BIOCHIMIA APARATULUI CARDIOVASCULAR

XVII. BIOCHIMIE CLINIC

XVII.1. EXAMENUL BIOCHIMIC AL SNGELUI

Examenul biochimic al sngelui este o important component a investigaiilor paraclinice de laborator, necesar stabilirii diagnosticului pozitiv, diagnosticului diferenial, urmririi evoluiei i tratamentului aplicat bolnavului.

XVII.1.1. Recoltarea sngelui n vederea examenului biochimic

n mod curent, recoltarea sngelui se efectueaz dimineaa, pe nemncate (a jeun). Chiar i n cazul unui mic dejun frugal nu se constat modificri sanguine ale determinrilor n cazul: sodiului, potasiului, clorului, calciului, ureei, creatininei, acidului uric, proteinelor totale, colesterolului, amilazei, fosfatazei alcaline, transaminazelor, colinesterazei.

Sngele capilar se recolteaz din pulpa degetului, din clci (la nou nscut) sau din lobul urechii.

Sngele venos se recolteaz din venele din plica cotului (la adult i copii mari), din fontanel i venele jugulare (la sugari i copii mici).

Poziia corpului i staza venoas pot influena unele determinri biochimice: de exemplu, proteinele serice totale pot crete de la 6,6 g/dl n stare de decubit pn la 7,6 g/dl n ortostatism.

Actual, pentru recoltarea sngelui sunt utilizate recipiente de recoltare de unic utilizare vidate, fr anticoagulant sau cu anticoagulant, standardizate, foarte uor de recunoscut i manevrat datorit codurilor universale de culori ale dopurilor (exemplu: rou pentru biochimie, mov pentru hemogram, albastru pentru coagulare, negru pentru VSH) i a sistemului holder.

XVII.1.2. Produse biologice utilizate n investigaiile biochimice ale

sngelui

Analizele biochimice se pot efectua din snge integral, ser sau plasm. n principiu, utilizarea sngelui integral ca produs biologic n cadrul investigaiilor biochimice este admis numai n cazul n care concentraia analitului urmrit este aproximativ egal n eritrocite i n plasm, aa cum este cazul glucozei.

Serul sanguin reprezint supernatantul obinut prin centrifugarea sau decantarea sngelui recoltat fr anticoagulant, dup ce a fost lsat s coaguleze la temperatura camerei timp de 30-60 minute sau la termostat (la 37C) timp de 15-20 minute. La partea inferioar a recipientului se constituie cheagul, format din reeaua de fibrin ce nglobeaz elementele figurate ale sngelui.

Serul nu conine factorii coagulrii.

Plasma sanguin reprezint supernatantul obinut prin centrifugarea sngelui recoltat pe un anticoagulant (fluorur de sodiu, oxalat de potasiu i amoniu, EDTA, heparin, etc), la partea inferioar a recipientului sedimentnd elementele figurate ale sngelui. Spre deosebire de ser, plasma conine factorii coagulrii.

Anticoagulanii sunt substane care mpiedec procesul de coagulare a sngelui.

Oxalatul de sodiu, potasiu, sau litiu este un anticoagulant contraindicat n determinrile electroliilor (sodiu, potasiu), calciului i n determinarea unor enzime (n special LDH).

Citratul de sodiu, de potasiu are aceleai dezavantaje ca i oxalatul.

Fluorura de sodiu, potasiu este utilizat n determinrile glicemiei (inhib glicoliza) atunci cnd determinrile nu se pot efectua n decurs de 4 ore de la recoltarea sngelui. Nu este utilizat n determinrile de electrolii.

EDTA (sare de sodiu) este impropriu pentru determinrile de calciu, electrolii, fosfataz alcalin.

Heparina este anticoagulantul fiziologic ideal pentru c nu modific starea fizico-chimic a sngelui. Cu heparinatul de amoniu se pot determina, cu excepia amoniacului i a fosfatazei acide, toi metaboliii, electroliii i enzimele.

Serul (plasma) normal este limpede, de culoare galben pai. n anumite condiii, aspectul serului poate fi modificat:

Opalescent pn la lactescent (lipemic), datorit particulelor lipidice

Roz pn la rou n caz de hemoliz

Galben-brun, n cazul serului icteric

Aceste modificri ale aspectului serului pot constitui surse de eroare n cazul determinrilor biochimice ale sngelui.

Serurile hemolizate (prin distrugerea hematiilor, cel mai frecvent ca accident de recoltare) constituie surse de eroare mai ales n cazul determinrilor analiilor a cror concentraie intracelular (intraeritrocitar) este mai mare dect cea seric (LDH, ASAT, ALAT, potasiu). Hemoliza constituie o surs de interferen i n cazul unor determinri colorimetrice (bilirubina, colesterol).

Serul sau plasma icteric poate interfera semnificativ cu determinrile colorimetrice ce se efectueaz n domeniul 400-500 nm.

Plasma sau serul lipemic constituie o surs de eroare n cazul determinrilor turbidimetrice.

Cu excepia unor enzime (fosfataza acid, LDH, aldolaza) ce se elibereaz din trombocite n timpul coagulrii sngelui, nu se constat diferene ntre concentraia seric i cea plasmatic a analiilor.

Att n cazul plasmei ct i a serului, determinrile biochimice trebuie realizate n decurs de 4 ore de la recoltarea sngelui, n condiiile pstrrii acestuia la temperatura camerei, dac nu se separ de hematii. Fr alterri importante, serul sau plasma, separate de hematii, pot fi pstrate la 4C timp de 24 ore. n cazul determinrilor efectuate dup 24 de ore de la recoltare, plasma sau serul trebuie conservate prin congelare.

XVII.1.3. Examenul biochimic al sngelui

n cadrul acestui examen sunt explorate metabolismele (glucidic, lipidic, protidic), dar i unele sisteme sau aparate ale organismului uman.

Examenul biochimic al metabolismului glucidic include:

Determinarea glicemiei, cea mai solicitat investigaie din laboratorul clinic

Testul de toleran la glucoz, utilizat n depistarea strilor de scdere a toleranei la glucoz, ce pot precede instalarea unui diabet zaharat

Determinarea hemoglobinei glicozilate, cu rol n evaluarea retrospectiv a nivelului glicemiei n urm cu 6-8 sptmni.

Examenul biochimic al metabolismului lipidic include:

Determinarea colesterolului seric total

Determinarea fraciunilor de colesterol (HDL-colesterol, LDL-colesterol), ce permite diagnosticarea hiperlipoproteinemiilor primare sau secundare

Determinarea trigliceridelor serice.

Examenul biochimic al metabolismului proteic include:

Determinarea proteinelor serice totale, ce permit aprecierea funcionalitii i a unor organe (ficat, rinichi)

Electroforeza proteinelor serice, cu rol n evaluarea raportului dintre fraciunile proteice (albumine, globuline, fraciuni globulinice).

Explorarea metabolismului mineral (determinarea ionilor serici) include:

Determinarea sodiului seric

Determinarea potasiului seric

Determinarea calciului seric

Determinarea magneziului seric

Determinarea fosforului seric

Determinarea fierului seric (sideremie) ce permite, n principal, diagnosticarea i urmrirea sindroamelor anemice

Determinarea clorului seric.

Explorarea echilibrului acido-bazic include:

Determinarea rezervei alcaline

Determinarea pH-ului sanguin.

Explorarea aparatului digestiv const, de obicei, n:

Determinarea transaminazelor (ALAT, ASAT) serice

Determinarea GGT

Determinarea fosfatazei alcaline

Determinarea colinesterazei

Determinarea amilazemiei

Determinarea lipazei serice.

Explorarea miocardului const, n general, din:

Determinarea CK, CK-MB

Determinarea LDH

Determinarea ASAT

Explorarea aparatului reno-urinar include n principal:

Determinarea ureei

Determinarea creatininei

Clearance-ul creatininei endogene

Determinarea acidului uric

Aplicaie practic

Determinarea glicemiei cu ajutorul testelor rapide

Testele rapide sunt utilizate, n special, pentru monitorizarea, la domiciliu, de ctre pacienii diabetici a tratamentelor aplicate sau n cabinetele medicale (medici de familie, mediul rural, servicii de urgen, etc), atunci cnd se urmrete obinerea rezultatului ct mai rapid, sau n condiii de dotare redus.

Principiu

-D-glucoza este oxidat enzimatic de ctre glucozoxidaz, n prezena apei i a oxigenului atmosferic, la acid gluconic i ap oxigenat. Apa oxigenat rezultat este descompus sub aciunea peroxidazei la ap i oxigen atomic care oxideaz o-tolidina la un derivat colorat, albastru de tolidin.

Testele rapide pentru glucoz constau n general din benzi de material plastic care prezint la un capt o zon reactiv, ce conine toi reactivii necesari desfurrii testului. Pe aceast poriune se depune o pictur de snge obinut prin puncionarea pulpei degetului. n general, intensitatea culorii obinute se msoar la o singur lungime de und, cu ajutorul unor fotometre portabile (glucometre), cu afiare digitalic a rezultatului n mg/dL snge.

Mod de lucru cu glucometrul (ACCU-CHEK, Roche)

Se introduce n aparat bandeleta de determinare a glicemiei, cu sgeata spre interiorul glucometrului.

Se ateapt cteva secunde s apar pe ecranul glucometrului scris: 888, apoi codul de bar 609 sau 963.

Se verific ca acest cod s corespund cu acelai cod de pe cutia cu bandelete (tot 609 sau 963).

Se neap pulpa degetului cu un ac steril, de unic folosin.

Cnd apare pe ecranul glucometrului desenat o pictur, se aplic o pictur de snge n zona special a bandeletei (zona de culoare portocalie).

Se ateapt cteva secunde i pe ecran va aprea valoarea glicemiei.

Valori normale: 55 90 glucoz mg/dl snge XVII.2. EXAMENUL BIOCHIMIC AL URINEIIntroducere

Urina este un lichid biologic, produs al excreie renale, cu o compoziie complex, alctuit din ap, substane minerale, substane organice. etc.

Compoziia urinei depinde de o serie de factori cum sunt: aportul exogen (alimentaie), metabolismul intermediar, starea de funcionare a unor organe (rinichi, ficat), medicaie etc. Urina excretat n condiii de funcionare normal (fiziologic) a organismului are o compoziie i caracteristici fizico-chimice bine determinate, acestea modificndu-se, mai mult sau mai puin profund, odat cu modificarea factorilor menionai. De aceea un examen de laborator al urinei poate furniza clinicianului date utile privind att explorarea metabolismului intermediar ct i a funciei diverselor organe.

Pentru ca rezultatele examenelor de laborator s reflecte fidel starea de funcionare a organismului, la colectarea urinei din care urmeaz s se efectueze determinrile trebuie s se in seama de anumite prescripii.

Colectarea i conservarea urinei

Colectarea urinei se face n vase de sticl, bine splate i acoperite, iar pentru examenul bacteriologic trebuie s fie sterile. Uneori este necesar utilizarea unor recipiente nchise la culoare deoarece unele substane de determinat (ca de exemplu, bilirubina, porfirinele) sunt sensibile la lumin, iar expunerea lor conduce la rezultate false.

Pentru urina de 24 ore colectarea ncepe la ora 8 dimineaa dup ce s-a aruncat urina emis la aceast or. Poriunile urinate n continuare n cursul zilei i a nopii se colecteaz mpreun, numai urina emis a doua zi dimineaa la ora 8 se colecteaz separat.

