2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Deskripsi dan Klasifikasi Tumbuhan Api-Api (A. marina)

Ekosistem mangrove merupakan sumber alami tannin dan kayu yang

bernilai tinggi. Sebagai contoh, batang kayu rizhopora yang keras digunakan

untuk pembuatan kapal tahan rayap dan organisme laut (Rao 1994). Tanaman

mangrove dipakai sebagai obat masyarakat untuk mengobati beragam penyakit

selama berabad-abad. Beberapa tanaman mangrove telah ditapis beberapa

aktivitasnya, yaitu antiviral, antibakteri, antibisul, dan antiinflamasi

(Agoramoorthy et al. 2008)

Tumbuhan A. marina merupakan salah satu jenis mangrove yang sudah

lama dikenal oleh penduduk di Indonesia, mereka mengenalnya dengan nama

yang berbeda-beda tergantung pada daerah masing-masing. Di Pulau Jawa

tumbuhan ini dikenal dengan nama pohon Api-api, di Pulau Bali dikenal dengan

nama pohon Prapat dan di Sumatera Selatan dikenal dengan nama kayu Api-api

betina (Yusuf 2010). Bentuk dan morfologi daun Api-api dapat dilihat pada

Gambar 1. Klasifikasi A. marina menurut Duke et al. (2008) adalah sebagai

berikut:

Kingdom : Plantae

Filum : Thacheophyta

Kelas : Magnoliopsida

Ordo : Lamiales

Famili : Avicenniaceae

Genus : Avicennia

Spesies : Avicennia marina (Forsk.) Vierh

Gambar 1 Daun Api-api (A. marina) (Sumber: Borkar et al. 2011)

5

Tanaman Api-api (A. marina) termasuk pepohonan semak hingga medium

dengan ketinggian 2-5 meter (Peng dan Xin-men 1983). Spesies ini ditemukan

dari daerah hilir hingga pertengahan perairan payau di semua kawasan pasang

surut (Robertson dan Alongi 1992). Menurut Peng dan Xin-men (1983) A. marina

ditemukan di mulut sungai atau di area pasang terendah dan toleran terhadap

salinitas maksimum air payau, yaitu 85 ppt (part per thousand). Pertumbuhan

optimal terdapat pada salinitas 0-30 ppt (Robertson dan Alongi 1992).

Supriharyono (2002) menyatakan bahwa A. marina merupakan salah satu jenis

penyusun magrove yang dapat bertahan pada tempat-tempat yang bersalinitas

hingga lebih dari 90 ‰.

Tanaman Api-api (A. marina) memiliki banyak sekali manfaat dan

kegunaan, baik dalam bidang pangan, pakan, perumahan, farmasi dan lain

sebagainya. Yusuf (2010) menyebutkan, tumbuhan kayu Api-api (A. marina)

dapat digunakan untuk kayu bakar, perabot rumah tangga, mengasapi ikan, juga

dapat digunakan untuk membuat lumpang padi. Kulit batangnya dapat

dimanfaatkan sebagai obat-obatan tradisional misalnya obat sakit gigi, dan

menurut Yusuf (2010) kulit batangnya mempunyai khasiat terhadap penurunan

produksi hormon seksual (afrodisiaka) dan sering digunakan sebagai antifertilitas.

Buahnya dapat dimakan dengan merebusnya terlebih dahulu, kemudian direndam

semalam lalu dibersihkan dari kotorannya. Api-api (A. marina) secara tradisional

telah dimanfaatkan sebagai obat-obatan untuk rematik, cacar air, borok/bisul dan

penyakit ringan lainnya (Bandaranayake 2002). Tariq et al. (2007) menyatakan

bahwa A. marina melepaskan senyawa- senyawa yang bersifat toksik terhadap

nematoda yaitu phenol, tannin, azadirachtin dan ricinin.

2.2 Radikal Bebas

Radikal bebas adalah molekul yang kehilangan elektron, sehingga molekul

tersebut menjadi tidak stabil dan selalu berusaha mengambil elektron dari molekul

atau sel lain. Beberapa contoh senyawa Reactive Oxygen Spesies (ROS) yang

ditemukan pada organisme hidup adalah superoksida (O2*), hidroksil (OH*),

peroksil (RO2*), alkoksil (RO*) dan hidroperoksil (HO2*). Nitrit oksida dan

nitrogen oksida (*NO2) adalah dua radikal bebas nitrogen. Radikal bebas oksigen

dan nitrogen dapat dikonversi menjadi spesies reaktif non radikal lain, misalnya

6

hidrogen peroksida, asam hipoklorit (HOCl), asam hipobromous (HOBr), dan

peroksinitrit (ONOO-). Reactive Oxygen Spesies (ROS), Reactive Nitrogen

Spesies (RNS) diproduksi di dalam tubuh manusia secara fisiologis dan patologis

(Fang et al. 2002).

Radikal bebas dapat menyebabkan oksidasi DNA, sehingga DNA

termutasi dan menimbulkan kanker (Muchtadi 2000). Radikal bebas merupakan

penyebab timbulnya penyakit jantung koroner. Hal ini dikarenakan molekul besar

lemak yang disebut LDL atau low density lipoprotein teroksidasi oleh radikal

bebas akan mengendap di pembuluh darah jantung sehingga menjadi sempit dan

aliran darah terganggu sehingga sebagian sel-sel jantung tidak cukup makanan dan

mati. Selain itu, kerusakan protein akibat elektronnya diambil oleh radikal bebas

dapat mengakibatkan sel-sel jaringan tempat protein berada menjadi rusak dan

banyak terjadi pada lensa mata sehingga menyebabkan penyakit katarak

(Kumalaningsih 2006).

