Colorazione dei preparati istologici

• Per colorazione si intende un procedimento che rende colorate determinate porzioni dei preparati microscopici

• Per colorante si intende una molecola solubile fornita di colore proprio capace di legarsi stabilmente a substrati cellulari e tissutali

• Il termine substrato può essere riferito ad un composto chimico ben definito o ad una struttura citologica o istologica identificabile morfologicamente

colore• Il colore è la percezione visiva

generata dai segnali nervosi che i fotorecettori della retinainviano al cervello quando assorbono le radiazioni elettromagnetiche di determinate lunghezze d'onda e intensità nel cosiddetto spettro visibile o luce. (Wikipedia)

In fisica lo spettro visibile è quella parte dello spettro elettromagnetico che cade tra il rosso e il violetto includendo tutti i colori percepibili dall'occhio umano

Colorazione dei preparati istologici•coloranti biologici sono quelle sostanze che hanno la proprietà di rendere visibili le strutture biologiche nei preparati microscopici.

•I coloranti si raggruppano in due grandi categorie: •coloranti naturali•coloranti artificiali

•I coloranti naturali•di derivazione animale (per es. carminio) •di derivazione vegetale (per es. ematossilina e orceina),

•sono poco numerosi e in genere scarsamente conosciuti dal punto di vista chimico•alcuni di essi (per es. l’indigo e l’orceina) si ottengono oggi per sintesi.

•I coloranti artificiali, una volta indicati con il nome generico di «coloranti di anilina », sono più propriamente designati come « coal-tar (catrame) dyes »

STRUTTURA DEI COLORANTI

• I coloranti sono in genere composti organici della serie aromatica

• constano di due componenti– cromoforo – auxocromo

• Le due componenti insieme formano il colorante completo

cromoforo• nel cromoforo, si trovano sempre raggruppamenti

atomici dai quali dipende il colore.

Proprietà del cromoforo

• La presenza di più gruppi cromofori, aumenta l’intensità del colore

• Il colore è dovuto all’assorbimento selettivo di alcune lunghezze d’onda della luce

• La luce trasmessa o riflessa da una data sostanza, privata delle lunghezze d’onda che ha assorbito, appare colorata

auxocromo

• il cromoforo, pur essendo colorato, non ha proprietà coloranti: è soltanto un cromogeno (generatore di colore)

• perché il colorante acquisti la proprietà di colorare deve contenere anche un gruppo noto come auxocromo

Proprietà dell’auxocromo• L’auxocromo è un gruppo chimico ionizzabile, unito covalentemente al

cromoforo

• L’auxocromo è responsabile:

– della solubilità in acqua del colorante

– della sua ionizzabilità

– della capacità di contrarre legami stabili (spesso mediante legami di tipo

salino) con le proteine o con altri componenti dei tessuti

• A seconda della carica assunta in soluzione, l’auxocromo può essere

– acido (quando ionizza come anione)

– basico (quando ionizza come catione)

• Questa caratteristica genera la fondamentale distinzione dei coloranti istologici in acidi e basici

• La classificazione non tiene quindi conto della concentrazione degli

idrogenioni nelle loro soluzioni

• Tiene invece conto se la parte significativa del colorante, l’auxocromo, è

anionica o cationica

• Per queste ragioni i coloranti dovrebbero essere classificati più

propriamente in «anionici» e «cationici».

Tipi di auxocromo• Gli auxocromi acidi sono i gruppi:– solfonico (-SO3H il più frequente) – carbossilico (-COOH) – idrossilico (-OH)

• Gli auxocromi basici sono:– il gruppo aminico (-NH2) ed i suoi derivati – i metalli (nelle cosiddette lacche)

• I coloranti vengono in genere posti in commercio sotto forma di sali:

– Acidi: come sali di sodio, talvolta di potassio, di calcio o di ammonio

– Basici: come cloruri, talvolta come acetati o solfati

Elenco dei colorantiSeguendo le indicazioni contenute nel Conn’s Biological Stains, i coloranti

biologici si elencano in base alla natura del cromoforo, nei seguenti gruppi e sottogruppi:

I. Nitroso coloranti (chinone oxime) (Fast green O, verde naftolo B).2. Nitro coloranti (ac. picrico, giallo naftolo).3. Coloranti azoici, suddivisi in:

monoazoici (orange G, cromotropo 2 R, ponceaux 2 R); diazoici (rosso Congo, Sudan IV, bruno Bismark); poliazoici (nero di clorazolio E, rosso Sirius F 3 B).