Colectarea urinei se face diferit, n funcie de produsul de analizat i de testul utilizat:Urin Timp de colectareTeste efectuateTeste neindicate

Urina spontan recoltat din jetul mijlociuPrima urin de diminea- examen bacteriologic

- examen cu stripuri

- testul pentru punerea n eviden a nitriilor (doar pentru urina recoltat n recipient steril)

- examinarea microscopic a sedimentului urinar

- determinarea semi-calitativ a proteinelor urinare

- alte determinri biochimice calitative- determinarea cantitativ tuturor compuilor biochimici (pentru toate situaiile n care folosim urina spontan)

A dou urin de diminea- examen cu stripuri

- determinarea semi- cantitativ a proteinelor i glucozei urinare- testul pentru punerea n eviden a nitriilor

Urina spontan, recoltat n oricare moment al zilei- determinarea semi-cantitativ a glucozei urinare postprandial- examen bacteriologic

- examinarea microscopic a sedimentului urinar

Urin Timp de colectareTeste efectuateTeste neindicate

Urin recoltat prin puncie suprapubian-- examen bacteriologic

- determinarea cantitativ tuturor compuilor biochimici

Urina colectat pe anumite intervale de timpPerioad de timp bine determinat, de obicei 24 ore (sau 3 ore pentru unele determinri)- determinarea cantitativ tuturor compuilor biochimici (24 ore)

- sedimentul minutat Addis-Hamburger (3 ore)- examen bacteriologic

- examinarea microscopic a sedimentului urinar

Conservarea urinei

Pentru ca urina s nu se altereze n timpul colectrii este necesar conservarea ei. Se poate face fie prin congelare imediat sub -20C, prin depozitare la frigider (4-8C), fie prin adugarea unor substane conservante, dar care s nu afecteze componentele urinei. n mod normal, exist conservani speciali, n funcie parametrii pe care vrem s-i determinm:

Parametru msuratStabilitate n urinFactori de influenFactori de interferenConser-vaniObservaii

-200C4-80C20-250C

Densitate urinar---Ingestie de lichide, diureticepH > 7-Precipitarea modific densitatea

pHInstabil InstabilInstabilDiet (carnat: , vegetarian: )--Crete n cazul formrii amoniacului

Leucocite -1-4 ore1-4 oreSecreii vaginaleCuloarea intens a urinei: ;

Valori crescute ale glucozei i proteinelor urinare: ;

Unele antibiotice: sau.-Liz rapid la densitate < 1.010 g/ml i pH > 7

Proteinele (albumina)6 luni1 lun1 lunExerciiile fizice, sarcin Hemoglobina; Ejacularea; Adsorbia pe pereii recipientelor de colectare Azid de sodiu 10 mmoli/l-

Nitriii -8 ore4 oreContaminare bacterianCuloarea intens a urinei: ;

Acidul ascorbic: -Antibioticele inhib formarea nitriilor

Corpii cetonici-6 ore2 oreInaniia, febraFenilcetonele, ftaleinele, compuii sulfhidrilici-Testul este sensibil n special la acidul acetoacetic

Glucoza 2 zilePeste

2 ore2 oreSarcina, dieta, vrsta, febraBacteriile Azid de sodiu 10 mmoli/l-

Eritrocite -1-4 ore1-4 oreMenstruaia, exerciiile fizice intenseOxidarea unor produi de metabolism ai unor medicamente

-Liz rapid la densitate 7

Parametru msuratStabilitate n urinFactori de influenFactori de interferenConser-vaniObservaii

-200C4-80C20-250C

Urobilino-genul-- 2 ore-Expunerea la lumin ;

Culoarea intens a urinei ; Fenazopiridina -Se oxideaz la aer

Bilirubina --2 ore-Expunerea la lumin ; Acidul ascorbic ; Fenazopiridina -Se oxideaz la aer

Amilaza3 spt-mni10 zile2 zileFuncia renal-Azid de sodiu 10 mmoli/lContaminare cu saliv

Proteina Bence-Jones6 luni1 lun7 zile--Azid de sodiu 10 mmoli/l-

Calciul Sub 3 spt-mni4 zile2 zileDieta , sezonul, momentul zilei (cu minime ntre 9.00 p.m. i 6.00 a.m.)Cristalizarea la temperaturi sczute n absena acidifieriiAcidifiere la pH < 2Precipitarea (sub form de fosfat de calciu)

Creatinina 6 luni6 zile2 zileVrsta, dieta, masa muscularCorpii cetonici, unele medicamenteAzid de sodiu 10 mmoli/l-

Potasiul 1 an2 luni45 zile----

Sodiul 1 an45 zile45 zileDieta, sexul, ritmul circadian, unele medicamente ingerate--Azida de sodiu produce interferene

Ureea 1 lun7 zile2 zileDieta proteic, perfuzie cu aminoacizi-pH < 7; Azid de sodiu 10 mmoli/lBacteriile

Acidul uricInstabil Instabil 4 zileExerciiile fizice, dietapH < 5, unele medicamentepH > 8; Azid de sodiu 10 mmoli/LPrecipitare la

pH < 7

Oxalatul 4 luni, pH 1,5Instabil Instabil < 1 orDiet, vrstVitamina C pH < 2; Azid de sodiu 10 mmoli/l-

Fosfatul anorganic-6 luni pH < 52 zile pH < 5Diet, ritm circadianBacteriile, unii conservaniHCl 25 ml 6 mol/l sau timol 1% (vol) 5 ml per urina de 24 ore

Cistina > 1 an3 luni7 zile--Acidifiere cu HCl-

Sediment

Bacterii

Cilindri

Celule epiteliale

Eritrocite

Leucocite -

-

-

-

-24 ore

1-4 ore

-

1-4 ore

1-4 ore-

Instabili

Ore

1-4 ore

1-4 ore ---Celulele sufer o liz dependent de pH i osmolaritate (osmolaritatea < 300 mmol/l reduce stabilitatea)

Urocultura ---Timp de colectare, antibiotice, infecii din sfera genital, prezen de cateterTehnica de colectare (copii, vrstnici)-Se recomand prima urin de diminea. Factorii de influen pot produce rezultate fals negative; factorii de interferen pot produce rezultate fals pozitive.

Aplicaie practic

Examenul sumar al urinei

Examenul sumar al urinei cuprinde:

examenul macroscopic

examenul biochimic

examenul microscopic al sedimentului urinar.

1. Examenul macroscopic al urinei

a) Volumul

Nu intr n analiza sumarului de urin, ci doar la determinrile ce se efectueaz cantitativ pe urina de 24 de ore, dar din motive didactice se va trata n acest capitol.

Cantitatea de urin emis n 24 de ore, denumit diurez, se colecteaz ntr-un vas de sticl acoperit cu un capac i se msoar cu un cilindru gradat.

n condiii normale, diureza la brbai este de 1500 ml (1200 -1800 ml) iar la femei 1200 ml (1000-1400) dintre care 3/4 sunt eliminate n cursul zilei i numai 1/4 n cursul nopii (raport diurn / nictemeral 3/1). La copii diureza crete cu vrsta.

Diureza n clinostatism este mai mare dect n ortostatism, funcia normal se poate adapta la eliminarea unui volum foarte mic (25 ml/or) sau foarte mare (1200 ml/or) de urin, dup necesitile de moment.

n condiii fiziologice, volumul urinei din 24 de ore depinde de ingestia de lichide, alimentaie i temperatur, precum i de masa corporal i de factorii emoionali (starea psihic).

Produii finali azotai, ingestia de cafea, ceai i buturi alcoolice (n special berea) au efect diuretic, crescnd volumul urinei emise n 24 ore.

Modificrile patologice ale diurezei se refer la:

- volumul de urin eliminat n 24 de ore: poliurie, oligurie, anurie.

- ritmul eliminrii n 24 de ore: nicturie, opsiurie.

Poliuria nseamn producerea unei cantiti de urin ce depete 2 litri n 24 de ore. Se ntlnete n:

condiii fiziologice: frig, umezeal, emoii, consum excesiv de lichide sau produse vegetale bogate n ap, consum excesiv de cafea; n poliuriile fiziologice raportul nictemeral rmne nemodificat;

condiii patologice: hipertiroidie, administrare de diuretice n insuficien cardiac sau edeme renale, dup crize dureroase (angor pectoris, colic renal), dup crize de epilepsie, diabet zaharat, diabet insipid, glomerulonefrit, pielite, pielonefrite acute sau cronice, scleroz primar sau secundar, rinichi polichistic, TBC renal, hipertrofie de prostat etc; nicturia este caracteristic poliuriilor de cauz renal.

Oliguria nseamn producerea unei cantiti de urin mai mic de un litru n 24 de ore. Se ntlnete n:

condiii fiziologice: ingestia de cantiti mici de lichide, pierdere excesiv de ap prin transpiraie;

condiii patologice: insuficien cardiac, deshidratri prin vrsturi, diaree i hemoragii, oc, colaps, afeciuni hepatice, hipotiroidie, stri febrile, tulburri nervoase reflexe, glomerulonefrite difuze, glomerulonefrite cronice, nefrite interstiiale, nefropatii tubulare toxice, litiaz renal, tumori ale micului bazin, cuduri ureterale prin rinichi mobil etc.

Anuria nseamn incapacitatea complet a rinichiului de a produce urin (se elimin totui o cantitate mai mic dect 150 ml urin n 24 de ore). Anuria apare n toate afeciunile n care se produce oligurie, dac aciunea factorilor cauzali este mai intens sau de durat mai lung.

b) Aspectul

Aspectul urinei normale variaz n funcie de timpul trecut de la emisiune, de temperatura mediului ambiant, de tehnicile de conservare.

La emisiune, urina normal este limpede, transparent.

La o examinare fcut dup cteva ore, apare o suspensie sau un depozit floconos (nubecula) compus din celule descuamate ale cilor urinare, iar la femei i din celule vaginale descuamate.

n cazul urinelor alcaline sau neutre, aspectul imediat dup emisiune poate fi tulbure, datorit fosfailor alcalino-pmntoi.

inut la temperatur prea sczut, urina se tulbur datorit cristalizrii acidului uric i a uratului acid de sodiu.

Conservat defectuos, urina formeaz depozite de carbonat de calciu i fosfat amoniaco-magnezian.

Pentru a diferenia modificrile patologice ale aspectului urinei de modificrile ce depind de factorii mai sus amintii, se folosesc urmtoarele modaliti:

nclzire uoar pentru dizolvarea cristalelor de acid uric i urat acid de sodiu (5 ml urin ntr-o eprubet nclzit la flacr);

acidifiere cu acid acetic pentru dizolvarea depozitelor de carbonat de calciu, fosfat amoniaco-magnezian, fosfai alcalinopmntoi (5 ml urin peste care se pipeteaz 1 ml acid acetic 10%).

Modificri patologice ale aspectului urinei se ntlnesc n afeciuni renale ale cilor excretoare renale i sunt datorate prezenei elementelor figurate ale sngelui (hematii, leucocite), mucusului i diferiilor cilindri. Analiza unei urini tulburi (cu excepia determinrii aciditii), se execut numai dup ce urina a fost limpezit prin sedimentare.

Exist i afeciuni renale (insuficiena renal cronic) n care urina este foarte limpede, ca apa, transparent i fr sediment datorit poliuriei.

c) Culoarea

Culoarea urinei este dat de substanele colorate pe care le conine. Dintre acestea unele apar ca produi normali sau patologi ai metabolismului intermediar (pigmeni urinari, cromogeni, etc.), iar altele sunt de provenien alimentar (de exemplu coloraie roie dup consum de sfecl i varz roie) sau medicamentoas.

n mod fiziologic, urina prezint modificri i anume:

urina nocturn este mai nchis la culoare fa de urina diurn;

urina acid este mai nchis la culoare fa de urina alcalin;

urina ce conine medicamente sau produi de conjugare ai acestora poate fi:

verde albastr n cazul albastrului de metilen;

brun pn la neagr n cazul fenolului, rezorcinei, salolului, pirogalolului, taninului;

roie n cazul piramidonului, aspirinei.

Schimbri ale coloraiei urinei pot fi atribuite i diferitelor afeciuni renale sau extrarenale:

urina galben-portocalie, n boli febrile acute sau dup transpiraii acute;

urina galben palid, n diabet insipid, scleroz renal, insuficien renal cu poliurie,

dup ageni diuretici;

urina roie, n hematurie (bulion de came), hemoglobinurie, porfirie;

urina cenuie, n methemoglobinemii, sarcom;

urina brun n sindroame icterice;

urina verde-roiatic, pn la verde-neagr n nefrite acute hemoragice, sindroame

icterice forme grave;

urina neagr, n alcaptonurie.

d) Mirosul

Urina normal are un miros fad, miros de migdale amare, datorit acizilor volatili sau substanelor urinoide.

