ตั�วอย่�างการเขี ย่นโครงการภาคน�พนธ์� ( Proposal )

โครงการภาคน�พนธ์�

เร��อง

การศึ�กษาฤทธ์��ย่�บย่� งเชื้� อแสตับฟิ%ลโลคอกค�สออเร ย่สท �ดื้� อย่าเมท�ซิ�ล�น

โดื้ย่เชื้� อแลคโตับาซิ ร�สสปี+ชื้ ย่�The study on inhibition of Methicillin-

resistant Staphylococcus aureus (MRSA) by Lactobacillus species

ผู้-.น/าเสนอโครงการ

นางสาวไพร�นทร� ก�นธ์�ย่ะเทพ50233040 นาย่ปีณิ�ธ์าน ร3�นบาง50232647

น�กศึ�กษาเทคน�คการแพทย่�ชื้� นปี+ท � 4ส/าน�กว�ชื้าสหเวชื้ศึาสตัร� มหาว�ทย่าล�ย่นเรศึวรพะเย่า

2553

ชื้��อโครงการ การศึ�กษาฤทธิ์��ยั�บยั��งเชื้��อแสตบฟิ�ลโลคอกค�สออเร�ยัสท��ดื้��อยัาเมท�ซิ�ล�นโดื้ยัเชื้��อแลค โตบาซิ�ร�สสปี%ชื้�ยั&(The study on inhibition of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) by Lactobacillus species)

ผู้-.เสนอโครงการ นางสาวไพร�นทร& ก�นธิ์�ยัะเทพ

นายัปีณิ�ธิ์าน ร, -นปีาง

อาจารย่�ท �ปีร�กษาโครงการ อาจารยั&ส�ทธิ์�ชื้�ยั ปี/ญญาใส

อาจารย่�ท �ปีร�กษาร�วม -

ความส/าค�ญและท �มาขีองปี7ญหาในปี/จจ,บ�นการดื้�� อยัาต2านจ,ลชื้�พในแบคท�เร�ยัก3าล�งเข้2าส5-ภาวะ

ว�กฤต ม�ผู้52 กล- าวว-า เราก3า ล� ง เข้2 าส5-ยั, คหล�งยัาปีฏิ�ชื้�วนะ (post

antibiotic era) น��นค�อยั,คท�� ไม-สามารถน3า ยัาปีฏิ�ชื้�วนะมาใชื้2ปีระโยัชื้น&ไดื้2อ�กต-อไปี การกล-าวเชื้-นน��ไม-เก�นความจร�ง เน��องจากในข้ณิะน��ม�แบคท�เร�ยัหลายัชื้น�ดื้ท��ม�การดื้��อยัาหลายัต�ว (multidrug

resistance, MDR) แบคท� เร�ยับางต� วม�การดื้�� อยัาท,กชื้น�ดื้ (panresistance) ดื้�งน��นในปี/จจ,บ�นเร��มม�การพบโรคต�ดื้เชื้��อท��ร �กษาไม-ไดื้2 (untreatable infectious disease) ท��ไม-ใชื้-เอดื้ส&เพ��มข้��นตลอดื้เวลา ผู้ลข้องการดื้��อยัาปีฎิ�ชื้�วนะข้องแบคท�เร�ยัม�ไดื้2ต��งแต-การท3า ให2อ�ตราปี<วยัส5งข้��นอ�ตราการตายัส5งข้��น ผู้52ปี<วยัต2องอยั5-ในโรงพยัาบาลนานข้��น เส�ยัค-าใชื้2จ-ายัมากข้��น จนถ�งเก�ดื้โรคท��ร �กษาไม-ไดื้2แล2ว

