscopio óptico Leica DMLB(MeyerInstruments, Houston, TX, USA) y sedeterminó la positividad o negatividad en lostejidos para cada grupo experimental siguiendo laspautas sugeridas para los procesos de calidad eninmunohistoquímica(Baquero,2007).

Consideraciones éticas

En esta investigación se acató la normatividad vigente en Colombia para la investigaciónBiomédica: ley 84 de 1989 y las normasreglamentarias de la resolución 08430 de 1993del Ministerio de Salud. El trabajo fue aprobadopara su realización por elComité deBioética parala Experimentación Animal de la Universidadde Antioquia, Acta No.44 de agosto de 2008. Elpersonal encargado del experimento observó lasmedidasdeseguridadrecomendadasparaelusodelproducto. El Clorpirifos es un producto aprobadoen los Estados Unidos por la FDA-CVM. EnColombia está aprobado su uso como insecticidaparaelcontrolde insectosdepastosycultivosporelInstitutoColombianoAgropecuarioICA.

Método estadístico

Despuésdeobtenidoslosanálisisdelaboratoriose creó una base de datos en el paquete Excel,luego se efectuó su control de calidad verificandola adecuada consignación de la informacióny se realizó el análisis estadístico referido acontinuación.

Seempleóundiseñocompletamentealeatorizado,efecto fijo, desbalanceado, con análisis MANOVA,donde se emplearon contrastes canónicos de tipoortogonal, basado en la familia Box-Cox, con el



objetivo de encontrar por máxima verosimilitudel λ óptimo para hacer ajuste a la información. Sevalidaron los supuestos tanto del MANOVA paracada tipo de situación experimental. El análisis devarianza mediante el método MANOVA se realizóporetapasencadaperíododetiempo,conbaseeneldiseño completamente aleatorizado y entre tiemposcon base en un diseño por bloques aleatorizados,dondecadatiempofueelefectodebloque.

También se empleó análisis descriptivo de tipounivariado, el que permitió construir intervalos deconfiabilidadparacadagrupodelesiones,conajustedebidoaltamañodelamuestra,empleandounerrorde tipo I del 5%. Para calcular el porcentaje deanimalesquepresentaronunalesióndeterminada,seutilizólasiguientefórmula:

%Lesión=Número de animales con la lesión/total de animales evaluados x 100

Resultados

Parámetros de calidad del agua

Los parámetros de calidad del agua semantuvieron constantes durante la faseexperimental. La temperatura promedio en losacuariosfuede24±0.8ºC,elpHpromediofuede6.90 ± 0.20 y el oxígeno disuelto en los acuariosfue de 7.0 ± 0.2 mg/L, con una dureza total delaguade80mg/L.Estosparámetros se encontraronen los rangos óptimos propuestos para tilapia encondicionesdecultivo(Córdoba,2006).

Manifestaciones clínicas

Noseobservaronmanifestacionesclínicasenlospecesdurantelafaseexperimental,relacionadasconlostratamientosutilizadosduranteelperíododiurnode 12 horas por día de observación de los peces(6:00a.m.a6:00p.m.).

Mortalidad durante el período del ensayo

En el tratamiento de 12 µg/L se presentaron dosmuertos para la primera semana del experimentoy uno para la tercera semana. En el tratamiento de 8 µg/L sólo se presentó un muerto en la tercerasemanadelexperimento.Paraeltratamientode4µg/Lse presentaron dos muertes la primera semana del

experimento. No se presentómortalidad en el grupocontrol. En general, las muertes ocurrieron en horas de lanoche,períodoenquenoseobservabaalospeces,estosseencontraronenlamañanafueradelosacuarios(saltaronalexterior).Alrealizarlasnecropsiasdeestosanimalessusórganospresentaronautolisisynofueronaptosparaanálisishistopatológico.

Índice hepatosomático (IHS) e índice gonadosomático (IGS)

Al analizar todos los tratamientos durante el período del experimento no se encontró diferenciaestadística significativa para las variables IGS eIHS,alosdías7,14,21y28(p≥0.05)(Tabla2).

Tabla 2. Índices hepatosomático (IHS) y gonadosomático (IGS) en machos de tilapia expuestos a dosis variables de Clorpirifos.

