شرکت مهندسی آب و فاضالب کشورمعاونت نظارت بر بهره برداری

دستورعمل شمارش جمعيت ميکروبی

هتروتروف در آب

دفتر نظارت بر بهداشت آب و فاضالب 1384پاییز – ویراست نخست

در تدوين اين دستورعمل از منابع زير استفادهشده است:

1. American Water Works Association(1999)“Waterborne Pathogens”, AWWA Manual M48

2. Bartram J. ,Cotruvo J. , EXner M. , Fricker C. & Glasmacher A.(2002) “Heterotrophic Plate Counts and Drinking-water Safty”, WHO,NSF,IWA

3. Bitton G.(1999) “Wastewater Microbiology” Wiley Liss, Second edition4. Gleeson C.& Gray N.(1997) “The Coliform Index and Waterborne

disease” , E & FNSPON

0

5. Moria Csuros & Cfaba Csuros(1999) “Microbiological Examination of Water & Wastewater” , Lewis

6. Report of an Expert Meeting(2002) “Heterotrophic Plate Conut Measurement in Drinking Water Safty Management” , WHO , Geneva

7. World Health Organization(2004) “ Guidelines for Drinking Water Quality”, Vol. 1 ,WHO , Geneva

موسسه استاندارد تحقيقات صنعتي ايران به آب )شمارش به گيروارگانيسم هاي قابل.� 88-5271كشت( استاندارد شماره ي

ی تخصصی بهداشت آب و اعضای کميتهفاضالب شهری

ارشد مهندسی بهداشت کارشناسمجيد قنادیمحيط

مدير دفتر نظارت بر بهداشت آب وفاضالب کشور

?ب و فاضالب کشور شرکت مهندسی آ

ارشد مهندسی عمران محیط کارشناسسید سعید تاجزیست

کارشناس دفتر نظارت بر بهداشت آب و فاضالب شرکت مهندسی آب و

فاضالب کشور 1

ارشد ميکروبيولوژی کارشناسمحمد حسن ربيعی راد مدير کنترل کيفيت و بهداشت آب وفاضالب شرکت آب و فاضالب اهواز

کارشناس شیمی رقيه نيک مرام مدير کنترل کيفيت و بهداشت آب و

فاضالب شرکت آب و فاضالبآذربايجان شرقی

کارشناس میکروبیولوژیسیدمحمد سیدخادمی ?ب و مدير کنترل کيفيت و بهداشت آ

فاضالب شرکت آب و فاضالب گلستان

ارشد مهندسی شیمی کارشناسسهيل اميری مدير کنترل کيفيت و بهداشت آب و فاضالب شرکت آب و فاضالب غرب

استان تهران

کارشناس بهداشت محیط هادی اشرف زاده مدير کنترل کيفيت و بهداشت آب و

فاضالب شرکت آب و فاضالبخراسان رضوی

کارشناس شیمیغالمرضا احمری مدیر کنترل کیفیت و بهداشت آب و

فاضالب شرکت آب و فاضالب مرکزی

اصطالحاتPour plate :ی روشی از کشت ميکروبی است که در آن آگ��ار م��ذاب ب��ا نم��ونه

.شود میمايع)نظیر آب(مخلوط و همگن SPREAD PLATE : ی مايع بر روشی برای کشت ميکروبی است که در آن نمونه

شود میروی سطح محيط کشت جامد به طور يکنواخت پخش HPC (HETEROTROPHIC PLATE COUNT) :شمارش کلنی های تشکيل شده حاصل

ای هتروتروف در يک محيط کشت جامده نيسماز رشد ميکروارگا2

که برای رشد به کربن آلی نياز دارند و ياها نيسمگروهی از ارگا هتروتروف:د. کنن میی آلی کربن دار به عنوان منبع غذایی استفاده هاز ماد

(COLONY FORMING UNIT )CFU: کل��نی و واح��دی هواحدهای تش��کيل دهند است که در هر میلی لیتر نمونه وجود دار.دHPCشمارش

(TOO NOMERATE TO COUNT )TNTC: بيش از حد قابل شمارش (LABORATORY ACCIDENT )LA : خطای آزمايشگاهی(SPREADERS )SPR: کلنی هایی از ميکروارگانيسم که به صورت گسترده بر

شوند میروی سطح آگار ايجاد ( American Water Works Association) AWWA :انجمن کارهای آبی ایالت متحده

AOC((Assemble Organic Carbon: کربن آلی قابل جذب

3

فهرست مطالبHPC----------------------------------------------------5تعریف و اهمیت

6----------------------------------------------------رشد میکروبی در آب 6--------------------------------------------- در مدیریت آبHPCکاربرد

7-------------------------------- در مدیریت آبHPCموارد مهم کاربرد 7-------------------------------شمارش میکروارگانیسم های هتروتروف

8-------------------------------------------------------------انتخاب روش PourPlate----------------------------------------------------------------8

Spread plate-------------------------------------------------------------8Membrane filter---------------------------------------------------------8

9------------------------------------------------------------------محل کار9------------------------------------------------------------نمونه برداری

9----------------------------------------------------آماده سازی نمونه ها 9--------------------------------------------------------------محیط کشت

Plate Count Agar-------------------------------------------------------9mHPC Agar-------------------------------------------------------------10

R2A Agar----------------------------------------------------------------10(HPCA )NWRI Agar---------------------------------------------------10

10------------------------------------------------انکوباسیون )گرماگذاری(11----------------------------------------------------شمارش و ثبت نتایج

13------------------------------------محاسبه و گزارش نتیجه ی آزمایش HPC---------------------------------------------13مراحل انجام آزمایش

13-------------------------------------------------------------وسایل و مواد14------------------------------------------------------تهیه ی محیط کشت

14----------------------------------------------------------آماده سازی آگار15--------------------------------------------------------آماده سازی رقت 16---------------------------------------------------------آماده سازی پلیت

19-----------------------------------------------------روش کشت سطحی19------------------------------------------------------------وسایل و مواد

19------------------------آماده سازی پلیت های حاوی محیط کشت آگار19-----------------------------------------------------روش انجام آزمایش

4

HPCتعريف و اهميت شود كه براي رشد ني��از هایی گفته می اصطالح هتروتروف به ميكروارگانيسم