Urina normal poate avea miros modificat i anume:

accentuat, n urinele concentrate;

de violete, dup administrare de medicamente cu esen de terebentin;

dezagreabil, dup aport exogen de sparanghel, usturoi, hrean.

Modificrile patologice ale mirosului urinei pot fi:

miros amoniacal n boli infecioase sau tumorale renale i ale cilor excretoare renale;

miros putrid n infecii cu flor anaerob;

miros de mere acre n diabet, vrsturi acetonemice ale copiilor.

2. Examenul biochimic al urinei

Examenul biochimic se efectueaz n prezent cu ajutorul stripurilor urinare (numite i bandelete reactive). Acestea analizeaz semicantitativ unii produi prezeni n urin: urobilinogenul, bilirubina, corpii cetonici, acidul ascorbic (unele dintre ele), glucoza, proteinele, hematiile, nitriii, leucocitele precum i pH-ul i densitatea urinar.

Bandeleta de test conine mai multe zone distincte, fiecare corespunztoare unui anumit parametru de testat. Introducerea bandeletei n urin va produce sau nu modificarea coloraiei n fiecare zon. Modificrile vor fi comparate cu o scar etalon, livrat odat cu testul, n care se face corelaia ntre concentraia parametrului analizat i modificarea de coloraie obinut.

Un strip este alctuit din 4 straturi suprapuse: o folie protectoare de nylon, o hrtie impregnat cu reactivul corespunztor, o hrtie de filtru absorbant i un suport de plastic.

SHAPE \* MERGEFORMAT

Indicaiile utilizrii stripurior urinare:

- boli renale i de tract urogenital. n acest caz, se urmresc modificrile de culoare la nivelul bandeletelor reactive n special a urmtorilor parametrii: pH, leucocite, nitrii, proteine, hematii, densitate urinar. Importana efecturii unui examen sumar de urin de rutin reiese din faptul c bolile renale i de tract urogenital rmn adesea asimptomatice o perioad lung de timp, conducnd adesea la alterri ireversibile. De exemplu, insuficiena renal reprezint stadiul terminal al diverselor nefropatii primare i secundare, iar singura posibilitate de tratament a acesteia este reprezentat de dializ sau de transplantul renal. n plus, are repercusiuni negative asupra altor organe i sisteme, ndeosebi asupra sistemului cardiovascular.

- boli metabolice (n special diabetul zaharat). Se urmresc glucoza i corpii cetonici urinari i nu numai acestea deoarece, n timp, diabetul zaharat se complic cu diverse forme de nefropatie.

- boli hepatice i anemii hemolitice. n acest caz important este determinarea urobilinogenului i a bilirubinei. n multe boli hepatice simptomatologia apare doar n stadii avansate iar un diagnostic precoce conduce la instituirea imediat a tratamentului, evitnd complicaiile ce pot aprea ulterior.

- monitorizarea unor tratamente cu schimbarea, la nevoie, a strategiei terapeutice.

- medicina general cu scopul efecturii de screening-uri pentru depistarea bolilor aflate ntr-un stadiu incipient asimptomatic.

Mod de lucru

Se utilizeaz urina proaspt necentrifugat, de obicei prima urin de diminea.

Urina se colecteaz ntr-un vas de preferin steril (dac recipientul nu este steril, nu se interpreteaz nitriii).

Bandeleta se imerseaz timp de dou secunde n urin n aa fel nct toat suprafaa s fie acoperit.

Se ndeprteaz excesul de lichid, lipind marginea bendeletei de marginea vasului cu urin, apoi se pune bandeleta n poziie orizontal.

Se compar zonele reactive de pe bandelet cu cele corespunztoare de pe scala etalon ntr-un interval de 60 de secunde (pentru leucocite intervalul de 60-120 de secunde).

Nu se vor depi dou minute pentru compararea rezultatelor.

Parametrii determinai cu ajutorul stripurilor (bandeletelor) urinare

a) Densitatea urinar

Principiu

Testul determin concentraia ionic a urinei, bazndu-se pe eliberarea protonilor care, n prezena cationilor, formeaz un complex. Reacia produce schimbarea culorii indicatorului (albastru de brom-timol). Constituenii neionici ai urinei, cum ar fi glucoza sau ureea nu sunt determinai. De aceea, o cretere a densitii datorit concentraiei glucozei > 1000 mg/dl (> 56 mmol/l) nu este determinat prin acest test.

(* = Etilenglicol bis (-aminoetileter) N,N-tetraacetic acid)

Surse de eroare

prezena proteinelor (100-500 mg/dl) conduce la rezultate fals crescute. Acelai fenomen are loc i n cazul urinei cetoacidozice.

la un pH de 7 sau mai mare, valorile sunt mai mari cu 0,005 g/ml

Semnificaii clinice

Densitatea urinei normale, numit normostenurie, variaz ntre 1,015-1,025 g/cm3. n condiii de hidratare sau de deshidratare a organismului, limitele sunt mai largi, variind ntre 1,000-1,030 g/cm3. n condiii fiziologice densitatea urinei variaz invers proporional cu cantitatea emis i direct proporional cu cantitatea de substane pe care le conine i cu intensitatea culorii.

Valorile mai mici de 1,010 g/ml au o semnificaie analitic deoarece, n acest caz, leucocitele i hematiile sufer o liz rapid. Aa se explic rezultatele negative obinute la citirea sedimentului urinar dar cu rezultate pozitive pe strip.

n cazul alterrii funciei de concentrare a rinichiului, sau a eliminrii anormale a unor metabolii, corelaia dintre densitate i diurez se pierde. Patologic se remarc urmtoarele situaii:

Hiperstenurie, densitate peste 1,025 g/ml, apare n diabet, proteinurie, urini concentrate survenite n urma unui regim de sete, transpiraii abundente, stri febrile, etc.

Hipostenurie, densitate sub 1,015 g/ml, apare n diabet insipid, aport excesiv de ap sau alimente bogate n ap (fructe).

lzostenurie, densitile tuturor emisiunilor din 24 de ore sunt egale i cuprinse n jurul valorii de 1,002 g/ml (densitatea ultrafiltratului plasmatic glomerular). Apare n caz de insuficient renal grav dovedind incapacitatea de diluare sau concentrare a rinichiului.

b) pH-ul

Principiu

Zona reactiv conine un amestec de trei indicatori: rou metil, albastru de brom-timol i fenolftalein. n limita de pH de 5-9 se obine o culoare care variaz gradat de la portocaliu-galben-verde pn la albastru.

Surse de eroare

n cazul probelor de urin care staioneaz timp ndelungat nainte de a fi lucrate, pH-ul poate vira spre alcalin, ca rezultat al creterii bacteriene.

Semnificaii clinice

n mod normal, urina are o reacie acid. pH-ul urinei este determinat, n cea mai mare msur, de proporia de fosfai bibazici (alcalini) i monobazici (acizi) aflai n urin. Dup cum se tie, rinichiul este irigat de snge, care are un pH de aproximativ 7,4 i formeaz urina cu un pH acid. Aceast variaie de pH se realizeaz, n parte, prin modificarea proporiei dintre fosfaii acizi i alcalini.

Raportul acestora n plasm (pH = 7,4) este:

iar n urin (pH = 4,5 - 5,5) se inverseaz:

n cazurile n care urina atinge aciditatea maxim, raportul este egal cu 50:1.

Prin acest mecanism sunt cruate o mare cantitate de baze fixe ale organismului (n special Na+, dar i K+, Mg2+ i Ca2+).

pH-ul urinar variaz n intervalul 5,8 - 7,4 n cursul zilei; urina de diminea are un pH de 5 - 6.

n condiii fiziologice, pH-ul urinar variaz n funcie de alimentaie. ntr-o alimentaie strict carnal, urina este acid, cu un pH cuprins ntre 5,2 - 5,3, n timp ce ntr-o alimentaie exclusiv vegetarian, urina este alcalin, cu un pH cuprins ntre 7,0 - 7,5. n cazul unei alimentaii mixte, reacia urinei este slab acid. Trebuie reinut faptul c, dup administrarea de bicarbonai sau tratament cu ape minerale, urina are o reacie alcalin.

Ca i volumul urinei, valoarea pH-ului este supus unui ritm nictemeral. Urina cea mai acid se elimin spre miezul nopii i cea mai puin acid (uneori alcalin) dimineaa. Prin pstrare timp mai ndelungat, urina poate deveni alcalin cci, prin contaminare cu germeni microbieni, are loc descompunerea ureei (sub aciunea ureazei) n amoniac.

Valorile pH-ului care depesc valoarea 7 au o importan analitic deoarece, n acest caz, eritrocitele i leucocitele sufer o liz rapid, ceea ce explic rezultatele negative obinute la sedimentul urinar n condiiile unor rezultate pozitive pe strip.

n mod patologic semnalm persistena valorilor pH-ului acid sau alcalin independent de alimentaie.

Valori sczute ale pH-ului urinar (urinei acide) se ntlnesc n: inaniie, diverse intoxicaii, insuficien renal, cetoacidoz diabetic.

Valori crescute ale pH-ului urinar (urinei alcaline) se ntlnesc n: vrsturi abundente de diferite etiologii, infecii ale cilor urinare (uretrite, cistite, pielite, pielonefrite), hipopotasemii severe, diverse intoxicaii, febr de diverse etiologii.

c) Leucocitele

Principiu

Leucocitele excretate n urin sunt aproape exclusiv granulocite ce prezint o activitate esterazic detectat prin reacia de pe strip. Zona reactiv conine un ester indoxilic care este clivat de ctre esteraza granulocitar. Indoxilul liber reacioneaz apoi cu o sare de diazoniu, formnd un derivat diazo colorat violet.

Acest test detecteaz activitatea esterazei granulocitare i histiocitare (histiocitele sunt de asemenea produse n urma unui proces inflamator iar la examinarea microscopic nu se pot diferenia de leucocite pe preparate native necolorate). Ca urmare, sunt detectate nu numai celulele intacte ci i cele lizate.

Surse de eroare

Dac urina este intens colorat, aceast coloraie poate masca culoarea obinut n urma reaciei de pe strip.

Excreia de proteine peste 500 mg/dl i a glucozei peste 2 g/dl poate bloca colorarea zonei reactive zonei reactive. Aceleai efecte le au i unele medicamente administrate n doze mari (gentamicina, cefalexinul).

Unele medicamente pot da reacii fals pozitive: meropenemul, imipenemul, acidul clavulanic.

Semnificaii clinice

Leucocituria reprezint un indicator important al proceselor inflamatorii renale i ale tractului urinar: infecii bacteriene (cistite, uretrite, pielonefrite acute i cronice), infecii abacteriene cauzate de virusuri i levuri, infecii parazitare, glomerulopatii, intoxicaii. De asemenea, prezena leucocitelor n urin poate fi cauzat i de o contaminare cu secreii din cile genitale, dar n marea majoritate a cazurilor, pozitivarea testului pentru leucocite semnific prezena unei infecii bacteriene de tract urinar.

Uneori, n cazul inflamaiilor cronice, se observ o puternic reacie leucocitar n absena bacteriilor, cunoscut sub numele de leucociturie abacterian. Aceast situaie este observat adesea ca simptom unic n pielonefritele cronice, tuberculoz, diverse tumori.

d) Nitriii

Principiu

Nitriii sunt detectai pe baza principiului testului Griess: orice nitrat prezent n urin e transformat prin reducere de ctre bacterii ntr-un nitrit:

Nitrat reducere bacterian NitritAmina aromatic a sulfanilamidei reacioneaz cu nitritul n prezena unui tampon acid, formnd o sare de diazoniu, care se cupleaz cu 3-hidroxi-1,2,3,4-tetrahidrobenzo-(h)-chinolin, formnd un derivat azo de culoare roie. Intensitatea culorii este direct proporional cu concentraia nitriilor, dar fr nici o legtur cu severitatea infeciei.

