1

6. Replikacija (umnažanje) DNA

Sveučilište u SplituPrirodoslovno-matematički fakultet

Odjel za kemiju

prof. dr. sc. Maja Pavela-Vrančič

Replikacija je sposobnost DNA da kopirasamu sebe

roditeljskaDNA

novosintetiziranilanci DNA

2

Mathew MeselsonFranklin Stahl 195815N DNA (t šk )

Replikacija DNA je semikonzervativna

1958. 15N DNA (teška)

hibridna DNASvaka molekula kćeri sadržijedan roditeljski lanac ijedan novosintetizirani lanac

roditeljska molekula

14N DNA (laka)hibridna DNA

molekule kćeri druge generacije

molekule kćeri prve generacije

Kromosomi prokariota imaju jedno ishodištereplikacije (ori, engl. origin of replication)

ori inicijacijskiprotein

oriU ishodištu replikacije započinjeodmatanje dvolančane DNA

oriC

TerA

TerCTerB

vezanjeinicijacijskog

proteina

odmatanjeTerDTerEE. coli Ter

TerB

ori oristvaranje

replikacijskihrašlji

TerF

E. coli: na Ter sljedove veže seTus protein koji dozvoljava

replikaciju samo u jednome smjeru

Kod kružne DNA replikacijazavršava na suprotnome kraju

3

Replikacijske rašlje su mjesta odmatanja roditeljske DNA i sinteze nove DNA

tro

mi l

an

ac

vod

eći l

an

ac

replikacijske rašljeishodištereplikacijeVODEĆI

lanac

VODEĆITROMI

TROMIlanac

početnica

5

5

5

5

3

3

3

3

VODEĆIlanac

TROMIlanac

početnica

smjer replikacije

Replikacija kružne DNA odvijase u dva suprotna smjera

roditeljska DNA

Kromosomi eukariota imaju višeishodišta replikacije

roditeljska DNA

replikacijskimjehurić

replicirana DNA

replikacijskerašljerašlje

4

in vitro: pri temperaturama > 90 oC

Odmatanje dvolančane DNA

u fiziološkim uvjetima (37 oC) pomoću helikaza:

DnaA helikaza (inicijacijski protein) veže se na dvolančanu DNA

DnaB helikaza (heksamer) veže se na jednolančanu DNA odvaja lance i stvara

lik ij k šljreplikacijsku rašlju izvor energije: hidroliza

ATP

superuvijenikalup oriC

Za vrijeme replikacije, lanci DNAmoraju se razmotati

13 pb 9 pb

5 mM ATP (odmatanje pomoćuhidrolize ATP, koju katalizira DnaA)

inicijacijskikompleks

ATP·DnaA

DnaB DnaC (ATP)

13 pb sljedovi bogatiA:T parovima

DnaBheksamer

DnaB DnaC (ATP)

komplekss DnaB

DnaC (ADP + Pi)

5

SSB

Stabilizacija jednolančane DNA

DnaB protein

Smjer replikacijeTromi lanac

Vodeći lanac

SSB proteini (engl. single stranded binding protein): stabiliziraju dijelove jednolančane DNA štite jednolančanu DNA od hidrolize fosfodiesterske veze

djelovanjem nukleaza

Helikaza, koristeći energiju hidrolize ATP, razdvaja lance DNA

Prirodne kružne DNA su negativne superuzvojnice

Helikaza za svaki zavoj Helikaza za svaki zavoj kojega odmota, ispred sebe stvori po jedan pozitivni superzavoj

Pri razmotavanju zatvorene kružne DNA javljase topološki problem

6

DNA giraza (topoizomeraza II),d d lik ij k šlj

DnaB helikaza kreće se duž tromog lanca u 53 smjeru

DnaBhelikaza

53

uzvodno od replikacijske rašlje,odstranjuje pozitivne superzavoje koje stvara helikaza dok odmata DNA

DNA giraza, na račun hidrolize ATP, uvodi negativnesuperzavoje u zatvorenu kružnu DNA

početnica

primaza

topoizomeraza II SSB

Adicijom primaze na helikazu nastaje multienzimski kompleks: primosom

Uzvodno odreplikacijske rašlje

Primaza, specifična RNA-polimeraza, (engl primer = klica)

Primaza sintetizira početnicu

(engl. primer = klica)

sintetizira kratki potez RNA (~ 10 nukleotida) komplementaran kalupu DNA

Primaza može započeti sintezu lanca de novo

Smjer sinteze: 5 3

primaza

DNA kalup

l b d i

Slobodna 3-hidroksilna skupina lanca RNA služi kao početnica za sintezu DNA pomoću DNA polimeraze III

RNApočetnica

slobodni3-OH kraj

7

DNA polimeraza III (Pol III) je primarni enzimski kompleks u replikaciji prokariotske DNA

