5/20/2018 1) GENERALIDADES INMUNOLOG A

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INMUNOLOGA ESPECIAL

GENERALIDADES

Lic. TM Henry A. C amp os Pa juelo

06/03/2013

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Mtodos ana ltic os basados en la rea cc inAntgeno - Ant icuerpo (Ag-Ac ).

Antgeno: Estruc tura capaza de generar unarespuesta inmunolgica Y Propios

Y No prop ios

ANTGENO

EPTOPE

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Protena produc ida por el c uerpo en respuesta aalgo extrao.

Ana lito: Todo lo que se mide en una p rueba delaboratorio:

Antic uerpo

Antgeno

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CADENA LIGERA

CADENA PESADA

ZONABISAGRA

PUENTES DISULFURO (2)

REGIONESCONSTANTES

REGINVARIABLE

SITIO DE UNINANTIGNICA(PARATOPO)

ESTRUCTURA DEL ANTICUERPO IgG

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TIPOS DE ANTICUERPO

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CASO HIPOTTICO

VIRUS EPTOPE

VIH A, B, C, D, E

HEP B A, B, D, E, F

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CASO HIPOTTICO

VIRUS EPTOPE EPTOPE ESPECFICO

VIH A, B, C, D, E C

HEP B A, B, D, E, F F

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Mezc la de a nticuerpos (antisuero polic lona l) cadauno de los cua les puede unirse a d iferentes puntosde unin d el antgeno o ep top e.

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ANTGENODETERMINANTES

ANTIGNICOS

INOCULACINDEL Ag ENCONEJO

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DESARROLLO DE CLULAS PLASMTICAS(LINFOCITOS B ACTIVADOS) Y FORMACINDE ANTICUERPOS

CLULA PLASMTICA

ANTICUERPO

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LOS DIVERSOS ANTICUERPOS FORMADOS ESTNDIRIGIDOS A DIVERSOS EPTOPES

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PURIFICACIN DE ANTICUERPOS

ANTISUERO:

MEZCLA DEANTICUERPOS(POBLACINHETEROGNEA)

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ANTICUERPOS POLICLONALES ANTI ANTGENO X

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Rea c tivo anti antgeno X

Ad

nti Eptope 1el Ag X

Anti Eptope 3del Ag X

Anti Eptope 2del Ag X Anti Eptope 4

del Ag X

Anti Eptope 7del Ag X

Anti Eptope 6del Ag X

Anti Eptope 5del Ag X

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Muy espec ficos para un eptope simple en unantgeno multiva lente. Se prod ucen a partir deuna lnea celula r simple usando tec nologa parahibridomas y lneas celula res de m ieloma de ra tn.

Hibridomas son c lulas tumorales prod uc toras de anticuerposque p rod ucen va rias c op ias del mismo a ntic uerpo.

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ANTGENODETERMINANTES

ANTIGNICOS

INOCULACINDEL Ag ENRATN

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DESARROLLO DE CLULAS PLASMTICAS(LINFOCITOS B ACTIVADOS) Y FORMACINDE ANTICUERPOS

CLULA PLASMTICA

ANTICUERPO

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LOS DIVERSOS ANTICUERPOS FORMADOS ESTNDIRIGIDOS A DIVERSOS EPTOPES

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CLULAS TUMORALES: Clulas de mieloma de ratn Se van a fusiona r con las c lulas p lasmticas (linfoc itos B ac tivad os)

prod uc toras de anticuerpos

Estas clulas pueden crecerindefinidamente en cultivocelular (inmortales)

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LOS LINFOCITOS B OBTENIDOS DEL BAZO DEL RATN SE FUSIONAN CONLAS CLULAS DE MIELOMA DE RATN PARA FORMAR LAS HIBRIDOMAS

HIBRIDOMAS(inmortales)

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SELECCIN YAISLAMIENTO DEHIBRIDOMASFORMADAS

Los anticuerpos que forman lasdiferentes colonias son analizadospara conocer su capacidad de unirsea un antgeno determinado

El hibridoma ms eficiente y queresulte de inters se expande

Y Por cultivo celularY Por induccin de tumores en ratones

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LOS ANTICUERPOSMONOCLONALESPRODUCIDOS SE PURIFICAN

Reconocen especficamente a un nico eptope deun determinado antgeno (poblacin homognea)

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Inmunoensayos Direc tos: Med ic in d irec ta delc omp lejo Ag-Ac.