Surse de eroare

rezultatele fals pozitive se datoreaz: poliuriei care spal cile urinare, alimentaiei parenterale, dietei carnale, timpului ndelungat scurs pn la efectuarea testului (peste 4 ore), utilizarea de recipiente nesterile (n aceast situaie nu se interpreteaz testul pentru nitrii).

rezultatele fals negative se datoreaz: contaminrii bacteriene a urinei, tratament cu substane ce conin fenazopiroclor.

Semnificaii clinice

Reacia pentru nitrii este specific pentru prezena bacteriuriei; reacia este independent de pH. Un singur test negativ nu exclude o infecie de tract urinar deoarece numrul bacteriilor i coninutul de nitrai poate varia. Absena culorii la teste repetate nu exclude o infecie deoarece nu toate microorganismele formeaz nitrii.

n mod normal, urina nu conine nitrii. Administrarea de tratamente ce au n componena lor nitrii nu se concretizeaz prin excreia de nitrii. Orice nitrit excretat urinar este de natur exclusiv bacterian.

n prezena unui tratament antibiotic sau a chimioterapiei, metabolismul enzimatic i populaia microbian sunt inhibate, deci vom avea un test negativ. Din aceast cauz, orice tratament antimicrobian trebuie ntrerupt cu cel puin 3 zile nainte de efectuarea testului.

e) Proteinele (albuminele)

Principiu

Reacia se bazeaz pe aa numita eroare proteic a indicatorilor de pH. Zona reactiv conine un amestec tampon i un indicator care i schimb culoarea de la galben la verde n prezena proteinelor, independent de pH.

Surse de eroare

Rezultate fals pozitive sunt obinute n urmtoarele condiii: administrare de polivinilpirolidona (un substitut de snge), prezena unor reziduuri de dezinfectani ce conin grupri cuaternare de amoniu sau clorhexidin, medicaie ce conine fenazopiridin.

Medicamente ca i chinina, chinidina, clorochina, sulfonamidele, penicilina nu interacioneaz cu reacia de pe strip.

Semnificaii clinice

Indicatorul este foarte sensibil la albuminele cu mas molecular mic, excretate n cazul afectrii renale. Sensibilitatea la alte proteine este sczut (proteina Bence-Jones, -globuline, peptone, mucoproteine).

Urina normal conine cantiti extrem de mici de proteine (50-100 mg/24 ore sau 10-30 mg/dl pentru prima urin de diminea), ce nu pot fi evideniate prin reaciile de recunoatere obinuite. n mod patologic urina poate conine ns cantiti mai mari sau mai mici de substane proteice: ele constituie aa numita proteinurie.

Proteinuria este frecvent un semn de boal renal dar este nespecific. Prezena ei nu demonstreaz o nefropatie dar nici absena ei nu o exclude. Depistarea unei proteinurii necesit un diagnostic diferenial.

Proteinuria benign. La unele persoane sntoase, fr afectare renal, se poate observa uneori o proteinurie ce apare mai frecvent n jurul vrstei de 30 ani. Cauzele cele mai incriminate sunt: stresul fizic i emoional, ortostatismul prelungit, lordoza. Proteinuriile asociate hipotermiei, supranclzirii organismului, sarcinii sau folosirii medicamentelor vasoconstrictoare sunt, de asemenea, considerate benigne.

Proteinuria extrarenal. Proteinele pot aprea n urin n majoritatea situaiilor cu tablou acut, cum ar fi: colicile, crizele epileptice, infarctele, accidentul vascular cerebral, traumatisme craniene, postoperator. Aceste proteinurii dispar imediat ce cauza extrarenal a fost eliminat.

Proteinuria de cauz renal. O cretere a permeabilitii capilarelor glomerulare datorit modificrilor patologice de la acest nivel conduce la dezvoltarea proteinuriei renale. Aceast proteinurie este persistent i este observat pe tot parcursul zilei i a nopii. Cele mai pronunate proteinurii sunt observate n nefroze. n glomerulonefrite excreia proteic este de obicei situat n jurul valorii de 200-300 mg/dl i nsoit de alte cteva simptome, fiind acompaniat aproape constant de microhematurie.

Proteinuria de origine tubular se datoreaz leziunilor celulelor tubulare i/sau tulburrilor de absorbie tubular a proteinelor din filtratul glomerular. Acest tip de proteinurie se ntlnete n cazul pielonefritelor, nefritelor, chistelor renale, rinichiului polichistic.

Excreia intermitent de proteine apare adesea n pielonefritele cronice.

Proteinuria postrenal nsoete procesele inflamatorii de la nivelul vezicii urinare, prostatei i hemoragiile tractului urinar.

f) Glucoza

Principiu

Testul de punere n eviden a glucozei se bazeaz pe reacia specific cu glucozoxidaz - peroxidaz n care D-glucoza este oxidat enzimatic de ctre oxigenul atmosferic la -D-gluconolacton. Apa oxigenat rezultat este utilizat ntr-o reacie de culoare. Astfel, sub aciunea peroxidazei, apa oxigenat se descompune n ap i oxigen atomic care oxideaz tetrametilbenzidina la un derivat colorat n verde-albastru.

Surse de eroare

Datorit reaciei enzimatice, interferentul major, vitamina C, a fost eliminat.

Testul este independent de pH i de prezena corpilor cetonici.

Rezultate fals pozitive pot aprea la utilizarea dezinfectanilor care conin ap oxigenat.Semnificaii clinice

Urina normal conine o cantitate foarte mic de glucide (350-500 mg/24 ore sau 15 mg/dl n urina de diminea), cantitate neidentificabil prin metodele uzuale.

Determinarea glucozei n urin are o valoare diagnostic mare pentru depistarea diabetului zaharat ct i pentru posibilitatea de autocontrol a acesteia de ctre pacieni. Pe de alt parte, absena glicozuriei nu exclude o alterare a metabolismului glucidic, n particular, nu exclude un diabet zaharat. De asemenea, glicozuria poate fi cauzat i de ali factori.

Glicozuria apare atunci cnd reabsorbia tubular (tubul proximal) la nivel renal a glucozei este depit, la o valoare a glicemiei de peste 150-180 mg/dl (prag renal de eliminare a glucozei).

Glicozuria din diabetul zaharat. Majoritatea pacienilor diabetici prezint glicozurie, dependent de severitatea bolii i de integritatea funciei renale. Determinarea glicozuriei postprandial este mai eficient pentru depistarea diabetului dect cea efectuat folosind prima urin de diminea.

Glicozuria renal (diabetul renal) reprezint o tulburare congenital benign caracterizat prin prezena unei glicozurii, constante sau intermitente, n timp ce glicemia are valori normale sau sczute. n aceast situaie, reabsorbia tubular a glucozei este limitat, fapt care duce la pierderea de glucoz prin urin.

g) Corpii cetonici

Principiu

Depistarea corpilor cetonici se bazeaz pe reacia Legal. Acidul acetoacetic i acetona reacioneaz cu nitroprusiatul de sodiu i glicina n mediu alcalin conducnd la un compus violet. Reacia este specific doar pentru cei doi corpi cetonici; acidul -hidroxibutiric nu reacioneaz.

Semnificaii clinice

Corpii cetonici (acidul acetoacetic, acidul -hidroxibutiric i acetona) sunt prezeni n urin atunci cnd exist o degradare a acizilor grai datorit unui aport insuficient de energie sub form de glucoz. Predominana lipolizei conduce la creterea nivelului acizilor grai liberi n ser, urmat de degradarea lor la nivel hepatic pn la acetil-Coenzima A, form sub care pot fi utilizai n continuare n alte procese metabolice. Acest exces va fi convertit n acid acetoacetic ce va fi transformat parial n acid -hidroxibutiric i doar o mic parte n aceton.

Cetonuria din diabetul zaharat. Prezena corpilor cetonici n urin este semnalat atunci cnd diabetul zaharat este decompensat. Starea comatoas i precomatoas sunt ntotdeauna acompaniate de cetoacidoz, cu excepia comei hiperosmolare. Deficitul relativ sau absolut de insulin determin reducerea utilizrii glucozei de ctre esutul adipos i celula muscular, avnd ca rezultat intensificarea lipolizei. Corpii cetonici rezultai mpreun cu alte modificri fiziopatologice (deshidratare, pierdere de electrolii) au ca i consecin instalarea comei.

Cetonuria de cauz nediabetic. Exist i alte situaii n care apar corpii cetonici n urin: inaniie, vrsturi incoercibile la copii mici, febr n special atunci cnd nsoete o boal infecioas, vrsturile din primele luni de sarcin, boli metabolice congenitale.

h) Urobilinogenul

Principiu

Fluoroboratul de p-metoxibenzendiazoniu, o sare de diazoniu stabil, formeaz un compus azo de culoare roie n prezena urobilinogenului n mediu acid.

Surse de eroare

Rezultate fals negative se ntlnesc n urmtoarele condiii: timpul ndelungat scurs de la recoltare pn la efectuarea testului i expunerea probei la lumin determin oxidarea urobilinogenului; terapia cu hexametilentetramin, conservarea probei de urin cu formol.

Rezultatele fals pozitive se pot datora medicaiei care coloreaz urina n rou sau prezint o culoare roie n mediu acid.

Testul este specific, nefiind supus interferenelor care apar n cazul reaciei Ehrlich.

Semnificaii clinice

Urobilinogenul se formeaz prin reducerea de ctre bacteriile intestinale a bilirubinei care este secretat n intestin prin bil. Acesta aste reabsorbit i ajunge la ficat, dar o mic parte se excret prin urin.

Suprancrcarea capacitii funcionale hepatice. Cnd sunt prezente cantiti mari de bilirubin, i de asemenea i urobilinogen, ca rezultat al degradrii excesive a hemoglobinei, capacitatea funcional hepatic poate fi depit, chiar dac ficatul prelucreaz de 2-3 ori mai mult urobilinogen dect n mod normal. Urobilinogenul neprelucrat ajunge n torentul sangvin i n final este excretat renal. Cauzele suprancrcrii capacitii funcionale hepatice sunt: anemii hemolitice, anemie pernicioas, hemoliz intravascular ca i consecin a unor intoxicaii, boli infecioase sau accidente transfuzionale, policitemie.

Alterarea capacitii funcionale hepatice. Bolile hepatice au drept consecin alterarea capacitii funcionale a ficatului. Urobilinogenul ce intr prin vena port nu este complet metabolizat i se elimin ca atare la nivel renal. Aceast alterare se ntlnete n urmtoarele situaii: hepatite virale, hepatite cronice, ciroz hepatic, intoxicaii cu lezarea parenchimului hepatic, tumori hepatice.

Scurtcircuitul hepatic. n unele situaii patologice (de exemplu, n ciroza hepatic cu hipertensiune portal, tromboz de ven port, ocluzia venei hepatice) fluxul sangvin la nivelul venei porte este redus, iar o parte din urobilinogen trece direct n snge, fiind excretat renal.

Absena urobilinogenului din urin. Urobilinogenul este absent n urin n situaia produciei insuficiente de bil de ctre celulele hepatice, alterarea capacitii de secreie a bilei n intestin i absena reducerii bilirubinei la nivel intestinal. Cauze: obstrucia complet a ductului biliar comun n absena infeciei de tract biliar, stoparea complet a produciei de bil de ctre ficat (hepatite virale severe, intoxicaii cu afectare hepatic sever), absena florei intestinale (fiziologic la nou-nscui i ntlnit rar dup un tratament antibioterapic intensiv).

i) Bilirubina

Principiu

Reacia se bazeaz pe cuplarea bilirubinei cu o sare stabil de diazoniu (2,6-diclorobenzendiazoniu difluoroborat) n mediu acid, cu formarea unui derivat azo de culoare violet.