2.3 Antioksidan

2.3.1 Definisi antioksidan, jenis dan sumbernya

Secara umum, antioksidan didefinisikan sebagai senyawa yang dapat

menunda, memperlambat dan mencegah proses oksidasi. Dalam arti khusus,

antioksidan adalah zat yang dapat menunda atau mencegah terjadinya reaksi

oksidasi radikal bebas dalam oksidasi lipid (Kochar dan Rossell 1990). Sauriasari

(2006) menyatakan bahwa antioksidan adalah zat yang dapat melawan pengaruh

bahaya radikal bebas atau Reactive Oxygen Spesies (ROS) yang terbentuk sebagai

hasil dari metabolisme oksidatif yaitu hasil dari reaksi- reaksi kimia dan proses

metabolik yang terjadi di dalam tubuh.

Antioksidan merupakan garis depan pertahanan kita untuk melawan

kerusakan yang disebabkan radikal bebas. Kebutuhan antioksidan bahkan menjadi

lebih kritis seiring meningkatnya kehadiran radikal bebas (Percival 1998).

Antioksidan sangat bermanfaat bagi kesehatan dan berperan penting untuk

mempertahankan mutu pangan produk. Berbagai kerusakan misalnya ketengikan,

perubahan nilai gizi, perubahan warna dan aroma, serta kerusakan fisik lain pada

produk pangan karena oksidasi dapat dihambat oleh antioksidan (Trilaksani 2003).

7

Antioksidan sangat beragam jenisnya. Berdasarkan sumbernya

antioksidan dibagi dalam dua kelompok, yaitu antioksidan sintetik (antioksidan

yang diperoleh dari hasil sintesis kimia) dan antioksidan alami (antioksidan hasil

ekstraksi bahan alami) (Trilaksani 2003)

1) Antioksidan sintetik

Diantara beberapa contoh antioksidan sintetik yang diijinkan untuk

makanan, ada lima antioksidan yang penggunaannya meluas dan menyebar di

seluruh dunia, yaitu Butylated Hidroxy Anisol (BHA), Butylated Hidroxy Toluen

(BHT), propil galat, Tert-Butylated Hidroxy Quinone (TBHQ) dan tokoferol.

Antioksidan tersebut merupakan antioksidan alami yang telah diproduksi secara

sintesis untuk tujuan komersial (Buck 1991)

Butilated Hidroxy Anisole memiliki kemampuan antioksidan yang baik

pada lemak hewan dalam sistem makanan panggang, namun relatif tidak efektif

pada minyak tanaman. BHA bersifat larut lemak dan tidak larut air, berbentuk

padat putih dan dijual dalam bentuk tablet atau serpih, bersifat volatil sehingga

berguna untuk penambahan ke materi pengemas (Buck 1991; Coppen 1983)

Antioksidan BHT memiliki sifat serupa BHA, dan akan memberikan efek

sinergis bila dimanfaatkan bersama BHA, berbentuk kristal padat putih dan

digunakan secara luas karena relatif murah (Sherwin 1990). Antioksidan propil

galat mempunyai karakteristik sensitif terhadap panas, terdekomposisi pada titik

cairnya 148 oC, dapat membentuk komplek warna dengan ion metal, sehingga

kemampuan antioksidannya rendah. Propil galat berbentuk kristal padat putih,

sedikit tidak larut lemak tetapi larut air, serta memberi efek sinergis dengan BHA

dan BHT (Buck 1991). Rahardjo & Hernani (2006) menyatakan bahwa kedua

senyawa antioksidan (BHT dan BHA) tersebut banyak dimanfaatkan dalam

industri makanan dan minuman, namun beberapa hasil penelitian yang dilakukan

oleh para ilmuwan telah membuktikan bahwa antioksidan tersebut mempunyai

efek samping yang tidak diinginkan, yaitu berpotensi sebagai karsinogenik

terhadap efek reproduksi dan metabolisme, bahkan dalam jangka waktu lama tidak

terjamin keamanannya.

Tert-Butylated Hidroxy Quinone (TBHQ) dikenal sebagai antioksidan

paling efektif untuk lemak dan minyak, khususnya minyak tanaman karena

8

memiliki kemampuan antioksidan yang baik pada penggorengan tetapi rendah

pada pembakaran. Tert-Butylated Hidroxy Quinone (TBHQ) direkomendasikan

dengan BHA yang memiliki kemampuan antioksidan yang baik pada

pemanggangan, maka akan memberikan kegunaan yang lebih luas. Antioksidan

TBHQ berbentuk bubuk putih sampai coklat terang, mempunyai kelarutan cukup

pada lemak dan minyak, tidak membentuk kompleks warna dengan Fe dan Cu

tetapi dapat berubah menjadi warna merah jambu dengan adanya basa (Buck

1991). Tokoferol merupakan antioksidan alami yang dapat ditemukan pada

hampir di setiap minyak tanaman, tetapi saat ini telah dapat diproduksi secara

kimia. Tokoferol memiliki karakteristik berwarna kuning terang, cukup larut

dalam lipida karena rantai C panjang. Pengaruh nutrisi secara lengkap dari

tokoferol belum diketahui, tetapi α-tokoferol dikenal sebagai sumber vitamin E.

