เครื่องวัดความเข มแสง (photometers) 1....

เครื่องวัดความเขมแสง (PHOTOMETERS)

1. อธิบายผังองคประกอบของเครื่องวัดความเขมแสง

แบบตางๆ ไดแบบตางๆ ได

2. อธิบายระบุองคประกอบสําคัญและหนาที่

ขององคประกอบภายในเครื่องวัดกลุมที่ใช

หลักการวัดความเขมแสงได

เครือ่งวดัความเขมแสง (วิสุทธิ ์กังวานตระกูล) 1

หลักการวัดความเขมแสงได

3. อธิบายการตรวจสอบการทํางานเบื้อตน

ของเครื่อง spectrophotometer ได

• เครื่องวัดคาดูดกลืนแสงของสารละลายSpectrophotometer และ Photometer

• เครื่องวัดแสงที่สะทอนจากผิววัตถุReflectance photometer

เครื่องวัดความเขมแสง (PHOTOMETERS)

Reflectance photometer• เครื่องวัดคาการดูดกลืนแสงของอะตอมอิสระAtomic absorption spectrophotometer

• เครื่องวัดการเปลงแสงของอะตอมอิสระAtomic emission photometer

• เครื่องวัดการเรืองแสงของสารละลาย


• เครื่องวัดการเรืองแสงของสารละลายFluorescent photometer, Illuminometer,Chemiluminescent photometer

• เครื่องวัดแสงกระเจิงจากโลเลกุลสารNephelometer / Turbidimeter

Electromagnetic energy or wave

Wavelength(l) Common Source of energy

Over 25 cm Radio waves Electron-spin orientation

0.4 – 25 cm Microwaves (radar) Molecular rotation

25,000 – 4,000,000 nm Far Infrared

Molecular vibration25,000 – 25,000 nm True Infrared

800 – 2,500 nm Near Infrared

400 – 800 nm Visible lightValence electron transition

10 – 400 nm Ultraviolet (UV)

0.1 – 10 nm Soft X-rays and X-rays Inner-shell electrontransition


Less than 0.1 nm Gamma rays (isotopes) Nuclear transition

Visible Spectrum

ApproximatedWavelength (nm)

Color of absorbed light

Color of solution

400-435

435-500

500-570

570-600

Violet

Blue

Green

Yellow

Green-yellow

Yellow

Red

Blue

Green-blue


600-630

630-700

Orange

Red

Green-blue

Green

Incident Light [ Io ] Transmitted Light [ It ]

ITransmittance [T] =

It

I0

%Transmittance [%T] =It

x 100 = 100TI0

Absorbance [A or O.D.] = log1

= logI0

= log100

T It %T

= log 1 – log T = - log T


A = 2 - log %T

= log 1 – log T = - log T

Absorbance [A or O.D.] = log100

= log 100 – log %T%T

b = ความกวาง หรือ ระยะทางที่แสงผาน( cm )

Incident Light [ I0 ] Transmitted Light [ It ]

C = ความเขมขนของสารละลาย หรอื ความเขมขนของตัวถกูละลาย

b*ตัวทาํละลายไมดดูกลืนคลื่นแสง

( g%)

b

b b

aA CC มากขึ้น, b คงที่

b มากขึ้น, C คงที่


A = a b CBeer and Lambert’s Law ===>

A ba

b มากขึ้น, C คงที่

a = absorptivity coefficient (สัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสง)

ถา C มีหนวยเปน mole/L

A = a b CBeer and Lambert’s Law ===>

หนวยของ molar absorptivity คือ L.mol-1.cm-1

molar absorptivity ใชสัญญลักษณเปน e

ถา C มีหนวยเปน mole/L


Amplifier &

Display deviceGrating

Entrance Slit

เครื่องวดัคาดูดกลืนแสงของสารละลายSpectrophotometer และ Photometer

0.852Energy Lamp

Mirror


Monochromator Cuvette

Photodetector

Mirror

Exit Slit•Interference filters•Prism•Grating

Single beamspectrophotometer

Double beamDouble beamspectrophotometer

Beam Splitteror Half-mirror


Split beamspectrophotometer

VIS spectrophotometerUV spectrophotometerUV/VIS spectrophotometer

Tungsten filament lamp : 320 - 2500 nm

Hydrogen/Deuterium lamp : 160 - 275 nm

ชนิดของหลอดใหพลังงาน(Energy lamp)


Hydrogen/Deuterium lamp : 160 - 275 nm

Tungsten-halogen lamp :

Xenon arc lamp :

MgF2 GlassGlass

Interference filters

ชนิดของ monochromater

Reinforced wave


เคลือบดวยSilver

Wave not Reinforced

1st-order spectrum

2nd-order spectrum

3rd-order spectrum

RefractionGrating 1st-order spectrum

Reverse-order spectrum

Exit slit

Entrance slit

Grating


White Light

200 500 800

Spectrum pattern(linear scale)

Near Infrareds light(NIR)

NIR

Near UV lightNear UV

Corn type prism Littrow type prism

350 400 800

Glass prism spectrum pattern(log scale)


200 300 800

Quartz prism spectrum pattern(log scale)250

200 500 800

Grating spectrum pattern(linear scale)

Band pass is that range of wavelengths that pass through the

exit slit of the wavelength selecting device.

