CURSO DE POSTGRADO

Muerte celular programada (MCP) en plantas

GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

Profesor Responsable: Dra. Sara Maldonado

Docentes a cargo:Dr. Fabio Causin,Dra.María Paula López Fernández, Dr. Hernán P. Burrieza, Dra. Laura Moyano

Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental

Facultad de Ciencias Exactas y NaturalesUniversidad de Buenos Aires.

(2017)

MUERTE CELULAR PROGRAMADA DURANTE EL DESARROLLO Y LA GERMINACIÓN DE SEMILLAS

El grano de los cereales constituye un fruto uniseminado (cariopse) en el que las paredes

del ovario (pericarpio) se encuentran unidas al tegumento seminal (episperma). La semilla

propiamente dicha consta de un embrión con un único cotiledón haustorial (el escutelo),

que se interpone entre el eje embrionario hipocótilo-radícula y el tejido reservante

(endosperma). Durante el desarrollo, las células de este último tejido sufren un proceso de

muerte programada,tal que, en el grano maduro, queda constituido en su mayor parte por

células muertas cargadas de amiloplastos, y en menor medida de pequeños cuerpos

proteicos. Sólo las células de la/s capa/s periférica/s, denominada capa de aleurona,

permanecen vivas y acumulan proteínas y lípidos. La/s capa/s de aleurona, tendrá/n un rol

fundamental durante la germinación: a partir de la digestión de las proteínas acumuladas

durante la germinación, se sintetizan las enzimas responsables de la degradación del

almidón y otras reservas que utilizará el embrión durante las primeras etapas de

crecimiento. Una vez consumidas las reservas contenidas en la semilla, tanto la capa de

aleurona como el escutelo dejarán de ser funcionales, y sus células entrarán en un

proceso de muerte programada.

En las semillas de Gimnospermas, el gametofito femenino (“prótalo”) constituye el tejido

reservante, y son las células del mismo y también las del embrión las responsables de la

producción de enzimas que digerirán las reservas.

Esquema de corte longitudinal de Corte longitudinal de semilla de

cariopsede trigo Araucariasp.

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ee= eje embrionariocot= cotiledonesmgp= protaloprótalo

Mediante el uso de técnicas histoquímicas se identificará el proceso de muerte celular y la

evolución del contenido de las diferentes substancias de reserva en cariopses de

cerealesy semillas de Araucaria sp.

METODOLOGÍATinción con azul de Evans

El azul de Evans es un colorante que posee las propiedades de tinción inversa a las de

una tinción vital para determinar la supervivencia de las células de la planta. Las células

con membranas intactas excluyen el colorante, mientras que el colorante penetra y tiñe a

las células muertas.

1. Cortar longitudinalmente el material y sumergir las mitades durante 2 min. en una

solución acuosa de azul de Evans 0,1% .

2. Dejar en agua destilada durante 20-30 min.

3. Observar bajo la lupa y determinar las zonas en donde ocurre muerte celular.

Tinción de substancias de reserva

En granos con diferente estadio de desarrollo realizar secciones delgadas en la parte

longitudinal-media para su posterior observación al microscopio. Mantenerlos

humedecidos.

1. En las secciones realizar tinción con lugol y observar la presencia de hidratos de

carbono.

2. Teñir otro grupo con amidoblack (1 min.), quitar el exceso de colorante

sumergiendo brevemente en agua y luego dejar en ác. acético al 7% (5 min.), y

observar la presencia de cuerpos proteicos.

3. Teñir un último grupo con sudán IV para detectar lípidos.

Tinción de xilema

Realizar secciones longitudinales del embrión en granos de diferente tiempo de

germinación y añadir una gota de floroglucinol ácido. Cubrir inmediatamente con

cubreobjeto y observar el desarrollo de elementos de conducción en el escutelo y en la

porción más cercana a éste del eje embrionario

BIBLIOGRAFIADomínguez F., Cejudo F. J. 2014.Programmedcelldeath(PCD):anessentialprocessofcerealseeddevelopmentandgermination.

Frontiers in Plant Science 5: Art. 336.

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Detección in situ de ADN fragmentado mediante ensayo TUNEL

Debido a que la degradación del ADN es una de las características más importantes de la

MCP, al presente se han desarrollado diferentes métodos que permiten analizar

individualmente cada célula, en busca de esta degradación. Uno de los métodos más

utilizados es el marcaje de la hebra sencilla de ADN por medio de una transferasa

terminal que adiciona nucleótidos marcados al ADN en extremos 3´-OH libres. Este

método se conoce como método de TUNEL (Terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT)-

mediateddUTP Nick endlabeling) y se puede utilizar tanto para la detección por medio de

citometría de flujo, como por microscopía. Esta técnica permite determinar la

fragmentación de ADN en células individuales, por lo que es posible conocer la proporción

de células que están muriendo por MCP en un determinado momento.

