Metabolismul tesuturilor specializate LP1 DETERMINAREA COLINESTERAZEI SERICEOrganismul poseda enzime capabile sa produca hidroliza esterilor colinei cu diversi acizi organici. Astfel de enzime se gasesc in tesutul nervos si in eritrocite. Ele catalizeaza preferential hidroliza acetilcolinei si sunt denumite acetilcolinesteraze. Acetilcolinesteraza din tesutul nervos este activata de ionii de Mg2+ si este implicata in transmiterea influxului nervos. Aceste enzime se gasesc in cantitati mici in ser si au o importanta diagnostica redusa. In ficat este biosintetizata o colinesteraza ce actioneaza si asupra altor esteri ai colinei: butirilcolina, benzoilcolina, succinilcolina, care sunt secretate in pasma. Ea este cunoscuta sub denumirea de colinesteraza serica (colinesteraza nespecifica sau pseudocolinesteraza). Denumirea recomandata de IUB este acil: colinacilhidrolaza. Metodele de dozare ale colinesterazei se clasifica in trei categorii: a) Metoda bazata pe modificarile de pH produse prin eliberarea acizilor din esterii colinei (titrimetrica Metoda Mitchel); b) Metoda spectrofotometrica foloseste drept substrat benzoilcolina, care absoarbe la 240 nm, in timp ce produsii de hidroliza, benzoatul si colina, nu absorb. In acest caz scaderea densitatii optice la 240 nm constituie o masura a activitatii enzimatice (Metoda Kallow si Lindsay); c) Metode colorimetrice, in care sunt determinati colorimetric fie produsii de reactie (Metoda Ellman), fie substratul ramas nehidrolizat (Metoda De La Huerga).

Metoda Ellman (modificata de Barzu O. si colab.)Principiu: Prin hidroliza butiriltiocolinei catalizata de colinesteraza rezulta tiocolina care in prezenta DTNB (acid ditiodinitro benzoic) formeaza un complex cu maxim de absorbtie la 412 nm. Reactivi: 1). Solutie substrat acetiltiocolina 6,6 mM. Se pastreaza 7 zile la +40C. 2). Reactiv DTNB-fosfat-etanol. Se dizolva 20 mg acid 2-ditiodinitro benzoic in 120 mL in tampon fosfat 0,05 M, pH=7,4. Se adauga 125 mL etanol p.a. Se completeaza la 250 mL cu tampon fosfat. 3). Serul de analizat se dilueaza de 11 ori cu NaCl 9%. Tehnica de lucru: Se pregatesc 2 eprubete in care se pipeteaza: Martor 0,2 mL Incubare 10 minute la 250C, apoi se pipeteaza Reactiv de culoare 2 mL Ser diluat 0,02 mL Reactivi Sol. substrat Ser diluat Proba 0,2mL 0,02 mL 2 mL -

Se citeste absorbanta probei la 412 nm, fata de martor, la un interval de maxim 15 minute de la adaugarea ultimului reactiv. Calculul activitatii 1 unitate (U) de activitate enzimatica este corespunzatoare cantitatii de enzima care hidrolizeaza 1 mol butiriltiocolina in timp de 1 minut la temperatura de 250C. Activitatea serica se exprima in U/L ser. U/L colinesteraza = 8978 x DA412 Valorile normale pentru conditiile descrise mai sus sunt cuprinse intre 30008000 U/L ser. Valoarea diagnostica Aceasta enzima este un indicator al functiei proteosintetice a ficatului. Pseudocolinesteraza scade mult in insuficientele hepatice, in intoxicatiile hepatice, in intoxicatiile cu organe fosforice si la bolnavii cu denutritie proteica grava. Scaderi extrem de accentuate se intalnesc dupa tratamentul cu L-Asparaginaza al leucemiilor, cand se induce o perturbare grava a sintezelor proteice la nivelul ficatului. Cresteri ale pseudocolinesterazei serice se intalnesc in sindromul nefrotic, in obezitate, in diabet si la subiectii cu hiperlipemie.