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CA García Sepúlveda MD PhD

Conformaciones, Compactación del DNA, Viroides, PartículasSubvirales y Priones

Laboratorio de Genómica Viral y HumanaFacultad de Medicina, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

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Sesión #3 Niveles de organización de los ácidos nucleicos

Contenido

• Conformaciones

– A DNA, B DNA & Z DNA

– mRNA, tRNA & rRNA

• Compactación del DNA y jerarquias organizacionales

– Supercoiling

– Compactación plectonémica y solenoide

– Nucleosomas e histonas

– Fibras cromatínicas de 30 nm

– Loops y dominios

– Andamiaje nuclear

– Cromátides y cromosomas

– Centrómeros y telómeros

• Genomas

• Viroides, partículas subvirales y priones

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Conformaciones del RNA

• mRNA, tRNA & rRNA Mucha mayor variedad.

Interpretación de relevancia relativamente facil más no totalmente comprendida.

En el caso de mRNA, simplemente un fragmento lineal de ácido nucleico que sirve de intermediario entre el DNA y la proteina.

miRNA es un “simple fragmento” de mRNA que tiene una función altamente especializada...silenciar un gen.

En general cualquier ácido nucleico de cadena sencilla tiende a formar estructuras secundarias.

Las estructuras secundarias dependen de secuencias y palindromos que permiten el apareamiento...dificil de predecir.

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Conformaciones

• mRNA, tRNA & rRNA La estructura del tRNA es un claro ejemplo de formación de estructuras secundarias por parte de un ssNA...

solo que esta fue provechosa para la vida y se volvió necesaria y común.

Casi simétrica.

Unidad funcional de la traducción, anti-codon (el codon está en el DNA que está siendo leido).

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Conformaciones

• mRNA, tRNA & rRNA

Y si esto se veia complejo, no se iguala al nivel de complejidad exhibido por el rRNA, constituyente crucial de la maquinaria proteosintética.

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Conformaciones

• mRNA, tRNA & rRNA

PyMol

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Compactación y jerarquias organizacionales

Compactación y jerarquias organizacionalesMatemáticas elementales:

3,000'000,000 de bases en genoma humano

0.34 nm ocupados por cada escalon del DNA

Aproximadamente 1080 millones de nanómetros = 1.08 metros de DNA (Conf B)

...en cada célula, y hay miles de millones de células...

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• Los cromosomas bacterianos circulares se compactan con poliaminas (como la espermina) las cuales se unen a las cargas negativas del DNA para neutralizar su carga y evitar la repulsión con el objeto de permitir la formación de madejas.

• El problema se agrava cuando se contempla que el ser humano posee 3 mil millones de pares de bases...pero no somos los más “grandes”

• La salamandra común...poseee 4x más DNA que nosotros.

• Incluso algunas plantas poseen más DNA que nosotros.

• Paradoja del valor C...el tamaño del genoma no es directamente proporcional a la complejidad del organismo.

++ +

+++ ++

++

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• El DNA (ca 2 mts de largo) se almacena en el núcleo de las células eucariótas.

• El diámetro del núcleo celular fluctúa entre 5 y 10 m.

• El contorno de los cromosomas mide entre 1.6 y 8.2 cm.

• Compactación cromosómica human altamente eficiente:

• Condensación de 100,000 X

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Supercoiling (super-embobinado)

Es crítico para compactación del DNA.

Especialmente util durante eventos de división nuclear.

Las cohesinas y condensinas (Proteinas de mantenimiento estructural de los cromosomas) la inducen para condensar las cromátides.

Resulta de la apertura del duplex de DNA durante la síntesis de DNA/RNA para darle acceso a la polimerasa (girasa, una topoisomerasa tipo II).

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Plectonémica Solenoide Superbobina

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En procariotas la plectonémica es suficiente para su pequeño genoma circular.

Eucariotas emplean diversos grados de ambos tipos (pero la solenoidal es más eficiente).

La solenoide reduce el espacio ocupado por DNA acoplado a histonas a través de giros que lo compactan en fibras de 10 y 30 nm.

Compactación plectonémica: Bobinas extendidas con sentido horario.Se observa en DNA in vitro.

