1-sensitivity plaque tech study newcastle disease

8/7/2019 1-sensitivity plaque tech study newcastle disease

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A P P L I E DM I C RO B I O L OGY,OC t . 1 9 7 0 ,p . 6 3 8 - 6 4 0C o p y r i g h t 1 9 7 0 Am e r i c a nS o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

Vo l . 2 0 ,No . 4P r i n t e d i n U . S . A .

NOTES

S e n s i t i v i t yo f t h e P l a q u e Te c h n i q u ef o rt h e S t u d yo fS e l e c t e d Va c c i n eS t r a i n sa n d a Vi r u l e n t S t r a i n

o fN ew c a s t l eD i s e a s eVi r u sK . V . S INGH , NAJLA SAAD, AND A . EL ZEIN

D ep a r t m en t o fVi r o l o g y ,F a n a r R e g i o n a lP o u l t r y L a b o r a t o r y ,N e a r E a s t A n i m a lH e a l t h I n s t i t u t e ,P. O . Box 3 2 1 6 ,B e i r u t ,L e b a n o n

R e c e i v e df o rp u b l i c a t i o n8 J u n e 1 9 7 0

A p l a q u e t e c h n i q u ewas f o u n du s e f u lf o rt h e d i f f e r e n t i a t i o na n d t i t r a t i o no f twov a c c i n e s t r a i n sa n d a l o c a lh i g h l yv i r u l e n tf i e l di s o l a t eo f N ew c a s t l ed i s e a s ev i r u s .

A l t h o u g h p l a q u e f o r m a t i o n w i t h New c a s t l ed i s e a s ev i r u s( N D V )i np r ima r yc h i c k em b r y oc e l l( C EC ) c u l t u r e sw a s f i r s td e s c r i b e da lmo s t 1 8y e a r sa g o ( 3 ) ,i t sa p p l i c a t i o na s a q u a l i t a t i v et o o li nd i a g n o s t i cp r o c e d u r e sa n d v a c c i n et i t r a t i o nr e -ma i n e d l i m i t e d .R e c e n t l y ,t h ep l a q u ec h a r a c t e r -

i s t i c so f

v e l o g e n i ca n d

me s o g e n i cs t r a i n sh a v e

b e e n d e s c r i b e di n d e t a i l( 2 ,7 ) .T h e s ea u t h o r s r e -p o r t e dt h a tp l a q u ed e v e l o pmen tw i t h l e n t o g e n i cs t r a i n so f NDV w a s p o o r a n d w a s s e l d omob -t a i n e du n d e ra g a r o v e r l a y .B a r a h o n aa n d H a n s o n( 1 ) ,h ow e v e r , d e s c r i b e da r e p r o d u c i b l ep l a q u ea s s a y m e t h o df o r l e n t o g e n i cs t r a i n so f NDV b yi n c o r p o r a t i n gM g 2 +o r d i e t h y l a m i n o e t h y li no v e r -l a y med ium o r b y i n c o r p o r a t i n gs o l i d i f y i n ga g e n t s w i t h l o w s u l f a t e dp o l y s a c c h a r i d e s( 1 ) .Va r i o u s i n v e s t i g a t o r sh a v e a l s or e p o r t e da r e l a -t i o n s h i pb e t w e e nt h e v i r u l e n c ef o rc h i c kemb r y o s

a n d p l a q u es i z e( 4 ,6 ) .T h e p r e s e n t s t u d ywas d e -s i g n e dt o d e s c r i b et h e p l a q u ec h a r a c t e r i s t i c so ft h eK ( K om a r o v )a n d F va c c i n e s t r a i n su s e d i nL e b a n o na n d a l o c a lh i g h l yv i r u l e n ts t r a i n ,d e s i g -n a t e d V LT , i s o l a t e dd u r i n g1 9 6 8New c a s t l ed i s -e a s e o u t b r e a k sa n d t o d e t e rm i n et h e s e n s i t i v i t yo ft h e p l a q u e a s s a y m e t h o d f o r t i t r a t i o no f t h e s et h r e es t r a i n so f NDV. Vi r u s s t o c k sw e r ep r e p a r e di n 9 - d a y - o l dc h i c kemb ry os b yi n o c u l a t i n gt h es e e dv i r u si n t ot h e a l l a n t o i cc a v i t y .A l l a n t o i cf l u i d si n f e c t e dw i t h K a n d F v i r u ss t r a i n sw e r el y o p h i l i z e dw i t h 25% s k i m mi l k a n d s t o r e da t