Surse de eroare

Sensibilitatea este alterat de cantiti mari de acid ascorbic sau nitriii din urin.

Rezultate fals negative se ntlnesc n urmtoarele condiii: timpul ndelungat scurs de la recoltare pn la efectuarea testului i expunerea probei la lumin determin oxidarea bilirubinei.

Rezultatele fals pozitive se pot datora medicaiei care coloreaz urina n rou sau prezint o culoare roie n mediu acid (de exemplu fenazopiridina).

Semnificaii clinice

Ca rezultat al conjugrii (esterificrii) cu acid glucuronic, bilirubina devine hidrosolubil i astfel susceptibil de a fi excretat renal. Bilirubina prezent n urin este ntotdeauna bilirubin conjugat (direct).

n toate procesele patologice, n care avem o cretere a concentraiei bilirubinei conjugate n plasm, avem i nivele considerabile ale bilirubinei urinare. Bilirubina conjugat este prezent n cantiti mari n plasm n urmtoarele situaii: creterea presiunii intracanaliculare datorit obstruciei intra- sau extrahepatice, inflamaie sau fibroz periportal, necroz hepatic.

j) Hematiile (eritrocitele)

Principiu

Testul se bazeaz pe activitatea de tip peroxidazic a hemoglobinei i mioglobinei, care catalizeaz oxidarea unei substane indicator (3,3,5,5-tetrametilbenzidin) de ctre un hidroperoxid organic (2,5-dimetilhexan-2,5-hidroperoxid), conducnd la un compus verde-albastru.

Exist dou scale pentru determinarea hemoglobinei i a eritrocitelor libere. Sensibilitatea testului este de 5 eritrocite/l ceea ce corespunde la 0,015 mg hemoglobin/dl urin. Aceast sensibilitate mare este dat de adugarea unui activator n amestecul de reacie.

Surse de eroare

Prezena vitaminei C nu interfer cu reacia de pe strip.

O concentraie a nitriilor de peste 2,2 mmol/l (10 mg/dl) (valori foarte rar ntlnite n infeciile de tract urinar) scade sensibilitatea reaciei.

Nu se recomand conservarea urinei cu formol deoarece conduce la rezultate fals negative.

Rezultate fals pozitive se pot obine dac urina conine urme de detergeni oxidani.

Proteinuria peste 5 g/l (500 mg/dl) poate atenua reacia de culoare a hemoglobinei.

Semnificaii clinice

Hematuria, excreia eritrocitelor n urin, este ntlnit n multe situaii patologice i din acest motiv este necesar clarificarea originii sngerrii. n aceast situaie, cele mai multe date sunt oferite de examinarea morfologiei hematiilor din sedimentul urinar.

Cauzele hematuriei

calculii renali. Prezena lor provoac dureri colicative renale acute, nsoite adesea de hematurie.

tumori ale tractului urinar. Microhematuria de cauz neprecizat ca manifestare unic de boal este adesea de origine tumoral, deoarece majoritatea tumorilor sunt asimptomatice o perioad lung de timp.

glomerulonefritele. n acest caz hematuria, adesea microscopic, este nsoit de proteinurie i hipertensiune arterial. Dismorfismul eritrocitar are, n acest caz, un rol diagnostic important.

pielonefritele n care hematuria este prezent doar la o treime din pacieni.

Metode clasice utilizate la examenul biochimic al urinei

Unele laboratoare utilizeaz nc unele metode de determinare a ctorva parametrii biochimici ai urinei

a) Densitatea urinar

Densitatea urinei se determin cu urodensimetrul, folosind un eantion din urina colectat n 24 de ore. Urodensimetrul este un densimetru etalonat pentru determinarea densitii de lichide cuprinse ntre 1,000-1,060 g/cm3 la 15C. De aceea, n cazul n care determinarea densitii urinei se face la alt temperatur i urina conine glucoz este necesar corectarea densitii. Corectarea se face folosind tabelul Buchardat.

Mod de lucru

ntr-un cilindru gradat de 50 ml se aduc aproximativ 40 ml urin, evitnd formarea spumei; dac spuma totui s-a format, ea se ndeprteaz cu o hrtie de filtru. Se cufund apoi urodensimetrul n cilindrul cu urin, iar cnd acesta nu mai oscileaz se citete densitatea corespunztoare diviziunii de pe tija aflat la suprafaa urinei, avnd grij ca urodensimetrul s nu fie lipit de pereii cilindrului.

b) pH-ul urinar

Determinarea pH-ului cu hrtie indicatorReactivi: pachete cu benzi de hrtie i o scala de culori corespunztoare.

Mod de lucru

Se introduce n urina proaspt emis, timp de 1-2 secunde, o band de hrtie indicator universal. Dup 30 de secunde se stabilete valoarea pH-ului comparnd culoarea hrtiei cu cea a scalei de culori care nsoete pachetul.

c) Proteinele

Recunoaterea global a proteinelor din urin

Apariia proteinelor n urin se evideniaz prin precipitarea lor sub aciunea unor ageni de precipitare ca: acidul sulfosalicilic, picric, acetic etc. Mai folosit este primul pentru c:

- este foarte sensibil, reuind s deceleze cele mai fine urme de proteine prezente;

- precipit toate tipurile de proteine, cu excepia peptonelor;

- reacia are loc la rece.

Proba cu acid sulfosalicilic

Principiu

n prezena proteinelor existente n urin, acidul sulfosalicilic determin apariia unei turbiditi sau chiar a unui precipitat, n funcie de proteinurie.

Reactivi

Acid sulfosalicilic 20%.

Mod de lucru

ntr-o eprubet se msoar aproximativ 3 ml urin, centrifugat, peste care se toarn 2-3 picturi de acid sulfosalicilic. Se agit i se urmrete apariia turbiditii pe un fond negru, n comparaie cu o eprubet care conine numai urin.

Rezultat

urina rmne limpede: lipsesc proteinele n urin, rezultat negativ (-);

urina prezint opalescen uoar = urme de proteine ():

opalescen evident = pozitiv (+);

opalescen intens = pozitiv (++);

precipitat uor = intens pozitiv (+++):

precipitat granular sau cazeinos abundent = intens pozitiv (++++).

Cauze de eroare

Unele medicamente, aflate n urin, pot da cu acidul sulfosalicilic o opalescen mai mult sau mai puin intens.

Recunoaterea albuminelor termosolubile (Bence-Jones)

Mod de lucru

ntr-o eprubet se nclzesc 10 ml urin la temperatura de 60C. Prezena albuminei termosolubile se manifest prin apariia unui coagul sau a unei tulbureli, care dispare dac ridicm temperatura. Natura chimic a albuminelor tip Bence-Jones este diferit.

Determinarea proteinelor din urin (Metoda Esbach)

Reactivi

Reactiv de precipitare: 10 grame acid picric i 20 grame acid citric se dizolv n ap i se aduc la un volum final de 1000 ml.

Mod de lucru

n albuminometrul Esbach se toarn urina filtrat pn la semnul U i reactiv pn la semnul R. Se amestec i se las n repaus 24 de ore, dup care se citete nlimea precipitatului depus. Gradaiile albuminometrului indic direct grame de proteine/1000 ml urin. Dac urina are o densitate mai mare de 1,008 g/ml, se va dilua cu ap de dou ori, iar pentru densitatea de 1,020 g/ml se va dilua de 3 ori. Rezultatele obinute se nmulesc cu diluia.

n unele cazuri, albumina precipitat nu se depune la fundul tubului, ci rmne n suspensie. n aceste cazuri avem de-a face cu albumina neretractibil, descris de Bouchardat.

d) Glucidele

Recunoaterea glucidelor reductoare

Glucidele eliminate (aldozele) au proprieti reductoare fa de anumii reactivi care conin sruri de cupru, argint sau bismut, datorit prezenei n molecula lor a unei funciuni carbonilice libere. Excepie face zaharoza, care are funciunile carbonilice blocate, dar prin hidroliz elibereaz produi cu aciune reductoare. Reducerea reactivilor poate fi dat i de alte substane cu caracter reductor coninute n urin, motiv pentru care este normal s se indice existena corpilor reductori.

Metoda Botger-Nylander

Principiu

Azotatul bazic de bismut, n mediu alcalin, la cald este redus de ctre un glucid reductor la bismut metalic de culoare neagr:

Reactivi

Reactiv Nylander: 100 g hidroxid de sodiu, 40 g sare Seignette (tartrat dublu de sodiu i potasiu) i 20 g azotat bazic de bismut se dizolv i se aduc la 1000 ml cu ap distilat.

Mod de lucru

Se msoar ntr-o eprubet 1 ml urin i o pictur de reactiv Nylander. Se menine eprubeta n baia de ap la fierbere, timp 5 minute. Apariia unui precipitat negru indic un rezultat pozitiv. Pot aprea rezultate fals pozitive datorit apariiei unui precipitat negru de sulfur de bismut, produs de aminoacizii cu sulf din albuminele urinare. n aceste cazuri se repet proba cu un reactiv cu sulfat de cupru (Benedict). Reacia este sensibil i are valoare diagnostic deosebit cnd rezultatul este negativ.

Metoda Benedict (semicantitativ)

Principiu

Monozaharidele, n mediu alcalin, la cald, reduc srurile cuprice complexate la oxid cupros rou-crmiziu. Complexarea ionilor de cupru n mediu alcalin (pentru a mpiedica formarea hidroxidului cupric) se face cu citrat de sodiu.

Reactivi

Reactiv Benedict: 173 g citrat de sodiu, 100 g crbonat de sodiu anhidru i 17,3 g sulfat de cupru se dizolv i se aduc la 1000 ml cu ap distilat.

Mod de lucru

ntr-o eprubet se msoar: 1 ml reactiv Benedict i o pictur urin. Se menine eprubeta n baia de ap la fierbere, timp de 5 minute.Rezultat

Modul n care este interpretat reacia este redat n tabelul urmtor:

CuloareaCitirea reacieiConcentraia glucidului

(g/1000 ml)

Neschimbatnegativ0

Verde fr precipitat+0,2-0,3

Verde cu precipitat+0,5

Verde msliniu++1,0

Portocaliu+++1,5

Rou-crmiziu++++peste 2,0

Deoarece reacia de reducere este dat i de alte glucide n afar de glucoz, pentru a stabili exact natura glucidului identificat se utilizeaz reacia cu fenilhidrazin sau o reacie enzimatic.

e) Corpi cetonici

Reacii de recunoatere

La recunoaterea lor se folosesc reaciile de culoare pe care acidul acetilacetic i acetona le dau cu: nitroprusiatul de sodiu, aldehida salicilic, clorura feric. n continuare sunt prezentate cteva modaliti de recunoatere a corpilor cetonici, bazate pe reacia de culoare cu nitroprusiatul de sodiu.

Reacia Legal-Imbert

Principiu

Corpii cetonici menionai reacioneaz cu reactivul Legal-Imbert n prezena amoniacului, dnd natere unui produs de culoare violet.

Reactivi

1. Reactiv Legal-Imbert (nitroprusiat de sodiu 5 g, acid acetic glacial 50 ml se dizolv i se completeaz cu ap distilat la 100 mI). Se conserv n sticle brune.

2. Amoniac concentrat 25%.

Mod de lucru

ntr-o eprubet se pipeteaz 2-3 ml urin filtrat i 4-6 picturi de reactiv Legal-Imbert i se omogenizeaz. Pe pereii eprubetei se prelinge circa 1 ml de amoniac 25%, n aa fel nct acesta s formeze un strat superior, apoi se las n repaus 15 minute.

Urina normal nu d nici o reacie. n prezena corpilor cetonici apare un inel violet la limita de contact dintre cele dou straturi de lichide.

Reactivi sub forma solid

Deoarece reactivul Legal-Imbert, aflat sub form de soluie, se altereaz n timp, poate fi nlocuit cu reactivi n stare solid care, sub form de pulbere sau de pastile, sunt mai stabili.

