2. laboratorijas darbs. spektrofotometrija

10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

1

2. laboratorijas darbs.

Spektrofotometrija.Spektrofotometrija.

Māris Lazdiņš [email protected]

LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

Studiju kurss Bioloģija (biologiem)

Bloks Šūnas bioloģija, bioķīmija, ģenētika


2

- Kvantu plūsma.

- Noteikta diapazona elektromagnetiskais starojums.

Kas ir gaisma?Kas ir gaisma?


3


Elektromagnetiskā starojuma viļņu garums - (nm).

C = 300 000 km/s

- attālums, kuru starojums veicis vienas svārstības laikā.


4


Elektromagnetisko starojumu pēc tā- īpašībām un- mijiedarbības ar dzīvās un nedzīvās dabas objektiem

iedala vairākos diapazonos:

diapazons

10 km – 1 mm - radiodiapazons1 mm – 800 nm - infrasarkanais starojums800 nm – 350 nm - redzamā gaisma350 nm – 1 nm - ultravioletais starojums1 nm – 10 pm - rentgena starojums10 pm – 100 fm - starojums


5

Redzamā gaismaRedzamā gaisma

krāsa

760 nm – tumši sarkans660 nm – sarkans590 nm – oranžs560 nm – dzeltens500 nm – zaļš480 nm – gaiši zils450 nm – zils380 nm – violets


6

Kā mēra gaismas un vielas mijiedarbību?Kā mēra gaismas un vielas mijiedarbību?

Transmisija – (T = I2/I1)

Transmisijas % – T% = (I2/I1) 100

Transmisijas% parāda cik % starojuma izkļuvuši cauri videi.

I1 I2


7

Kā mēra gaismas un vielas mijiedarbību? Kā mēra gaismas un vielas mijiedarbību?

Turpinot pētījumus noskaidrojās, ka T ir atkarīga no:

- starojuma ceļa garuma;- vielas koncentrācijas šķīdumā;- izmantotā starojuma ;- konkrētai vielai raksturīga starojuma absorbcijas koeficienta pie noteikta starojuma .


8


Sakarību apraksta Bera likums:

T=10-kcl

k – konkrētai vielai raksturīgs starojuma absorbcijas koeficients pie noteikta starojuma ;

c – vielas koncentrācija šķīdumā;l – starojuma ceļš cauri šķīdumam.


9


Praksē bieži izmanto Lamberta – Bera likumu un mērvienības:

Absorbcija (A)Ekstinkcija (E)Optiskais blīvums (D; OD)

A = - lg(T) = kcl


10

Kādas iekārtas izmanto spektrofotometrijā?Kādas iekārtas izmanto spektrofotometrijā?

Spektrofotometrs (SF)

Starojuma avots

Kondensors Dispersijas sistēma

Optiskā sprauga

Kivete ar paraugu

Starojuma intensitātes mērītājs


11

Kādas iekārtas izmanto spektrofotometrijā?Kādas iekārtas izmanto spektrofotometrijā?

Fotoelektrokolorimetrs (FEK)

Starojuma avots

KondensorsOptiskie filtri

Kivete ar paraugu

Starojuma intensitātes mērītājs


12

Absorbcijas spektrsAbsorbcijas spektrs

Grafiks - absorbcijas (optiskā blīvuma) atkarība no viļņu garuma

(nm)

OD(o.v.)

400 450 500 550 600 650 700


13

Cilvēka acs jūtībaCilvēka acs jūtība

(nm)

%100

80

60

40

20

0

400 450 500 550 600 650 700


14



400 450 500 550 600 650 700 (nm)

OD(o.v.)


15



400 450 500 550 600 650 700

OD


16



400 450 500 550 600 650 700

OD


17


400 450 500 550 600 650 700


18

Pie darba ?Pie darba ?


19

Absorbcijas spektra noteikšanaAbsorbcijas spektra noteikšana

(nm) OD1 (o.v.) OD2 (o.v.)

400420440460480500520540

1. tabula

(nm) OD1 (o.v.) OD2 (o.v.)

560580600620640660680700


20

Absorbcijas spektra noteikšanaAbsorbcijas spektra noteikšana

400 450 500 550 600 650 700

OD


21


22


23

Ūdens un sausnas satura noteikšanaŪdens un sausnas satura noteikšana

2.1.