ه��ا را ها، مخمرها وكپك انواعی از باكتريها ميكروارگانيسمبه كربن آلي دارند. اين شود. شامل می

ی كش��ت س��اده ب��راي بازي��افت اين دس��ته از ه��اي مختلفي ب��ر پ��ايه آزمايش ه�ا ش�مارش ش�ود ك�ه ب�ه مجم�وع آن ها از آب در نظر گرفته مي ميكروارگانيسم HPCه��ای اين واژه گردد. بنابر اطالق ميHPCهای هتروتروف و يا ميکروارگانيسم

باشند . و هتروتروف مترادف نمي هوازی اختی��اری های هوازی- بیي یی از باکتر های هتروتروف، مجموعه باکتری

( بقی��ه گ��رم منفی ب��وده وBacillus و Microcoucus)هس��تند ک��ه ب��ه ج��ز دو جنس آن ،Aeromonas ، Klebsiellaه��ای جنس Flavobacterium، Proteus، Enterobacter،

Moraxella، Alcaligenes، Citrobacter، Pseudomonas،Serratia و Acinetobacterرا Enterobacterه����ای ه����ای غ����الب این مجموع����ه، باکتری ش����وند. جنس ش����امل می ،

Flavobacterium، Pesudomonas،Serratia و Acinetobacterهای هستند. عالوه بر جنس Mycobacteriumه���ای مهم در پزش���کی نظ���یر ی���اد ش���ده، ب���رخی از باکتری ،

Staphylococcus و Serratiaه��ای ه��تروتروف ممکن اس��ت ن��یز در ت��رکیب باکتری حضور داشته باشند.

ه�ای ه�تروتروف س�اکن ط�بیعی ب�دن انس�ان و حیوان�ات هس�تند و از باکتری ه��ای ب��اران و ح��تی شوند. برگ درختان، خ��اک، آب، قطره طریق مدفوع دفع می

ان��د. ه��ر اینچ ها را در خود ج��ای داده بزاق دهان نیز تعداد معتنابهی از این باکتری ه��ای ه��تروتروف اس��ت. مربع از پوست سالم انسان، میزبان صدها هزار باکتری

یی و غش��ایی، های ماسه ه��ا، ص��افی ها در بسترهای کربن فعال، رزین این باکتری ها، مخ��ازن تحت فش��ار و ح��تی ج��دار کنن��ده های توزی��ع و اج��زای آن، خنک ش��بکه ه��ا ب��ر کیفیت آب و های آب وجود داشته و اث��ر ناش��ی از تغی��یر جمعیت آن بطری

کند. تغییر می10تأسیسات آب رسانی با ضریب وجود ندارد. روش شمارشHPCی جهاني براي شمارش روش يكسان شده

HPCهاي مختلف آزم��ايش اس��ت ك��ه نت��ايج متن��وع شامل انواع وسيعي از حالت ی درجه40 ت���ا 20ی دم���اي آزم���ايش از . دامنه کند كيفي را تولی���د می كمي و

روز متغير است . 7سیلسوس و زمان انكوباسيون از چند ساعت تا هاي كم ت��ا مق��ادير ب��االي م��واد غ��ذايي متف��اوت اي نيز از حالت شرايط تغذيه

توانن��د در ش��رايط خ��اص هاي فعال مي با شند. تنها بخشي از ميكروارگانيسم مي رشد كرده و تشخيص داده شوند .HPCتنظيم شده براي آزمايش

ه��ای ه��تروتروف ب��ه ن��وع ی باکتری ب��ه ط��ور کلی تع��داد ش��مارش ش��ده کشت، زمان و دمای انکوباسیون و سرانجام روش کشت بستگی داشته و محیط

یابد. ها افزایش می ی آن با افزایش دما و زمان انکوباسیون، تعداد شمارش شده ت��ا10 از کمتر از Bitton(1999های توزیع بنابر نظر ) در شبکه ها تعداد این باکتری

ی اعالم انجمن کاره�ای آبی ای�االت لیتر و بر پ�ایه کلنی در هر میلی104بیشتر از متغیر است.cfu/mL 105( تا AWWAمتحده )

رشد ميكروبي در آب ها معموال در آب وسطوح مرتبط با آب در حالت بيوفيلم )اليه رگانيسما م�يکرو

ها در آب آش��اميدنی تص��فيه کنن��د. ب��ه رش��د ميکروارگانيسم ی زيستی( رش��د مي ه��ا شود. به طور کلی مواد غذایی م��ورد نی��از باکتری شده "رشد مجدد" گفته مي

ی رش��د میک��روبی در (، عام��ل مح��دود کنن��دهAOCبه ویژه کربن آلی قابل جذب)5

ها در غلظت های کمتر های آب شهری محسوب شده و رشد اغلب باکتری شبکه ش��ود و این در میکروگرم بر لی��تر ک��ربن آلی قاب��ل ج��ذب متوق��ف می10-15از

E.coli ه��ای های گروه کلیفرم به ویژه باکتری حالی است که باکتری ، E.cloacaea و K.pnenumonac وE.aerogenesهای بسیار کم�تر در غلظتAOCن�یز ق�ادر ب�ه رش��د

هستند. بآ نمونه ه��اي در HPCها معم��وال ب��ا مق��ادير ب��االی رش��د ميکروارگانيسم

،ه��ايی ک��ه جري��ان آب کم است در لوله HPCگ��ردد. مق��ادير ب��االی ميمش��خص گير هايی مانند سختی های بطری شده، مجاری دستگاه داخلی منازل ، آبمجاري

، رویدهند های خودک��ار ک��ه ب��ا پ��رداخت پ��ول، آب تحوي��ل مي و ص��افي دس��تگاه مان��ده ی گندزدای باقي دما ، در دسترس بودن مواد غذايی، کاهش مادهدهد. می

رسانی هستند. م��واد مغ��ذی ممکن های آب سه عامل اصلی رشد مجدد در شبکه ق��رارها رگانيسما م���يکرواست از خود آب و يا مواد در تماس ب��ا آب در اختی��ار

ه��ای ه��تروتروف را چ��نین اعالم ي شرایط مناسب برای رشد باکترAWWAگیرد. کرده است:

AOC میکروگرم بر لیتر 50 بیشتر از ی سیلسیوس درجه10دما بیشتر ازگرم بر لیتر میلی2/0ی آزاد کمتر از مانده کلر باقی

در مديريت آبHPCکاربرد ، در یازدهمین کنفرانس پزشکان آلم��ان در ب��رلین، راب��رت کخ1883در سال

های هتروتروف در آب، خاک برای نخستین بار چگونگی شمارش میکروارگانیسم به عنوان شاخص عملکردHPCو هوا را توضیح داد. پس از آن به تدریج شمارش

س��ازی م��ورد اس��تفاده ق��رار گ��رفت. در ی آب ، به وی��ژه صاف های تصفیه فرآیند ب��ه عن��وان ش��اخص آل��ودگی E.Coliق��رن بیس��تم ب��ا رواج تع��یین مق��دار ب��اکتری

در تعیین سالمت میکروبی آب ک��اهش ی��افت. ب��اHPCمدفوعی آب، استفاده از ب��ه عن��وان ش��اخص مکم��ل در بس��یاری از کش��ورهاHPCگیری این ح��ال ان��دازه

ی توزیع از سه نظر ها در شبکه همچنان ادامه یافت. تغییرات جمعیت این باکتریحایز اهمیت است:

های لزج چسبنده ) شناختی: ایجاد طعم و بو، تغییر رنگ، ایجاد و رشد الیه زیباییSlime)

گذاری و کاهش آبدهی اقتصادی: نظیر خوردگی، رسوبزایی های هتروترف شاخص سالمت میکروبی از نظر بیماری زایی: باکتری بیماری

زا و گروهی دیگر از آن بیماری E.coli O157:H7ها نظیر نیستند. ولی برخی از آن ه��ای پوس��تی و ری��وی و آئرومون��اس عام��ل ه��ا)س��ودوموناس عام��ل عفونت

ه��ا در آب طلب هس��تند و از این رو ف��راوانی این باکتری گاس��تروآنتریت( فرصت اند و ی��ا های ش��دید ش��ده تواند سالمت افرادی که دچ��ار س��وختگی آشامیدنی می

تحت درمان با کورتیکوستروئیدها قرار دارند، افراد مبتال به بیماری سندرم نقص ی ایمنی )ایدز(، نوزادان، سالخوردگان و زنان ب��اردار ک��ه همگی اکتسابی سامانه

شوند را به مخاطره اندازد. پذیر محسوب می ی افراد آسیب در زمره

در مديريت آبHPCموارد مهم کاربرد های هتروتروف ب��ه عن��وان ش��اخص س��المت میک��روبی کم��تر هر چند باکتری

ی کننده ه��ا، مش��خص ان��د، ام��ا ش��مارش و تع��یین مق��دار این باکتری م��ورد توجه6

ی ی آب و تأسیس��ات ش��بکه های تص��فیه چگونگی عملکرد و شاخص کنترل فرآیندشود و در موارد زیر کاربرد دارد: توزیع محسوب می

ی آب)انعقاد، گندزدایی( ارزیابی کارآمدی فرآیندهای تصفیهکنترل کیفیت میکروبی آب تصفیه شده در مخازن و شبکهتعیین نیاز و یا عدم نیاز به شست و شوی شبکه و مخزنتعیین کارآمدی شست و شوی شبکه و مخزنتعیین وقوع و میزان رشد میکروبی در تأسیساتی توزیع تعیین احتمال وقوع رشد مجدد در شبکههای بطری شده تعیین کیفیت آب

شمارش ميکروارگانيسم هتروتروف اين تحت عن��وان ( ك��ه پيش ازHPCهای هتروتروف ) شمارش ميکروارگانيسم

ش��د، روش��ي اس��ت ك��ه توس��ط آن تع�داد ش��مارش پليت اس��تاندارد ش��ناخته مي ج��زء تغي��يرات كيفي ب��ه گيري ش��ده و هاي هتروتروف زنده در آب ان��دازه باكتري

گ��ردد. ي��ا كيفيت آب اس��تخرهاي ش��نا بررس��ي مي توزي��ع آب و هنگ��ام تص��فيه و اي، توانن��د ب��ه ص��ورت دوت��ايي، زنج��يره هاي مورد مطالع��ه ب��ا اين روش مي كلني

ی ان��واع آن تحت عن��وان واح��دهاي يا منف��رد تش��كيل ش��وند ك��ه همه اي و خوشه ش��وند. ش��مارش نه��ايي ب��ه مق��دار م��وثر ( ناميده ميCFU كلني) يتشكيل دهنده

ای بای��د انتشار كلني بستگي دارد، از این رو روش كار و محي��ط كش��ت ب��ه گ��ونه گ��ذاري انتخاب شود كه به تواند بيشترين تعداد كل��ني را در م��دت معي��ني از گرما

عمل سه روش و چهار نوع محيط كشت مناس��ب ش��رح توليد كند. در این دستورشود. داده مي

انتخاب روش Pour plate

هاي هايي از نمونه يا حجم تواند براي حجم اي است كه مي ی ساده شيوه ه��اي ليتر باشند ب��ه ك��ار رود. كلني ميلي1/0-�� 2اي از آن كه در حدود رقيق شده

ند و به عكس انواع كش��ت اتشكيل شده در اين روش به نسبت كوچك و فشرده شده روي سطح، تمايل چنداني به نزديك شدن به يكديگر ندارند. از سوی ديگ��ر

ور در محي�ط كش�ت اغلب داراي رش��د كن��دتري ب�وده، برداش�تن هاي غوطه كلني كشت، ني��از ب��ه ها مشكل است. در اين روش براي حفظ دماي محيط وانتقال آن

باشد. در هر حال احتمال بروز شوك ح��رارتي حمام آب با دماي كنترل شده مي ه��ايي ك��ه ب��ا آگ��ار ذوب ش��ده ب��ا هاي موجود در نمونه آني و زودگذر براي باكتري

گردند، وجود دارد . ی سلسیوس مخلوط می درجه45- 46دمای

كشت سطحي( Spread plate) ه��ايي ك��ه روي س��طح اين روش م��وجب ش��وك گرم��ايي نش��ده و تم��ام كلني

هاي ه��وا توانند به سادگي از ذرات ديگر و يا حباب كنند مي محيط كشت رشد مي ت��وان ب��ه ه��ا را مي های تکميلی، كلني متمايز گردند. در صورت نياز برای بررسی

سرعت جدا كرد و انتق��ال داد و ب��ه آس��اني شناس��ايي نم��ود. مش��كل اص��لي اين روش كم بودن حجم نمونه يا نمونه ی رقيق شده نسبت به آگار مصرفي اس��ت.