Reactivul sub form de pulbere. Se obine prin amestecarea urmtoarelor substane n proporiile indicate (nitroprusiat de sodiu 0,5 g, sulfat de amoniu 10,0 g, carbonat de sodiu anhidru 10,0 g)

Mod de lucru

Pe o plac de porelan se pune un vrf de spatul de pulbere peste care se adaug 2-3 picturi de urin i se amestec cu o baghet sau cu colul unei lame de microscop. Dac urina conine corpi cetonici apare o culoare violet mai mult sau mai puin intens. n absena corpilor cetonici culoarea violet nu apare.

Reactiv sub form de pastil. Se gsete n comer, sub denumirea de "acetotest", nsoit de modul de lucru, care fiind foarte simplu, poate fi efectuat chiar de ctre bolnavul neinternat n spital.

Mod de lucru

ntr-o eprubet se introduc aproximativ 5 ml de urin proaspt peste care se adaug pastila i se ateapt cteva minute. Prezena corpilor cetonici face ca pastila s se coloreze n violet, cu nuane i intensiti de culoare dependente de cantitatea de corpi cetonici.

Cauze de eroare

La concentraii mari i creatinina d, n aceleai condiii, culoare violet.

Importana diagnostic a reaciei

n mod curent, n strile de cetoacidoz, eliminarea corpilor cetonici n urin crete apreciabil. Aceast situaie se ntlnete n afeciuni care cresc cetogeneza hepatic sau scad utilizarea corpilor cetonici n esuturile extrahepatice (esut muscular, rinichi) i anume: efort muscular intens, inaniie sau regim alimentar dezechilibrat (bogat n lipide i proteine, srac n glucide); tulburri gastrointestinale acute sau cronice, n special la copii (dispepsie acut, toxicoz); vrsturi accentuate de sarcin, diabet zaharat.

f) Urobilinogenul

n urina normal, urobilinogenul se afl n cantiti mici dar decelabile; lipsete sau apare crescut n stri patologice.

Recunoaterea urobilinogenului cu reactiv Ehrlich

Principiu

Urobilinogenul se condenseaz cu p-dimetilaminobenzaldehida n mediu acid, dnd natere unui produs de culoare roie.

Reactiv Ehrlich

Se dizolv 2 g p-dimetilaminobenzaldehida n 100 ml acid clorhidric 20%.

Mod de lucru

ntr-o eprubet se pipeteaz aproximativ 2 ml urin proaspt (dar rece) i 1-2 picturi de reactiv Ehrlich; dac nu apare imediat o coloraie roie se nclzete la flacr sau n baia de ap.

Interpretare

Urobilinogenul normal: coloraia roie nu apare dect prin nclzire.

Urobilinogenul crescut: coloraia roie apare chiar la rece (temperatura camerei).

Urobilinogen absent: coloraia roie nu apare nici la cald.

Urobilinogenul are valori crescute n icterul hemolitic i parenchimatos (hepatic), tumori maligne hepatice, steatoza hepatic, abces hepatic i lipsete n icterele mecanice (prin obstrucie).

g) Pigmenii sanguini

n urin pot fi reprezentai de hemoglobina liber i cea coninut n eritrocite. n primul caz, n sedimentul urinar nu sunt prezente hematii, n cel de-al doilea caz, n sedimentul urinar apar structuri hematice.

Reacii de recunoatere

Recunoaterea pigmenilor sanguini se poate face spectroscopic sau prin reacii chimice. Spectral, hemoglobina se recunoate prin benzile caracteristice pe care le prezint, iar chimic prin activitatea sa pseudoperoxidazic, ce o exercit asupra apei oxigenate. Metoda descris mai jos mai are aplicabilitate practic doar pentru examenul scaunului pentru decelarea hemoragiilor oculte

Metoda Adler

Principiu

Hemoglobina descompune H202 cu eliberare de oxigen atomic, care oxideaz benzidina la un compus de tip chinoidinic. Acesta, condensndu-se cu o nou molecul de benzidin, formeaz albastrul de benzidin.

Reactivi

1. benzidin pur

1. acid acetic glacial

1. ap oxigenat 3 g/100 ml (12 ml perhidrol/100 ml).

Mod de lucru

ntr-o eprubet se introduc cteva cristale de benzidin, 5-10 picturi de acid acetic glacial i se agit pn la dizolvare complet. Apoi se adaug 1-2 ml urin, cteva picturi de ap oxigenat i se agit pentru omogenizare. n prezena pigmenilor sanguini apare o culoare verde care trece n albastru.

3. Examenul microscopic al sedimentului urinar

Mod de lucru ntr-o eprubet de centrifug se introduc aproximativ 10 ml de urin care se centrifugeaz 10 minute la 2000 rotaii/minut.

Se arunc supernatantul i se efectueaz un preparat nativ (ntre lam i lamel).

Pe o lam 76 x 26 mm se pune o pictur din sedimentul urinar i se acoper cu o lamel 20 x 20 mm.

Se examineaz la microscop cu obiectivul 20x i apoi cu 40x. Ocularele recomandate sunt cele de 10X

Clasificarea sedimentului urinar sedimentul urinar organizat

sedimentul urinar neorganizat

a) Sedimentul urinar organizat cuprinde:

1) Celulele sedimentului urinar

Leucocitele sunt cele mai frecvent ntlnite elemente de sediment. Majoritatea sunt reprezentate de granulocitele neutrofile; mai rar, se ntlnesc i alte tipuri de leucocite: eozinofile, monocite, macrofage, limfocite, histiocite.

Valori normale: < 5 celule/cmp de putere mare (obiectiv 40X)

Leucocitele se prezint n urin sub form de globule sferice granulate, cu un nucleu de form i mrime diferit. Pe preparatele necolorate nu se poate face distincia ntre diferitele tipuri de leucocite dar pot fi identificate cu coloraii specifice.

Nu exist ntotdeauna o concordan ntre numrul de leucocite/cmp i gravitatea leziunilor inflamatorii.

Hematiile apar, n sedimentul proaspt, ca nite discuri biconcave, cu diametrul mediu n jur de 6 m; n urinile concentrate hematiile ncep s se ratatineze.

Valori normale: < 5 celule/cmp de putere mare (obiectiv 40X)

n funcie de aspectul morfologic al hematiilor, putem diferenia o sngerare de origine glomerular de una neglomerular.

Dac avem de-a face cu o sngerare neglomerular, hematiile vor fi eumorfe.

Dac sngerarea este glomerular, hematiile eumorfe vor deveni dismorfe. Aceste modificri apar prin reversibilitatea sau ireversibilitatea rspunsului fa de varietatea influenelor pH-ului urinar, hipertonicitii medularei renale sau prezena acizilor grai, lizolecitinei, acizilor biliari i eventual a barbituricelor i salicilailor.

Celulele epiteliale ale cilor urinare sunt de obicei absente sau rare ntr-un sediment normal. Aspectul acestor celule difer mult de cel al esutului de origine. Datorit pierderii legturilor tisulare, ele adopt o form rotund i prezint diferite tipuri de transformri degenerative deoarece celulele moarte nu pot rezista atacului osmotic al urinei. n funcie de originea lor, exist 3 tipuri de celule epiteliale:

1. Celulele scuamoase, care de obicei nu provin din tractul urinar ci de la nivelul tractului genital, i rareori sunt semnificative.

2. Celulele tubulare renale provin de la nivelul tubilor renali i apar n afeciunile care intereseaz parenchimul renal.

3. Celulele tranziionale (uroteliale) provin de la nivelul uroteliului care cptuete tractul urinar de la bazinet pn la prima poriune a uretrei; apar n urin atunci cnd avem de-a face cu un proces inflamator urotelial.

2) Cilindrii urinari sunt formaiuni cilindrice bine conturate, cu capetele rotunde sau rupte care se formeaz la nivelul tubului contort distal i colector. Proteinele sangvine care trec prin membrana glomerular lezat se coaguleaz i se muleaz pe tubii uriniferi. Proteina Tamm-Horsfall (o glicoprotein secretat de ctre braul gros ascendent al ansei Henle) reprezint substana fundamental a cilindrilor.

Tipuri de cilindri urinari:

1. Cilindrii hialini sunt formai n absena celulelor n lumenul tubilor i conin numai protein Tamm-Horsfall, ceea ce la confer un indice de refracie sczut. Aceti cilindrii nu indic o afectare renal atunci cnd sunt prezeni n numr mic.

2. Cilindrii granuloi au suprafaa acoperit cu granulaii care au forme i mrimi diferite. Aceti cilindri sunt considerai o form de degenerare a cilindrilor celulari.

3. Cilindrii ceroi se numesc astfel deoarece au un aspect asemntor cu ceara topit. n condiiile unui flux urinar sczut, un cilindru va rmne mai mult timp n interiorul tubilor, lund un aspect ceros. Prezena acestora indic ntotdeauna o afectare tubular de natur cronic i, spre deosebire de cilindri hialini i granuloi, au ntotdeauna o semnificaie patologic.

4. Cilindrii celulari apar la pacienii ce prezint o scdere a perfuziei renale i indic ntotdeauna o afectare tubular acut, dar nu indic extinderea sau reversibilitatea acestei afectri.

b) Sedimentul urinar neorganizat cuprinde:

1) Cristalele. Urina este un mediu complex care influeneaz procesul de cristalizare, aceeai substan putnd cristaliza n diferite forme, dependent de compoziia urinii. Studiul cristalelor se efectueaz att n microscopie obinuit ct i n lumin polarizat. Cristalele se exprim sub form de: rare, prezente, frecvente, semnalndu-se de asemenea prezena de macrocristale sau microcristale. Principalele cristale ntlnite n sedimentul urinar sunt:

1. Cristalele de acid uric. n microscopia optic obinuit cristalele de acid uric se prezint sub form de butoia sau lmie, avnd o culoare galben-brun; n microscopia cu lumin polarizat aceste cristale sunt intens birefringente, avnd o palet larg de culori, de la albastru-verzui la rou sau galben, n funcie de grosimea lor.

2. Cristalele de oxalat de calciu sunt slab birefringente i se prezint sub dou forme: dihidrat sau plic de scrisoare i monohidrat sau trunchi de copac.

3. Cristalele de fosfat amoniaco-magnezian apar adesea n urinile vechi i conservate necorespunztor, datorit fermentaiei amoniacale bacteriene. Prezena lor n urina proaspt de diminea semnific o infecie urinar. Sunt birefringente i au un aspect de capac de sicriu.

2) Bacteriile i levurile. Prezena lor semnific o infecie urinar i n majoritatea cazurilor sunt nsoite i de o reacie leucocitar.

Buletin de analizRezultatele examenului sumar de urin se nscriu ntr-un Buletin de analiz ca n modelul alturat. Un buletin de analiz care d relaii normale privind examenul sumar de urin se prezint astfel:

Densitate................................. 1,015 g/ml

pH................. ............................ 5

Nitrii.......................................... absent

Proteine................................... absent

Glucoza................................... absent

Corpi cetonici........................... absent

Urobilinogen............................ normal

Bilirubin.................................. absent

Sediment: 1-2 hematii/cmp, 1-2 leucocite/cmp, rare epitelii plate de tip scuamos.XVII.3. INVESTIGAII BIOCHIMICE N CADRUL SISTEMULUI

ENDOCRIN. METODE MODERNE DE DETERMINARE A

HORMONILOR N MATERIALUL BIOLOGIC

Hormonii sunt substane sintetizate n cantiti mici de celule specializate, uneori asociate n structuri anatomice distincte denumite glande endocrine i secretai direct n snge care i transport la organele efectoare (esuturile int) asupra crora i manifest aciunea reglatoare specific.