DNA polimerazaHoloenzim Pol III: potpuni enzim,

uključuje sve podjedinice

-podjedinica: katalitička-podjedinica: ispravlja pogreške

-podjedinica

-podjedinica(klizna stezaljka između DNA i Pol III)

Visoka efikasnost Pol III: -podjedinicaomogućuje kontinuiranu replikaciju

bez disocijacije

DNA polimeraza III holoenzim je sastavnakomponenta replisoma

Replisom: kompleks sastavljen od helikaze primaze polimeraze i SSB

SSB

vodeći lanac

kompleks, sastavljen od helikaze, primaze, polimeraze i SSB istovremeno replicira oba lanca tromi lanac se mora izviti za svaki novi Okazakijev fragment

DNA polimerazaholoenzim

-podjedinica

primaza

tromi lanac

DnaB

RNA-početnica

8

Enzimi koji kataliziraju sintezu komplementarnog lanca DNA

DNA polimeraze

Arthur Kornberg(1918-2007.)

Nbelova nagrada1959.

(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi

Potrebni su: supstrati DNA polimeraze:

sva četiri deoksinukleozidtrifosfata (dNTP):dATP, dTTP, dGTP, dCTP

Mg2+

ne sintetizira lanac DNA de novo: treba početnicu (kratki lanac RNA) sa slobodnom 3´-OH skupinom

jednolančani DNA kalup (ssDNA)

Smjer sinteze 5 3

Ioni metala (najčešće Mg2+) sudjeluju u reakciji polimerizacije

Jedan ion metala (najčešće Mg2+) koordinira dNTP i 3-OH skupinu početnice olakšava nukleofilu (3-OH)

napad na -fosfatnu skupinu dNTP-a

Drugi ion metala koordinira Drugi ion metala koordinira dNTP olakšava otpuštanje

pirofosfata

9

Svojstva DNA polimeraza iz bakterije E. coli

Pol I Pol II Pol IIIPol I Pol II Pol III

53Polimerazna aktivnost

+ + +

35Egzonukleazna aktivnost

+ + +

aktivnost

53Egzonukleazna aktivnost

+ - -

pp

Polimerizacija

5` → 3`5` → 3`

OH OH

p

OH

ppp

ppi

dNTPDNA polimeraza katalizira stvaranje fosfodiesterske veze

Pokretačka snaga reakcije: ireverzibilna hidroliza pirofosfata (ppi)

+ H2O 2 pirofosfat ortofosfat

ppi pi

10

3´ 3´

RNA-početnicaRNA-početnica

DNA polimeraza je nespecifična - prima upute s kalupaUgrađuje nukleotide temeljem komplementarnosti baza

baza

PPi

2Pi

Pi Pi Pi

baza baza

baza baza

DNA

3´

DNAKALUP

DNA

3´

DNAKALUP

baza

Pi

bazabaza

bazabaza

5´ 5´

smjer

Vodeći lanac

Vodeći lanac

roditeljski lanci

replikacije

replikacijske rašlje

Sintetizira se kontinuirano, jer je smjer sintezeistovjetan smjeru odmatanja uzvojnice

11

Sintetizira se kontinuirano (5´ 3´)

Replikacija vodećeg lanca

DNA kalupprimaza

Jedna početnica (primer) po replikacijskoj rašlji

Sinteza početnice (~ 10 nukleotida): primosom: multienzimski

kompleks sastavljen odprimaze i drugih proteina

RNA početnicaPol III

primaza Pol III

DNA polimeraza III (Pol III) započinje sintezu DNA na 3´-kraju početnice

RNA-lanac se hidrolizira pomoćuDNA polimeraze I

novosintetizirana DNARNA početnica

Pol I

smjer

Tromi lanac

Tromi lanacroditeljski lanci

replikacije

Sintetizira se diskontinuirano, jer je smjer sintezesuprotan smjeru odmatanja uzvojnice

12

ppippi

Zašto se polinukleotidni lanacne sintetizira u smjeru 3 5 ?

ppp

polimerizacija

popravak

ppp ppp pp

H2O

ppp ppppp pp

Nastavak polimerizacije mogućjedino uz prethodnu fosforilaciju

monofosfata u trifosfat uzutrošak ATP

Sintetizira se diskontinuirano Okazakijevi fragmenti

novosintetizirani RNA RNAlanac početnica primaza početnica

Replikacija tromog lanca Pol III

više početnica po replikacijskoj rašlji (početnice sintetizira primaza)