4. Sali di diazonio: copulandosi con i composti fenolici nativi presenti nei tessuti danno luogo a coloranti azoici (Fast red G G, fast garnet G B C).

5. Copulanti azoici, usati sotto forma di fosfati, acetati e altri esteri nella istochimica enzimatica (alfa e beta-naftolo, naftoli A S).

6. Sali di tetrazolio. Fungono da accettatori di idrogeno dando luogo a formazani fortemente colorati là dove si realizzano ossidazioni enzimatiche o di altra natura (nitro blu di tetrazolio).

7. Coloranti stilbenici (diamine fast yellow A o curcumina S).

Elenco dei coloranti8. Coloranti della serie dell’arilmetano, divisi in:

a) Difenilmetani (auramina O, un fluorocromo);b) Diamminotrifenilmetani (Fast green FCF, verde brillante);c) Triamminotrifenilmetani (pararosanilina, Fucsina acida,

cristal violetto);d) Idrossitrifenilmetani (ac. rosolico, violetto cromo CG);e) Mono- e dinaftilfenilmetani (blu Vittoria 4 R, R, B, blu

notte).9 Coloranti xantenici:

a) Aminoxanteni [pironine (pironina G o Y); succineine(rodammina S); rosanine (sulforodammjna B); rodammine (rodammina B)];

b) Idroxanteni o fluoroni (eosina B; floxina B, rosa Bengala G).

Elenco dei coloranti10. Coloranti acridinici, usati come coloranti e fluorocromi

(arancio di acridina, acriflavina, fosfina).11. Coloranti e fluorocromi chinolinici (pinacianolo e

pseudoisocianina).12. Coloranti metinici polimetinici (astra violetto FF e rossi

d’astrazone).13. Coloranti tiazolici (primulina, tioflavina S e T).14. Coloranti chinone-imminici:

a) Indamine (blu di toluilene);b) Indofenoli (indossine);c) Azine [eurodine (rosso neutro); rosinduline (azocarminio B); safranine

(safranina O); induline (induline, nigrosine)];d) Oxazine (blu di cresile brillante, blu Nilo, rosso Darrow, orceina,

gallocianina);e) Tiazine (tionina, blu di metilene, azzurro B).

Elenco dei coloranti15. Coloranti ammino- e idrossichetonici (cromogeno I).16. Coloranti antrachinonici:

a) Idrossiantrachinoni (rosso di alizarina S, purpurina);b) Amminoantrachinoni (oil blue N, violetto Sudan R, blu di

alizarina acida).17. Indigo-coloranti (indigocarminio).18. Ftalocianine (alcian blu 8 GX, Luxol fast blue MBS).19. Coloranti naturali (ematossilina, carminio,

zafferano).20. Reagenti cromogeni diversi.21. Coloranti neutri.