Di dalam jaringan hidup, aktivitas antioksidan tokoferol cenderung α->β->γ->δ-

tokoferol, tetapi dalam makanan aktivitas tokoferol terbalik δ->γ->β-> α-tokoferol

(Belitz et al. 2009). Tetapi menurut Sherwin (1990), urutan tersebut terkadang

bervariasi tergantung pada substrat dan kondisi lain.

2) Antioksidan alami

Antioksidan alami di dalam makanan dapat berasal dari (a) senyawa

antioksidan yang sudah ada dari satu atau dua komponen makanan, (b) senyawa

antioksidan yang terbentuk dari reaksi- reaksi selama proses pengolahan, (c)

senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami dan ditambahkan ke

makanan sebagai bahan tambahan (Pratt 1992). Senyawa antioksidan alami

diantaranya adalah asam fenolik, flavonoid, β- karoten, vitamin E (tokoferol),

vitamin C, asam urat, bilirubin dan albumin (Gheldof et al. 2002). Zat-zat gizi

mineral misalnya mangan, seng, tembaga dan selenium juga berperan sebagai

antioksidan (Mega dan Swastini 2010).

Antioksidan berdasarkan aktivitasnya dapat dibedakan menjadi antioksidan

primer dan antioksidan sekunder. Antioksidan primer adalah suatu zat yang dapat

menghentikan reaksi berantai pembentukan radikal yang melepas atom hidrogen.

Zat- zat yang termasuk golongan ini dapat berasal dari alam dan dapat pula buatan

misalnya tokoferol, lesitin, fosfatida, sesamol, gosipol, asam askorbat, BHA, BHT

PG (Propylgalate), dan NDGA (NorDihidro Guaioretic Acid) (Winarno 1980).

9

Antioksidan sekunder adalah suatu zat yang dapat mencegah kerja

prooksidan sehingga dapat digolongkan secara sinergik. Beberapa asam organik

tertentu, biasanya asam di- atau trikarboksilat, dapat mengikat logam-logam

(sequestran). Contoh lain antioksidan sekunder antara lain turunan-turunan asam

fosfat, senyawa karoten, sterol, fosfolipid, dan produk-produk reaksi Maillard.

Tujuan dasar dari antioksidan sekunder adalah mencegah terjadinya radikal yang

paling berbahaya yaitu radikal hidroksil (BlueFame Forums 2008)

Ketaren (1986) menyatakan bahwa umumnya antioksidan memiliki

struktur inti yang sama, yaitu mengandung cincin benzena tidak jenuh disertai

gugus hidroksil atau asam amino. Antioksidan berdasarkan gugus fungsinya

dibagi atas tiga golongan, yaitu golongan fenol, amin dan aminfenol. Adapun

penggolongan antioksidan menurut Ketaren (1986), adalah sebagai berikut:

1) antioksidan golongan fenol

Antioksidan yang termasuk golongan ini biasannya memiliki ciri intensitas

warna yang rendah atau tidak berwarna sama sekali dan banyak digunakan karena

beracun. Antioksidan golongan fenol meliputi sebagian besar antioksidan yang

dihasilkan alam dan sejumlah kecil antioksidan sintesis. Beberapa contoh

antioksidan yang termasuk golongan ini antara lain hidrokuinon, gosipol, katekol,

resorsiol, dan eugenol.

2) antioksidan golongan amin

Antioksidan yang mengandung gugus amino dan diamino yang terikat

pada cincin benzene berpotensi tinggi sebagai antioksidan, namun beracun dan

biasanya menghasilkan warna yang intensif jika dioksidasi atau bereaksi dengan

ion logam, selain itu umumnya stabil pada suhu panas dan ekstrasi dengan

kaustik. Antioksidan yang termasuk dalam golongan ini adalah N,N difenilen

diamin, difenilhidrasin, difenil guanidine dan difenil amin.

3) antioksidan golongan aminfenol

Antioksidan golongan aminfenol biasanya mengandung gugus fenolat dan

amino sebagai gugus fungsional penyebab aktivitas antioksidan. Golongan

aminfenol banyak digunakan dalam industri petroleum, untuk mencegah

terbentuknya gum dalam gasolin, contohnya N-butil-p-amino-fenol dan N-

sikloheksil-p-amino-fenol. Adanya gugus hidroksil (-OH) dan amino (-NH2) yang

10

terikat pada cincin aromatis memegang peranan penting dalam aktivitas

antioksidan. Potensi antioksidan tersebut diperbesar oleh adanya substitusi gugus

lain yang terikat pada cincin aromatis.