Precipitacin Inmunodifusin

Ag lutina c in Reac cin de Wida l Floculacin

VDRL

Inmunoensayos Ind irec tos: Requieren e l uso de

ma teria l ma rcado p ara medir el c omplejo Ag-Ac

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LA MARCACIN DE ANTICUERPOS O DE ANTGENOS PERMITEN LA DETECCIN DELCOMPLEJO Ag-Ac

-Ac

INMUNOENSAYOS INDIRECTOS

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Clasificac in d e los Inmunoensayos Ind irec tos

Seg n el tipo de ma rc ador Radioinmunoensayos

Enzimoinmunoensayos Fluoroinmunoensayos

Quimioinmunoensayos

Seg n el mtod o d e sep arac in Homogneos

Heterogneos

Segn e l d iseo del ensayo Competitivos

No c om pe titivos (sndw ic h)

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Radioinmunoensayos

125 3

Se utiliza un marcador rad ioac tivo: I, H

La med ic in se rea liza con un c onta dor decentelleo

RIA (Rad ioinmuno ensayo)

IRMA (Ensayo Inmunoradiomtrico) RR

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RIA

COMPETITIVO

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IRMA

NO COMPETITIVO

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Enzimoinmunoensayos

Se utiliza una enzima como marcador: Fosfata sa

Alca lina , Peroxidasa La med ic in se rea liza colorimtricamente

ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente Liga do a Enzima)

WESTERN BLOT (Elec troinmuno transferenc ia)

E E

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ELISA DIRECTO

POCILLO RECUBIERTO CON ANTICUERPOS

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ELISA DIRECTO

INCUBACIN CON MUESTRA PROBLEMA

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ELISA DIRECTO

RESULTADO DEL PRIMER LAVA DO

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ELISA DIRECTO

INCUBACIN CON CONJUGADO

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ELISA DIRECTO

RESULTADO DEL SEGUNDO LAVADO

ELISA DIRECTO

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ELISA DIRECTO

INCUBACIN CON SUSTRATO

ELISA DIRECTO

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ELISA DIRECTO

FORMACIN DE PRODUCTOS COLOREADOS

ELISA DIRECTO

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ELISA DIRECTO

PRODUCTO FINAL LUEGO DE LA ADICIN DE SOLUCIN DE PARADA

WESTERN BLOT

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WESTERN BLOT

Ac.Primario(muestra)

Bandas(antgenos)

Ac. Sec undario(conjugado)

Sustrato

Membrana denitrocelulosa

Antgenos

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Fluoroinmunoensayos

Se utiliza como marcador una sustanc iafluorescente: isotioc ianato de fluorescena,ficoeritrina , ficocianina

IFD (Inmunofluoresc enc ia Direc ta )

IFI (Inmunofluoresc enc ia Ind irec ta )

Citometra De FlujoF F

IFD

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IFD

Tejido (muestra) quepresenta el Ag d e inters Ac marcado (reac tivo)

que reconoc e elantgeno de inters

Ob servac in d el prepa rad oc on el microsc opio defluorescencia

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Quimioinmunoensayos

Se utiliza como marcador una sustanc ia quegenera luminiscenc ia: luminol, isoluminol, ster deacridina, rutenio

QL (Quimioluminisc enc ia )

EQL (Elec troq uimioluminisc enc ia ) QQ

EQL

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EQL

CT O AG OELE ROD - M NET

Cam po e lc tric o

Luminiscencia

Antgeno de inters(muestra)

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Homogneos: El complejo Ag-Ac no requiere sera islado p ara la lec tura

Monitoreo teraputic o d e frmacos, detec c in

de d rogas de a buso

Heterogneos: El complejo Ag-Ac requiere sera islado para la lec tura (lavados)

ELISA

INMUNOENSAYOS HOMOGNEOS YHETEROGNEOS

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TUBO DEREACCIN

REACTIVO DE AcDE FASE SLIDA

SE MIDE ELCOMPLEJO Ag-Ac

LAVAR Y AISLAR ELCOMPLEJO Ag-Ac

TCNICA HOMOGNEA

TCNICA HETEROGNEA

MUESTRA (Ag)

+

REACTIVO DE Ac

MARCADO

+

HETEROGNEOS

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Competitivos

Nocompetitivos(sndwich)

COMPETITIVO

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Cantidad limitada deanticuerpos

FORMATO COMPETITIVO

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CONCENTRACIN

LE

CTURA

RELACININVERSA

NO COMPETITIVO (SNDWICH)

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CONCENTRACIN

LE

CTURA

RELACINDIRECTA