DNA polimeraza III zapoćinje sintezu DNA na 3´-kraju početnice

Pol I

Okazakijev fragment

DNA-polimeraza I izrezuje početnicu i popunjava jazove

DNA ligaza povezuje lance

DNA ligaza

13

Sinteza tromog lanca: u smjeru 5' 3‘Prividno: u smjeru 3' 5‘

vodećillanac

tromilanac

Ligaze povezuju lance DNA

-

LigazaIzvor energije:bakterije: NAD+

animalne stanice: ATP

Lanci DNA koje spaja DNA-ligazamoraju biti dio dvolančane molekuleDNA

Značajno pri:• sintezi DNA - replikaciji• popravku oštećene DNA

e koj eko bi a ijianimalne stanice: ATP • genskoj rekombinaciji

14

U replikaciji sudjelujuDNA topoizomeraza odstranjuje pozitivne superzavoje koje

stvara helikaza dok odmata DNAhelikaza odmata roditeljsku DNASSB proteini stabiliziraju jednolančanu DNAprimaza sintetizira početnicuDNA polimeraza I i III sintetizira i popravlja DNAligaza povezuje fragmente DNAligaza povezuje fragmente DNA

helikaza

primosom

primaza

SSB proteini

DNA polimeraza III

DNA polimeraza Ipočetnica ligaza

Ponavljanje

DnaA

DnaA

DnaC, DnaB

DnaC

DnaB

DnaA

primazaPol III

početnica

SSB

Pol I

ligaza početnica

helikaza

tromi lanac

početnicaprimaza

giraza

stezaljka

početnica

SSB

Pol III

Pol III

15

Obilježite sve komponente ovog sustava

Model “trombona”

pogrešno sparene baze

3´ 5´ egzonukleazna aktivnost DNApolimeraze I, II i III

Izrezuje pogrešno sparene baze tijekom polimerizacijepogrešno sparene baze

Odstranjuje mononukleotid s 3-kraja rastućeg polinukleotidnog lanca

Mjesto izrezivanja hidrolizomne smije biti dio dvostruke uzvojnice

Mora imati slobodnu 3- OH skupinu

16

kalupaktivno mjesto kalup

Klenowljeva podjedinicaDNA polimeraze I

DNA polimeraza I iz E. coli sastoji se od jednog

li tid l t i j

polimeraze polipeptidnog lanca s tri aktivna mjesta: 53 polimerazna

aktivnost 35

egzonukleaznaaktivnost

53egzonukleazna aktivnost

aktivno mjesto3 5 egzonukleaze

polimerizacija popravak

Djelovanjem tripsina cijepa se na dva fragmenta veći fragment:

Klenowljeva podjedinica

5´ 3´ egzonukleazna aktivnost DNA polimeraze I

Veza koja se cijepa mora biti unutar dvostruke uzvojnice(DNA ili DNA:RNA hibrid)

mjesto izrezivanja

lom u lancu DNA

3-OH kraj zarezanog lanca služi kao početnica, a komplementaran lanac kao kalup odstranjuje pogrešno sparene baze (nakon zarezivanja endonukleazama) odstranjuje RNA početnicu tijekom polimerizacije

Izrezuje mononukleotid ili oligonukleotid (do 10 nukleotidnih ostataka)s 5-kraja lanca

17

53

35

telomere su građene od kratkih ponavljajućih sljedova gvaninom bogate DNA

Telomere su nukleoproteinske strukture na 3‘-krajevimakromosoma, bitne za stabilnost genoma

telomera

gvaninom bogate DNA

u talomerama svih kralješnjaka nalazi se ponavljajući slijedTTAGGG

prosječna duljina telomera sisavaca iznosi oko 15 kilobaza (kb)

telomere ciklizacijom stvaraju petlje i tako štite krajeve kromosoma

T-petlja

kromosoma

53

D-petlja

Kromosomska DNA 3`5`

Replikacija linearne DNA u stanicama eukariota

Tromi lanac

Kromosomska DNA 35

3` 5`klicanovosintetizirana DNAklicanovosintetizirana DNA

Kromosomska DNA

klicanovosintetizirana DNA

3`

Kako je spriječeno skraćivanje linearne DNAuslijed nemogućnosti DNA polimerazeda replicira završni dio kromosoma?

telomeraze

praznina

18

Telomeraza je RNA-protein

Telomeraza je reverzna transkriptaza koja replicira telomerekoristeći unutrašnji RNA kalup

kromosomska

RNA kalup

telomeraza

koristeći unutrašnji RNA kalup

3kromosomskaDNA

nukleotidi

3

Obnova telomera

ponavljajući slijed TTAGGG TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA 3AATCCCAAUCCCAAUCCCAAU 5

AAUCCCAAUTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA 3AATCCC

telomeraza

AAUCCCAAUTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA 3AATCCC

klicanovosintetizirani lanac5-3-egzonukleaza

“reverzna”transkripcija

TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA 3AATCCC

3 5

3 5TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA 3

početnica

AAUCCCAAU

AAUCCCAAU translokacijaTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA 3AATCCC 53