2.3.2 Mekanisme Oksidasi Lemak

Meyer (1973) dan Hamilton (1983) menyebutkan bahwa autooksidasi

lipida berlangsung dalam dua tahap. Selama tahap pertama autooksidasi berjalan

lambat dengan laju kecepatan seragam. Tahap pertama ini sering disebut periode

induksi. Oksidasi periode induksi ini berlangsung beberapa waktu sampai pada

waktu titik tertentu dimana reaksi memasuki tahap kedua yang mempunyai laju

oksidasi dipercepat. Laju pada oksidasi tahap kedua beberapa kali lebih cepat dari

laju oksidasi tahap pertama. Umumnya lemak dan minyak mulai terasa tengik

pada awal tahap kedua. Asam lemak yang memiliki ikatan rangkap lebih banyak

(misalnya asam linoleat) bereaksi lebih cepat dibanding yang berikatan rangkap

lebih sedikit (asam oleat) sehingga periode induksinya lebih pendek.

Mekanisme oksidasi lipida tidak jenuh dimulai dengan tahap inisiasi, yaitu

terbentuknya radikal bebas (R*) bila lipida kontak dengan panas, cahaya, ion

metal dan oksigen. Reaksi ini terjadi pada group metilen yang berdekatan dengan

ikatan rangkap –C=C- (Buck 1991). Hal ini diperkuat oleh pernyataan Gordon

(1990) bahwa tahap inisiasi terjadi karena bantuan sumber energi eksternal

misalnya panas, cahaya atau energi tinggi dari radiasi, inisiasi kimia dengan

terlarutnya ion logam dan metaloprotein misalnya haem.

Tahap selanjutnya adalah tahap propagasi dimana autooksidasi berawal

ketika radikal lipida (R*) hasil tahap inisiasi bertemu dengan oksigen membentuk

radikal peroksida (ROO*). Reaksi oksigenasi ini terjadi sangat cepat dengan

energi aktivitas hampir nol sehingga konsentrasi ROO* yang terbentuk jauh lebih

besar dari konsentrasi R* dalam system makanan dimana oksigen berada (Gordon

1990). Radikal peroksida yang terbentuk akan mengekstrak ion hidrogen dari

lipida lain (R1H) membentuk hidroperoksida (ROOH) dan molekul radikal lipida

baru (R1*). Selanjutnya reaksi autooksidasi ini akan berulang sehingga

merupakan reaksi berantai.

Tahap terakhir oksidasi lipida adalah tahap terminasi, dimana

hidroperoksida yang sangat tidak stabil terpecah menjadi senyawa organik

11

berantai pendek yaitu aldehid, keton, alkohol dan asam (Trilaksani 2003). Buch

(1991) menyebutkan faktor-faktor dan kondisi yang dapat ikut berperan pada

oksidasi lipida antara lain (a) panas, setiap peningkatan suhu sebesar 10 oC laju

kecepatan meningkat dua kali lipat, (b) cahaya, terutama ultraviolet yang

merupakan inisiator dan katalisator kuat, (c) logam berat, logam terlarut misalnya

Fe, Cu merupakan katalisator kuat meski dalam jumlah kecil, (d) kondisi alkali,

kondisi basa, ion alkali merangsang radikal bebas, (e) tingkat ketidakjenuhan,

jumlah dan posisi ikatan rangkap pada molekul lipida berhubungan langsung

dengan kerentanan terhadap oksidasi, sebagai contoh asam linoleat lebih rentan

dibanding asam oleat, dan (f) ketersediaan oksigen.

2.3.3 Mekanisme kerja antioksidan

Sesuai mekanisme kerjanya, antioksidan memiliki dua fungsi. Fungsi

pertama merupakan fungsi utama dari antioksidan yaitu sebagai pemberi atom

hidrogen. Antioksidan (AH) yang mempunyai fungsi utama tersebut sebagai

antioksidan primer. Senyawa ini dapat memberikan atom hidrogen secara cepat

ke radikal lipida (R*, ROO*) atau mengubahnya ke bentuk lebih stabil, sementara

turunan radikal antioksidan (A*) tersebut memiliki keadaan lebih stabil dibanding

radikal lipida. Fungsi kedua merupakan fungsi sekunder antioksidan, yaitu

memperlambat laju autooksidasi dengan berbagai mekanisme di luar mekanisme

pemutusan rantai autooksidasi dengan pengubahan radikal lipida ke bentuk lebih

stabil (Gordon 1990).

Penambahan antioksidan (AH) primer dengan konsentrasi rendah pada

lipida dapat menghambat atau mencegah reaksi autooksidasi lemak dan minyak.

Penambahan tersebut dapat menghalangi reaksi oksidasi pada tahap inisiasi

maupun propagasi. Radikal- radikal antioksidan (A*) yang terbentuk pada reaksi

tersebut relatif stabil dan tidak mempunyai cukup energi untuk dapat bereaksi

dengan molekul lipida lain membentuk radikal lipida baru. Menurut Hamilton

(1983) radikal-radikal antioksidan dapat saling bereaksi membentuk produk non

radikal. Mekanisme penghambatan antioksidan primer dapat dilihat pada

Gambar 2.

12

Gambar 2 Reaksi penghambatan antioksidan primer terhadap radikal lipida

(Gordon 1990)

Besarnya konsentrasi antioksidan yang ditambahkan dapat berpengaruh

pada laju oksidasi. Pada konsentrasi tinggi, aktivitas antioksidan grup fenolik

sering lenyap, bahkan antioksidan tersebut menjadi prooksidan. Pengaruh jumlah

konsentrasi pada laju oksidasi tergantung pada struktur antioksidan, kondisi dan

sampel yang akan diuji.