- 20 C , wh e r e a sa l l a n t o i cf l u i di n f e c t e dw i t hVLTs t r a i nw a s s t o r e di n 1 -m l amounts a t - 60 C .CEC c u l t u r e sw e r ep r e p a r e di nE a g l e ' smin imume s s e n t i a lmed ium f r o m9 - d a y - o l demb r y o sb y r e -p e a t e d t r y p s i n i z a t i o n .App r o x im a t e l y5 X 1 0 6c e l l sp e r 2 - o z ( c a .6 0 m l )p r e s c r i p t i o nb o t t l ew e r e

s e e d e d ,a n d mono l a y e r sw e r e o v e r l a i dw i t h 6 m lo f o v e r l a ym e d i u mw h i c h c o n s i s t e do f H a n k sb a l a n c e d s a l ts o l u t i o nw i t h o u tp h e n o l r e d ,0 . 5 %l a c t a l b um i n h y d r o l y s a t e ,1 . 0% 7N o b l e a g a r( D i f c o ) ,3% h o r s e s e r um ,1 . 5 %o f 1 : 1 , 0 0 0d i l u -t i o no f n e u t r a lr e d ,5% o f 4 . 4 % s o d i u mb i c a r -b o n a t e s o l u t i o n ,a n d

u s u a lco nc en t r a t i o ns o f

p e n i c i l l i na n d s t r e p t o m y c i n .I n s t e a do f N o b l ea g a r ,0 . 5 % a g a r o s e ( S e r v a cL a b o r a t o r i e sL t d . ,En g l a n d ) w a s u s e d i n o v e r l a ymed i um f o rp l a q u i n g t h eF s t r a i no f NDV.

P l a q u e s o f t h e VLT s t r a i nw e r e w e l l - d e f i n e d ,c i r c u l a r ,a n d g e n e r a l l yh a d r e d c e n t e r so n t h ef o u r t hp o s t i n o c u l a t i o nd a y .T h e p l a q u e s f i r s tap -p e a r e d a t 36 t o 4 8 h r a f t e ri n f e c t i o na n d m e a s u r e d3 . 0mm o n t h ef i f t hd ay a f t e ri n o c u l a t i o n .Mi c r o -s c o p i c a l l yt h e i rb o r d e r s w e r e no t c l e a r l y d e f i n e d .P l aq ue s o ft h eF s t r a i nu n d e r a g a r o v e r l a yf i r s t

a p p e a r e d a t t h e s i x t hd ay p o s t i n o c u l a t i o na n dw e r e f a i n tw i t h i r r e g u l a rb o r d e r s .On t h ee i g h t hd a y , t h e yw e r e a b o u t 0 . 5 mm i n d i a m e t e r .M i c r o s c o p i c a l l yt h e i rb o r d e r s w e r e i r r e g u l a ra n dd i f f u s e d .How e v e r ,p l a q u e so f t h eF s t r a i na p -p e a r e d o n t h e f o u r t h d a y p o s t i n o c u l a t i o na n dw e r e d i s t i n c tu n d e r a g a r o s e o v e r l a y .A l s o t i t e r se x p r e s s e da s p l a q u e - f o rm i n gu n i t s( P F U ) u n d e ra g a r o s e w e r e a lm o s t 1 l o g 1 0h i gh e r t h a n u n d e rN o b l e a g a r .P l a q u e s o f t h eK s t r a i na p p e a r e db e t w e e n4 8 a n d 7 2 h r a f t e ri n f e c t i o n ,w e r ec i r c u l a rw i t h c l e a rc e n t e r s ,a nd m ea s u r ed2 . 0mm o n t h e

f i f t hd a y .M i c r o s c o p i c a l l yt h e i rb o r d e r sw e r ew e l l -d e f i n e db y a d e e p l ys t a i n e d t h i c kr i n go f c e l l s .T h e r e f o r e ,i t s e e m s t h a ti t w o u l db e p o s s i b l et od i f f e r e n t i a t et h e t w o v a c c i n e s t r a i n sa n d t h ev i r u l e n tf i e l di s o l a t eo f NDV o n t h e b a s i so fp l a q u e s i z em e a s u r e do n a c e r t a i nd a y p o s t i n o c u -