ليتر باشد. ميزان دقيق نمونه، بستگي ب��ه ميلی1/0-5/0در اين روش حجم بايد 7

ی ك��افي ها دارد. به هنگ��ام ك��ار ب��ا اين روش ب��ه ان��دازه ی آماده كردن پليت نحوهپليت حاوي آگار از پيش باید آماده شده باشد.

( صافي غشايي( Membrane filter هاي آب با حجم زي��اد و ك�دورت كم و معم��وال ب��راي این روش در مورد نمونه

رود. اين ( به كار ميCfu/mL 10-1هايي با احتمال شمارش کم كلني)كمتر از آب هاي غش��ايي ی ص��افي ی آن برای تهيه کند و هزينه روش شوك گرمايي ايجاد نمی

ش��مرده اس��ت. از ديگ��ر مش��كالت اين روش كوچ��ك ب��ودن بیشتر از دو روش بر ی س��فيد ب��رای مقاب��ل زمينه سطح محي��ط كش��ت، اس��تفاده از ن��ور برگش��تي در

آم��يزي مناس��ب هاي رنگي ي��ا رنگ ه��ا )در ص��ورتی ک��ه از ص��افي بررس��ي كلنيهاي غشايي است. استفاده نشود( و احتمال تغيير در كيفيت صافي

محل كار يك ميز يا سكوي مسطح با فضاي كافي و اتاقي با نور مناسب ، فضاي آزاد و تميز يا هود المينيار تهيه كنيد. قبل از انجام آزم��ايش، م��يز ي��ا س��كوي ب��ا س��طح

زدايي كنيد. بدون خلل و منفذ را گند

برداري نمونه پيش از ب��روز برداري و ترین زم��ان پس از نم��ونه شروع آزمايش باید در كوتاه

تغييرات هر چند جزيي در جمعيت ميكروبي انج��ام ش��ود. بيش��ترين م��دت زم��ان س��اعت ب��راي انتق��ال6 س��اعت )ح��داكثر 8برداري و آزم��ون مج��از بين نم��ونه

باش��د. ساعت برای انجام آزمايش در آزمايش��گاه( مي2ها به آزمايشگاه و نمونه ه��ا را بای��د چنانچه امكان انجام آزمايش در اين مدت وجود نداش��ته باش��د ، نمونه

ی سیلس��يوس در يخچ��ال ب��دون اين ك��ه يخ بزنن��د، درجه4در دم��اي كم��تر از برداري وآزم��ايش ی زماني بين نم��ونه نگهداري کرد. در هر صورت حداكثر فاصله

ساعت شود.24نبايد بيشتر از

ها سازي نمونه آماده ه��ای الزم قب��ل ها و هرگون��ه مفروض ها، رقت ها را براساس تعداد نمونه پليت

ت�وان دو از آزمايش، آماده كنيد. براي حجمي ازنمونه يا رقت م�ورد آزم�ايش مينوع پليت تهيه كرد.

اي س��ترون )ب��ا براي روش پورپليت يا كشت سطحي باي��د از ظ��روف شيشه س��ازی ب��اال مربع( و يا از ظروف پالستيكي با سترون متر سانتی65سطح مقطع

متر مربع( استفاده كرد. سانتی57)با سطح مقطع ب�ار تك�ان دادن ب�ه25ه�ا را ب�ا ی آن هاي رقي�ق ش��ده ها يا حجم ی نمونه همه

پایين )يا جلو و عقب( كامال مخلوط كني��د. از دس��تگاه ش��يكر ب��رای صورت باال وتوان استفاده کرد. ثانيه نیز می15ها به مدت ها يا رقت تكان دادن نمونه

محيط كشتplate count agar ( Tryptone glucose yeast agar)

8

شود. در استفاده مي Spread Plateو pour plate اين محيط کشت براي روش گ��رفت، اين محيط كشت غني شده که در گذشته بيشتر مورد استفاده قرار مي

آگ��ار ش��مارش NWRI و ي��ا R2Aه��ای كم��تري نس��بت ب��ه محی��ط کش��ت کلنی ی سلس�یوس درجه121شوند. پس از اتوكالو كردن محيط کش�ت در دم�ای می

باشد. 7 ± 2/0 آن بايد حدود pH دقيقه، 15به مدت

mHPC Agar اين محيط كشت که حاوی مواد مغذي بيشتري است فقط در صافی غش��ایی

مورد استفاده قرار می گیرد.?ب مقط��ر مخل��وط کنی��د. در ص��ورت نی��از را ب��اpH پودر محیط کشت را ب��ا آ

NaOH 1 تنظیم کنی��د و در ح��رارت مالیم بجوش��انید ت��ا ک��امالً ح��ل1/7 نرمال در ی سیلسيوس به مدت دمای درجه121شود. سپس گلیسرول اضافه کنید و در

دقیقه اتوکالو کنید.5

R2A Agar شود. اين استفاده مي Spread Plateو pour plate اين محيط کشت براي روش

محيط كشت با مواد مغ��ذي كم، ش��مارش كل��ني بيش��تري را نس��بت ب��ه محي��طدهد. كشت با مواد مغذي زياد نشان مي

pHرا با محلول K2HPO4 يا KH2PO4 جامد قب��ل از اض��افه ك�ردن آگ�ار در ح�د 121 تنظيم کنید. براي حل شدن آگار، محيط كشت را ح��رارت دهي��د و در 2/7

دقيقه سترون کنید.15ی سلسیوس، به مدت درجه

(HPCA )NWRI Agar membraneو pour plate ، spread plate از اين محيط كشت براي روش های

filter شود . اين محيط كشت با مواد مغ��ذي كم، ش��مارش كل��ني استفاده مي ده��د و ب��ه ش��كل بيشتري را نسبت به محيط كشت با مواد مغذي زياد نشان مي