AH + O2 ----------------------------- A* + HOO*

AH + ROOH ----------------------------- RO* + H2O + A*

Gambar 3 Antioksidan bertindak sebagai prooksidan pada konsentrasi tinggi

(Gordon 1990)

Trilaksani (2003) berpendapat bahwa penghambatan oksidasi lipida oleh

antioksidan melalui lebih dari satu mekanisme tergantung pada kondisi reaksi dan

sistem makanan. Ada empat kemungkinan mekanisme penghambatan tersebut

yaitu (a) pemberian hidrogen, (b) pemberian elektron, (c) penambahan lipida pada

cincin aromatik antioksidan, (d) pembentukan kompleks antara lipida dan cincin

aromatik antioksidan. Studi lebih lanjut menunjukkan bahwa ketika atom

hidrogen labil pada suatu antioksidan tertentu diganti dengan deuterium,

antioksidan tersebut menjadi tidak efektif. Hal ini menunjukkan bahwa

mekanisme penghambatan dengan pemberian atom hidrogen lebih baik dibanding

pemberian elektron. Beberapa peneliti percaya bahwa pemberian hidrogen atau

elektron merupakan mekanisme utama. Sementara pembentukan kompleks antara

antioksidan dengan rantai lipida adalah reaksi sekunder.

Antioksidan sekunder, misalnya asam sitrat, asam askorbat, dan esternya,

sering ditambahkan pada lemak dan minyak sebagai kombinasi dengan

antioksidan primer. Kombinasi tersebut dapat memberi efek sinergis sehingga

Inisiasi ; R* + AH --------------------------RH + A*

Radikal lipida Antioksidan

Propagasi : ROO* + AH ------------------------- ROOH + A*

13

menambah keefektifan kerja antioksidan primer. Antioksidan sekunder ini bekerja

dengan satu atau lebih mekanisme berikut (a) memberikan suasana asam pada

medium (sistem makanan), (b) meregenerasi antioksidan lama, (c) mengkelat atau

mendeaktifkan kontaminan logam prooksidan, (d) menangkap oksigen, (e)

mengikat singlet osigen dan mengubahnya ke bentuk triplet oksigen (Gordon

1990)

Trilaksani (2003) menegaskan bahwa antioksidan sebaiknya ditambahkan

ke lipida seawal mungkin untuk menghasilkan efek maksimum. Menurut Coppen

(1983), antioksidan hanya akan benar-benar efektif bila ditambahkan seawal

mungkin selama periode induksi, yaitu suasana periode awal oksidasi lipida

terjadi, dimana oksidasi masih berjalan secara lambat dengan kecepatan seragam.

2.3.4 Metode uji aktifitas antioksidan

Pengujian anti radikal bebas senyawa-senyawa bahan alam atau sintesis

dapat dilakukan secara reaksi kimia dengan menggunakan 1,1-Di Phenyl-2-Picryl

Hydrazyl (DPPH) sebagai senyawa radikal bebas yang stabil dengan melihat

proses penghambatan panjang gelombang maksimumnya pada spektrofotometer

UV-Vis. Molyneux (2004) mengemukakan bahwa metode uji DPPH merupakan

salah satu metode yang paling banyak digunakan untuk memperkirakan efisiensi

kinerja dari substansi yang berperan sebagai antioksidan. Hannani et al. (2005)

juga menambahkan bahwa metode DPPH dipilih karena sederhana, murah, cepat

dan peka serta hanya memerlukan sedikit sampel.

1,1-Di Phenyl-2-Picryl Hydrazyl ( DPPH ) merupakan radikal bebas yang

stabil pada suhu kamar dan sering digunakan untuk mengevaluasi aktivitas

antioksidan beberapa senyawa atau ekstrak bahan alam. Prinsip dari uji aktivitas

antioksidan dengan DPPH adalah DPPH yang menerima elektron atau radikal

hidrogen akan membentuk molekul diamagnetik yang stabil. Interaksi antioksidan

dengan DPPH baik secara transfer elektron atau radikal hidrogen pada DPPH,

akan menetralkan karakter radikal bebas dari DPPH. Jika semua elektron radikal

bebas pada DPPH menjadi berpasangan, maka warna larutan berubah dari ungu

tua menjadi kuning terang dan arbsorbansi pada panjang gelombang 517 nm akan

hilang (Suratmo 2009).

14

Penghambatan warna ungu merah (absorbansi pada 517 ± 20 nm)

dikaitkan dengan kemampuan sebagai anti radikal bebas (free radical scavenger)

(Mega dan Swastini 2006). Molyneux (2004) mengatakan bahwa DPPH adalah

radikal bebas yang bersifat stabil dan beraktivitas dengan cara mendelokalisasi

elektron bebas pada suatu molekul, sehingga molekul tersebut tidak reaktif

sebagaimana radikal bebas lain. Proses delokalisasi ini ditunjukkan dengan

adanya warna ungu (violet) pekat yang dapat dikarakterisasi pada pita absorbansi

dalam pelarut etanol pada panjang gelombang 520 nm.

Adapun reaksi penghambatan DPPH dengan senyawa anti radikal bebas

dapat dilihat pada Gambar 4.

