Sekvenciranje DNK fragmenata

Sekvenciranje predstavlja utvrđivanje

slijeda baza u lancu nukleinskih kiselinakiselina

DNK i RNK

Metode sekvenciranja:Metode sekvenciranja:

--Maxam - Gilbertova Maxam - Gilbertova

-Sangerova-Sangerova

-Automatsko -Automatsko sekvenciranjesekvenciranje

Maxam - Gilbertova ili metoda hemijskog cijepanja Ova metoda se bazira na upotrebi

različitih hemijskih reagenasa koji diferecijalno boje nitrogenske baze

molekule DNK. Ovaj tip bojenja može se okarakterisati kao bazno-specifičan, jer

se svaka baza boji različito. Danas je upotrebna vrijednost ove metode

relativno smanjena usljed primjene enzimatske “dideoxy” analize DNK fragmenata i metoda automatskog

sekvenciranja. Ipak, Maxam-Gilbertov postupak i danas nalazi primjenu pri

ilustraciji poliakrilamidne gel elektroforeze kao primjenjene metode

DNK sekveniranja.

Da bi bio sekvenciran, DNK lanac mora biti obilježen na jednom od krajeva radioaktivnim 32P-fosfatnom izotopom. Bazno specifično bojenje zasniva se na sljedećoj proceduri:

- tretmanu hemijskim reagensom koji “potencira” različitosti DNK baza, tako da ih alternirajuće boji. Reagens stupa u bazno-specifične reakcije, npr. formiranje dimetilsulfat-metilata guanina, koji nastaju na N7 poziciji ove baze;

-  dislociranje alternirajućih baza sa fosfo-šećernog skeleta DNK molekule;

- bojenje lanca piperidinom na sećernoj komponenti kostura, gdje nedostaje odgovarajuća baza. Uspješnost ovoga bojenja ovisi o efikasnosti prethodnih koraka.

Upotrebom bazno-specifičnih reagenasa dobije se set fragmenata različite dužine markiranih na jednom od svojih krajeva. Bitno je spomenuti da je ova metoda značajno limitirana mogućim generiranjem samo jednog ili par dugih obojenih fragmenata na sekvencionom gelu. Sekvencioni gel je dizajniran tako da frakcionira jednolančane DNK fragmente, na osnovu njihovih dužina. Uglavnom sadrži 6-20% poliakrilamida i 7M ureu. Urea onemogućava formiranje sekundarnih struktura DNK molekule koje bi bitno smanjile mobilnost fragmenata. Povišena temperatura, pri kojoj fragmenti putuju, ima istu funkciju. Postoji više načina očitavanja rezultata poliakrilamidne gel elektroforeze. Kod manuelnog sekvenciranja, koje uključuje i Maxam-Gilbertoviu metodu, neophodno je postavljanje minimalno 4 kolone na gelu, za svako baznospecifično bojenje po jednu.

Sangerova ili dideoksi metoda Sangerova ili dideoksi metoda sekvenciranja DNK fragmenatasekvenciranja DNK fragmenata

Mada se razlikuje u hemijskim Mada se razlikuje u hemijskim detaljima i ova metoda počiva na detaljima i ova metoda počiva na istom principu: dobijanje serije istom principu: dobijanje serije fragmenata DNK sa istom početnom fragmenata DNK sa istom početnom ali različitom terminalnom tačkom.ali različitom terminalnom tačkom.

Determinacijom dužine Determinacijom dužine fragmenata i terminalne baze fragmenata i terminalne baze sekvenca može biti određena sa sekvenca može biti određena sa velikom tačnošću.velikom tačnošću.

U cilju determinacije sekvence baza u DNK fragmentu prvo se treba dobiti veliki broj identičnih kopija.Sekvenca malih DNK molekula (virusni genom ili plazmid) može biti određena odjednom.

Sangerov metod koristi ssDNK, a amplifikacija se odvija u prisustvu DNK fragmenta, polimeraze, prajmera, 4 dNTP-a i male količine ddNTP-a (dideoxynucleotides).

Inkorporacijiom određene dideoksi baze kojoj nedostaje OH grupa na 3’ kraju polimerizacija se završava u toj tački

Nakon određenog

perioda inkubacije mix će sadržavati

niz radioaktivno obilježenih DNK

fragmenata različitih dužina od kojih svaki

završava dideoksi bazom.Fragmenti se

separiraju elektroforetski

na poliakrilamidno

m gelu.

Automatsko sekvenciranje

Izazvalo je svojevrsnu revoluciju u molekularnoj genetici. Njegovim otkrićem proces sekvenciranja je postao lakši i brži.Pokrenuti su veliki projekti sekvenciranja genoma nekih vrsta: E. coli, Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Homo sapiens,...

Sam proces automatskog sekvenciranja baziran je na Sangerovoj dideoksi metodi.Amplifikacija se odvija u prisustvu DNK, DNK-polimeraze, prajmera, dNTP-a i male količine 4 različito obojena terminatora - ddNTP-a. Poliakrilamidna gel elektroforeza se odvija u DNK sekvenceru. Ultravioletni laser ugrađen u mašini skenira gel od jedne do druge strane I run se može pratiti na monitoru.

Shutgun Sequencing

Za sekvenciranje dužih fragmenata koristi se tzv. shotgun sequencing metod. Osnovni princip je slučajna fragmentacija ciljanog DNK fragmenta i inkorporacija nastalih segmenata u univerzalne vektore. Prilikom te reakcije vežu se poznate DNK sekvence koje se prepoklapaju i koje bi trebale posluziti kao “ljepilo” prilikom kompletiranja analiziranih fragmenata. Tokom kompletriranja sekvenci u kontigent identificirju se gapovi (rupe na kojima sekvenca nije dostupna) i jednolančani regioni (postoji sekvenca za samo jedan lanac). Prilikom formiranja biblioteke DNK fragmenata, ovi gapovi mogu biti popunjeni direktnim sekvenciranjem upotrebom prajmera sintetisanih na osnovu poznate sekvence. Sve sekvence se pročitaju i kompariraju međusobno. Uoče se podudarnosti sekvenci na osnovu kojih se slaže mozaik. S obzirom da su moguće greške prilikom sekvenciranja neophodno je izvrštit provjeru svake baze u kontigentu.

DETEKCIJA STR DETEKCIJA STR LOKUSALOKUSA