Actualmente definiia dat este lrgit i, n sens mai larg, denumirea de hormon este atribuit oricrui compus chimic elaborat i secretat de o celul care influeneaz activitatea altei celule. Din punct de vedere al acestei ultime definiii hormonii se pot clasifica n:

hormoni endocrini, secretai de glandele endocrine i ajuni pe cale sangvin la celulele int (celule asupra crora ei i exercit aciunea specific). Glandele endocrine sunt: hipofiza, epifiza, glanda tiroid, glandele paratiroide, timusul, pancreasul, glandele suprarenale, glandele sexuale, etc;

hormonii paracrini, sunt secretai de o celul i acioneaz asupra celulelor nvecinate, fr a ajunge n circulaia general;

hormoni autocrini sunt secretai de o celul n spaiul extracelular i acioneaz ca mesager pentru celulele productoare.

Efectele hormonilor se pot clasifica n:

directe (aciunea hormonilor se manifest nemijlocit asupra esutului);

permisive (hormonul sensibilizeaz un esut ori un organ la aciunea altui hormon);

trofice (includ acei hormoni care menin buna funcionare a unor glande endocrine sau esuturi)

Investigarea unei glande endocrine urmrete prezena manifestrilor clinice de hiper- sau hipofuncie a glandei respective.

Pentru evaluarea funciei endocrine se realizeaz una sau asocierea urmtoarelor determinri:

concentraia plasmatic a hormonului;

excreia urinar a hormonului sau a produilor de eliminare;

viteza de secreie a hormonului n circulaie;

rezerva hormonal i reglarea hormonal, ambele prin teste dinamice;

nivelul receptorilor hormonali;

efectele selective realizate de hormon asupra esuturilor int.

Stabilirea nivelelor plasmatice ale hormonilor

Nivelele plasmatice ale hormonilor steroizi sunt cuprinse ntre 1 nmol/l i 1 mol/l, iar cei peptidici i proteici au valori ntre 1 pmol/l i 1 nmol/l. Aceste concentraii foarte mici, iar pentru cei peptidici i proteici determinarea lor n jungla de proteine din snge impune folosirea unor tehnici sensibile i specifice de nalt performan pentru determinare (vezi n continuare).

Investigarea biochimic a sistemului endocrin are n vedere:

n cazul hormonilor cu nivel plasmatic constant pe ntreg parcursul zilei (tiroxin, triiodtironin) determinarea ntr-o prob izolat de snge ofer o ncredere suficient;

Pentru hormoni cu secreie pulsatil (LH, testosteron) devin necesare mai multe probe recoltate aleator ori se face o determinare pe sngele obinut din amestecare mai multor probe luate la intervale de 20-30 minute.

La hormonii cu ritm circadian (exemplu cortizolul) interpretarea valorilor se face n funcie de ora la care a fost recoltat proba de snge. Pentru femeie, n perioada de fertilitate, nivelul plasmatic al gonadotropinelor, progesteronului i estradiolului vor fi interpretate n funcie de fazele ciclului menstrual i sunt necesare determinri n plasm de-a lungul mai multor zile.

n cazul hormonilor care necesit transportor plasmatic (steroizi, tiroidieni), nivelele plasmatice libere redau cel mai bine funcia endocrin, dar uzual se determin hormonul plasmatic total (liber i legat). Atunci cnd exist fluctuaii ale proteinei transportoare se impune determinarea nivelului transportorului alturi de cea a hormonului total. Pentru populaia sntoas, intervalul nivelelor plasmatice ale hormonilor este foarte larg. n astfel de situaii este bine s se fac determinri de hormoni pereche (testosteron i LH, tiroxin i TSH). Aa bunoar, dac testosteronul este la limita inferioar a normalului i se nsoete de LH crescut, este vorba de insuficien testicular; dac LH este normal, funcia testicular se consider normal.Msurarea nivelelor urinare ale hormonilor i ale metaboliilor acestora

Pentru hormonii cu secreie fluctuant (exemplu cortizolul) determinrile urinare au avantaje fa de valorile obinute pe probe de snge izolate. Determinarea se face n urina de 24 de ore i se stabilete mai bine funcia cortexului suprarenal dect pentru o valoare izolat a cortizolului plasmatic.

Dezavantajele determinrii urinare sunt:

eliminarea urinar depinde de funcia renal, motiv pentru care raportarea se face la creatinina urinar;

exist hormoni care se elimin prin bil (T3, T4);

valorile urinare pot fi modificate de medicaie;

exist hormoni cu origini tisulare diferite, dar cu un metabolit urinar comun (17-cetosteroizii urinari provin de la androgenii adrenali i gonadali i de aceea stabilirea nivelului lor are o valoare redus n aprecierea produciei androgenice testiculare).

Vitezele de secreie i producie hormonal

Msurarea vitezei actuale de secreie rezolv problemele ce apar la determinrile plasmatice i urinare. Se administreaz hormon radioactiv i se msoar diluia hormonal ca urmare a prezenei hormonului endogen, ntr-o anumit perioad de timp.

Determinri dinamice pentru aprecierea rezervei i a reglrii hormonale

Pentru interpretarea valorilor de grani ale valorilor hormonale se fac teste de stimulare sau de supresie hormonal.

Msurarea receptorilor i a anticorpilor hormonali

Msurarea receptorilor hormonali este util n diagnosticul afeciunilor cu rezisten hormonal (rahitism datorat rezistenei la vitamin D, hiperglicemie i hiperinsulinemie asociate cu rezisten la insulin).

Laboratoarele specializate folosesc ADNc care ulterior este secvenializat pentru a furniza informaii specifice despre structura proteinelor mutante.

n unele situaii se pot msura nivelele anticorpilor hormonali (de exemplu anticorpi fa de hormonii tiroidieni care determin hipotiroidismul).

Efectele la nivelul esuturilor

Testul ideal este msurarea efectului hormonal asupra esutului int.

Metode moderne de determinare a hormonilor

Metodele de determinare hormonal pot fi clasificate n: metode biologice, metode fizico-chimice, metode de determinare prin legare competitiv i metode de determinare imunometric.

Metodele biologice i fizico-chimice sunt metode vechi, laborioase i costisitoare i au fost nlocuite cu metodele moderne.

Metodele moderne de determinare sunt: metode bazate pe principiul competiiei imune (RIA, FIA, LIA, EIA) i metodele imunometrice (IRMA, IFMA, ILMA, IEMA). Principiul acestor metode a fost fundamentat n Capitolul V.5.

Unul din factorii de selecie a acestor metode, n vederea determinrii unui anume hormon, este sistemul de marcare folosit. Sistemele de marcare cele mai uzitate sunt urmtoarele:

A. Marcarea cu radioizotopi (RIA, IRMA)

Se folosesc izotopi radioactivi, n special iod radioactiv 125I i tritiu 3H. Aceste metode tind s fie nlocuite deoarece necesit laboratoare specializate i personal calificat, datorit utilizrii substanelor radioactive.

B. Marcarea cu substane fluorescente (FIA, IFMA)

n prezent principalele tehnici de determinare neizotopice se bazeaz pe utilizarea unor reactivi marcai cu substane fluorescente. Fluorescena este proprietatea unor molecule (fluorofori) de a emite o radiaie electromagnetic de o anumit lungime de und, dup ce au fost excitate cu o radiaie electromagnetic cu lungime de und diferit. Unda incident excit molecula care trece, astfel, la un alt nivel energetic, iar prin revenirea la starea iniial se emit radiaii. Reacia este complex, implic spectre de excitaie i spectre de emisie. Diferena dintre excitaia i emisia maxim constituie efectul Stokes. Cu ct acesta este mai mare cu att i eficiena msurtorii este mai mare. Principalele substane fluorescente utilizate n determinrile imunologice sunt derivai ai fluoresceinei cum este izotiocianatul de fluorescein (FITC), rodamina i chelai ai lantanidelor (europiu). Fluorescena se msoar cu un fluorimetru, care este alctuit dintr-o surs de radiaie, un schimbtor de probe i un detector fotomultiplicator.

Tehnicile de determinare bazate pe fluorescen sunt variate, funcie de fluoroforul folosit i de modul n care este evideniat complexul ligand-protein.

n unele sisteme de determinare ligandul marcat cu un fluorofor i excitat cu radiaie de o anumit lungime de und transfer energia absorbit unei alte molecule, care se dezactiveaz fr s emit lumin. Adugarea de ligand rece (nemarcat) restabilete emisia de fluorescen, a crei intensitate va crete odat cu cea a ligandului rece.

Sistemele de determinare DELFIA sunt cele mai cunoscute: proteina se leag de un chelat de lantanid. Complexul format este puin fluorescent. Adugarea unui reactiv chelator cu afinitate mai mare pentru europiu deplaseaz reacia, intensificnd procesul de fluorescen. Dup excitaie cu un fascicol de lumin laser, fluorescena emis de lantanidul chelat se prelungete cu 400 la 800 microsecunde mai mult dect n cazul unei fluorescene clasice. Aceast diferen permite evitarea unor interferene de fluorescen parazitar.

n sistemele TDX Abbot ligandul devine fluorescent prin cuplare cu un fluorofor ce are nsuiri chimice apropiate. Excitaia se face cu lumin polarizat, monocromatic. Procentul de polarizare a fluorescenei (lumina emis) va depinde de starea n care se afl fluoroforul. Dac este liber, procentul de polarizare este mic, deoarece molecula revine rapid la starea iniial. Dac este cuplat cu o protein, complexul format revine mai ncet, iar procentul de polarizare va fi mai mare.

C. Marcarea cu substane luminescente (LIA, ILMA)

n sistemele de determinare imunologic care se bazeaz pe fenomenul de luminescen (LIA), marcarea se face cu o substan care produce lumin, numit luminofor.

Termenul de luminescen se refer la emisia de lumin (fotoni) ca urmare a revenirii electronilor de la nivele energetice ridicate la nivele energetice mai joase, stabile. Spre deosebire de fluorescen unde energia absorbit care a produs excitarea electronilor este de natur extern, n cazul luminescenei aceasta este rezultatul unor reacii chimice (chemiluminescen) sau unor procese biologice (bioluminescen).

Chemiluminescena este proprietatea unor substane de a emite fotoni atunci cnd sunt oxidate. Cele mai cunoscute sunt: luminolul (5-amino-2,3-dihidroftalazin-1,4-dion) i compui derivai ai acridinei. Luminolul este oxidat cu ap oxigenat n prezena unui catalizator, la un pH alcalin, rezultnd aminoftalat, azot liber i emisie de radiaie electromagnetic:

luminol + H2O2 aminoftalat + N2 + ( (425 nm)

Catalizatorii folosii pot fi ioni metalici bivaleni sau peroxidaz. Au fost sintetizai diveri derivai ai luminolului, dintre care cel mai cunoscut este ABEI [6-(4-aminobutil-N-etil-izoluminol)]. Esterii acridinei nu necesit prezena catalizatorilor i sunt larg rspndii.

Flash-urile de lumin produse prin fenomenul de chemiluminescen sunt aproape instantanee i dureaz cteva microsecunde. Fiecare molecul este teoretic capabil s emit fotoni. Practic, emisia se realizeaz ntr-o proporie de 10%, ceea ce este convenabil avnd n vedere c, n cazul emisiei gama de ctre 125I, eficiena este de 1 la 7,5 milioane de atomi.

Procedurile de lucru sunt asemntoare cu cele n sistem RIA. n loc s se msoare radiaiile gama emise de izotopul radioactiv, care au lungimi de und scurte, sistemele LIA opereaz cu radiaii cu lungimi de und mari, din spectrul vizibil. Marcarea cu luminofori poate fi efectuat fie pe antigen, fie pe anticorp, att n sistemul competitiv ct i n cel imunometric. Tehnicile imunoluminometrice (ILMA), similare ca principiu cu cele imunoradiometrice (IRMA), au o mare sensibilitate i precizie. Un anticorp specific unui antigen este legat de un suport (faz) solid. Al doilea anticorp se marcheaz cu un luminofor. Antigenul, care are doi epitopi, este prins ntre cei doi anticorpi formnd un complex tip sandwich. Numrul de complexe format este direct proporional cu concentraia antigenului din prob. Astfel, n ILMA, cu ct concentraia de antigen este mai mare, cu att intensitatea luminii msurate va fi mai mare. Tehnicile ILMA se recomand pentru determinarea hormonilor peptidici.