Compactación Toroidal (solenoidal):Giros anti-horarios muy apretadosDNA in vivoMás compacto que la plectonémica.

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Superembobinado Relajado

Duplex relajado, una vuelta sobre su eje cada 10 bp.

Una molécula de DNA circular (como en las bacterias) puede ser sometida a torceduras que la obliguen a ocupar menos espacio...DNA-B

Figura 8 = super-embobinado (plectonémico) elemental.

Lóbulos de figura 8 exhibirán rotación horaria o antihoraria (sobreembobinado o infraembobinado).

Compactación en levaduras

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Topoisomerasas generan o relajan el super-embobinamiento.

La Topoisomerasa II eucariota no puede introducir giros negativos.

El super-embobinado positivo es deseable por que:

1.- Reduce la posibilidad de interacciones con proteínas (hendidura M y m).

2.- Reduce el espacio físico ocupado por el DNA.

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Nucleosomas

Estructura propuesta por Roger Kornberg (1974).

Premio Nobel Quimica 2006 “base molecular de la transcripción de DNA hacia RNA”

Cromatosoma = Nucleosoma + proteina espaciadora.

Nucleosoma posee coro de histonas (octámero) y ca 146 bp DNA.

Compactación: 7x

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Nucleosomas

Hijo de Arthur Kornberg

Premio Nobel Medicina o Fisiología 1959 “Mecanismos de la síntesis del DNA”

Descubrio DNA polimerasa I (primera de uso in vitro)

Tuvo tres hijos:

•Roger, Nobel 2006

•Thomas, Descubridor de DNA polimerasa II

•Kenneth, Arquitecto especializado en el diseño de laboratorios.

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Nucleosomas

Estructura propuesta por Roger Kornberg (1974).

Premio Nobel Quimica 2006 “base molecular de la transcripción de DNA hacia RNA”

Cromatosoma = Nucleosoma + proteina espaciadora.

Nucleosoma posee coro de histonas (octámero) y ca 146 bp DNA.

Compactación: 7x

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Nucleosomas

Histonas poseen carga positiva y hacen función de poliaminas bacterianas.

Coro formado por ocho histonas formando disco de 11 nm de diámetro.

146 bp de DNA se enrollan alrededor de coro.

Particulas de coro separadas entre ellas por 54 bp (varía desde 8 hasta 114 bp) de DNA espaciador envuelto alrededor de proteina espaciadora (H1).

Cantidad total en particula cromatosomal ca 200 bp de DNA.

Las histonas interfieren con la unión de otras proteinas al DNA.

El enrollamiento del DNA alrededor de las histonas es un proceso dinámico y regulado.

1.8 vueltas de DNA por nucleosoma.

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Nucleosoma

6 nm

11 nm

• Coro nucleosomal compuesto por octamero de histonas.

•2 x H2A

•2 x H2B

•2 x H3

•2 x H4

• 6 x 11 nm dimensiones.

• Péptidos entre 10 y 25 kDa

• Cargados positivamente para interactuar con DNA negativo.

• Peptidos ricos en Arg y Lys.

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Nucleosoma

6 nm

11 nm


•2 x H2A

•2 x H2B

•2 x H3

•2 x H4





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Nucleosoma

6 nm

11 nm


•2 x H2A Azules

•2 x H2B Amarillos

•2 x H3 Rojos

•2 x H4 Verdes





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Nucleosoma

6 nm

11 nm


•2 x H2A Azules


•2 x H3 Rojos

•2 x H4 Verdes





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Nucleosoma


•2 x H2A Azules


•2 x H3 Rojos

•2 x H4 Verdes





6 nm

11 nm

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Nucleosoma


•2 x H2A Azules


•2 x H3 Rojos

•2 x H4 Verdes





6 nm

11 nm

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• Formación del nucleosoma aporta al super-embobinamiento negativo (DNA in vivo)...por lo que no necesitamos una enzima para lograrlo (topo II no puede).

Modelo de collar de cuentas en ME:

• Cuentas = nucleosomas

• Hilo = DNA espaciador

• H1 se une al DNA espaciador

• Pérdida de H1 no disrumpe nucleosoma

• Observable bajo microscopía electrónica.