Tratamiento 7 14 21 2812µg/L n=8 n=7 n=8 n=9

IHS 3.44 ± 0.83 2.94 ± 0.87 2.58 ± 0.56 2.75 ± 0.54IGS 0.49 ± 0.45 0.44 ± 0.19 0.59 ± 0.45 0.52 ± 0.32

8µg/L n=6 n=8 n=8 n=8IHS 3.52 ± 0.38 3.05 ± 0.77 4.48 ± 4.38 2.52 ± 0.62IGS 0.53 ± 0.25 0.36 ± 0.34 0.69 ± 0.72 0.70 ± 0.58

4µg/L n=8 n=8 n=7 n=9IHS 3.71 ± 0.41 2.84 ± 0.48 3.40 ± 0.73 3.85 ± 0.65IGS 0.51 ± 0.22 0.55 ± 0.46 0.26 ± 0.15 0.49 ± 0.22

Control n=3 n=3 n=3 n=3IHS 3.31 ± 0.23 3.27 ± 0.28 2.62 ± 0.63 2.90 ± 0.23IGS 0.49 ± 0.36 0.39 ± 0.17 0.41 ± 0.47 0.20 ± 0.02

Hallazgos macroscópicos

La evaluación macroscópica de los órganosevidenció en forma general las siguientescaracterísticas: branquias rojizas en forma difusa,las que ocasionalmente presentaron moco blanco-grisáceoentre losfilamentos;hígadosde color rojizocon áreas blanco amarillentas irregulares distribuidas enunpatrónmultifocal;riñonesdecolorrojointensoydifuso.Lasgónadasengeneralsecaracterizaronporsucolorblancoamarillentodifuso.Noseobservaronalteracionesmacroscópicasenelencéfalodelospeces.

Hallazgos histopatológicos

Se evaluaron las lesiones histopatológicasen branquias, hígado, encéfalo, riñón y gónada.La tabla 2 resume las principales alteracioneshistopatológicas que pueden considerarse comoefecto del tratamiento con Clorpirifos a dosissubletales durante un período de 28 días. Las



principales alteraciones en orden de importanciase encontraron en encéfalo, riñón e hígado,encontrando diferencias estadísticas significativas(p<0.05) entre los tratamientos con relación a las

dosis utilizadas de Clorpirifos. La tabla 3 incluyelas principales lesiones encontradas en tilapiasexpuestas a dosis subletales de Clorpirifos por unperíodode28días.

Tabla 3. Principales lesiones encontradas en tilapias expuestas a dosis subletales de Clorpirifos por un período de 28 días.

Lesiones 4 μg/L 8 μg/L 12 μg/L Control WilksLambdan % n % n % n %

Alteraciones degenerativas tectum 20 62.50 21 67.74 28 87.50 1 8.33 0.0001

Gliosis tectum optico 14 43.75 19 61.29 30 93.75 0 0 0.0001

Nefrosis vacuolar 28 87.50 22 70.96 29 90.62 0 0 0.0001

Hiperplasia glomerular 16 50.00 20 64.52 27 84.38 0 0 0.0001

Alteraciones nucleares hígado 17 53.13 26 83.87 31 96.87 0 0 0.0001

Gránulos hialinos hígado 16 50.00 21 67.74 25 78.13 0 0 0.0001

Gránulos hialinos riñón 9 28.13 11 35.48 14 43.76 0 0 0.0001

Para el caso del encéfalo, las principalesalteraciones encontradas fueron: vacuolización ygliosis difusa del tectum óptico (Figura 1). Estasalteraciones fueron mayores en el tratamientode 12 µg/L, al compararlas con los tratamientos

de 4 y 8 µg/L. El grupo control no presentó lasalteraciones descritas. Al realizar el análisis MANOVAseencontrarondiferenciassignificativas(p<0.0001)paralasdosalteracionesdescritasentrelostratamientosyelgrupocontrol.

Figura 1. Cerebro. Tectum óptico. A, Tectum normal, grupo control, zona gris periventricular flecha (20X H-E). B, Vacuolización, congestión y gliosis del tectum en zona gris periventricular (flecha), tratamiento clorpirifos 8 μg/L día 21, (20X H-E). C, Vacuolización, gliosis y congestión del tectum en zona gris periventricular, tratamiento clorpirifos 12 μg/L día 21, (40X H-E).

En el riñón, las alteraciones encontradas fueron:vacuolización severa y extensa de los túbulosproximales, gránulos hialinos intracitoplasmáticosen túbulos y el agrandamiento glomerular condisminucióndelespaciourinario(espaciodeBowman)(Figura 2). Al realizar el análisis MANOVA seencontraron diferencias significativas (p<0.0001) enunadimensiónparatodaslaslesionesdescritas.