LACCHE

• Le lacche costituiscono una classe particolare di coloranti basici

• Si tratta di coloranti basici in cui l’auxocromo è un metallo

• Hanno largo impiego per l’intensità e la stabilità del colore

• I metalli più usati nelle lacche per uso istologico sono alluminio, ferro e cromo

• Gli allumi (di potassio, di ferro ammoniacale) formano lacche con alcuni coloranti, come l’emateina, dando luogo a complessi fortemente colorati

ematossilina• trova largo impiego in istologia ed in istochimica, come colorante nucleare

• è una lacca alluminica dell’emateina, comunemente indicata come ematossilina

• L’ematossilina è in realtà una sostanza estratta dal legno di un albero originario del centro America, il campeggio (Haematoxylon campechianum)

• L’ematossilina di per sé è praticamente incolore ed incapace di colorare• L’ematossilina viene ossidata ad emateina (che è colorata e costituisce il

cromoforo) e fatta reagire con allume potassico (solfato doppio di alluminio e potassio, KAl(SO4)2 )

• Si forma così la lacca completa definita emallume

• In particolare l’emallume viene utilizzato per lo studio della basofilia

• Può accadere (eccezioni) però che l’emallume– Colori anche strutture abitualmente non basofile – non colori, viceversa, alcune strutture tipicamente basofile

MODALITA’ DI ESECUZIONE DELLE COLORAZIONI

• Colorazione in blocco (in toto o whole-mount) è la colorazione di frammenti di tessuto, di un organo o di un embrione prima che siano inclusi e sezionati

• colorazione di sezioni: può avvenire sia con le sezioni adese a vetrini, sia con fette libere

• Colorazioni dirette: sono quelle in cui il preparato non richiede trattamenti particolari prima di essere immerso nella soluzione colorante

• Colorazioni indirette: sono quelle in cui l’immersione nel bagno di colorazione deve essere preceduta da una mordenzatura

Mordenti o mordenzanti• Alcuni metodi di colorazione comportano la cosiddetta

mordenzatura• Questa operazione consiste nel trattare il tessuto con un

composto capace di fissare su di esso dei gruppi acidi o basici, i quali a loro volta potranno legarsi con un colorante basico o acido• Il composto che costituisce questo termine di collegamento

fra il tessuto e il colorante si chiama mordente• La maggior parte dei mordenti impiegati in istologia sono

ossidanti – acido cromico, acido fosfomolibdico, acido fosfowolframico,

acido nitrico – cloruri di Pb, Zn, Hg – permanganato di potassio– iodio– ac. picrico, ecc.

MODALITA’ DI ESECUZIONE DELLE COLORAZIONI

• colorazioni progressive: il processo di colorazione è arrestato quando il preparato ha raggiunto il colore desiderato

• colorazioni regressive: il preparato è sovracolorato e poi decolorato (differenziato) , finché non assume il colore desiderato

• In condizioni ideali, quali quelle ricercate per le reazioni istochimiche, le colorazioni devono essere progressive e tali che, una volta assunto il colorante da parte delle porzioni del preparato che gli sono affini, non si abbia ulteriore colorazione di altre strutture

• Le colorazioni regressive sono utili in istologia in quanto permettono di dimostrare strutture difficili da colorare con metodi progressivi

MODALITA’ DI ESECUZIONE DELLE COLORAZIONI

• colorazioni semplici: si usa un solo colorante

• colorazioni complesse : si usano più coloranti, contemporaneamente o in successione l’uno dietro l’altro

• Colorazioni vitalisono quelle applicate ad elementi (cellule o animali) viventi (Vedi esame a fresco di cellule e tessuti)

• Queste colorazioni presuppongono l’intervento di processi vitali per l’assunzione e la localizzazione del colorante all’interno di cellule o nella sostanza intercellulare

• Nell’ uso comune viene impiegato il termine– colorazione vitale quando il colorante è somministrato ad un

animale vivo– colorazione sopravitale, quando il colorante è usato per trattare

tessuti o cellule isolate, ancora vive, dopo l’allontanamento dell’animale di cui facevano parte

fattori che influenzano l’azione dei coloranti• L’azione differenziale dei coloranti dipende da fattori insiti nel

tessuto: – affinità chimica fra i vari costituenti del tessuto e i coloranti– concentrazione dei costituenti che reagiscono con il colorante– permeabilità dei costituenti– il pH– la forza ionica– la concentrazione del colorante– la temperatura del bagno di colorazione – la fissazione cui e stato sottoposto il tessuto

