OSNOVNE TEHNIKE MOLEKULARNE BIOLOGIJE

EKSTRAKCIJA FENOLOMsolucija sa nukleinskim kiselinamafenolmeanjecentrifugiranjefaza fenola proteinivodena faza

IZOLACIJA mRNKTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAtotalna RNK

IZOLACIJA mRNKRNK (bez mRNK)mRNK

ELEKTROFOREZA

ELEKTROFOREZA NA GELUhorizontalna-DNKgelpufer+-DNK fragmenti razliite veliinevizualizacija DNK na agaroznom gelu+

ELEKTROFOREZA NA GELUvertikalnavizualizacija DNK na poliakrilamidnom gelu

POLYMERASE CHAIN REACTION

PCRdenaturacijahibridizacija prajmeraelongacija

PCR

vezivanje prajmera x oC , 30sinteza novog lanca DNK 72 oC , x denaturacija 94 oC , 30 PCRdenaturacija uzorka DNK 94 oC , 5

PCR

KOMPONENTE PCR REAKCIJEDNKENZIMTaq DNK-polimeraza NUKLEOTIDIPRAJMERIMg JONIPUFER

PCRM 1 2 3 4 5 6 7 M

RT- PCRAAAAAAAAAAAAAAAAAAAARNKAAAAAmRNKreverzna transkriptazacDNKAAAAAmRNKsinteza drugog lanca DNK5533

OLIGONUKLEOTIDI ZA SINTEZU cDNKAAAAAmRNKAAAAAmRNKAAAAAmRNKcDNKcDNK5 prajmer3 prajmer5 prajmer3 prajmer3 prajmer5 prajmeroligo (dT)random primerispecifini prajmer

ODREDJIVANJE SEKVENCE DNK

MAXAM-GILBERT METODAC C T A C G T A332 PCH3C C T A C T A332 Pmetilacija guanina dimetilsulfatomodvajanje metilirane baze zagrevanjem ili piperidinomobeleeni fragmentdestrukcija riboze baznim rastvoromobeleena jednolanana DNK

MAXAM-GILBERT METODAC C T A C G T A C C G T A T G A C32 P32 P32 P32 PGCA + GC + T

MAXAM-GILBERT METODAG A+G C+T CC G A T T C G G G T T T T T C

OOHHHHHHbazaCH2OOOPO-O-OOHHHHHHbazaCH2OOPO-OOPO-O-OSANGER METODAdeoksiribonukleozid trifosfat dNTPdideoksiribonukleozid trifosfat ddNTP

SANGER METODA5353jednolanana DNK4 dNTPsddATPddGTPddTTPddCTPAGTCAAGGTTCC

SANGER METODA

RESTRIKCIONI ENZIMI

FENOMEN RESTRIKCIJEl fagE. coli - soj A E. coli - soj Banaliza DNK l faganema lize lizaplake

Escherichia coli REcoRIProvidencia StuartiPstIHaemophilus parainfluenzaeHaemophilus influenzaeHindIIIHpaI

RESTRIKCIONE ENDONUKLEAZEblunt endssticky endsTTCGAAAAGCTT5335CTTAAGGAATTC5335CAATTGGTTAAC5335GACGTCCTGCAG5335GCTAGGCGATCC5335HpaIEco RIHind IIIPst IBam HI

53T T A A53A A T T53T T A AA A T T35+

RESTRIKCIONA MAPA10 kbrestrikcioni enzim Arestrikcioni enzim Brestrikcioni enzimi A i B2 kb8 kb3 kb7 kb2 kb3 kb5 kbAB2 kb5 kb3 kb

SOUTHERN BLOT

SOUTHERN BLOTDNK u nativnoj formirestrikcioni enzimOko 106 fragmenata DNKdenaturacija u baznom rastvorutransfer DNK na membranuelektroforezapufer (SSC 20x)gelmembrana

membrana za koju se vezala DNKPREHIBRIDIZACIJAHIBRIDIZACIJA sa radioaktivnom sondomispiranjeautoradiografijatrake odgovaraju fragmentima hibridizovanim sa sondomsalmon spermdekstransulfat + formamid 42 oC SSC

SOUTHERN BLOT C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

MARKIRANJE SONDI

NICK - TRANSLACIJA5533DNaza IDNK polimeraza I5-3 egzonukleazna aktivnost55335533 polimerazna aktivnostdCTP dGTP dTTP dATPradioaktivna sonda5533

Sephadex mikrokolonapul radioaktivnih frakcija rastvorenih iz koloneinkubacija u vodenom kupatilu na 15oCDNaza I + DNA pol IdCTP dATP dGTP dTTP sondamarkirana sondaslobodni nukleotidifrakcijeradioaktivnost

RANDOM PRIMINGsondazagrevanje na 100 oC + brzo rashladjivanje na ledu53hibridizacija na 25oC sa random prajmerima53Klenow fragment DNK polimeraze IdCTP dGTP dTTP dATPobeleena sonda

MARKIRANJE OLIGONUKLEOTIDAoligonukleotidPPPribozaadening b ag 32 P ATPT4 polinukleotid kinazaOH53Pobeleen oligonukleotid

NORTHERN BLOT

DOT-BLOT