La vacuolización de los túbulos proximalestambién denominada nefrosis vacuolar, fue uncambio frecuente relacionado directamente conlos tratamientos utilizados, siendo mayores los

efectos conforme se incrementó la dosis. El grupocontrol no presentó las alteraciones descritas y fuediferente estadísticamente de los tratamientos de4 y 8µg/L.La acumulación intracitoplasmáticadeinclusioneseosinófilasenlascélulasde los túbulosrenales presentó diferencias significativas entreel tratamiento de 12 µg/L y el grupo control. Elagrandamientoaparentedelosovillosglomerularesy el efecto asociado de disminución del espaciourinariopresentódiferenciassignificativasentrelostratamientos en forma similar a la observada en lanefrosisvacuolar(p<0.0001).



Figura 2. Riñón. A, Grupo control 28 días. Apariencia normal de glomérulo y estructuras tubulares ( H-E 40X). B, Nefrosis vacuolar severa epitelio tubular (flecha) e hiperplasia de glomérulos y reducción de espacio de Bowman (cabeza de flecha), tratamiento 12 μg/L, 28 días, (H-E 40X). C, Gránulos hialinos intracitoplasmáticos en epitelio tubular, tratamiento 12 μg/L, 28 días, flecha (H-E 40X).

Las lesiones encontradas en los hígadosfueron: degeneración grasa, congestión sinusoidal,infiltrado de células granulares eosinofílicasasociadas principalmente a grandes vasos portales,alteraciones nucleares como cariomegalia ybinucleación, y por último la presencia de

inclusiones eosinófilas en el citoplasma de loshepatocitos (Figura 3). Al realizar el análisisMANOVA se encontró significancia en unadimensión (p<0.0001), para las alteracionesnuclearesylapresenciadegránuloscitoplasmáticoseosinófilosentrelostratamientos.

Figura 3. Hígado. A, Característica normal de hepatocitos, grupo control, (H-E 40X) B, Tumefacción de hepatocitos y cambios nucleares del tipo cariomegalia (flecha) tratamiento de 12 μg/L, 28 días, (H-E 40X). C, Cambios similares a los descritos para la imagen B, adicionalmente las flechas indican la presencia de gránulos hialinos en el citoplasma de hepatocitos, tratamiento de 12 μg/L, 28 días, (H-E 40X)

En las branquias se encontraron lesionesfrecuentes como: atrofia, fusión, hiperplasia ycongestión lamelar. Sin embargo, al realizar el análisis MANOVA no se encontró diferenciaestadística para las lesiones entre los tratamientos.(p>0.05).

El 100% de las gónadas estudiadas presentaronmadurez, caracterizada por la presencia deespermatozoides y espermátidas en las lucestubulares.Como lesiones frecuentesseencontraronpara los diferentes tratamientos fibrosis intersticialyvacuolizacióndelepiteliogerminal.Sinembargo,al realizar el análisis MANOVA no se encontrósignificancia en ninguna dimensionalidad para laslesionesentrelostratamientos(p>0.05).

Hallazgos inmunohistoquímicos

La inmunomarcación de Vtg en hígado seevidenció en los hepatocitos como granulacionespequeñas de color café en su citoplasma; confrecuencia estos gránulos se agruparon hacia lacara sinusoidal del hepatocito. De igual manera,se observó inmunomarcación en los sinusoides yen el plasma retenido en las estructuras vascularesde mayor calibre relacionadas tanto con los vasoscentrales del lobulillo y los vasos portales (Figura4). Las inclusiones intracitoplasmáticas eosinófilasobservadas con la coloración de hematoxilina –eosinanofueronpositivasparalainmunomarcación.



Figura 4. Inmunomarcación en hígado. A, Hígado de tilapia hembra madura. Control positivo inmunomarcación Vtg. Se observa positividad en citoplasma de hepatocitos, sinusoides y plasma de vaso portal. B, Hígado de tilapia hembra madura. Control negativo inmunomarcación Vtg. C, Inmunomarcación de Vtg en hígado de tilapia macho al día 28 del tratamiento 4μg/L. La marcación es evidente en sinusoides. La marcación en hepatocitos es tenue y granular. D, Hígado de tilapia macho. La inmunomarcación es negativa en los gránulos eosinófilos citoplasmáticos presentes en los hepatocitos, en hígado de tilapia macho al día 28 del tratamiento 4μg/L (flecha). Inmunohistoquímica. Técnica del polímero Advance. DAB. Hematoxilina de Harris 40 X.