Materiales y reactivos:Secciones de 3 µm de espesor de cortes de prótalo deAraucaria angustifoliaen diferentes

estados de germinación.

Buffer de lavado: PBS

Vial 1 (azul) (50 l) Enzymesolution

Vial 2 (violeta) (550 l) Labelsolution(TÓXICA x inhalación e ingestión).

La mezcla debe prepararse inmediatamente antes de usar y mantenerla en frío y

oscuridad.

Preparación de la mezcla TUNEL:1. Usar 100 l del vial 2 para 2 controles negativos2. Agregar el volumen total del vial 1 (50 l) a los restantes 450 l del vial 2 para

obtener 500 l de mezcla TUNEL. Mezclar bien.

Control negativo: Incubar en 50 l de vial 2 en vez de incubar con la mezcla TUNEL

Control positivo: Incubar los portas ya permeabilizados con micrococcal nuclease (3000U/ml) o DNasa I(*) recombinante (3U/ml) durante 10 min a 15 – 25º C para inducir rupturas en el ADN, previo al marcado.

(*) DNasa I recombinante en 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mg/ml BSA, 1mM MgCl2

METODOLOGIA

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1. Humedecerlos cortes con PBS x 5 min.

2. Secar el área alrededor de la muestra (cuidado de no levantar los cortes)

3. Agregar 50l de proteinasa K (20 g/ml) en 10 mM Tris-HCl

4. Incubar 20 min a temperatura ambiente.

5. Lavar 2 veces con H2O destilada durante 10 min cada lavado.

6. Secar el área alrededor de la muestra.

7. Agregar 50 l de mezcla TUNEL sobre la muestra y cubrir con parafilm.

8. Incubar en cámara húmeda durante 60 min a 37º C en oscuridad.

9. Lavar 2 veces con PBS durante 10 min cada lavado.

10.Lavar rápidamente 2 veces con H2O destilada.

11.Observar bajo microscopio de fluorescencia a de excitación en el rango de 450-

500nm y detección de 515-565 nm (verde)

BIBLIOGRAFIAFilonova, L. H., Suárez, M. F. &Bozhkov, P. V. 2008.  Detection of programmed cell death in

plant embryos. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 427, 173–9

Prego I, Maldonado S, Otegui M. 1998. Seedstructureandlocalizationof reserves in

Chenopodiumquinoa. AnnalsofBotany 82: 481-488.

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Electroforesis de ADN

La fragmentación del ADN es una característica típica de los programas de muerte celular

en muchos sistemas.

Materiales y reactivos:ADN total de prótalo de Araucaria durante la germinación

Agarosa 2% en buffer TBE- SYBR ® Safe ADN gel stain (Invitrogen)

Buffer de siembra

METODOLOGIA

1. Preparar la cuba electroforética teniendo en cuenta la ubicación de los electrodos y

el peine.

2. Depositar la agarosa en la cuba y poner el peine, evitar burbujas de aire. Dejar

solidificar (aprox. 20min).

3. Retirar el peine, agregar el buffer

4. Preparar la muestra sobre parafilm con 4 µl de buffer.

5. Sembrar. Conectar electrodos

6. Correr a 50V.

7. Proceder al revelado para detectar ADN. Los geles se revelarán y se fotografiarán

utilizando G: software de GeneSnap, TransiluminadorSyngene Box.

BIBLIOGRAFIAHorii, M. &Marubashi, W.2005. Even juvenile leaves of tobacco exhibit programmed cell

death. Molecular Biology 344, 339–344.

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Ensayo de actividad nucleasa

Para identificar las actividades de las desoxirribonucleasas se utilizará ADN-SDS-PAGE.

Estas enzimas se asocian a la fragmentación del ADN nuclear y se agrupan en diferentes

clases basándose en su pH y en la dependencia de iones específicos para su actividad.

La actividad de ADNsa se detectará de acuerdo con el método realizado por Thelen y

Northcote (1989), con ligeras modificaciones.

Materiales y reactivos:Extractos proteicos de cariopses de trigo luego de 1, 3 y 6 días de germinación.

Extractos de prótalo de Araucaria en diferentes estados de germinación .