ซิ��งเก�ดื้จากการดื้�� อยัาท,กชื้น�ดื้ นอกจากน��นเก�ดื้การส5ญเส�ยัทางเศึรษฐก�จอยั-างมากจากผู้ลกระทบต-ออ,ตสาหกรรมการผู้ล�ตยัา เน��องจากการผู้ล�ตยัาปีฏิ�ชื้�วนะแต-ละชื้น�ดื้ใชื้2เวลาไม-ต3�ากว-า 5 ปี%และส5ญเส�ยัค-าใชื้2จ-ายัไม-น2อยักว-า 500 ล2านเหร�ยัญสหร�ฐ แต-เม��อยัาน��นไดื้2ร�บการน3ามาใชื้2โดื้ยัไม-ระม�ดื้ระว�ง อายั,ข้องยัาน��นจะส��นลงมากอยั-างน-าตกใจ(1) ปี/จจ,บ�นจ�งไดื้2ม�การชื้ะลอต�วข้องการพ�ฒนายัาปีฏิ�ชื้�วนะลงอยั-างมาก ดื้�งน��นปี/ญหาท��จะเก�ดื้ข้��นในอนาคตก?ค�อ การท��ม�เชื้��อท��ดื้��อยัามากข้��น ท3า ให2ม�ยัาปีฏิ�ชื้�วนะใชื้2น2อยัลง และผู้52ปี<วยัท��ม�การต�ดื้เชื้�� อแบคท�เร�ยัท��ม�การดื้��อยัาจะไม-ม�ทางร�กษา อ�ตราการปี<วยัตายัจากโรคต�ดื้เชื้��อแบคท�เร�ยัจ�งกล�บมาส5งข้��นอ�กคร��งหน��ง เปี@นการยั2อนเข้2าส5-ยั,คข้องก-อนการใชื้2ยัาปีฏิ�ชื้�วนะ (preantibiotic era) อ�กคร��งหน��ง ซิ��งเชื้��อแบคท�เร�ยัต�วหน��งท��ก-อปี/ญหาอยั5-ในปี/จจ,บ�นน��ค�อ Methicillin-

resistant Staphylococcus aureaus (MRSA) ก?ค�อเชื้��อ S.

aureus ท��พ�ฒนาให2ดื้�� อต-อยัาปีฏิ�ชื้�วนะกล,-มแลคแทม(2-4) เปี@นแบคท�เร�ยัต�ดื้ส�แกรมบวก เซิลล&ม�ล�กษณิะกลม ข้นาดื้เส2นผู้-านศึ5นยั&กลาง 0.7-1.2 ไมโครเมตร ส-วนใหญ-ม�การเร�ยังต�วเปี@นกล,-มคล2ายัพวงอง, -น (grapelike clusters) อาจพบเปี@นค5-หร�อสายัส��นๆ ไดื้2 โดื้ยัเฉพาะเม��อเล��ยังในอาหารเหลว เชื้��อน��ไม-ม� แฟิลกเจลลา ไม-เคล�� อนท��และไม-สร2าง สปีอร& อยั5-ในวงศึ& Micrococcaceae สก,ล Staphylococcus(1) ม�อยั5-ดื้2วยัก�นอยั-างน2อยั 20 species แต-ท��ม�ความส3าค�ญทางการแพทยั&ไดื้2แก- S. aureus, S. epidermidis

และ S. saprophyticus species ท��ม�ความส3าค�ญและก-อโรคในคนท��พบไดื้2บ-อยัค�อ S.aureus(2) ซิ��งพบในโรงพยัาบาลมากกว-าในชื้,มชื้น แต-ยั�งไม-ทราบว-าสายัพ�นธิ์,&เร��มแรกข้องเชื้��อ MRSA เก�ดื้ข้��นไดื้2อยั-างไร สร,ปีว-าม�มาก-อนท��จะม�ยัาปีฏิ�ชื้�วนะใชื้2โดื้ยัเฉพาะกล,-ม penicillin โดื้ยัไดื้2ม�รายังานการตรวจพบสายัพ�นธิ์,& MRSA คร��งแรกจากปีระเทศึอ�งกฤษ เม��อปี% ค.ศึ. 1961 และท3าให2เก�ดื้การระบาดื้แบบคล��นสองล5กจากโลกตะว�นตก คล�� นล5กแรกเก�ดื้ในชื้-วงปี% ค.ศึ.

1970 ถ�งปี% ค.ศึ. 1980 และคล�� นล5กท��สองเก�ดื้ในชื้-วงปี% ค.ศึ.