La inmunomarcación de la Vtg en el tejidotesticular estuvo relacionada principalmente con eltejido intersticial y asociada directamente con losvasossanguíneosallípresentes.Deigualmaneraaloencontradoparaelhígado,lainmunomarcaciónsehizoevidente en los grandes vasos asociados al mediastino de la gónada. En forma esporádica la marcación sepresentóenelepiteliogerminaldelórgano(Figura5).

Figura 5: A. Inmunomarcación testículo de tilapia en el tejido intersticial, vascularización y plasma al día 21 del tratamiento 12μg/L. B. Inmunomarcación negativa testículo de tilapia macho día 21 del tratamiento 12 μg/L. C. Inmunomarcación en testículo de tilapia en tejido intersticial al día 14 del tratamiento 4 μg/L. D. Inmunomarcación para Vtg en tejido intersticial y en el epitelio espermático (flecha). Inmunohistoquímica. Técnica del polímero Advance. DAB. Hematoxilina de Harris. 40X

Las figuras 6 y 7 presentan la evolución dela inmunomarcación de Vtg observada en los tejidos hepático y gonadal en los machos detilapia expuestos a concentraciones subletales deClorpirifosduranteunperíodode28días.

Figura 6. Evolución inmunomarcación de Vtg en hígado de machos juveniles de tilapia expuestos a dosis bajas de Clorpirifos. Los resultados se expresan como promedio de inmunomarcación ± Error Estándar de la Media.

0d 7d 14d 21d 28d 35d0

50

100

150Control4 µg/L8 µg/L12 µg/L

Días

Prom

edio

pos

itivi

dad

Vtg

± EE

M

Figura 7. Evolución inmunomarcación Vtg en testículo de machos juveniles de tilapia expuestos a dosis bajas de Clorpirifos. Los resultados se expresan como promedio de inmunomarcación ± Error Estándar de la Media.

Al realizarelanálisisMANOVAnosepresentódiferenciaestadísticasignificativaparalamarcaciónde Vtg entre los diferentes tratamientos en losdías 7 y 14 de experimentación; (p>0.05, 0.7917y0.4918, respectivamente).En losdías21y28deexperimentación se presentó diferencia estadísticasignificativa (p< 0.001) para la marcación de Vtgentre el grupo control con relación a los otros trestratamientosde4,8y12µg/L(Tabla4).

Tabla 4. Análisis Multivariado de Varianza. Inmunomarcación vitelogenina en tilapias expuestas a dosis subletales de Clorpirifos por un período de 28 días.

Día Wilks’Lambda Pillai’s Hotelling-Lawley Roy’s7 0.7917 0.6707 0.7929 0.235914 0.4918 0.5165 0.4388 0.029321* 0.0001 0.0027 0.0001 0.000128* 0.0236 0.3781 0.0065 0.0001

* Se presentó diferencia estadística entre los tratamientos



Discusión

Los parámetros de calidad del agua evaluadosdurante el experimento no presentaron variacionessignificativasentrelosdiferentestratamientos.Estosparámetros en general se encontraron dentro delrango adecuado descrito para la especie (Córdoba,2006) y por lo tanto se considera que estos nose relacionan directamente con las alteraciones encontradasenlospecesevaluados.

No se observaron manifestaciones clínicasasociadas a las diferentes concentraciones deClorpirifos empleadas, aunque los compuestosorganofosforados se han considerado responsablesde efectos neurológicos y alteraciones delcomportamiento debido a su mecanismo de acción(Córdoba, 2001; Gul, 2005). Estas observacionesdifieren de lo observado en trabajos previos deexposiciónsubagudaconClorpirifosenjuvenilesdeP . reticulatadurante14días,enlosqueseevidenciaronmanifestaciones clínicas de parálisis y edema ventralque se relacionaron directamente con la dosis deltóxico(DeSilvaySamayawardhena,2005).

Las concentraciones utilizadas en nuestro estudio se ubican entre el 4% y 10% de la CL-50para laespecieynoindujeronefectosclínicamenteobservables;estoposiblementesedebióa lasbajasconcentración utilizadas, a una mayor resistenciarelacionada con la edad de los individuos y a lasinergiade losdosfactoresanterioresfavoreciendouna detoxificación más eficiente del compuestotóxico (Dai et al.,2001).

