1 role of λ5 in b cell development kitamura et al. 1992 supplemental material
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1
Role of λ5 in B Cell Development
Kitamura et al. 1992
Supplemental Material
2
Homologe RekombinationHomologe Rekombination
Zielgen
Neo
Neo
Wildtype
Deletions-vektor
Rekombi-nierter Lokus
TKHSV
3
Acyclovir (ZoviraxAcyclovir (Zovirax®) ®)
Acyclovir, ein Purinanalog, hat hohe Affinität zu viraler TK
Acyclovir wird durch Thymidinkinase phos-phoryliert und als Nukleotidanalog in DNA eingebaut
DNA Elongation wird terminiert
Struktur Wirkungsmechanismus
4
Selektion gegen zufällige IntegrationSelektion gegen zufällige Integration
Zielgen
Neo TKHSV
Neo
HomologeRekombination
Neo+
TKHSV-
Neo TKHSV
Zufällige Insertiondes gesamten Vektors
Neo+
TKHSV+
Neo TK
Zufällige, partielle Insertion des Vektors
Neo+
TKHSV-
5
Homologe RekombinationHomologe Rekombination
Zielgen
Neo
Neo
Wildtype
Deletions-vektor
Rekombi-nierter Lokus
6
Konstruktion des Konstruktion des λλ5 Deletions-Vektor5 Deletions-Vektor
neoDeletions-
vektor
Wildtyp-Lokus
KloniertesFragment
„Promoter“-Deletion
neo
„Neo“-Insertion
Vektor
7
Homologe RekombinationHomologe Rekombination
neo Deletions-vektor
Wildtyp-Lokus
neo DeletierterLokus
PCR
8
Knockout MäuseKnockout Mäuse
Blastozyteninjektion
9
Chimäre Agouti-Maus
Main Entry: agou·tiPronunciation: &-'gü-tEFunction: nounEtymology: French, from Spanish agutí, from TupiDate: 1625
1 : any of a genus (Dasyprocta) of tropical American rodents about the size of a rabbit
2 : a grizzled color of fur resulting from the barring of each hair in several alternate dark and light bands
Chimäre MäuseChimäre Mäuse
10
Southernblotanalyse von Maus-DNASouthernblotanalyse von Maus-DNA
EcoRI EcoRI
1 2
10.2
neo
1 2
EcoRIEcoRI EcoRI
7.5 2.5
Sonden
11
Von der chimären zur hetero- und homozygoten Von der chimären zur hetero- und homozygoten Knockout-MausKnockout-Maus
ChimäreMaus
Rag2-/-
C57Bl6
Rag2-/-
Rag2-/- Rag2-/-F1
(nicht nach Mendel)
12
Oberflächenmarker zur Bestimmung des Oberflächenmarker zur Bestimmung des Differenzierungsstadiums Differenzierungsstadiums
D JH VH DJH
SpätePro-B-Zelle
SpätePrä-B-Zelle
UnreifeB-ZelleFrühe Prä-B-
Zelle
Stamm-zelle
FrühePro-B-Zelle
V J
IgM
B220
ReifeB-Zelle
IgD
Große Zellen Kleine Zellen
13
Blut
Milz
Milz
+/+ -/+ -/-
Milz
Lymphozyten in Blut und Milz
14
B-lymphoide Zellen im Knochenmark
15
Analyse der λ5-KO-MausWolfgang Schuh (Jäck Lab)
16
Bedeutung des Prä-B-Zellrezeptor für die Entwicklung Bedeutung des Prä-B-Zellrezeptor für die Entwicklung B-lymphoider Vorläuferzellen B-lymphoider Vorläuferzellen
Stamm- Prä-Pro- Pro- Frühe Prä- Späte Prä- Unreife Reife Plasma- Zelle B-Zelle B-Zelle B-Zelle B-Zelle B-Zelle B-Zelle zelle
CD19
c-kit CD25
D JH VH DJHVL JL
IgM IgM
IgD
RAG-/-
Ig
µm-/-
5-/-
VpreB-/-
µDys-/-
JH-/-
)
µ
Prä-BZR
B220 (CD45)
17
Bl/6 WT Rag2 KO 5 KO (7weeks)
CD19
CD19
CD
19C
-kit
CD
25
IgM
BM
14,17 0,09 7,56
27,37 2,2 8,7
25,13 6.97 10,4
18
Bl/6 WT Rag2 KO 5 KO(7weeks)
CD
19
IgM
CD
4
CD8
Spleen
47,7 0,1 16,6
19
Serum-Ig
20
Humorale ImmunantwortT-unabhängig T-abhängig
21
B-lymphoide Zelle im Peritoneum
22
Allelausschluss
+/+-/-
Methode: Photoimmunfluoreszenz
23
Iso-, Allo- Idiotypic Markers
C57Bl/6 (μb)
Durch Immunisieren z.B. eines Kaninchens mit gereinigtem Maus-IgM aus einer weißen Maus = BALB/c wird die Produktion folgender Kaninchen-Antikörper induziert.
Anti-isotypische AK(gegen Epitope in C-Regionen
der H- und L-Kette)
Anti-idiotypische AK(gegen Epitope in V-Regionen
der H- und L-Kette)
BALB/c (μa)
Anti-allotypische AK(gegen ein bestimmtes Epitop
In C-Region)
24
Initiierung von Prä-B-Zellrezeptorsignalen?? Initiierung von Prä-B-Zellrezeptorsignalen??
ER
Konstitutiv vom ER
ER
cytoplasm ?
Konstitutiv von der Zelloberfläche
Ligand
cytoplasm
ER
Liganden induziert
cytoplasm
?
?