1990 จนถ�งปี/จจ,บ�นและชื้-วงระหว-างคล��นสองล5กน��นพบว-าความชื้,กข้ อ ง เ ชื้�� อ MRSA น��น ล ดื้ ล ง ไ ปี ม า ก ยั� ง ไ ม- ท ร า บ ส า เ ห ต, ข้ อ งปีรากฏิการณิ&น�� แต-พบว-าเชื้��อ MRSA ท��ท3าให2เก�ดื้การระบาดื้ในคล��นล5กแรกและในคล��นล5กท��สองม�ความแตกต-างก�นดื้2านแบบแผู้นการดื้�� อยัา phage typing และการควบค,มทางพ�นธิ์,กรรมข้องการดื้��อยัา สายัพ�นธิ์,&เก-าในคล��นล5กแรกน��นม�กตรวจหาชื้น�ดื้ข้อง phage

โดื้ยัพบว-าส-วนใหญ-เปี@น phage group III ส-วนสายัพ�นธิ์,&ใหม-ในคล�� นล5กท��สองม�กเปี@น non-typing phage และม�กม�ความแตกต-างก�นในดื้2านพ�นธิ์,กรรมการควบค,มการดื้��อยัา(1-3)

การต�ดื้เชื้��อ MRSA ในโรงพยัาบาลอาจแบ-งไดื้2เปี@น 3 แบบ ค�อ แ บ บ ปี ร ะ ปี ร า ยั (sporadic) แ บ บ ก า ร ร ะ บ า ดื้ (outbreak/epidemic) และแบบโรคปีระจ3าถ��น (endemic) การศึ�กษาการจ�ดื้กล,-มในระดื้�บโมเลก,ล (molecular typing) ซิ��งม�ความก2าวหน2ามากในปี/จจ,บ�นบ-งให2ทราบว-าการต�ดื้เชื้��อท��ง 3 แบบข้อง MRSA ในโรงพยัาบาลม�ความแตกต-างก�น การศึ�กษาเหล-าน��พบว-าการต�ดื้เชื้�� อแบบ sporadic ม�กเก�ดื้จากเชื้�� อสายัพ�นธิ์,&ชื้,มชื้น (community strain) ในการศึ�กษาเหล- าน��ยั�งบอกไดื้2ว- า เชื้�� อ MRSA ในร5ปีการระบาดื้น��นเปี@นท��แน-นอนว-าเปี@นการแพร-กระจายัข้องเชื้��อจากผู้52ปี<วยัรายัใดื้รายัหน��ง (index case) หร�อจากบ,คลากรในโรงพยัาบาล ในการต�ดื้เชื้��อแบบโรคปีระจ3าถ��นน��นพบว-าเชื้��อ MRSA

อาจมาจาก 2 ทางค�อจากชื้,มชื้นและจากการแพร-กระจายัในโรงพยัาบาล (cross-transmission) โดื้ยัท��ความชื้,กข้อง MRSA ในโรงพยัาบาลแต-ละแห-งในปีระเทศึไทยัน��นแตกต-างก�นตามสถานท��และเวลา ส-วนใหญ-ในชื้-วง 5 ปี%ท��ผู้-านมาจนถ�งปี/จจ,บ�น จะม�ความชื้,กข้องเชื้��อ MRSA ปีระมาณิร2อยัละ 20-45 (1-4) อยั-างไรก?ตามยั�งไม-ม�การศึ�กษาว-าการต�ดื้เชื้�� อ MRSA ในสถานพยัาบาลต- างๆ ในปีระเทศึไทยัเปี@นล�กษณิะร5ปีแบบใดื้ แต-ไดื้2ม�รายังานว-า MRSA เร��มม�

การดื้��อต-อยัา Vancomycin ซิ��งใชื้2ร�กษาโรคต�ดื้เชื้��อ MRSA ดื้�งน��นเพ��อไม-ให2ม�การชื้�กน3าการดื้��อต-อยัาข้อง MRSA ให2มากข้��นกว-าเดื้�มจ�งไดื้2ม�การศึ�กษาฤทธิ์��ทางชื้�วภาพข้องเชื้��อในกล,-ม Lactobacillus ในการควบค,มการเจร�ญข้องเชื้��อกล,-ม MRSA ดื้�งกล-าว