La toxicidad de los pesticidas es altamentedependientedeladuración,frecuencia,eintensidadde la exposición, pero de igual manera esimportantelasusceptibilidaddelorganismoblanco,lo que está influenciado por la edad, el estado desalud y la variación genética (Chandrasekara yPathiratne, 2007). La inhibición de la actividadde la enzima acetilcolinesterasa en el cerebro del pez en exposiciones tóxicas a compuestosorganofosforados es muy específica y lasconcentracionescercanasalaCL50puedeninducirunadisminucióndel60%enlaactividadfisiológicanormal (De Silva y Samayawardhena, 2005,RajeswaryyRamudu,2005).

Las muertes ocurridas durante el experimento,probablementefueronaccidentales,ocasionadasporasfixia en peces que escaparon de los acuarios, esimportante indicar que lasmuertes cesaron cuandoseutilizaronmayasparacubrirlosacuarios.

IHS e IGS

En este estudio no se encontraron diferenciassignificativas entre los tratamientos con Clorpirifosy los índices hepatosomático y gonadosomático.Esto puede explicarse por la presencia de lesionescomo cambio vacuolar hepático presentes en losgrupos control y en los tratados, no inducidas porlos tratamientos. Adicionalmente, las dosis utilizadas probablemente no fueron lo suficientementealtas para incrementar el grado de lesiónhepática y gonadal, de manera que modificaransignificativamente los valores de estos índices enlos grupos experimentales. Es importante destacarqueelconsumodealimentonosemodificóentrelosdiferentesgrupos,duranteelperíododeestudio.

Histopatología

Los principales órganos afectados por laexposiciónsubagudaalClorpirifosfueron:encéfalo,riñón e hígado; y las principales alteracionesasociadasparadichaexposiciónfueron:alteracionesdegenerativas y gliosis del tectum óptico, nefrosisvacuolar, hiperplasia glomerular, alteracionesnucleares en hígado, y gránulos eosinófilos enhígadoyenriñón.Esteesunodelospocosestudiosa nivel mundial que describe los efectos delClorpirifos sobre diferentes órganos en peces, laslesionesentectumópticoyenhígadocoincidenconlas descritas previamente por otros investigadores(RajeswaryyRamudu,2005).

En el estudio se encontró diferencia estadísticasignificativa para la frecuencia de lesiones en elencéfalo, riñón e hígado, entre el grupo control ylos tratamientos, lo que sugiere que estos son losprincipales órganos afectados por el Clorpirifos abajasconcentracionesencondicionesdeexposiciónsubaguda.

En el encéfalo, en los peces tratados con lasdiferentes concentraciones de Clorpirifos huboun incremento en el espesor de la zona gris



periventricular del tectum óptico. Este incrementosedebióavacuolizacióndifusadeestazona, juntocon gliosis y congestión multifocal. Los efectosadversos en el encéfalo tuvieron una relacióndependientedeladosis.

El cerebro es el primer órgano blancoafectado por los pesticidas organofosforados (DeSilva y Samayawardhena, 2002). En el cerebroel Clorpirifos interfiere con la actividad deenzimas como la acetilcolinesterasa, llevándola a una disfunción progresiva y en último caso a suinhibición (Córdoba, 2001). Estas alteracionesen conjunto se han descrito poco en la literatura;sin embargo, estudios previos realizados en pecesjuveniles de Oreochromis mossambicus utilizando dosissubletalesentre34y100ug/Lporunperíododesietedías,relacionanestasalteracionesenformadirectaconladosisutilizada(RajeswaryyRamudu,2005). El tectum óptico de los peces es un centroque orienta patrones de respuesta que incluye losmovimientos coordinados de la musculatura axial, aletas y ojos, las cuales constituyen respuestasnaturalesdelospeces(Cerdáet al.,2008).

Como se indicó previamente no se observaronmanifestaciones clínicas compatibles con efectosde inhibición de colinesterasas. Lo anterior sugiere que posiblemente el grado de alteracióntisular encontrado en éste estudio no implicaefectos clínicos evidentes. Infortunadamente lostrabajos realizados con Oreochromis mossambicus (Rajeswary y Ramudu, 2005), utilizando dosissubletales mucho mayores a las aquí empleadas,no relacionan los efectos clínicos asociados conlas lesiones y las dosis utilizadas. No obstante, laaparición de lesiones en el tectum óptico comolas aquí descritas en peces de cultivo o delmedionatural, debe alertar sobreunposible efecto tóxicocausado por organofosforados, el cual deberácomprobarseconevaluacionescomplementarias.