باشد و بايد از مواد اوليه تهي��ه ش��ود. ب��ه این دلي��ل آماده و بدون آب موجود نمي ها اغلب تمایل كمتري به استفاده از آن دارند. قبل از ات��وكالو کارکنان آزمایشگاه

محی��ط راpHی سیلس��یوس، درجه121 دقيق��ه و در دم��ای 15كردن به م��دت تنظيم کنید. 2/7حدود

گذاري( انكوباسيون )گرما يب��راي تص��فيه EPA براي مطابقت با اهداف پ��ايش، تحت عن��وان ق��انون

35ه��ا را در دم��اي ه��اي ه��تروتروف، پليت ه��اي س��طحي مرب��وط ب��ه باكتري آب ماه��ايها و د صورت از بين زمان گذاري كنيد. در غير اين ی سلسیوس گرما درجه

يك��ه دوره ط��وريه د، ب��كنيپيشنهاد شده در پايش تغييرات كيفي آب ، استفاده ی درجه20-28 روز در دم���اي 5-7ه���اي كش���ت ش���ده از گ���ذاري نمونه گرما

سیلسیوس خواهد بود.)ب��ه جهت يكن��واخت س��ازي روش گرما گ��ذاري و همچ��نين امكان مقايس��ه نت��ايج ب��ه دس��ت آم��ده در س��طح كش��ور و ب��ا توج��ه ب��ه تج��ربه ي

ش��بكه هاي آب آش��اميدني توص��يهHPCشركت هاي آب و فاض��الب در ان��دازه گيري 8 بن��د ش��ماره ي 18مي شود گرما گ��ذاري مط��ابق روش درج ش��ده در ص��فحه ي

انجام شود.

9

ك��ه ط��وريه رطوبت داخل دستگاه انكوباتور را ب�� در طول مدت گرماگذاري، درصد نداش��ته باش��د، نگه��داري كني��د.15ها كاهش وزني رطوبت بيشتر از پليت

گ��ذاري ط��والني م��دت اس��تفاده اين موض��وع ب��ه وي��ژه ب��راي زم��اني ك��ه از گرما شود، خيلي اهميت دارد. قرار دادن يك ظ��رف آب در عم��ق انكوب��اتور ممكن می

ش��دنزدن ي��ا اكسيد ي��د ك��ه از زنگكنتوج��ه .اس��ت ب��راي اين ك��ار ك��افي باشد ی ب��اال زنگ ب��ا درجه ها بايد از استيل ضد ديواره.هاي داخلي جلوگيري شود ديواره

ه��ا را در يا آلومينيوم آندي شده باشند. براي انكوباتوره��اي ب��دون رط��وبت، پليتيد.كنهاي پالستيكي بسته بندي كيسه

شمارش و ثبت نتايج ه��ا را انج��ام بالفاصله پس از اتمام م��دت زم��ان گرماگ��ذاري، ش��مارش كلني

س��اعت24ها را حداكثر تا توانيد پليت پذير نباشد مي دهيد. چنانچه اين كار امكان ش��ود ت��ا ی سیلسيوس دريخچال نگهداري کنید. توص��یه می درجه5-10در دماي

حد ممکن از انجام اين عمل اجتناب كنيد. ی ش��اهد هم ثبت ها بايد نتيجه هنگام گزارش نتيجه حتي براي تعداد كم نمونه

توانيد از دستگاه كل��ني شود)وجود شاهد ضروري است(. براي ثبت شمارش ميشمار به جاي شمارش دستي كمك بگيريد. ه��ا ، حجم برداش��ت ش��ده س��ازي پليت توجه داشته باشيد كه به هنگ��ام آماده

300 ت��ا 30توسط پيپت را طوري انتخاب كنيد كه براي ش��مارش نه��ايي، ح��دود كلني در هر پليت تشكيل شده باش��د. ه��دف اين اس��ت ك��ه ح��داقل در ي��ك پليت

ی یاد شده را ش��مارش دامنه ها در ی رقيق شده، به توان تعداد كلني حاوي نمونهکرد.

ليتر نمونه را كشت ندهيد، مگ��ر ميلي2است بيشتر از به طور معمول بهتر ع��دد باش��د ك��ه در اين30ليتر نمونه كم��تر از ميلی2هاي حاصل از اين كه كلني

ه��ا را بش��ماريد. ب��ه ج��ز م��وارد ی ب��اال، تم��ام كلني صورت بدون توجه به توص��يه كل��ني را ب��ه حس��اب آوري��د.30-300هاي حاوي استثنا، در ساير موارد تنها پليت

ه��ا در ها در هر پليت نتيجه را ب��ه ص��ورت تع��داد باكتري پس از شمارش كل كلنيليتر نمونه درج کنید. ميلي

براي محاسبه بايد تعداد كلني در هر پليت را تعيين كرده و باتوج��ه ب��ه ض��ريبگزارش شود . Cfu/mLسازي نمونه در آن پليت نتيجه بر حسب رقيق

كل�ني نداش�ت و300 ت�ا 30ها ، هيچ ك�دام شمارش�ي بين چنانچه در ميان پليت هايي ب��ا ی شمارش پليت كلني بود از نتیجه300ها حاوي بيش از تعدادي از آن

در محاسبه استفاده كنيد. 300ترين عدد به نزديكها با ضرايب رقت گوناگون، رشد كلني مشاهده نش��د، اگر در هيچ يك از پليت

اي با كمترين ض��ريب ی آزمايش را به صورت كمتر از يك كلني در نمونه نتيجه ی رقي��ق چ��ه در پليت ح��اوي نم��ونه رقت محاسب كنيد به عن��وان مث��ال چن��ان

100 هيچ كلني شمارش نشد، نتيجه به صورت كم��تر از 01/0شده به نسبت شود. گزارش ميCfu/mL 100 )> )لیتر در میلی

اس��ت،300اگر در مواردي شمارش كلني در ه��ر پليت ب��ه م��راتب بيش��تر از گزارش نكنيد.(TNTC)نتيجه را به شكل بسيار بيشتر از حد قابل شمارش

متر مرب��ع ب��ود، كل��ني ب��ر س��انتي10ها در واحد سطح كمتر از اگر تعداد كلني مرب��ع ) دس��تگاه ش��مارش کل��نی( ك��ه توزي��ع13ه��اي رش��د ك��رده در كلني