6 38


2/3

VOL .2 0 ,1 9 7 0

TA B L E1 . C o m p a r a t i v et i t r a t i o no f N e w c a s t l ed i s -e a s e v i r u s(NDV ) K s t r a i ni n e m b r y o n a t e de g g sa n d p r i m a r y c h i c k e m b r y oc u l t u r e sb y t h e

p l a q u e t e c h n i q u e

Vi r u s

NDV K 4NDV K 5NDV K 6NDV K 7NDV K 8 / 6 8NDV K 9 / 6 8NDV K 1 0 / 6 8NDV K 1 1 / 6 8NDV K 1 / 6 9NDV K 2 / 6 9NDV K 3 / 6 9

Ti t e r / m l

EID5oa

1 0 9 . 71 0 9 . 31 0 9 . 61 0 9 - 1 0 9 . 21 0 9 . 5

1 0 8 91 0 8 . 7

1 0 8 . 6

PFUb

1 0 9 . 31 0 9 . 51 0 9 . 61 0 8 . 91 0 9 . 31 9 . 20 9 . 51 0 9 . 31 0 9. 0

1 0 9 . 41 9 . 2

a F i f t yp e r cen t e g g i n f e c t i v ed o s e .I P l a q u e - f o r m i n gu n i t s .

l a t i o n ,o n t h emi c r o s c o p i cas we l l a s ma c r o s c o p i cm o r p h o l o g yo f t h e p l a q u e s a n d on t i m e o fappe a r a n c e .To c o m p a r e50% e g g i n f e c t i v ed o s e ( E I D 5 o )a n d

P FU t i t e r s ,1 1b a t c h e s o f K va c c i n e a n d 7 b a t c h e so f F va c c i n e w e r e a s s a y e db o t h i n em b r y o n a t e degg s a n d CEC. R e s u l t s s u mm a r i z e di n Ta b l e 1i n d i c a t e dt h a tb o t h E ID , 0 a n d P FU t i t e r sf o rKs t r a i nw e r e s i m i l a r .T h e F s t r a i np l a q u e t i t e r si nCEC mono l a y e r sw e r e l o w e r t h a n t h e t i t e r si ne m b r y o n a t e de g g s ( T a b l e2 ) .R e p r o d u c i b i l i t yo ft h e p l a q u e a s s a y m e t h o df o rt h e F s t r a i n( l e n t o -g e n i c )u n d e r o v e r l a yc o n t a i n i n g0 . 5% a g a r o s ew a s a l s ot e s t e db y t i t r a t i n ga s t o c ko f v i r u so nf o u r d i f f e r e n to c c a s i o n s .T i t e r so b t a i n e dr a ng edf r o m 1 0 8 . 3 0t o 1 0 8 - 5 4P F U / m l .T h e r e f o r e ,i t i sa p p a r e n t t h a ta h i g h l yq u a n t i t a t i v ep l a q u e a s s a ym e t h o dc a n b e e f f e c t i v e l yu s e d f o r t h et i t r a t i o no f F a n d K s t r a i n so f NDV.F u r t h e rmo r e , t h e c om p a r a t i v e s e n s i t i v i t yo f

em b r y o n a t e de g g s a n d p r i m a r yCEC f o rv i r u si s o -l a t i o nw a s t e s t e db y s i m u l t a n e o u s l ya s s a y i n gv a r i o u s t i s s u e sc o l l e c t e df r o m s i c kb i r d se x p e r i -m e n t a l l yi n f e c t e dw i t h t h e v i r u l e n ts t r a i n( V LT )o f NDV i nb o t h s y s t e m s .A f t e r 5 d a y s o f i n c u b a -t i o no f o v e r l a i dc u l t u r e s ,p l a q u e sw e r e c o u n t e da n d t i t e r sw e r e e x p r e s s e da s P FU p e r g r a m o ft i s s u e s .F i n a lc a n d l i n go f i n f e c t e de g g s w a s d o n eon t h e f i f t hd a y p o s t i n o c u l a t i o n ,a n d t h el i v eegg sp o s i t i v ef o r h e m a g g l u t i n a t i o nw e r e c o u n t e d a sd e a d .T i t e r sw e r e c a l c u l a t e db y t h e R e e d a n dMuench m e t h o d( 5 )as E ID50p e r g r a mo f t i s s u e .Ta b l e 3 i n d i c a t e st h a tP FU t i t e r sw e r e l o w e r t h a nt h e t i t e r si n em b r y o n a t e de g g s .I t i s a l s oc l e a rt h a tp r e v i o u sa d a p t a t i o no f t h e w i l ds t r a i no fv i r u st o c e l lc u l t u r ew a s n o t e s s e n t i a lf o r t h e