24

Proteīnu kvantitatīva noteikšanaProteīnu kvantitatīva noteikšana

2.2. Pamatā - krāsu reakcija

Bradfordas + proteīni => zils krāsojums reaģents (mērījumiem izdevīgs (brūns) = 590 nm - oranža gaisma)


25


http://www.histosoft.com/services/background/ba/baback.html#ref

http://en.wikipedia.org/wiki/Bradford_protein_assay


26


2.3. - reakcijas “kalibrēšana”

Reakciju veic ar zināmas koncentrācijas proteīnu (BSA)šķīdumiem, -

lai iegūtu OD sakarību ar proteīnu koncentrāciju.

0,1 mg/ml,0,3 mg/ml,0,5 mg/ml, 0,8 mg/ml.

Ar katras koncentrācijas šķīdumu veic 3 atkārtotas reakcijas / mērījumus.


27


2.4. Reakcijas un mērījumu gaita:

1. Kivetē iepilda 2 ml Bradfordas reaktīva (2 reizes pa 1000 l).

Kivetes ņemt aiz rievotajām/matētajām malām!

Sekojiet, lai kivetes rievotās/matētās malas neievietotu gaismas ceļā!

Pārbaudiet vai FEK uzstādīts oraņžais filtrs.


28



2. Nospiežot pogu „R“, aparātu iestāda uz D = 0 (T% = 100).

Ieslēgt / izslēgt


29



3. Izņem kiveti un pievieno 20 l proteīnu šķīdumu.

4. Ar 1000 µl automātiskās pipetes palīdzību (iesūcot un izpūšot) samaisiet šķīdumus un ielieciet kiveti FEK.


30



5. Pēc 1 minūtes izdara mērījumu, nospiežot taustiņu „T“.

6. Rezultātu pierakstiet 3. tabulā.

T


31



Katrai reakcijai jālieto jauna kivete!

Katrai kivetei ar reaģentu individuāli jāiestāda OD = 0,00 (nospiežot kontroles (references) taustiņu “R”).


32


2.3. - reakcijas “kalibrēšana”

3. tabulā jāieraksta reakcijā izmantoto proteīnu (BSA) masa.

0,1 mg/ml,0,3 mg/ml,0,5 mg/ml, 0,8 mg/ml.


33


2.5. Reakcijas “kalibrēšanas” grafiks

Pēc iegūtajiem rezultātiem uz milimetru papīra konstruē graduācijas grafiku.

- uz X ass atliek proteīnu masu (g), kura ar 20 l BSA šķīduma tika ienesta reakcijā.

- uz Y ass atliek vidējo nomērīto optisko blīvumu (o.v.).

Vienības uz asīm izvēlieties tā, lai racionāli tiktu izmantots viss milimetru papīra laukums!


34


2.5. Reakcijas “kalibrēšanas” grafiks

D(o.v.)

g BSA / 20 l šķīduma

.

..

. Grafikam jāsanāk lineāram!


35


2.6. Proteīnu kvantitēšanas reakcijas analizējamo pārtikas produktu lizātiem.

Veic reakcijas un mērījumus ar pārtikas produkta lizātu.(2 atkārtojumus)

Rezultātus ieraksta 4. tabulā un aprēķina vidējo vērtību.


36


2.6. Proteīnu kvantitēšanas reakcijas analizējamo pārtikas produktu lizātiem.

D(o.v.)

g BSA / 20 l šķīduma

.

..

.


37


3.2. Proteīnu satura aprēķini produktos.

No grafika nolasītos rezultātus ieraksta arī 5. tabulā.

Tabulā apkopo arī grupas biedru rezultātus (proteīnu g / 20 l šķīduma, nevis OD !!! ).

Veic aprēķinus un izsaka:- proteīnu daudzumu (g) 100 g svaiga produkta;- % no sausnas masas.


38

Veiksmi darbāVeiksmi darbā


39

Uz nākošo nodarbību Uz nākošo nodarbību (mājas darbs)(mājas darbs)

Rezultātu apstrāde un secinājumi:

3.1. 3.2.

!

2. laboratorijas darbs. spektrofotometrija

Documents