Gambar 4 Contoh mekanisme penghambatan antioksidan (tokoferol) terhadap

radikal bebas (DPPH) (Mega dan Swastini 2010)

Gugus- gugus fungsi yang diduga terlibat pada reaksi antara senyawa

antiradikal bebas adalah gugus –OH dan ikatan rangkap dua (-C=C-). Kapasitas

aniradikal bebas DPPH diukur dari penghambatan warna ungu merah dari DPPH

pada panjang gelombang 517 ± 20 nm (Mega dan Swastini 2010).

15

2.4 Ekstraksi Senyawa Aktif

Khopkar (2003) menyatakan bahwa ekstraksi adalah suatu proses

penarikan komponen yang diinginkan dari suatu bahan dengan cara pemisahan

satu atau lebih komponen dari suatu bahan yang merupakan sumber

komponennya. Faktor- faktor yang berpengaruh terhadap proses ekstraksi adalah

lama ekstraksi, suhu, dan jenis pelarut yang digunakan. Ekstraksi dapat dilakukan

dengan dua cara yaitu fase air dan fase organik. Fase air dilakukan dengan

menggunakan pelarut air dan fase organik merupakan ekstraksi yang dilakukan

dengan menggunakan pelarut organik (Winarno et al. 1973). Hal yang harus

diperhatikan dalam pemilihan jenis pelarut yang digunakan adalah daya

melarutkan, titik didih, sifat toksik, mudah tidaknya terbakar, dan sifat korosif

terhadap peralatan ekstraksi.

Menurut Harborne (1984) hal lain yang perlu diperhatikan dalam

pemilihan pelarut adalah selektivitas, kemampuan untuk mengekstrak, toksisitas,

kemudahan untuk diuapkan, dan harga pelarut. Jenis dan mutu pelarut yang

digunakan sangat menentukan keberhasilan proses ekstraksi, pelarut yang

digunakan harus dapat melarutkan zat yang diinginkannya, mempunyai titik didih

yang rendah, murah, tidak toksik dan tidak mudah terbakar (Ketaren 1986). Nur

dan Adijuwana (1989) menyatakan bahwa sifat penting yang harus diperhatikan

dalam pemilihan pelarut adalah kepolaran senyawa yang dilihat dari gugus

polarnya (misal gugus OH, COOH). Derajat polaritas tergantung pada konstanta

dielektrik, makin besar konstanta dielektrik semakin polar pelarut tersebut.

Beberapa pelarut organik dan sifat-sifat fisiknya dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1 Beberapa pelarut organik dan sifat fisiknya

Pelarut Rumus

molekul

Titik didih

(oC)

Titik beku

(oC)

Konstanta

dielektrik

(Debye)

Masa molar

(g/mol)

Heksana C6H14 69 -94 1,8 32,0

Etil asetat C4H8O2 77 -84 6,0 86,2

Metanol CH4O 65 -98 32,6 88,1

Air H2O 100 0 80,2 18,0

Sumber: Pramadhany (2006)

16

Pelarut non polar merupakan salah satu pelarut yang dikenal efektif

terhadap alkaloid dalam bentuk basa dan terpenoid dari bahan. Pelarut nonpolar

juga mengekstrak senyawa kimia misalnya lilin, lemak, dan minyak yang mudah

menguap. Pelarut semi polar mampu mengekstrak senyawa fenol, terpenoid,

alkaloid, aglikon dan glikosida. Pelarut yang bersifat polar, mampu mengekstrak

senyawa alkaloid kuartener, komponen fenolik, karotenoid, tanin, gula, asam

amino dan glikosida (Harbone 1987).

Metode ekstraksi dikelompokkan menjadi dua yaitu ekstraksi sederhana

dan ekstraksi khusus (Harborne 1984). Ekstraksi sederhana antara lain terdiri atas

maserasi, perkolasi, reperkolasi, evakolasi dan diakolasi. Ekstraksi sederhana

menurut Harbone (1984) adalah sebagai berikut:

a) maserasi, yaitu metode ekstraksi dengan cara merendam sampel dalam pelarut

dengan atau tanpa pengadukan;

b) perkolasi, yaitu metode ekstraksi secara berkesinambungan;

c) reperkolasi, yaitu perkolasi dimana hasil perkolasi digunakan untuk melarutkan

sampel di dalam perkolator sampai senyawa kimianya terlarutkan;

d) evakolasi, yaitu perkolasi dengan pengurangan tekanan udara;

e) diakolasi, yaitu perkolasi dengan penambahan tekanan udara.

Metode ekstraksi khusus antara lain soxhletasi, arus balik, dan ultrasonik.

Ekstraksi khusus menurut Harbone (1984) antara lain:

a) soxhletasi, yaitu metode ekstraksi secara berkesinambungan untuk melarutkan

sampel kering dengan menggunakan pelarut bervariasi;

b) arus balik, yaitu metode ekstraksi secara berkesinambungan dimana sampel dan

pelarut saling bertemu melalui gerakan aliran yang berlawanan;

c) ultrasonik, yaitu ekstraksi dengan menggunakan alat yang menghasilkan

frekuensi bunyi atau getaran antara 25-100 KHz.

Proses ekstraksi terdiri dari beberapa tahap yaitu tahap penghancuran

bahan, penimbangan, perendaman dengan pelarut, penyaringan, dan pemisahan.