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Solenoide - Fibras de 30 nm

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Solenoide - Fibras de 30 nm

1

2

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5

6

6 nucleosomas forman un arreglo helicoidal.

El arreglo helicoidal resultado del super-embobinamiento solenoidal del “collar de cuentas” forma una fibra de 30 nm.

El “collar de cuentas” se fija al andamiaje nuclear.

Fibra cromatínica observada en ME.

En general solo regiones inactivas (sin expresión genética).

Corresponde a la mayor parte de la heterocromatina.

Compactación: 100x

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Asas de 300 nm

Fibras de 30 nm forman asas largas (300 nm de largo) ancladas al andamiaje nuclear.

Cada asa posee aprox 75,000 bp

Asas de 300 nm = Dominios estructurales (no confundir con dominios funcionales...otro cuento).

Andamiaje nuclear

300 nm

(c) Looped domains (300-nm fiber)

Asas

Andamio

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Rosetas

En los cromosomas condensados (de metafase) las asas (entre 6 y 9) de 300 nm forman estructura helicoidal llamada kernel o roseta.

Andamiaje nuclear = cromosómico

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Bobinas

Asa

Roseta

Bobina

Las rosetas (ca 30) se apiñan una sobre otra de manera helicoidal formando las bobinas de las cromátides.

Bobina cromatínica (solenoide cromatínico) = como el cordón teléfono.

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Cromátides

Bobinas cromatínicas empalmadas forman cromátides.

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Cromosomas

Andamiajecromosómico

DNA depletado de histonas

Cromosoma de metafase forma más compacta.

Compactación: 15,000 x

En los procariotas el cromosoma consiste en una sola molécula circular de DNA de doble cadena desnuda (con excepción de las poliaminas).

Los eucariotas poseen un conjunto diploide de cromosomas lineares.

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Cromosomas

Especie Num. Cromosomas (diploide)

D. melanogaster 8 Cobayo 16Pichón 16 Caracol de tierra 24Lombriz de tierra 36 Zorro 36Gato 38 Cerdo 38Ratón 40 Rata 42Conejo 44 Hamster 44Liebre 46 Humano 46Gorillas, chimpances 48 Oveja 54Elefante 56 Vaca 60Burro 62 Caballo 64Perro 78 Pollo 78Carpa dorada 104

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Cromosomas

¿Cual es el organismo que mayor número

de cromosomas posee?

¿Cuantos tiene?

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Cromosomas

¿Cual es el organismo que mayor número

de cromosomas posee?

¿Cuantos tiene?

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Cromosomas

Ophioglossum

“Adder’s-tongue Fern”

Tropical/Subtropical

1400 Cromosomas

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Centrómeros y Telómeros

Centrómero formado por heterocromatina empleada en la fijación a huso mitótico/meiótico (microtúbulos).

Telómero formado por heterocromatina repetitiva destinada a proteger extremos cromosómicos.

Centrómeros y telómeros contienen cantidades abundantes de DNA de secuencia simple repetitiva (SSR).

SSR: Multiples copias en tandem de secuencias cortas).

SSR desempeñan funciones estructurales en telómeros y centrómeros.

¡Los centrómeros humanos poseen una secuencia de 170 bp repetida entre 500 y 3,000 veces!

¡Misma secuencia telomérica para todos los vertebrados! TTAGGG

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Telómeros

• Existen telómeros en los extremos de todos los cromosomas eucariotas lineares.

• Son una solución al “problema de la replicación de lo extremos cromosómicos”.

• Cada vez que la célula se divide se pierde algo del extremo terminal (telómero) de los cromosomas.

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Telómeros y telomerasa

• La telomerasa extiende los extremos 3´ descubiertos que quedan después de retirar el primer de RNA al final de la replicación.

• Telomerasa es una transcriptasa inversa, sintetiza DNA a partir de RNA.

• El RNA de referencia forma parte de la misma Telomerasa.

• La Telomerasa agrega multiples copias de la secuencia de referencia al extremo 3'.

• La DNA polimerasa convencional entonces se encarga de extender los extremos 5'.

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Panorama global

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