Solución buffer para los reservorios electródicos: Tris-glicina, pH 8,3

Buffer ácido de incubación 25 mM de acetato de sodio-ácido acético, (pH 5,5), 1 mM

ZnSO4, DTT 0,2 mM y 1% [v / v] de Tritón X-100

Buffer neutro de incubación 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM de MgCl2, 10 mM de CaCl2,

0,2 mM DTT y 1% [v/v] de Tritón X-100

Buffer del gel concentrador (0.125 M Tris-HCl, pH 6.8)

Buffer del gel separador (0.375 M Tris-HCl, pH 6.8)

Persulfato de amonio (0.05%)

ADN de esperma de arenque/ salmón

Solución lavadora: 25% de 2-propanol y EDTA 1 mM

Buffer Frio (10 mMTris-HCl, pH 8 , EDTA 1 mM).

METODOLOGIA1. Armar el molde con los vidrios y espaciadores

2. Preparar la solución correspondiente al gel separador y agregarle 50ul de ADN,

luego agregarle el TEMED. Dejar polimerizar

3. Preparar la solución correspondiente al gel concentrador, colocar el peine. Dejar

polimerizar

4. Colocar el molde en la cuba de electroforesis

5. Preparar los tubos de cada muestra mezclada con azul de bromofenol

6. Sembrar el volumen apropiado de cada muestra

7. Colocar la solución buffer en la cuba. Conectar electrodos

7

8. Aplicar una intensidad de corriente de 20mA por placa, dejando la cuba en hielo

durante la corrida.

9. Desarmar cuidadosamente el molde, marcar el gel en el extremo de inicio de

siembra en la parte superior para permitir la identificación de las calles

10.Lavar los geles dos veces con solución lavadora durante 10 minutos para eliminar

el SDS y los cationes divalentes residuales

11.Enjuagar los geles en buffer de incubación

12. Incubar los geles a 37ºC o. en buffer neutro o buffer ácido

Día siguiente

13.Lavar durante 5 min en buffer frio

14.Para revelar la posición de las nucleasas teñir los geles con azul de toluidina 15

minutos y lavar con agua.

15.La actividad nucleasa se detecta como una región (banda) acromática la cual no se

colorea con azul de toluidina debido a la ausencia del ADN como sustrato.

BIBLIOGRAFIAThelen MP &Northcote DH. 1989. Identification and purification of a nuclease from Zinnia elegans L.: a potential molecular marker for xylogenesis. Planta 179: 181-195.

Rizhsky, L., Shulaev, V. &Mittler, R. 2004. Measuring programmed cell death in plants. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.) 282:179–89

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Ensayo de actividad proteolítica

Materiales y reactivos:Extractos proteicos(1) de cariopses de trigo luego de diferentes días de germinación.

Extractos proteicos de hojas de trigo(1)con distintos grados de senescencia, inducida

mediante la exposición a sombreo con filtros lumínicos selectivos.

Solución buffer para los reservorios electródicos: Tris-glicina pH 8,3

Buffer del gel concentrador (0.125 M Tris-HCl, pH 6.8)

Buffer del gel separador (0.375 M Tris-HCl, pH 6.8)

Persulfato de amonio (0.05%)

Solución de gelatina 2 %

Buffer muestra (Tris HCl 0.5 M pH 6.8 + glicerol 10 % + SDS 10% + azul debromofenol)

Buffer de lavado (Tris HCl 50 mM, pH 7.5 + tritón-x100 2.5 %)

Buffer de incubación (Tris HCl 50 mM, pH 7.5)(1)Para la obtención de los extractos el material cosechado se muele en N liquido y se homogenizaen buffer Tris-HCl50 mM (pH 7,5) conteniendo 2mM β-mercaptoetanol, 5 mM MgSO4en presencia depolivinilpolipirrolidona (PVPP) 1% (p/v) en una relación de 1 ml de buffer por 0.30 g PF. Los homogenatos se centrifugan a 13000 xg por 20 min a 4ºC, recuperando las proteínas solubles en el sobrenadante. Se determina el contenido de proteínas en los extractos a fin de sembrar igual cantidad en cada calle.

METODOLOGÍA (ver detalles de armado de geles en documento anexo)

1. Armar el molde con los vidrios y espaciadores

2. Preparar la solución correspondiente al gel separador y agregarle 1:10del volumen

final de gelatina, luego agregarle el TEMED. Dejar polimerizar.

3. Preparar la solución correspondiente al gel concentrador, colocar el peine. Dejar

polimerizar.

4. Colocar el molde en la cuba de electroforesis

5. Preparar los tubos de cada extractoagregando 1:4 del volumen final de buffer

muestra, previo agregado decantidades apropiadas de agua bidestiladaa fin de

igualar la concentración final de proteínas en cada tubo.

6. Sembrar 28µL por calle de cada muestra

7. Colocar la solución buffer en la cuba. Conectar electrodos

8. Aplicar una intensidad de corriente de 20mA por placa, dejando la cuba en hielo

durante la corrida.