Penghancuran bertujuan untuk mempermudah pengadukan dan kontak bahan

dengan pelarutnya pada saat proses pelarutan. Bahan ditimbang untuk mengetahui

berat awal bahan sehingga dapat dihitung rendemen yang dihasilkan. Bahan yang

telah ditimbang kemudian direndam dalam pelarut yang sesuai. Proses

17

perendaman yang dilakukan disebut maserasi. Tahap selanjutnya adalah tahap

pemisahan yang terdiri dari penyaringan dan evaporasi. Penyaringan dilakukan

untuk memisahkan residu bahan dan pelarut yang telah mengandung senyawa

bioaktif. Pemisahan pelarut dengan senyawa bioaktif yang terikat dilakukan

dengan evaporasi sehingga pelarut akan menguap dan diperoleh senyawa hasil

ekstraksi. Hasil ekstrak yang diperoleh akan tergantung pada beberapa faktor

antara lain kondisi alamiah senyawa tersebut, metode ekstraksi yang digunakan,

ukuran partikel sampel, kondisi dan waktu penyimpanan, lama waktu ekstraksi,

dan perbandingan jumlah pelarut terhadap jumlah sampel (Darusman et al. 1995)

2.5 Komponen Bioaktif

Bentuk metabolit sekunder menunjukkan sejumlah molekul yang sedikit

penting terhadap tanaman dan memiliki peranan utama dalam perlindungan

tanaman dari tekanan lingkungan atau dalam pengontrolan pertumbuhan tanaman

(Harborne 1999).

2.5.1 Terpenoid/steroid

Terpenoid atau isoprenoid dicirikan dengan biosintesis dari isopentenil dan

dimetilalil pirofosfat dan sifatnya yang secara umum lipofilik. Terpenoid adanya

di kelenjar trikoma daun, di pucuk exudates dan kayu damar. Secara kimia,

terpenoid pada dasarnya hidrokarbon tidak jenuh siklik, dengan derajat keragaman

oksigenasi dalam kelompok pengganti yang dilekatkan terhadap kerangka karbon

utama. Terpenoid dikelompokkan berdasarkan jumlah 5-atom karbon (C5)

(Harborne 1999). Monomer aktif dari isoprenoid adalah isopentenilpirofosfat

(IPP) yang digunakan untuk membangun monoterpen (C10), sesquiterpen (C15),

dan diterpen (C20) (Edwards dan Gatehouse 1999).

Terpenoid memiliki potensi anti-inflamasi tidak hanya in-vivo pada sel

hewan, tetapi juga ex-vivo. Beberapa terpenoid bertindak sebagai hormon

tanaman yang mengatur fungsi fisiologis yang berbeda dan metabolit sekunder

lainnya berperan dalam pertahanan dan perlindungan tumbuhan/hewan dari

patogen (Heras et al. 2003). Subklasifikasi terpenoid dapat dilihat pada Tabel 2.

18

Tabel 2 Subklasifikasi terpenoid

Kelas terpenoid Deskripsi

Monoterpenoid Volatil, unsur minyak esensial

Iridoid Lakton yang berasa pahit, biasanya dalam bentuk

glikosidik

Sesquiterpenoid

Sesquiterpen lakton

Diterpenoid

Triterpenoid saponin

Steroid saponin

Kardenolid dan bufadienolid

Fitosterol

Cucurbitacin

Nortriterpenoid

Triterpenoid lainnya

Karotenoid

Unsur minyak esensial yang tinggi titik didihnya

Karakteristik dari famili Compositae

Asam dammar dan giberelin

Glikosida hemolitik

Glikosida hemolitik

Racun bagi jantung dan toxin

Unsur-unsur membran

Pahit, terutama Cucurbitaceae

Limonoid dan Quassinoid

Lupanes, hapanes, ursanes, dsb

Pigmen kuning hingga merah

Sumber : Harborne (1999)

Komponen terpenoid yang menunjukkan aktivitas insektisidal adalah

steroid. Bentuk steroid dapat berupa komponen kardenolid dan saponin yang

dapat melawan herbivora mamalia. Kardenolid berasa pahit dan sangat beracun

serta dapat menyebabkan penyakit jantung. Saponin merupakan komponen yang

dapat larut di dalam air dan lemak, serta memiliki sifat seperti sabun (Scott 2008).

Struktur beberapa terpenoida dapat dilihat pada Gambar 5.

19

Gambar 5 Beberapa terpenoid dan alkaloid steroid (Robinson 1995)

2.5.2 Alkaloid dan metabolit nitrogen lainnya

Alkaloid merupakan basa-basa organik yang memiliki sebuah atom

nitrogen sebagai bagian dari srukturnya, biasanya terkait ke dalam suatu sistem

siklik lima atau enam karbon. Distribusi alkaloid terbatas pada tumbuhan tingkat

tinggi, sekitar 20 % dari spesies angiospermae. Metabolit-nitrogen juga terbatas

di alam. Keterbatasan distribusi metabolit ini disebabkan oleh ketersediaan unsur

dari metabolit ini juga terbatas. Metabolit-nitrogen merupakan turunan dari satu

atau lebih asam amino protein (Harborne 1999).