7را داشته باشد بشماريد. بهتر اس��ت در ص��ورت امك��ان ها يكنواختي از كلني

10

مربع متوالي در جهت عمودي انتخاب كني��د و6مربع متوالي در جهت افقي و توجه داشته باشيد كه ي��ك مرب��ع را دو ب��ار ش��مارش.دكنيرا شمارش ها كلني

متر مرب�ع ی�ک س��انتي13ه�اي ش��مارش ش��ده در نكنيد. س�پس مجم�وع كلني متر مرب��ع س��انتي65ها در س��طح ضرب كنيد تا كل كلني5مربعي را در عدد

پلیت محاسبه شود. متر مرب��ع ب��ود، کلنی ب��ر س��انتي10ها در واحد سطح بيشتر از اگر تعداد كلني

ه��ا را در واح��د فقط چهار مربع را انتخاب و ش��مارش ك��رده و مي��انگين كلنيمتر مربع ( محاسبه كنيد. اين عدد را در ض��ريب مناس��بي ) سطح )یک سانتي

اي( ضرب كني��د ت��ا براي انواع شيشه65بار مصرف و های يك براي پليت57 ها در سطح پليت به دست آيد. كل كلني

متر مربع بيش��تر باش��د، نتيج��ه را کلنی در ساتني100هنگامی كه شمارش از ه��اي < )ب��راي پليت5700اي( و ه��اي شيشه < )براي پليت6500به صورت

گزارش كنید. Cfu/mLيك بار مصرف( بر حسب هاي گس��ترش يابن��ده ها با كلني اگر هنگام بررسي پليت( SPREADERS)مواج��ه

ه��اي تش��كيل ش��ده ك��امال ها را شمارش کنید ك��ه كلني شدید، زمانی اين كلني ه��اي مشخص و يكنواخت توزي��ع ش��ده باش��ند و س��طح پوش��يده ش��ده از كلني

گسترش يابنده، بيش از نيمي از كل پليت را اشغال نكرده باش��د. در ص��ورت هاي گسترش يابنده، هر يك از ان��واع زي��ر ب��ه عن��وان ي��ك واح��د شمارش كلني

شود . كلني در نظر گرفته می ( بين آگ��ار و ك��ف پليت رش��د ك��ردهFilm ی ن��ازك ) كلني كه به ص��ورت ي��ك اليه.1

باشد. ی ب��اكتري ب��ه ی يك توده ی تجزيه ها كه به نظر رسد در نتيجه اي از كلني زنجيره.2

هنگام مخلوط كردن آگار و نمونه به وجود آمده باشد . ی آگ�ار ي��ا روي س��طح آگ�ار ی ن��ازك از آب در لبه كلني كه به ص�ورت ي��ك اليه.3

رشد كرده باشد . اي كه كلني گس��ترش يابن��ده گاهی بر اثر تجمع رطوبت از نقطه2 و 1موارد

ه��ا اغلب بيش از آين��د. اين گون��ه كلني در آن تشكيل شده است ب��ه وج��ود مي نيمي ازسطح پليت را پوشانده و كار شمارش قابل اطمينان و صحيح پليت را

کنند. مشكل میهاي مستقل و مشابه نزديك ب��ه هم و ن��ه ها به ترجیح كلني براي شمارش كلني

ترين كلني باشد ها حداقل برابر قطر كوچك ی بين آن به هم چسبيده، كه فاصلهكنيد. را انتخاب

اي كه از نظر شكل ظاهري و يا رنگ متفاوت هس��تند، هاي به هم چسبيده كلني ه�اي گس�ترش ه�ا داراي كلني ش�وند. اگ�ر پليت به صورت مستقل شمارش می

گزارش كنيد.SPR (Spreaders)ها را به صورت بيشتري باشند، آن ييابندهها به داليلي نظير عدم آگاهي از م��يزان رقت، ي��ا ريختن اتف��اقي و چنانچه پليت

قابل شمارش ب��وده و ي��ا محي��ط کش��ت كن��ترل ) ش��اهد( عالئمي از آلودگي غير Laboratory)ی آزمايش��گاهی آل��ودگي نش��ان داد، نتيج��ه را تحت عن��وان: ح��ادثه

Accident.و يا خطاي آزمايشگاهي گزارش کنید ) .

ی آزمايش محاسبه و گزارش نتیجه11

ه��اي آزم��ايش ی روش در همه(CFU)كل��ني ي هاي تشكيل دهنده ی واحد واژهHPCه��ا باي��د ب��ه روش م��ورد شود. از این رو در هنگ��ام تكمي��ل فرم استفاده می

گذاري و نوع محيط كشت مورد اس��تفاده در قس��مت استفاده، دما و زمان گرما ی درجه35، روش پ��ورپليت ، دم��ای Cfu/mL توض��یح، اش��اره ک��رد. ب��راي مث��ال

ی ش��مارش پليت، ساعت و آگار ش��مارش پليت. ب��راي محاس��به48سیلسیوس، هاي دوت��ایي از ي��ك ها )در مورد پليت هاي شمارش شده و يا ميانگين آن كل كلني

ضريب رقت يكسان( در هر پليت در عكس ضريب رقت ضرب مي شود. س��ازي ه��اي ب��ا ض��رايب رقيق هاي دو تایي يا در پليت هاي در پليت وقتي كلني

دار ) دو رقم شوند، به�تر اس�ت نت��ايج ابت�دا ت��ا دو رقم مع�ني متوالي شمارش مي گزارش شود. ب��راي مث��ال ع��دد Cfu/mL سمت چپ( گرد شده سپس به صورت

35 به همان ش��كل 35عدد و160 به صورت 155 و عدد 140 به صورت 142گزارش شود.

HPCمراحل انجام آزمايش ی پيپت به پليت س��ترون ی رقيق شده كه به وسيله مقداري از نمونه يا نمونه

اضافه شده و سپس محي��ط كش��ت آگ��ار م��ذاب اض��افه ش��ده و پس از مخل��وطگذاري شده و شمارش شود. شدن بايد سرد و منجمد گردد سپس گرما

وسايل و مواد زير توضيح داده شده است فهرست وسايل و مواد مورد نياز در

اتوكالو ی دماس��نج ی سیلسیوس. دما به وسيله درجه35±�� 5/0انكوباتور با دمای ثابت

NBCگزارش شود . دقيق به طور مرتب كنترل و داشتن ی سیلسیوس برای گرم نگه درجه44-46بن ماری تنظيم شده در دمای

م��تر س��اخته ميلی100×15 ب��ا قط��ر داخلی ونهای ستر ديش)پليت( آگار. پتریشده ازجنس شيشه يا پالستيك .