• La buona riuscita di molti metodi di colorazione dipende proprio dal tipo di fissativo impiegato

• Non è ben conosciuto il meccanismo attraverso il quale il fissativo favorisce la successiva colorazione

• Per questa la ragione, per ogni metodo di colorazione, si specifica il fissativo più adatto

ESECUZIONE DELLE COLORAZIONI SU SEZIONI

• I coloranti sono solubili in acqua • Per la colorazione è necessario che le sezioni siano

idratate• Se il tessuto era stato incluso in paraffina, questa viene

rimossa immergendo le sezioni in un solvente intermediario (xilolo)

• Le sezioni vengono poi trasferite in etanolo (o acetone) assoluto, per allontanare l’intermediario, e quindi in etanolo (o acetone) a titolo decrescente, fino all’acqua distillata

• La colorazione avviene per immersione della sezione nel bagno colorante

• in genere segue un lavaggio in acqua o in soluzioni particolari, a seconda del colorante impiegato

disidratazione• Segue disidratazione alcolica• occorre disidratare la sezione per applicare il

vetrino coprioggetto con l’interposizione di una soluzione di montaggio

• La disidratazione avviene mediante etanolo (o acetone) a titolo crescente, fino all’etanolo (o acetone) assoluto,

• Segue diafanizzazione in liquido intermediario (xilolo o succedanei)

Montaggio delle sezioni colorate

•Dopo la colorazione, il preparato viene montato,•in tale modo il tessuto viene imbibito da una sostanza con lo stesso indice di rifrazione del vetro• inoltre viene racchiuso tra due strati di vetro (portaoggetto-coprioggetto), con il mezzo di montaggio interposto•Ciò fa si che la luce non venga rifratta nel passaggio attraverso i vari strati. •Il vetrino portaoggetto è più spesso, di forma rettangolare•il vetrino coprioggetto è più sottile

Mezzi di montaggio non idrosolubilii mezzi di montaggio possono essere non idrosolubili o

idrosolulubili• I mezzi di montaggio non idrosolubili sono usati più frequentemente• si tratta per lo più di resine sintetiche che garantiscono preparati stabili,

al riparo dalla polvere e dall’essiccamento, con mantenimento nel tempo del colore del preparato

• Naturali :– balsamo del Canadà (terpeni, ac. Carbossilico ed esteri), – Balsamo dammara– Camsal, Euparal

• Sintetici– Composti stabili inerti solubili in xilolo; prodotti

commerciali: Permount Picolite, Klermount , DPX, Clearmount, Polymount

Mezzi di montaggio idrosolubili• I mezzi di montaggio idrosolubili si impiegano allorché la natura del

substrato (ad esempio, lipidi) o il mezzo di colorazione non consentano la disidratazione e la diafanizzazione

• molto usato è il glicerolo, da solo o in soluzione con gelatina.

• Vengono usate insieme anche altre sostanze che solidificano in acqua (gomma arabica, gelatina) oppure aumentano l’indice di rifrazione (Sali o zuccheri) o impediscono lo sviluppo di muffe (fenolo, timolo)

• I preparati montati con mezzi idrosolubili vanno lutati, cioè sigillati lungo il bordo del vetrino coprioggetto (con ceralacca o altro mezzo analogo), per impedire l’essiccamento e l’insudiciamento del mezzo di montaggio.