Tehnica SPALT (solid-phase antigen luminescense technique) este o metod de determinare imunologic competitiv. ntr-o prim etap, antigenul de determinat i cel din probele standard este legat de un anticorp. n a dou etap, fraciunea liber a anticorpului se leag de un antigen identic, fixat pe un suport solid. Urmeaz splarea i ndeprtarea componentelor ce nu s-au fixat pe faza solid. Se adaug apoi un al doilea anticorp care este marcat cu un luminofor. Rezultatele sunt cele caracteristice sistemului competitiv: cu ct concentraia de hormon din prob este mai mare, cu att cantitatea de anticorp ataat de complexul fazei solide va fi mai mic, iar intensitatea semnalului chemiluminescent va descrete.

Bioluminescena este un caz particular de chemiluminescen ntlnit la diverse organisme vii i care necesit prezena enzimelor. Un astfel de marker bioluminescent este sistemul luciferin-luciferaz:

Detecia semnalului luminos se face cu ajutorul unor luminometre, radiaia luminoas emis fiind specific i proporional cu cantitatea de marker existent la sfritul reaciei.

D. Marcarea cu enzime (EIA, IEMA, ELISA)

ntre metodele neizotopice de determinare a hormonilor, cele mai rspndite sunt cele enzimoimunologice (EIA). Unele enzime pot fi uor cuplate la moleculele de antigen sau anticorp. Enzima transform un substrat specific, iar modificrile produse se evideniaz printr-o reacie de culoare, absorbie n ultraviolet, fluorescen, etc. Se pot folosi diverse enzime: glucozoxidaza, glucozo-6-fosfat dehidrogenaza, fosfataza alcalin, (-D-galactozidaza, peroxidaza din hrean, malat dehidrogenaza, ureaza. Marcarea cu enzime se face dup principii similare marcrilor cu izotopi, cu separarea fraciunilor libere i legate. n unele tehnici procedura de separare a fost eliminat. Aceste tehnici se numesc n sistem omogen spre deosebire de cele unde se face separarea, care sunt n sistem heterogen.

O tehnic n sistem omogen, utilizat pentru determinarea liganzilor hormonali cu mas molecular mic, este tehnica EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Techniques): formarea complexului ligand-protein duce fie la intensificarea, fie la inhibarea activitii enzimatice. Aceast activitate enzimatic, care poate fi msurat fr separare, este invers proporional cu concentraia de hormon.

n sistem heterogen, cea mai cunoscut este metoda ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Este o metod bazat pe principiul competiiei dintre ligandul de determinat i ligandul marcat pentru ocuparea locurilor de legare ale anticorpului. Anticorpul este fixat pe un suport solid (peretele eprubetei, bile de plastic, baghete). Ligandul este ntotdeauna n exces n raport cu locurile de legare pentru a permite competiia ntre cei doi liganzi. Dup incubare i eliminarea fraciunilor libere marcate i nemarcate, se msoar activitatea enzimatic a complexului ligand-anticorp imobilizat pe suport.

Alegerea metodei de determinare

n cazul metodelor bazate pe reacia antigen-anticorp este necesar s existe capacitate antigenic pentru hormonul de determinat. n situaia n care hormonul nu posed aceast capacitate, se utilizeaz fie haptene de legare, fie marcarea direct cu izotopi. Alegerea metodei de analiz mai depinde de: gradul de sensibilitate cerut, factorul economic, dotarea laboratorului, calificarea personalului.n tabelul de mai jos sunt prezentate metodele cele mai folosite la determinarea hormonilor tiroidieni i a TSH:

Hormonul de determinatMetoda de determinareValori de referin

T4 (g/100 mlRIA

DELFIA

EIA4-12

5,3-10,2

5-13

FT4 ng/100 mlRIA

DELFIA

LIA0,7-2,2

0,6-1,6

0,7-1,9

T3 ng/mlRIA

DELFIA

EIA0,6-1,8

0,8-1,6

0,8-1,8

FT3 pg/mlRIA2,2-5,5

rT3 pg/mlRIA30-200

TSH mU/lRIA

EIA

DELFIA

LIA0,3-4,0

0,5-4,6

0,3-3,8

0,4-3,4

XVII.3.1. INVESTIGAIILE HORMONALE ALE TIROIDEI

Introducere

La nivelul celulelor foliculare, biosinteza hormonilor tiroidieni necesit prezena iodului anorganic n gland. Iodul ptrunde din snge n celul, este oxidat i ataat tirozinei din molecula de tiroglobulin. Se formeaz monoiodtirozina MIT i diiodtirozina DIT.

Cuplarea a 2 molecule DIT formeaz tiroxina (3,5,3,5-tetraiodo-L-tironina), adic T4 iar dintr-o molecul de MIT i una de DIT se formeaz triiodtironina (3,5,3-triiodo-L-tironina) adic T3. Tiroxina i triiodtironina rmn n tiroglobulin de unde, prin proteoliz, sunt eliberate n circulaia sanguin.

La nivelul organelor (ficat, rinichi, inim) T4 se transform prin deiodinare n T3 sau rT3 (reverse T3). 80% din cantitatea total de T3 provine din T4, numai 20% din tiroid. T3 este hormonul metabolic activ, T4 se consider a fi un prehormon. Raportul T3/T4 din snge este relativ constant, indiferent de activitatea fiziologic a tiroidei.

Secreia hormonilor tiroidieni scade cu vrsta.

n circulaia sanguin, hormonii tiroidieni circul n cea mai mare parte legai de proteine plasmatice de transport, i anume de:

globulina specific (Thyroxinbinding globulin, TBG)

prealbumina (Thyroxinbinding prealbumin, TBPA, sau transtiretina)

albumina

Condiiile care influeneaz concentraia plasmatic a proteinelor de transport vor modifica valorile dozrilor de hormoni tiroidieni totali.

n prezent, la explorarea funciei tiroidei, se utilizeaz urmtoarele determinri n ser:

determinarea concentraiei totale a T3, respectiv T4 (TT3, TT4)

determinarea concentraiei fraciunilor libere (free) ale T3 i T4 (FT3, FT4)

determinarea concentraiei proteinelor transportoare (TBG, TBPA i albumina)

determinarea TSH i testul de stimulare cu TRH a secreiei de TSH

determinarea tiroglobulinei (Tg).

De asemenea, n agresiuni autoimune ale tiroidei, se mai pot determina autoanticorpi antitiroidieni (anti-peroxidaz tiroidian, anti-tiroglobulin, anti-receptori de TSH).

A. Determinarea concentraiei totale a hormonilor tiroidieni

T4 circul n snge legat de proteinele transportoare n proporie de 99,97%: TBG 60-75%, TBPA 15-30%, albumin 10%. T3 circul legat n proporie de 99,7%. Iniial, au fost mai uor de determinat concentraiile totale (care sunt de ordinul nanomolior/l), fa de cele ale fraciunilor libere (de ordinul picomolilor/l).

Tehnicile vechi nu permiteau dect o evaluare grosier a concentraiilor de T4. Ele constau fie n determinarea chimic a iodului legat de proteinele plasmatice (PBI, proteinbindingiodine), fie n dozarea competitiv (T4 endogen i T4 marcat radioactiv) pentru locurile de legare ale unei cantiti constante de TBG.

Tehnicile actuale se bazeaz pe principiul determinrilor imunologice, n care hormonul din proba de determinat intr n competiie cu hormonul marcat pentru ocuparea situsurilor de legare ale anticorpului anti -T4. Marcarea se poate face cu iod radioactiv (RIA) sau cu o enzim (dozare imunoenzimatic). Legtura hormon protein de transport este rupt, hormonul eliberat intr n competiie cu hormonul marcat.

T3 se determin prin tehnici similare.

Dezavantajul acestor metode este c rezultatele pot fi distorsionate de modificri ale concentraiei proteinelor transportoare.

De aceea, din punct de vedere clinic este mai important determinarea concentraiilor de hormoni liberi.

B. Determinarea fraciunilor libere (FT3, FT4)

Aproximativ 0,03%din totalul seric de T4 i 0,3% din totalul seric de T3 sunt libere i n echilibru cu hormonii legai.

Pentru aciunea hormonilor tiroidieni la nivelul esuturilor periferice sunt eficiente doar fraciunile libere ale T4 i T3. Deoarece fraciunile libere sunt active, utilizate de esuturile periferice, msurarea lor anuleaz erorile de interpretare date de concentraiile serice totale, care sunt influenate de nivelurile proteinelor de transport. Aadar acestea diagnosticheaz mai corect funcia tiroidian real dect TT3 iTT4.

Ele pot fi determinate prin mai multe tipuri de metode, directe sau indirecte.

Cu ajutorul metodelor indirecte se apreciaz capacitatea latent de fixare pe TBG a hormonilor tiroidieni, prin testul de fixare a T3 (T3 resin uptake sau T3U) sau prin determinarea direct a TBG i calcularea indicelui de T3 liber (FT3I) respectiv indicelui de T4 liber (FT4I)= T4/TBG.

Determinarea direct a FT4 este cel mai precis evaluat prin dializarea echilibrat, care este consumatoare de timp, scump, necesit dotare tehnic i nu este disponibil n majoritatea laboratoarelor comerciale. Aceast metod separ hormonul liber de cel legat.

C. Determinarea proteinelor transportoare

Sunt utilizate mai ales determinarea direct a TBG i testul de fixare a T3, menionate anterior.

Modificrile ale concentraiei proteinei serice de transport produc modificri corespunztoare ale T3 i T4 total, chiar dac fraciunea liber, fiziologic activ, este neschimbat.

TBG crete n: sarcin, sub terapie estrogenic, contracepie oral, n faza acut a hepatitei infecioase, tiroidit subacut, porfirii intermitente, tumori secretante de estrogeni.

TBG scade n: hipoproteinemia marcat din sindromul nefrotic, boli hepatice, stres, poate fi chiar i idiopatic, genetic, mai apare i n acromegalie, la administrarea de steroizi anabolizani, inclusiv de testosteron, cantiti excesive de corticosteroizi.

D. Determinarea TSH

Secreia de TSH de ctre hipofiza anterioar este controlat de TRH (thyrotropin releasing hormone), un tripeptid secretat de hipotalamus. TSH stimuleaz producia de tiroxin (T4) i triiodotironin (T3) de ctre glanda tiroid. Fraciunile libere circulante T3 i T4 regleaz secreia de TSH prin feedback negativ la nivelul hipofizei i posibil la nivelul hipotalamusului. Diagnosticul hipotiroidismului cu un nivel sczut de T4 liber este confirmat prin creterea nivelului de TSH. Msurarea unui nivel sczut sau nedetectabil de TSH confirm un hipertiroidism, unde nivelele de T4 i T3 sunt ridicate iar secreia de TSH este supresat.

Imediat dup natere, concentraia seric de TSH crete brusc. T4 este de asemenea crescut n prima sptmn i tinde s scad apoi la valori asemntoare adultului.

Ca test screening pentru depistarea hipotiroidismului congenital, o boal grav prin consecinele sale, se utilizeaz determinarea T4, dar mai ales a TSH din pictura de snge recoltat pe hrtie de filtru dup tehnici imunologice.

S-a propus ca metodele de determinare a TSH-ului s fie apreciate dup gradul de sensibilitate clinic, definit ca valoarea cea mai mic de TSH, dozat n mai multe serii, cu un coeficient de variabilitate care nu depete 20%.

Sensibilitatea clinic este diferit de sensibilitatea analitic, definit ca valoarea cea mai mic a cantitii de ligand capabil s modifice semnificativ semnalul, fr a ine seama de reproductibilitatea metodei.

n funcie de sensibilitatea clinic, tehnicile de dozare TSH au fost mprite n metode de generaia I, a II-a, a III-a.

Cele din generaia I, n majoritate RIA, au o sensibilitate clinic cuprins ntre 1 - 2 mU/l, cele din generaia a II-a, n majoritate imun