Eneltejidorenallavacuolizacióndelascélulasepiteliales tubulares fue un cambio relacionadodirectamente con los tratamientos utilizados. De lo anterior seconcluyequeestecambioesuna lesióndegenerativa,alaqueotrosautoreshandenominadonefrosis vacuolar (Ferguson, 2006).Esta alteración

ha sido descrita previamente en trabajos deexposición a cadmio (Thophon et al., 2003),mercurio (Banerjee y Bhattacharya, 1994) y se haasociadoalatoxicidadporpesticidas,entreelloselglifosato(Eslavaet al.,2007).

La acumulación intracitoplasmática deinclusioneseosinófilasenlascélulasde los túbulosrenales presentó diferencias significativas entreel grupo no expuesto y el grupo dosificado con lamayorconcentracióndeClorpirifos.Estaalteraciónha sido descrita previamente en Colombia porotros autores, asociándose con exceso de proteína(Iregui et al., 2004) y con toxicidad por glifosato(Eslava et al., 2007). Este cambio podría deberseen este estudio a un aumento en la absorción de proteínas del filtrado glomerular o a sobrecargaen los túbulos proximales como ha sido propuestoantes (Jiraungkoorskula, 2002; Read, 1991), comoconsecuenciadelaexposiciónalClorpirifos.

El agrandamiento aparente de los ovillosglomerulares y la disminución del espacio urinarioasociado, presentó diferencias significativas entrelostratamientosenformasimilaralaobservadaenlanefrosisvacuolar.Estaalteraciónhasidodescritapreviamente por otros autores y se ha relacionadodirectamente al impacto del tejido renal porxenobióticos y por agentes infecciosos (Simpsonet al., 2000). En este estudio este hallazgo podríaexplicarse comounefectodirectode la exposiciónalClorpirifos.

Enelhígadosepresentódiferenciasignificativaentre los tratamientos para las alteracionesnucleares, con respecto al control, con predominiode cariomegalia y binucleación. Estas lesionesse han reportado previamente en estudios enpeces de estuario (Simpson et al., 2000) y bajola exposición al glifosato (Eslava et al., 2007).Estos cambios, y principalmente la cariomegaliasehaobservadocomouna lesiónen respuesta a laexposición a tóxicos y a químicos carcinogénicos(Stentiford et al., 2003). De esta manera, ladetección histopatológica de atipias nuclearespodría ser útil como biomarcador de la exposicióna contaminantes, donde el Clorpirifos podríadesempeñarunpapelimportanteparasudesarrollo.



La presencia de inclusiones eosinófilas en elcitoplasma de los hepatocitos también fue unalesión relacionada directamente a las mayoresconcentraciónes de Clorpirifos. Al parecer estosgránulos hialinos están compuestos esencialmentede albúmina sérica y el desarrollo de estasinclusiones citoplasmáticas se puede deber alaumentoensudisponibilidadyaalteracionesenlapermeabilidad producidas por un incremento en lapresiónportal(Schlicht,1963).

Ultraestructuralmente las gotas hialinasposeen una matriz granular limitada porretículo endoplásmico rugoso, o bien puedenestar constituidas por lisosomas secundarios(Papadimitriou et al., 2000). Esta lesión se haasociadoaexcesosdeproteína(Ireguiet al.,2004)y se ha observado en peces expuestos a glifosato(Eslava et al., 2007). En este estudio se constataque también puede ser ocasionada por exposiciónsubagudaaClorpirifos.

No se encontraron diferencias estadísticaspara las lesiones en las branquias. Estas lesionespodrían deberse a un efecto asociado a la calidaddel agua, y a variables diferentes a los parámetrosfísico químicos evaluados, sugiriendo exposición aposibles contaminantes.Las branquias por estar encontacto directo con elmedio acuático constituyenun blanco primario para contaminantes irritantes(Ferguson et al., 1992). Las lesiones encontradasenbranquiasnoestánasociadasauncontaminanteparticular y pueden ser originadas por metalespesados, pesticidas y xenobióticos orgánicoscomo se ha comunicado previamente (Eslava et al., 2007). De esta manera y bajo las condicionesdel estudio, estas lesiones no se pueden definircomo biomarcadores específicos de exposición alClorpirifos.