ว�ตัถุ3ปีระสงค�เพ��อศึ�กษาฤทธิ์��การยั�บยั��งเชื้��อ MRSA โดื้ยัเชื้��อ

Lactobacillus species

ปีระโย่ชื้น�ท �คาดื้ว�าจะไดื้.ร�บทราบปี/จจ�ยัท��ม�ผู้ลต-อการท3าลายัเชื้��อ Methicillin-resistant

Staphylococcus aureaus (MRSA) จ า ก เ ชื้�� อ Lactobacillus species

ร-ปีแบบการว�จ�ย่เปี@นการว�จ�ยัเชื้�งทดื้ลองเพ��อหาปี/จจ�ยัท��ม�ผู้ลต-อการท3าลายัเชื้��อ

MRSA (minimal lethal concentration, MLC) จ า ก เ ชื้�� อ Lactobacillus sp.

ขีอบเขีตัการว�จ�ย่เ ปี@ น ก า ร ศึ� ก ษ า ฤ ท ธิ์�� ท า ง ชื้� ว ภ า พ ข้ อ ง เ ชื้�� อ ใ น ก ล,- ม

Lactobacillus ในการควบค,มการเจร�ญข้องเชื้��อกล,-ม MRSA ท��ไดื้2จากผู้52ปี<วยัในโรงพยัาบาลมหาราชื้ นครศึร�ธิ์รรมราชื้ โดื้ยัใชื้2ว�ธิ์� Both dilution และ Agar diffusion จาก

ว�สดื้3และอ3ปีกรณิ�1.สารเคม

1.1 อาหารเล��ยังเชื้��อ- Blood agar

- Plasma- MHA (Mueller-Hinton agar)- Trypical soy broth- MSA (Mannitol-salt agar)- MRS (agar/broth)

1.2 ยัา Oxacillin 6 ไมโครกร�มต-อม�ลล�ล�ตร แบ-งเปี@น- ยัาผู้ง- Disk ยัา มาตรฐาน (6 g)

1.3 ส�ส3าหร�บยั2อมแกรม- Crystal violet- Iodine- Absolute alcohol- Safranin O

2.ว�สดื้3อ3ปีกรณิ�2.1 จานเพาะเชื้��อ จ3านวน

100 จาน2.2 Loop

จ3านวน 2 อ�น2.3 Auto pipette 10-100 l.

จ3านวน 2 อ�น2.4 Auto pipette 200-1,000 l.

จ3านวน 2 อ�น2.5 ไม2พ�นส3าล� (Sterile)

จ3านวน 1 ห-อ2.6 Rack ใส-หลอดื้ทดื้ลองข้นาดื้ 13x100 mm

จ3านวน 3 อ�น2.7 Rack ใส-หลอดื้ทดื้ลองข้นาดื้ 10x75 mm

จ3านวน 3 อ�น2.8 Rack ใส-หลอดื้ทดื้ลองส3าหร�บทดื้สอบ MLC

จ3านวน 3 อ�น

2.9 หลอดื้ทดื้ลองข้นาดื้ 13x100 mm

จ3านวน 60 หลอดื้2.10 หลอดื้ทดื้ลองข้นาดื้ 10x75 mm

จ3านวน 60 หลอดื้2.11 หลอดื้ทดื้ลองข้นาดื้ใหญ- (ส3าหร�บทดื้สอบ MLC)

จ3านวน 60 หลอดื้2.12API 50 CH ส3าหร�บ Identify Lactobacillus

sp.