“reverzna”transkripcija

3 5TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA 3AATCCC

TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA 3AATCCC AATCCCAATCCCA 5 DNA

polimeraza

19

skraćivanje telomera uzrokuje nespecifičnu

Skraćivanje telomera –molekulski mehanizam biološkog sata

Embrionalnematične

Odraslematičnestanicej p

degeneraciju stanica -stanično starenje

matičnestanice

stanice

kratke

kromosom

dugetelomere

telomere

Telomeri se skraćuju svakom diobom uzgubitak od 50-100 nukleotida

somatske stanice

telomera

stanice koje se dijele ograničeni broj puta (20-60 puta) ne eksprimiraju telomeraze

gubitak telomera = stanična smrt

tumorske stanice: aktivirana ekspresija

kromosomska DNA

stanična smrt

tumorske stanice

kromosomska DNAtelomera

p jtelomeraze - beskonačna dioba stanice

telomeraza

beskonačna dioba

20

Mutageni su tvari koje inducirajunastanak mutacija

fizički mutageni: fizički mutageni: ionizirajuće zračenje: X-zračenje neionizirajuće zračenje: UV zračenje

kemijski mutageni: alkilirajuća sredstva, dušikasta kiselina,

hidroksilamin interkalirajuća sredstva (akridinske boje, etidij

bromid, aktinomicin D)bromid, aktinomicin D) analozi baza (5-bromouracil, 2-aminopurin)

retrovirusi

UV zračenje uzrokuje kovalentno povezivanjesusjednih timinskih baza u pirimidinski dimer

timinske baze povezuju se ciklobutanskim prstenom

pirimidinski dimeri narušavaju uzvojitu

Timinski dimer

UV svjetlo

strukturu DNA i vezu s komplementarnim bazama

Susjedne timinske baze u DNA

21

izravni obrat kemijske reakcije odgovorne za oštećenje DNA

Izravni popravak fotoreaktivacijom

karakteristično za bakterije, kvasce, mnoge biljke i životinje, ali ne i za čovjeka

stvaranjetiminskog dimera

fotoliazavezanje enzima

u tami

fotoreaktivacijski enzimi cijepaju dimer na prvobitne baze nakon apsorpcije plave svjetlosti

vidljivasvjetlost

Popravak izrezivanjem

ekscinukleaza(lat. exci = izrezivanje)

helikaza

izrezani oligonukleotid

nukleaza kida lanac na 5 i 3-kraju

helikaza odmata lance i odvaja oligonukleotid

DNA polimeraza Iligaza DNA polimeraza I popunjava

prazninu DNA ligaza povezuje lance

22

Xeroderma pigmentosum

nastaje kao posljedica kvara u strukturi gena odgovornih za sintezu endonukleaze koja izrezuje okosnicu DNA u blizini pirimidinskog dimera

rijetka kožna bolest

mnogi bolesnici umiru prije tridesete godine mnogi bolesnici umiru prije tridesete godine života od metastaza malignih tumora kože

akridinske boje etidij bromid aktinomicin D

Interkalirajuća sredstva

akridinske boje, etidij bromid, aktinomicin D ubacuju se između susjednih parova baza uzrokuju pomak u okviru čitanja

Iste je veličine kao jedan par baza

etidij bromid

akridin narančasta

aktinomicin D

23

Kemijska oštećenja - deaminacija

uracilcitozin

HNO2

Uracil se uklanja iz DNAlanca djelovanjemuracil glikozidaze

hipoksantinadenin

Post-replikacijska tranzicijska mutacija A:T u G:C

DNA sadrži timin umjesto uracila radi popravke deaminiranih citozina

uracil glikozilaza kida glikozidnu vezu između baze i šećera

Deaminacijomcitozinat j il

nastaje AP (apirimidinsko mjesto)

AP endonukleaza kida lanac DNA

deoksi-fosfodiesteraza izrezuje

nastaje uracil uracil-DNAglikozilaza AP

deoksi-

AP endonukleaza

deoksi fosfodiesteraza izrezuje šećer i fosfat

DNA polimeraza popunjava prazninu

DNA ligaza povezuje lance

deoksifosfodiesteraza

DNA polimerazai ligaza

24

5-Bromouracil je analog timina

Ugradnjom 5-bromouracila na mjesto timina, T = A par se zamjenjuje BrU G paromse zamjenjuje BrU G parom

BrU

5-bromouracil gvanin

Kemijski karcinogeni Zahvaćeni organKemijski karcinogeni Zahvaćeni organ

derivati anilina mjehur

spojevi arsena pluća, koža

azbest pluća

soli kadmija prostata, pluća

olovo bubrezi

kl i ti idi j torganoklorni pesticidi jetra

vinil klorid jetra, pluća, mozak

drvna prašina nosni sinusi

25

bDim cigaretesadrži

Pluća, usna šupljina,dišni putovi, želudac,

gušterača, ostalo

kemijski karcinogeni