TA B L E2 . C o m p a r a t i v et i t r a t i o no f F s t r a i no fN e w c a s t l ed i s e a s e v i r u si n e m b r y o n a t e de g g sa n d p r i m a r y c h i c k e m b r y oc e l lc u l t u r e sb y

t h ep l a q u e t e c h n i q u e

T i t e r / m lVi r u s s t r a i n

E I D 5 0 a PFUb

F 1 / 6 9 1 0 9 . 4 1 0 8 . 3F 2 / 6 9 1 0 8 . 7 1 0 8 .F 3 / 6 9 1 0 8 . 7 1 0 7 . 2F 4 / 6 9 1 0 9 . 4 1 0 8 - 5F 5 / 6 9 1 0 9 . 6 1 0 8 . 6F 6 / 6 9 1 0 9 . 2 1 0 8 . 8F 7 / 6 9 1 0 9 . 6 1 0 8 . 6

a F i f t yp e rc e n te g g i n f e c t i v ed o s e .b P l a q u e - f o r m i n gu n i t s .

TA B L E3 . C o m p a r a t i v et i t r a t i o no f d i f f e r e n tt i s s u e sc o l l e c t e d f r o m b i r d s e x p e r i m e n t a l l y i n f e c t e d

w i t h l o c a l v i r u l e n t( V LT ) s t r a i no f New-c a s t l ed i s e a s e v i r u s

Ti s s u e a

1 7 6 9B R

1 7 6 9TR1 7 6 9SP1 7 6 9LUN1 7 6 8TR1 7 6 8SP1 7 6 8LUN1 8 1 3B R1 8 1 3SP1 8 1 3LUN1 8 1 3TR1 7 4 3BR1 7 4 3TR1 7 4 3S P1 7 4 3LUN

T i t e r / g r a m

E ID s o b

1 0 6 . 5

1 0 8 . 61 0 7 . 4

1 0 8 . 21 1 0 8 1 .

1 0 9 . 41 9 . 2

1 0 8 . 1

1 0 7 . 41 0 6 . 41 8 . 2

1 7 . 8

PFUc

1 0 6 . 4

1 0 7 . 91 0 6 . 91 0 7 . 41 0 8 . 91 0 9 . 31 0 8 98W. 6

1 0 7 .1 0 8 . 11 0 7 . 46 0 . 9

1 0 7 . 51 0 . 4

1 0 7 . 4

a BR , b r a i n ; TR, t r a c h e a ;S P ,s p l e e n ;LUN,l u n g .

b F i f t yp e rc e n te g g i n f e c t i v ed o s e .CP l a q u e - f o rm i n gu n i t s .

p l a q u e a s s a y m e t h o d .I t s e e m s t h a tCEC mono -l a y e r sc a n b e e f f e c t i v e l yu s e d f o rt h ei s o l a t i o na n de n um e r a t i o no f t h e l o c a lv i r u l e n tv i r u sf r o mb r a i n ,t r a c h e a ,l u n g ,a n d s p l e e nt i s s u e so f s i c kb i r d s .D a t a p r e s e n t e di nt h i sr e p o r t i n d i c a t et h a tb o t h

K a n d F v a c c i n e s t r a i n so f NDV c a n b e t i t r a t e db y t h ep l a q u e t e c h n i q u ei n CEC. Fu r t h e rmo r e ,t h e s y s t e m i s s e n s i t i v ee n o u g hf o r t h e i s o l a t i o na n d e n um e r a t i o no f t h e l o c a lv i r u l e n ts t r a i n( V LTs t r a i n )f r o m f i e l dc a s e s .B ec a u s e o ft h e o b v i o u sa d v a n t a g e so f t h ep l a q u ea s s a y s y s t e m ,s u c h a si t s r e p r o d u c i b i l i t y ,d e t e c t i o no f h e t e r o g e n i c i t yi n

NOTES 6 3 9


3/3

AP P L .MICROB IOL .

v i r u sp o p u l a t i o n s ,a n d t h e c l o n i n go f v i r u spopu l a t i o n sf o r p r e c i s ec h a r a c t e r i z a t i o na n d c o m -p a r a t i v es t u d i e so f i s o l a t e s ,i t s e e m s t o b e t h es y s t e m o f cho i c e f o rd e t e c t i o na n d e n um e r a t i o no f t h et h r e es t r a i n so f NDV e n c o u n t e r e d i n t h es t u d y o f N ew c a s t l ed i s e a s ei n L e b a n o n .