هاي سترون پيپتTDيا موهر مخصوص كشت باكتريولوژيكي از جنس شيشه يا مشخص . پالستيك با حجم

لي��تر، ب��ا خط��وط ميلی99گ��ذاری ش��ده ت��ا حجم دار عالمت ه��اي درپيچ بطري كشي برجسته. خط

( چراغ گازيBunsen )سازي سترون )محلول بافر فسفات( بافر رقيق

ی محيط كشت تهيهی محيط كشت بايد مورد استفاده قرار گيرد: مراحل زیر درتهيه

، محيط كشت را بر اساسR2A يا plate count agarاستفاده از پودر خشك .1ی سازنده بر روي قوطي آن تهيه كنيد . عمل كارخانه دستور

مقدار توصيه شده از محيط کشت خشک)پودری( را وزن کنيد..2آب مقطر به مقدار الزم به آن اضافه كنيد..3د.شوها را در حال هم زدن حرارت دهيد تا کامال حل محيط كشت.4 ليتر در هر لوله متناس��ب ب��ا حجم ميلي20 تا 15ها ) ها را در لوله محيط كشت.5

دار توزيع كنيد . های درب پيچ پليت مورد استفاده( يا به مقدار زياد در فالسكمحيط هاي كشت توزيع شده در لوله ها در اتومكال و سترون شود..6ها را سرد كرده و در يخچال نگهداري كنيد. محيط.7

12

تاريخ تهيه برچسب بزنيد. با ذكر نام و.8

سازي آگار آمادهی آگار بايد انجام شود: مراحل زیر برای تهيه

ی گرماي حاصل از جوش��يدن آب ، ذوب محيط كشت حاوي آگار را به وسيله.1 ها نبايد بيش��تر از زم��ان الزم در دم��ای (. محيط كشت1ی كنيد)شکل شماره

ذوب بمانند. توجه شود که محيط كشت آگار تهيه شده فق�ط ي�ك مرتب��ه باي�دذوب شود.

ی درجه44-46 محيط كشت آگار مذاب را داخل آب با ح��داقل دم��اي ح��دود .2 (. نبايد محيط كش��ت آگ��ار ن��واب2ی سیلسیوس نگهداري كنيد)شکل شماره

ساعت در اين دما نگه داشته شود. 3بيش از

ی ذوب شدن محيط كشت آگار : تصوير تجسمی نحوه1ی شكل شمارهها در لوله

ی دست : تصوير تجسمی چگونگي کنترل دما ، به وسيله2ی شكل شماره

13

سازي رقت آماده رقت صحيح را براساس منبع برداشت نمونه و نتايج قبلي آن انتخاب كنيد .

ليتر بدون رقت و برای ميلی1/0 -1ی توزيع مقدار هاي آب در شبکه براي نمونه-1های برداشت شده از آب خام و يا جريان آب در فرايند تصفيه مقدار نمونه(.3ی د)شکل شمارهشوهاي صد بار رقيق شده استفاده ليتر از نمونه ميلی1/0

HPCهای رايج در آزمايش : سری رقت3ی شكل شماره

آماده سازي پليت ها مراحل زیر به ترتيب بايد انجام شود : براي آماده كردن پليت

ها را چيده وعالمت گذاري كنيد. ابتدا در يك محل مناسب پليت.1 برای يك سري نمونه، يک پليت شاهد، دو پليت با شرايط يكسان براي تلقيح يك

نمونه و يک پليت كنترل مثبت تهيه كنيد. سازی سترون را به ليتر از آب رقيق براي كنترل كردن شرايط سترون، یک ميلی

پليت حاوي محيط كشت آگار ذوب شده اضافه و كامال مخلوط کنید. سازی را پليت كنترل)شاهد( سترون بودن پيپت ، محيط كشت آگار وآب رقيق

نشان خواهد داد.ها مرتب كنيد. ها و رقت ها را بر اساس نمونه پليت.2 ها و افزون ها را قبل از برداشتن حجم معيني از آن ها و رقت هريك از نمونه.3

هاي خالي سترون، به شدت تكان دهيد. ها به پليت آنهاي مدرج براي برداشتن نمونه يا رقت استفاده كنيد. از پيپت.4

درجه در كف پليت يا در قسمت45ها را با زاويه ی ی نمونه، پيپت هنگام تخلیهداخلي گردن

سازي نگهداريد. هنگام قرار دادن پيپت، درب پليت را هاي مخصوص رقيق بطري ليتر ي یک ميلی ثانيه زمان برای تخليه4تا 2ي كافي باال بگیريد. حدود به اندازه

(.4ی اي در كف پليت الزم است)شکل شماره نمونه به صورت قطره14

هاي سترون مجزا استفاده كنيد. براي هر يك ها از پيپت براي هر يك از نمونهها دو پليت با شرايط يكسان تهيه كنيد ها و رقت از نمونه

: تصوير تجسمی روش صحيح گرفتن پيپت در4ی شكل شمارهدست و برداشتن درپوش پليت

با استفاده از دماسنج دماي محيط كشت را قبل از اين كه با نمونه مخلوط.5شود کنترل كنيد.

ها محيط کشت مذاب را ها در هر سری از پليت بعد از اضافه کردن نمونه.6 ها (. تعداد نمونه5ی ها ريخته و با دقت مخلوط کنید )شکل شماره درون پليت

ی اولين رقت تا اضافه نمودن به آخرين را طوري انتخاب كنيد كه زمان تهيه دقيقه( نباشد. برای جلوگيري از10 دقيقه )به ترجیح20پليت بيشتر از هاي هاي مربوطه )شرايط آسپتيك( الزم است. زماني كه لوله آلودگي، احتياط

محتوي محيط كشت حاوي آگار مذاب را از داخل ظرف آب برداشتيد بايد اي يا كاغذي خشك شوند. زیرا ممکن است ی پارچه ی حوله ها به وسيله لوله

ها به داخل پليت راه یافته و ايجاد آلودگي كنند. هنگامي كه آب اطراف لوله هاي خواهيد محيط كشت آگار مذاب را به پليت اضافه كنيد، درپوش لوله مي

ی خارجي لوله بر روي شعله قرار داده تا محتوي آگار را برداشته ولبهميكروارگانيسم هاي آن ازبين بروند.