Metabolit-nitrogen lainnya yang berperan penting adalah glukosinolat,

cianogenik glikosida, dan asam amino non-protein. Bentuk lebih lanjut dari

metabolit-nitrogen adalah betalain, pigmen tanaman. Asam amino lisin, ornitin,

fenilalanin, tirosin, triptofan, dan histidin merupakan sumber N dari mayoritas

alkaloid pada tanaman (Edwards dan Gatehouse 1999).

Alkaloid biasanya diekstraksi dari tumbuhan dengan pelarut alkohol yang

bersifat asam lemah (HCl 1M atau asam asetat 10%), kemudian diendapkan

dengan amoniak pekat. Pemurnian selanjutnya dilaksanakan dengan ekstraksi

pelarut (ekstraksi cair-cair). Adanya alkaloid pada ekstrak nisbi kasar dapat diuji

dengan menggunakan berbagai pereaksi alkaloid (Harborne 1987). Klasifikasi

alkaloid dan metabolit-nitrogen lainnya dapat dilihat Tabel 3.

20

Tabel 3 Klasifikasi alkaloid dan metabolit-nitrogen lainnya pada tanaman

Metabolit Metabolit

Alkaloid: 11. Pirolizidin

1) Amaryllidaceae 12. Quinolin

2) Betalain 13. Quinolizidin

3) Diterpenoid (kadang beracun) 14. Steroidal

4) Indol 15. Tropana

5) Isoquinolin (kelompok terbesar alkaloid) Asam amino non-protein

6) Likopodium Amina

7) Monoterpen Cianogenik glikosida

8) Sesquiterpen Glukosinolat

9) Peptida Purin dan Pirimidin (termasuk

kafein pada kopi dan teh)

10) Pirolidin dan piperidin

Sumber : Harborne (1999)

Struktur beberapa senyawa alkaloid (Robinson 1995) dapat dilihat pada

Gambar 6 berikut.

Gambar 6. Beberapa penggolongan alkaloid (Robinson 1995)

2.5.3 Metabolit fenol

Komponen fenol merupakan metabolit sekunder dengan molekul dasar dari

beragam jenis senyawa adalah struktur fenol yang merupakan kelompok hidroksil

pada sebuah cincin aromatik. Komponen fenol menunjukkan beragam fungsi bagi

21

tanaman termasuk pertahanan dari herbivor dan patogen, penyerapan cahaya,

penarik pollinator, penghambat pertumbuhan dari tanaman pesaing, dan simbiosis

dengan bakteri penyedia nitrogen (Wildman 2001).

Fenol turut andil dalam biosintetis dari fenilalanin, merupakan salah satu

dari tiga asam amino protein yang dibentuk dari sedoheptulosa melalui jalur

shikimate. Asam p-hidroksisinamik dibentuk dari fenilalanin melalui deaminasi

dan p-hidroksilasi, yang menempati peranan sentral dalam pembentukan beragam

kelas dari fenol tanaman (Harborne 1999).

Flavonoid merupakan kelompok polifenol yang paling dikenal, memiliki

rangka karbon yang sama dengan flavon atau 2-fenilbenzopiron dan terdiri dari

4000 struktur. Flavonoid dapat ditemukan di sebagian besar tanaman dan sama

dengan struktur fenilpropanoid dan asam hidroksibenzoat (Harborne 1999).

Flavonoid adalah turunan dari chalcones yang dibentuk dari shikimate dan

prekursor asetat (Edwards dan Gatehouse 1999).

Sebagian besar karakteristik dari fenolik adalah kemampuan untuk

mengionisasi. Beberapa polifenol memiliki kelompok catechol dan karena itu

memiliki kemampuan untuk mengkelat ion logam divalen atau trivalen. Beberapa

antosianin menjadi pengkelat terhadap magnesium atau besi. Fenol dengan

substitusi o- atau p-dihidroksi dapat teroksidasi sesuai dengan quinon dan

beberapa p-quinon (Harborne 1999). Klasifikasi bagian-bagian fenolik dapat

dilihat pada Tabel 4.

Tabel 4 Klasifikasi bagian-bagian fenolik

Subkelas Deskripsi Subkelas Deskripsi

Antosianin Pigmen merah hingga

biru pada bunga Lignan

Umumnya ada

pada kayu dan

kulit kayu

Antoklors

Pigmen kuning pada

bunga: chalcones dan

aurones

Fenol dan asam

fenolik

Beberapa asam

yang umum pada

tanaman

Benzofuran Ada pada tumbuhan

tingkat tinggi Fenolik keton

Ada pada buah

hop dan pakis

22

Tabel 4 lanjutan

Chromones Kelompok kecil dari

zat pengobatan Fenilpropanoid

Strukturnya

banyak, tersebar

luas

Kumarin

Lebih dari 700

struktur, tersebar luas

pada tanaman

Quinonoid

Benzoquinon,

naphthoquinon

dan anthraquinon

Minoritas

flavonoid

Flavanon dan

dihidroflavonol Stilbenoid

Termasuk

dihidrofenantrin

Flavon dan

flavonol

Struktur banyak,

terutama dalam

kombinasi glikosidik

Tanin Kental dan dapat

dihidrolisis

Sumber : Harborne (1999)

Struktur dari beberapa metabolit fenolik di tanaman (Robinson 1995) dapat

dilihat pada Gambar 7.

Gambar 7 Beberapa senyawa aromatik fenol sederhana (Robinson 1995)