T h i s i n v e s t i g a t i o nwas j o i n t l ys u p p o r t e db y t h e F a n a r R e g i o n a lP o u l t r y L ab o ra t or y o ft h e A gr i cu l t ur eR e s e a r c h I n s t i t u t e ,L e b a -n o n , a n d t h e N e a rE a s t A n i m a lH e a l t h I n s t i t u t e ,w h i c hi s a U n i t e dN a t i o n s D e v e l o p m e n tP r o g r a mm e / S p e c i a lFund P r o j e c ta d -m i n i s t e r e d b y t h e Food a n d Ag r i c u l t u r e O rg a n i z a t i o n o f t h eU n i t e dNa t i o n s .

We t h a n k J . R i z k , t h e D i r e c t o r o f t h e F a n a r R e g i o n a lP o u l t r yL a b o r a t o r y , an d H. P . C h u , t h e P r o j e c t M a n a g e r , f o r c o n t i n u o u si n t e r e s ta n d e n c o u r a g emen t t h r o u g h o u tt h i si n v e s t i g a t i o n .

LITERATURE CITED1 . B a r a h o n a ,H . H . , a n d R . P .H a n s o n .1 9 6 8 .P l a q u ee n h a n c e m e n t

o f N ew ca s t l ed i s e a s e v i r u s( l e n t o g e n i cs t r a i n s )b y mag-n e s i u m a n d d i e t h y l am i n o e t h y l d e x t r a n . Av i a n Di s . 1 2 :1 51 .

2 . Dan i e l , M . D . , an d R . P . H a n s o n .1 9 6 8 .D i f f e r e n t i a t i o n o f r e p -r e s e n t a t i v eN e w c a s t l ed i s e a s e v i r u s s t r a i n sb y t h e i rp l a q u ef o r m i n ga b i l i t yon mo n o l a y e r s o f c h i c k e m b r y o .Av i a n D i s .1 2 : 4 2 3 .

3 . D u l b e c c o ,R . 1 9 5 2 .P r o d u c t i o no f p l a q u e s i n m o n o l a y e rt i s s u ec u l t u r e s b y s i n g l ep a r t i c l e so f an a n im a l v i r u s .P r o c . N a t .A c a d . S c i .U . S . A . 3 8 : 7 4 7 .

4 . G r a n o f f , A . 1 9 6 4 . N a t u r e o f N e w c a s t l ed i s e a s e v i r u sp o p u l a -t i o n ,p . 1 0 7 - 1 1 8 .I n R . P . Hanson ( e d . ) ,N e w c a s t l ed i s e a s ev i r u s ,an e v o lv i n g p a t h o g e n.Un i v e r s i t yo f Wi s c o n s i nP r e s s ,M a d i s o n .

5 . R e e d , L . J . , a n d H . M u e n c h .1 9 3 8 .A s i m p l e m e t h o d o f e s t i -m a t i n g f i f t yp e r c e n t e n d p o i n t s .Am e r . J . H y g . 2 7 : 4 9 3 .

6 . S c h o l e r , G . M . , a n d R . P . H a n s o n . 1 9 6 8 . R e l a t i o n s h i p o fp l a q u e s i z ean d v i r u l e n c e f o r c h i c k e n s o f 1 4 r e p r e s e n t a t i v eN e w c a s t l ed i s e a s e v i r u ss t r a i n s .J . Vi r o l .2 : 4 0 .

7 . S c h o l e r , G. , an d R . P . H a n s o n . 1 9 6 8 . P l a q u e m o r p h o l o g yo fN e w c a s t l ed i s e a s e v i r u sas i n f l u e n c e d b y c e l l t y p e a n d e n -v i r o nm e n t a l f a c t o r s .Anme r. J . Ve t . Re s . 2 9 : 8 8 3 .

6 4 0 NOTES

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