De igual manera a lo observado en las branquias, no se encontró diferencia estadísticasignificativa para las lesiones presentes en lasgónadas. Al estudiar las gónadas no se observó la presencia de ovocitos. Las lesiones encontradasde fibrosis intersticial y vacuolización del epiteliogerminal son lesiones asociadas a la exposiciónexperimental con algunos xenoestrógenos (Folmar,2001; Rasmussen et al., 2005) y reportadas

previamentepor otros autores enpeces de estuarioimpactados con químicos disruptores (Carballoet al., 2005; Simpson et al., 2000; Stentiford et al., 2003). De esta manera y bajo las condicionesde nuestro estudio, estas lesiones no se puedendefinir como biomarcadores específicos deexposiciónalClorpirifos,perosugierenlapresenciade contaminantes en el agua utilizada en el experimento.

Inmunohistoquímica

En este trabajo se verificó la inducción deVtgen hígado y gónada de los animales expuestosa bajas concentraciones de Clorpirifos 4, 8 y 12µg/Lyenlosnoexpuestos;encontrandodiferenciaestadística en la expresión de esta proteína entreel grupo control y los grupos con tratamiento. Ladetección de Vtg por inmunomarcación en pecesmachos confirmó la presencia de exposicióna xenoestrógenos. La Vtg es una proteínaespecíficade lashembras, sintetizadaenelhígado,transportada a través de la sangre a los oocitos encrecimientoyqueseacumulaenelsacovitelinodelospecescomoreservadealimentoparaembrionesy estadios larvales de los peces (Arukwe et al ., 2003).LasíntesisdeVtgeshormono-dependiente,y estámediadapor la interacciónentre el estradioly los receptores de estrógenos (REs), llevando ala inducción de los genes y a su transcripción. Enmachos la activación de genes que responden aestrógenos se produce por muchos disruptoresquímicos,comoestrógenossintéticos,alquilfenoles,fitoestrógenos y algunos pesticidas (Canapa et al., 2007; Desantis et al., 2005), los cuales puedeninterferir con la liberación de las gonadotropinas,la esteroidogénesis y con la unión a los receptoresde estrógenos nucleares (Frenzilli, 2008). Por estarazón,lapresenciadelaproteínaVtgolaexpresióndel gen de Vtg en machos se considera como un indicador de polución por xenoestrógenos (Folmaret al., 2000; Hemmer et al.,2008).

Las especies acuáticas parecen serparticularmente vulnerables a los químicosdisruptores endocrinos, debido a que susecosistemas reciben una amplia variedad decontaminantes (Ferreira, 2008). Este es el casodel presente trabajo donde la inmunomarcación



paraVtgsepresentó tantoen losanimales tratadoscon Clorpirifos, como en el grupo control sintratamiento. Lo anterior sugiere que la expresiónde Vtg observada en machos de tilapia se debe axenoestrógenos circulantes en el agua utilizada en este experimento, procedente de un acueductomunicipal. La producción anómala de Vtg enmachos o peces inmaduros se mide comúnmentecomo el punto final de exposición para químicoso contaminantes xenoestrogénicos en especies depeces(Canapaet al.,2007).

En este estudio, la inmunomarcación de Vtg se verificó para el caso del tejido hepático en elcitoplasma de los hepatocitos, sinusoides y plasmaretenido de venas centrolobulillares y de vasosportales. Esta marcación ha descrito sido similaren trabajos previos de otros autores (Beyer et al., 2007). La Vtg se produce primariamente en loshepatocitos,perodeigualmaneraaunqueconbajosnivelesdetranscritos,sehadetectadoeneltestículodevariasespeciesdepeces(Blumet al.,2008).

Para el caso del tejido gonadal en este estudiola inmunomarcación encontrada está de acuerdo a la descrita por otros investigadores (Davis et al., 2008), siendo esta prominente en el tejidointersticial, asociada a las estructuras vasculares y con menor frecuencia en el epitelio germinaltesticular.

En conjunto la evidencia de la Vtg en lostejidos evaluados está de acuerdo a lo relatadoanteriormente (Beyer et al., 2007). Luego de lainducción de su síntesis en el tejido hepático,la Vtg es secretada de los hepatocitos y pasa alos sinusoides y de allí a la circulación general.Al parecer la Vtg es una proteína de secreciónrápida, esto es sugerido por lamarcación un pocomás tenue en el citoplasma de los hepatocitos delos machos de este estudio, en contraste con la marcaciónmás fuerteen lasestructurasvasculares,de manera similar a lo comunicado antes porCanapaet al(2007).