ها ها، درپوش پليت هنگام اضافه كردن آگار مذاب موجود در لوله ها به پليت ی لوله به را فقط در يك جهت و به مقدار كافي به نحوي برداريد كه دهانه

ميلي ليتر محيط كشت حاوي آگار مذاب15تا 12آساني وارد پليت شود. حدود ها كه داراي مقدار مشخصي نمونه هستند، اضافه کنید. را به هر یک از پليت

15

: تصوير تجسمی روش صحيح اضافه كردن آگار مذاب به نمونه در5شكل شماره ی ها با رعايت شرايط سترون پليت

. محيط كشت تلقيح شده را به نحوي مخلوط کنید كه از آن بيرون ريختن7نشود. برای این کار توصیه

بار5 بار در جهت راست بچرخانيد و 5 بار پليت را در جهت چپ و 5می شود (. 6ی در جهت جلو و عقب حركت دهيد )شکل شماره

دقیقه صبر کنید تا محيط كشت مخلوط شده با نمونه جامد شود.10. حدود 8 48ی سلسیوس به مدت درجه35ها را وارونه كرده و در حرارت سپس پليت گذاري رطوبت درون گرم خانه را گذاري كنيد. در طول مدت گرما ساعت گرما

درصد رطوبت از دست ندهند. برای15ها بيش از طوری تنظیم کنيد تا پليت خانه کافی است. براي جلوگيري اين منظور قرار دادن يک طرف آب در ته گرم

ها بايد از استيل ضد خانه، آن هاي گرم هاي داخلي و طبقه از زنگ زدن ديوارهزنگ مرغوب يا آلومينيوم ساخته شده باشند.

ها ی چرخاندن پليت : تصوير تجسمی نحوه6ی شكل شماره

(plate Spread ) روش كشت سطحي ليتر از رقت مناسب ميلی5/0 يا 1/0ليتر از نمونه يا ميلی5/0 يا 1/0

نمونه به محيط كشت حاوي آگار جامد شده موجود در پليت اضافه كنيد.

16

ی تلقيح شده بر روي سطح محيط كشت را با يك نمونه ی اي سترون به صورت يكنواخت پخش كنيد. در اين روش همه ی شيشه ميله ها به ها بر روي سطح محيط كشت به وجود آمده و مانع از نفوذ كلني كلني

هاي گذاري در دما و زمان مناسب، كلني شود. پس از گرما داخل آگار مذاب ميها را بر روي سطح آگار شمارش كنيد . باكتري

ها بين محيط كشت و همچنين برروي سطح محيط در روش پور پليت، كلنيکنند. كشت حاوي آگار موجود در پليت رشد مي

وسايل و مواد ی روش پورپليت وسايل و مواد مورد نياز در روش كشت سطحي مشابه

شود. است. فقط يك ميله شيشه اي سترون به آن اضافه می هاي رقيق شده همانند روش سازي محيط كشت حاوي آگار، نمونه مراحل آماده

پورپليت است.

هاي حاوي محيط كشت آگار آماده سازي پليتهاي حاوي محيط كشت مراحل زير باید انجام شود: برای آماده سازي پليت

ها الزم هستند. برای جلوگيري از آلودگي برخي احتياط.1ها بريزيد. ليتر محيط كشت آگار مذاب را درون پليت ميلي20تا 2.15 پتری ديش را طوری بچرخانيد تا محيط ريخته شده در آن کف پليت را به.3

(.6پوشاند)شکل شماره ی قبل از جامد شدن محيط کشت پليت را حركت ندهيد..4 30 تا 15ها را بپوشانيد. برای خروج رطوبت اضافي به مدت درب پليت.5

دقيقه اندکی باز بگذاريد. وقتي كه سطح محيط كشت حاوي آگار خشك شد درب ظرف را ببنديد..6

روش انجام آزمايش ها مراحل زیر باید انجام شود: براي آماده سازي پليت

ها را به ترتيب چيده و عالمت گذاري كنيد . پليت شاهد، دوسري پليت پليت.1 ها تهيه براي هر نمونه مورد آزمايش ونمونه كنترل مثبت براي يك سري از نمونه

ميلي ليتر آب رقيق سازی سترون1/0كنيد. برای کنترل شرايط سترون از استفاده کنید. اين کار براي اطمينان از سترون بودن پيپت، آگار و آب رقيق

شود. سازي انجام ميها را رقيق سازی کنيد. نمونه.2ها را مرتب كنيد. ها پليت ها ورقت براساس نمونه.3 ها را قبل از اين كه با استفاده از پيپت به داخل پليت منتقل ها ورقت نمونه.4

كنيد به شدت تكان دهيد. ميلي5/0 يا 1/0چرخانيد، نمونه يا حجم رقيق شده ) در حالی که پليت را مي.5

ليتر( را با استفاده از پيپت روی سطح محيط آگار جامد بريزيد. اي ی شيشه ی تلقيح شده را بر روي سطح محيط كشت با استفاده از ميله نمونه.6

ی سترون به طور يكنواخت پخش کنید. اين کار با ثابت نگه داشتن ميله ی ای بر روي سطح آگار و حركت دادن پليت و يا با حركت دادن ميله شيشه ی شود. در اين روش همه اي بر روي سطح محيط كشت انجام می شيشهگيرند. ها بر روي سطح محيط كشت شکل مي كلني

17

ی تلقيح شده به طور كامل در محيط گذاري اجازه دهيد تا نمونه قبل از گرما.7كشت جذب شود.

ها را به ها را ببنديد، آن وقتي سطح محيط كشت آگار خشك شد درب پليت.8 گذاری های اختصاصی به مدت الزم گرما صورت وارونه براي انجام آزمايش

های مجزا بر روی گذاری در دما و مدت زمان مناسب، کلنی کنيد. پس از گرماشوند. سطح محيط کشت پديدار می

باشد. گذاري همانند روش پورپليت مي گرما.9

18