ขี� นตัอนการศึ�กษา1. ขี� นตัอนการเตัร ย่มเชื้� อ MRSA

1.1 ไดื้2จากส��งส-งตรวจท��พบว-าผู้52ปี<วยัต�ดื้เชื้��อ MRSA โดื้ยัไ ดื้2 ร�บ ส�� ง ส- ง ต ร ว จ จ า ก โ ร ง พ ยั า บ า ล ม ห า ร า ชื้ นครศึร�ธิ์รรมราชื้ จ3านวน 50 ต�วอยั-าง

1.2 น3ามาแยักเปี@น single colony โดื้ยัใชื้2การข้�ดื้เชื้��อลงบนอาหารเล��ยังเชื้�� อ MSA ท��ผู้สม Oxacillin 6

ไมโครกร�มต-อไมโครล�ตร บ-มไว2ท�� 37 องศึา 24

ชื้��วโมง1.3 จากน��นน3ามายั2อมแกรม และท3าการทดื้สอบเพ�� อ

ยั�นยั�นกล,-มเชื้��อทางดื้2านชื้�วเคม� โดื้ยัใชื้2 Plasma เพ��อทดื้สอบ Coagulase Test และท3า การทดื้สอบ Sensitivity โดื้ยัใชื้2 Disc ยัา Oxacillin

1.4 น3า โ ค โ ล น� ท�� ร ะ บ, ว- า เ ปี@ น MRSA ก ล- า ว ค� อ Coagulase Test Positive แ ล ะ ดื้�� อ ต- อ ยั า Oxacillin มาเพาะเล��ยังบน BA แล2วน3า ไปีไว2ท�� 4

องศึาและ/หร�อเก?บไว2เปี@น Stock ท�� –70 องศึาเพ��อรอการทดื้สอบ

2.ขี� น ตั อ น ก า ร Screening เ ชื้� อ Lactobacillus species

2.1 น3า Lactobacillus sp. ใน stock มาเล��ยังใน MRS agar ท�� 37 อ ง ศึ า 24 ชื้�� ว โ ม ง ท3า ก า ร Identify เชื้��อ lactobacillus sp.โดื้ยัการยั2อมแกร ม แ ล ะ ท ดื้ ส อ บ ท า ง Catalase Test ซิ�� ง Lactobacillus จะให2 Colony ส�ข้าวท�บและผู้ล Catalase บวกเล�อก Single colony น3ามาข้�ดื้ลงบนจานเพาะเชื้��อท��ม� MRS agar เปี@นอาหารเล��ยังเชื้��อโดื้ยัข้�ดื้ในแนวกลางข้อง Plate

2.2 น3าเชื้��อ MRSA ท��ต2องการทดื้สอบข้�ดื้ต��งฉากก�บแนวข้อง Lactobacillus sp. ท��ท3าการทดื้สอบบ-มท��อ,ณิหภ5ม�ห2อง 24 ชื้��วโมง ส�งเกตและบ�นท�กผู้ลท��ไดื้2

3. ขี� นตัอนการเตัร ย่ม Bioactive agent จากเซิลล�

กล3�ม Lactobacillus sp.

3.1 น3า Single colony ม า เ พ า ะ เ ล�� ยั ง ใ น MRS

broth แ ล ะ ท3า ก า ร ว� ดื้ ค ว า ม ข้,- น โ ดื้ ยั ใ ชื้2 spectrophotometer ปี ร� บ ค- า ค ว า ม ข้,- น ข้ อ งแบคท�เร�ยัให2เท-าก�นท,กหลอดื้ บ-มไว2ท�� 37 องศึา 24

ชื้��วโมง3.2 ปี/� นท�� 10,000 รอบต-อนาท�เปี@นเวลา 10 นาท� ดื้5ดื้

เอาส-วนใสมาท3าการทดื้สอบ4 .ขี� นตัอนเตัร ย่มการทดื้สอบ

4.1 ท3า Suspension ข้ อ ง เ ชื้�� อ MRSA ท�� เ ท- า ก� บ McFarland no. 0.5

4.2 ท3าการ Neutralize สาร Bioactive agent ให2ม�สภาพเปี@นกลาง

5.ขี� นตัอนการทดื้สอบ5.1 Broth dilution method- จ�ดื้เร�ยังหลอดื้ทดื้ลอง 5 หลอดื้

- เ ต� ม 0.5 ml. ข้ อ ง น3�า DI (Deionize water)

ต��งแต-หลอดื้ท�� 2 ถ�งหลอดื้ท�� 5- เ ต� ม 0.5 ml. ข้ อ ง Broth ท�� ไ ดื้2 จ า ก ก า ร เ ล�� ยั ง