La expresión de Vtg en el tejido hepáticoy gonadal en este trabajo presentó diferenciasestadísticas significativas entre los tratamientos,siendo mayor en los grupos testigo y expuesto a

4 µg/L de Clorpirifos que en los tratamientos de12 y 8 µg/L, para los días 21 y 28 de exposición.Las concentraciones crecientes de Clorpirifos enéste estudio, indujeron un efecto negativo sobrela expresión de Vtg, lo que sugiere un efecto debloqueo de la síntesis de la proteína (Park et al ., 2007), dependiente de la concentración de ésteinsecticidaydeltiempodeexposición.

Una respuesta en la expresión de Vtg, comola observada en este estudio no se ha reportadopreviamente, esto hace necesario plantear algunasposibles explicaciones al respecto, que deberáncomprobarse en el futuro empleando modelosexperimentales in vitro e in vivo, como los que sehan reportado previamente (Andersen et al ., 2002, Kimet al .,2003) .

Esta respuesta antiestrogénica, podría debersea que las concentraciones experimentales deClorpirifos saturaron los receptores (REs)inhibiendo la síntesis de Vtg; a que el Clorpirifosse une a los REs produciendo una alteraciónconformacional, la cual aunque permitela dimerización del receptor y la unión alcontrareceptor falla en activar la transcripción o, aqueelClorpirifosnoactivalosREsycausebloqueode estos, actuando como antagonista (Lazier et al., 1996).

Lo anterior indica la necesidad de realizar futurosestudiosparacaracterizaranivelmolecularlosefectosdelClorpirifossobrelaexpresióndeVtg.

Estos resultados también podrían deberse auna alteración en la tasa de inducción deVtg porefecto del agua utilizada en el experimento, quesi bien provenía de un acueducto municipal y sedestinaba al consumo humano, podría contenerxenoestrógenosquenofuerondeterminadosenesteestudio por exceder los objetivos y los recursosdisponiblesparaello.EstosxenoestrógenospodríanhabercompetidoporlauniónalosREsalterandolasíntesisdeVtg.

De este estudio se concluye que la exposiciónsubaguda al Clorpirifos provoca cambioshistopatológicos en el tectum óptico, el riñón y elhígado, e induce la expresión de Vtg en relación



inversa a la concentración utilizada, esto sugiere unefectodebloqueoenlasíntesisdeestaproteínadependiente la concentración de este insecticida.Adicionalmente, se determinó la expresión deVtg en tilapias sin tratamiento lo que insinúa lapresencia de xenoestrógenos en el agua de unacueductomunicipal enAntioquiautilizadapara elconsumo humano. Investigaciones futuras deberánincluir la identificación de los contaminantespresentesenelaguautilizadaenesteestudioyenelambiente acuático de la cuenca hidrográfica dondese origina.

En Norte América y en la unión europea sehan desarrollado múltiples investigaciones queproporcionan evidencia de disrupción endocrinaen ecosistemas acuáticos con énfasis particular encontaminantes estrogénicos. En esos países estasinvestigaciones han impactado la legislación ylas normas técnicas para monitorear disrupciónendocrina(MatthiessenyJohnson,2006).

Los resultados de este estudio, junto con losobtenidos por otros investigadores en Colombiaevaluando el impacto de los herbicidas y susmezclas (Eslava et al, 2007;Morales yRodríguez,2004;MurciayStashenko, 2008), sondocumentosclave, que sugieren la necesidad de establecerprogramas de monitoreo en nuestro medioque proporcionen información para la toma dedecisiones,queayudenaevaluarelimpactodeestoscontaminantes para la salud animal, para la saludpública, y para actualizar nuestra legislación alrespecto.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Politécnico Jaime Isaza Cadavidporelapoyobrindadodurantelaejecuciónde éste trabajo en sus instalaciones: Laboratoriode Bioensayos (San Jerónimo, Antioquia). Laejecución de esta investigación fue posible graciasalosrecursosconcedidosalgrupodeinvestigaciónen Ciencias Veterinarias Centauro en la Estrategia de Sostenibilidad 2009 – 2010 del Comité para elDesarrollodelaInvestigacióndelaVicerrectoríadeInvestigacióndelaUniversidaddeAntioquia.

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