• Esempi: Sciroppo di Apathy, Gelatina di Heringa• Commerciali: Acquamount, Karion, Glicerol.gelatine

METACROMASIA• Un particolare comportamento di alcuni coloranti basici, utile

per indagini istochimiche, è la metacromasia• Con questo termine si indica un cambiamento (o viraggio) del

colore, una volta che il colorante sia stato assunto da sostanze, definite cromotrope

• I coloranti metacromatici sono basici; nella pratica sono molto impiegati coloranti basici blu della serie delle tiazine, che virano metacromaticamente al blu violetto o al rosa violetto

• Il colore proprio del colorante in soluzione diluita è detto ortocromatico

• Alcune strutture tissutali appaiono metacromatiche subito dopo la colorazione allorché il preparato è esaminato immerso in acqua

• poi tornano ad essere ortocromatiche dopo disidratazione del preparato in alcool etilico

• Si può così distinguere una metacromasia – alcool resistente– non alcool-resistente

METACROMASIA

• Le sostanze capaci di dare metacromasia alcool-resistente nei tessuti animali sono gli eteroglicani (ad eccezione dell’acido ialuronico), le mucine epiteliali (ad eccezione di quelle neutre)

• Si ritiene probabile che nel complesso tra colorante e substrato, allorché le molecole del colorante sono vicine e ordinate regolarmente nello spazio, si stabiliscono delle interferenze,

• Queste sono responsabili di una variazione di legame dei cromofori e conseguentemente di una variazione del colore

Colorazione di uno striscio di sangue

Colorazione di uno striscio di sangueMetodo combinato May-Grunwald-Giemsa,

secondo Pappenheim, modificato da Ferrata.

• Si chiama anche metodo panottico.• Ha i vantaggi dei due metodi May-Grùnwald e

Giemsa• rimedia agli inconvenienti del primo (mancata

colorazione delle granulazioni azzurrofile dei leucociti) e a quelli del secondo (colore sbiadito dei globuli rossi, scarsa differenziazione fra le granulazioni neutrofile e quelle azzurrofile).

• E’ il metodo più largamente usato per lo studio del sangue umano allo stato normale e patologico

• è ottimo per lo studio dei parassiti del sangue.

liquidi coloranti May-Grunwald e Giemsa

• Si trovano in commercio già preparati.• Tutti e due sono ottenuti mescolando un

colorante basico (di anilina) con un colorante acido.

• Il colore acido è per tutti e due l’eosina• il colorante basico – nel May-Grunwald è il bleu di metilene officinale, – nel Giemsa è l’azzurro Il.

Procedura:primo passaggio• con una pipetta si versa sul vetrino il liquido colorante May-Grunwald ( v.oltre) in

tale quantità che il liquido ricopra lo striscio ma non debordi dal vetro. • tutta la superficie del vetrino rimane coperta (il liquido May-Grunwald fissa e

colora al tempo stesso).

• Dopo tre minuti si aggiunge acqua distillata a gocce lentamente, finché la diluizione della soluzione corrisponda a una parte di liquido colorante e due parti di acqua. Si lascia agire il colorante per altri 5-6 minuti.

• Complessivamente quindi la colorazione col liquido May-Grunwald deve durare da 6-9 min . Per il midollo osseo occorrono 5 m di più.

• Si controlla la colorazione al microscopio con un obiettivo a secco, – i globuli rossi devono essere colorati in rosa; – i nuclei dei leucociti in bleu pallido.

Procedura:secondo passaggio• Segue un breve lavaggio in acqua distillata e successiva colorazione nel

liquido di Giemsa diluito nella proporzione di 1 goccia per 1 ml di acqua distillata.

• La durata della colorazione è di 5-8 min per il sangue, e 25-30 min per gli strisci di midollo osseo.

• Il liquido colorante va cambiato ogni due minuti.• E’ opportuno controllare al microscopio il grado di colorazione e togliere il

colore quando i nuclei dei leucociti sì sono colorati in violetto (colorazione progressiva).

• Si procede poi al lavaggio sotto il getto della cannella; si asciuga con carta da filtro, e poi al calore;

• Si monta con balsamo del Canadà neutro oppure si procede anche all’esame diretto con l’immersione senza coprioggetto.

• Gli eritrociti ed i granuli eosinofili si colorano in rosa intenso; i granuli neutrofili (più piccoli degli eosinofili) in rosa violaceo più pallido, quelli azzurrofili in rosso violaceo; i basofili in bleu, i nuclei dei leucociti in violetto.