Lactobacillus sp. ใส-หลอดื้ 1 และ 2

- ดื้5ดื้ 0.5 ml. จากหลอดื้ท�� 2 ไปีหลอดื้ท�� 3 ผู้สมให2เข้2าก�น และดื้5ดื้จากหลอดื้ท�� 3 ไปียั�งหลอดื้ท�� 4

- ดื้5ดื้ 0.5 ml. ข้อง Suspension เชื้�� อ MRSA ใส-หลอดื้ท�� 1 ถ�งหลอดื้ท�� 5

- บ-มเล��ยังท�� 37 องศึาเซิลเซิ�ยัส 24 ชื้��วโมง บ�นท�กผู้ลค-า Minimal lethal concentration (MLC)

5.2 Agar diffusion test- น3า MRSA ท��ไดื้2จากการเตร�ยัม swap ลงบน MRS

plate- เจาะหล,มบนจานเพาะเชื้��อ หยัดื้ Bioactive agent ท��

ไดื้2จากการเล��ยัง Lactobacillus sp. ลงในหล,ม- เปีล��ยันหล,มใหม-เม��อเปีล��ยัน Bioactive agent จาก

Lactobacillus ต-าง species

- บ-มท�� 37 องศึา 24 ชื้��วโมง บ�นท�กผู้ลเส2นผู้- านศึ5นยั&กลางข้อง Clear zone

การว�เคราะห�ขี.อม-ลใชื้2การว�เคราะห&จากความสามารถในการยั�บยั��ง MRSA โดื้ยัเชื้��อ

Lactobacillus species ดื้2วยัว�ธิ์� Broth dilution และ Agar diffusion

แผู้นการดื้/าเน�นงาน

ก�จกรรม เมษายัน

พฤษภาคม

ม�ถ,นายัน

กรกฎิาคม

ส�งหาคม

ก�นยัายัน

ต,ลาคม

พฤศึจ�กายัน

ส�บค2นข้2อม5ลน3าเสนอข้2อม5ลก�บอาจารยั&ท��ปีร�กษาเข้�ยันโครงร-างและ น3าเสนอข้อใชื้2อ,ปีกรณิ&ข้อค3าแนะน3าจากอาจารยั&ท��ปีร�กษาดื้3าเน�นการน3าเสนอความก2าวหน2าสอบภาคน�พนธิ์&สร,ปีและส-งรายังานฉบ�บสมบ5รณิ&

งบปีระมาณิ1. อาหารเล��ยังเชื้��อ 2,000 บาท2. เชื้��อมาตรฐาน 1,000 บาท3. จานเพาะเชื้��อ 2,000 บาท4. ชื้,ดื้ทดื้สอบเชื้��อ 2,000 บาท5. ยัา 1,000 บาท6. ชื้,ดื้ยั2อมส� 500 บาท7. อ��นๆ 500 บาท รวม 9 ,000

บาท

เอกสารอ.างอ�ง1. ก น ก ร�ต น& ศึ� ร�พ า น� ชื้ ก ร . โ ร ค ต� ดื้ เ ชื้�� อ . พ� ม พ& ค ร��ง ท�� 2.

กร,งเทพมหานคร : ส3าน�กพ�มพ&โฮล�สต�ก, 2541.

2. รศึ.ร.อ.ชื้�ยัว�ฒน& ก�ตต�ก5ล. เอกสารปีระกอบการสอนว�ชื้าจ,ลชื้� ว ว� ท ยั า ท�� ว ไ ปี (MI-211) . ภ า ค ว� ชื้ า จ, ล ชื้� ว ว� ท ยั า ค ณิ ะว�ทยัาศึาสตร&มหาว�ทยัาล�ยัเกษตรศึาสตร&

3. นล�น� อ�ศึวโภค� และคณิะ . ปีระสบการณิ&ดื้2านโรคต�ดื้เชื้�� อในปีระเทศึไทยั. กร,งเทพมหานคร : ส3าน�กพ�มพ&โฮล�สต�ก, 2540.

4. Lertcanawanichakul M. “MRSA”. available from : URL : http://www.drug.pharmacy.psu.ac.th/student/homepage2/pharmaco.html