9

9. Desarmar cuidadosamente el molde, marcar el gel en el extremo de inicio de

siembra en la parte superior para permitir la identificación de las calles

10.Lavar los geles dos veces con solución lavadora durante 10 minutos para eliminar

el SDS. Enjuagar los geles en buffer de incubación

11. Incubar los geles a temperatura ambiente en buffer de incubación hasta el día

siguiente.

Día siguiente

12.Lavar durante 5 min en y teñir los geles con una solución de azul de Coomasie al

0,05% (15-20 min. aproximadamente). Si es necesario, decolorar con una solución

de ácidoacético : metanol (10% : 40%).La actividad proteolitica se detecta como

una región (banda) acromática la cual no se colorea con azul de coomasie debido a

la ausencia de proteína (gelatina).

BIBLIOGRAFIA

Leber T M &Balkwill FR.1997. Zymography: A Single-Step Staining Method forQuantitation of Proteolytic Activity on Substrate Gels.Analytical Biochemistry 249: 24–28.

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Inducción de formación de aerénquima

Cuando las raíces de una planta de hábito terrestrequedan sumergidas durante un

período prolongado (por ej. en un suelo anegado), la falta de oxígeno puede inducir la

muerte de células en la corteza (proceso que involucra, entre otros factores, señales

derivadas de reguladores del crecimiento tales como el etileno y el ácido abscícico),

dando origen a la formación de grandes espacios intercelulares lisígenos.

Anatómicamente, este tejido adquiere las características de un aerénquima, cuya finalidad

sería incrementar la superficie correspondiente al “espacio libre” (apoplasto), y el contacto

de la misma con los gases disueltos en el medio.

Materiales Plántulas de maíz crecidas en un sustrato sólido inerte y plántulas crecidas durante 12

días en cultivo hidropónico, sin aireación mecánica.

Procedimiento

Tomar las raíces que presenten mayor espesor y realizar cortes transversales delgados a

mano alzada, a tres alturas distintas desde el ápice y la base de las mismas. Observar

bajo el microscopio y representar gráficamente las diferencias estructurales detectadas en

cada caso.

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Endoreduplicación durante el desarrollo de tejidos y

órganos

Cambios en el nivel de ploidía durante el desarrollo y la senescenciaTres diferentes tipos de ciclos celulares ocurren durante el desarrollo del endosperma de

maíz y otros cereales: (i) división del núcleo no seguida de citocinesis, lo cual resulta en la

formación de un sincitio; (ii) división del núcleo seguida de citocinesis; y (iii)

endoreduplicación, la cual implica repetidas rondas de replicación del ADN, sin

condensación de cromatina y sin segregación de cromátidas hermanas o citocinesis,

resultando en células endopoliploides.

También durante el desarrollo de ciertostejidos en algunas plantas, toma lugar el proceso

de endoreduplicación, como parte del desarrollo.

En este práctico se evaluará el cambio en la cantidad de ADN, por citometría de flujo.

Materiales Hojas de plantas de quinua, en diferentes etapas del desarrollo

Endosperma de semillas de maíz, en diferentes etapas del desarrollo

ProcedimientoLas hojas y endospermasen diferentes estados de desarrollo serán disecadose inmersos

en el tampón de extracción Otto I; allí serán cortados en trozos muy pequeños. La

suspensión que contiene los núcleos liberados, serán pasados a través de un filtro de 50-

μm. Luego, los núcleos serán teñidos con dos volúmenes de Otto II que contiene DAPI

(López-Fernández et al., 2015). Después de agitar suavemente la solución, se analizarán

las muestras con un citómetro de flujo(CyFlowPloidyAnalyser, Partec). Los histogramas

de un solo parámetro mostrarán un único parámetro de medición (fluorescencia relativa)

en el eje xy el número de eventos (recuento de núcleos) en el eje y.

En el histograma de hojas, el número 2C indica el nivel de ADN que corresponde al

estado diploide del genoma (fase G1 del ciclo celular) mientras 4C indica la capacidad de

las células para entrar en el estado M del ciclo celular (fase G2 del ciclo celular). En el

endosperma los números serán 3c, 6c, 12c, etc.

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BIBLIOGRAFÍALópez-Fernández MP, Burrieza HP, Rizzo AJ, Martínez-Tosar LJ, Maldonado S. 2015. Cellular and molecular aspects of quinoa leaf senescence. Plant Sci. 2015 238:178-87Sabelli PA. 2012. Replicate and die for your own good: Endoreduplication and cell death in the cereal endosperm. Journal of Cereal Science 56 (2012) 9-20.

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1. Ciclo celular

2. Tipos de divisiones a lo largo del desarrollo de hoja de quinoa

3. Tipos de divisiones celulares a lo largo del desarrollo del endosperma de maíz

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