100% peak height

Nominal band pass(width) and half-band pass(width)

100% peak height

50% peak height

half-band pass

Radi

ant E

nerg

y In

tens

ity


l

0

l

1

l

2

Band pass

half-band pass

Radi

ant E

nerg

y In

tens

ity

Wavelength, nm

วัสดุที่ใชทาํ cuvette


วัสดุที่ใชทาํ cuvette

Simple glass Special glass Plastic Quartz

Flow-cell cuvette

ชนิดของ photodetector

•Photocell or Barrier layer cell or Photovoltaic cell•PhototubePhotomultiplier tube•Phototube•Photomultiplier tube•Photodiode•Phototransistor•Photodiode array


•Photodiode array

Glass window

Silver lacquerSemiconductor( selenium, cadmium )

Photocell or Barrier layer cell or Photovoltaic cell

( selenium, cadmium )

Metal base(iron)

-Selenium type ตอบสนองตอแสงชวง 380-700 ทท,

ไวตอแสงชวง 500-600 nm


ไวตอแสงชวง 500-600 nm

-ผลิตกระแสงได 10-100 mA

-ไมเหมาะกับ spectrophotometer ที่มี bandpass แคบๆ-ถาถูกแสงนานๆ จะผลิตกระแสงไดนอยลง เรียกวา fatigue

Glass envelopePhoto cathodeAnode

Phototube

Base

+-90 volt

90 voltจายกระแสงไฟฟาจนเกิด dark current

Photosensitive material ที่ใชไดแกcesium-antimony 352-625 nm


cesium-antimony 352-625 nmcesium oxide 600-1000 nmmultialkaline ( Sb / K / Na / Cs )

ผลิตกระแสไดนอย ตองมีภาคขยายสญัญาณไฟฟา, มคีวามไวกวา photocell,ถูกแสงนานๆ เกิด fatigue ได, อายกุารใชงานสั้นกวา photocell

Gas-filled phototube

Photomultiplier tube : PMT


P N P N

P N

N

PhotodiodeP N

P N

P N

P N

N

P

N


Phototransistor Photodiode array

1. Very elevated concentrations are measured.

2. Incident radiant energy is not monochromatic.

กรณีที่การดูดกลืนแสงของสารไมเปนไปตาม Beer’s Law

A = a b C

2. Incident radiant energy is not monochromatic.

3. The solvent absorption is significant compared to the solute absorbance.

4. Radiant energy is transmitted by other mechanisms(stray light).


mechanisms(stray light).

5. The sides of the cell are not parallel.

6. The absorbance of a fluorescent solution is measured.

Stray light 0% Stray light 1 %

Stray light 5 %

Absorbency

Linearity เมื่อมี 1% Stray light

Linearity เมื่อมี 5% Stray light


Concentration

การปรับความถูกตองของความยาวคลื่นแสงWavelength calibration

Amplifier &

GratingEntrance Slit

0.852Energy Lamp

Amplifier &

Display device

Mirror


Monochromator Cuvette

Photodetector

Mirror

630 nm

Holmium oxide

241.5 + 0.2279.4 + 0.3287.5 + 0.35333.7 + 0.55

Peak(nm)

Potassium dichromate solution

0.004 g/L in 0.5 N KOH

Peak=> 374+4 nm

Cobalt chloride solution

4.4 g/L in 1% HCl333.7 + 0.55360.9 + 0.75418.4 + 1.1453.2 + 1.4536.2 + 2.3637.2 + 3.8

Peak=> 540+4 nm

Oxyhemoglobin solution

Red cell in 0.05% NH4OH

4.4 g/L in 1% HCl

Peak=> 512+5 nm


Didymium filter :

Peak => 585 nm

576+4 nm

Absorbance accuracy

Potassium dichromate solution

120 mg/L in 0.01 N H2SO4 257 nm => 1.738+0.03 Abs.

การตรวจสอบความถูกตองของการดูดกลืนแสง

Copper sulfate solution

Cobalt sulfate solution

4 g% in 1%H2SO4

4 g% CoSO .(HN ) SO .6H O in 1%H SO

357 nm => 1.288+0.02 Abs.

650 nm => 0.448 Abs.

510 nm => 0.48 Abs.


4 g% CoSO4.(HN4)2SO4

.6H2O in 1%H2SO4

Neutral density filters

Absorbance linearity

การตรวจสอบความเปนเสนตรงของคาการดูดกลืนแสง

Copper sulfate solution in 1%H2SO4

0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 g%

Potassium dichromate solution in 0.5 N KOH

0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 g%


Stray light checking

การตรวจสอบแสงรบกวน

Stray light filter มีคณุสมบัตดิูดกลืนคลื่นแสงไดหมด

=> 0 %T หรือ ตวัเลข Abs. กระพริบ=> 0 %T หรือ ตวัเลข Abs. กระพริบ

NaI 10g/l 220 nmNaNO2 50 g/l 340 nmK2Cr2O7 0.25 g/l in 0.05 N KOH 370 nmK2Cr2O7 0.50 g/l in 0.05 N KOH 400 nmCuSO4 350 g/l 680 nm


CuSO4 350 g/l 680 nm

* Stray light ไมควรเกิน 1%T

เครื่องวดัแสงที่สะทอนจากผิววัตถุReflectance photometer

วัดคาความเขมแสงที่สะทอนจากผิววัตถุเปรียบเทียบกับคาความเขมแสงกอนกระทบผิววัตถุ

Light Source Photo detector

Readout device

Sample surface


Readout device

Reflection density (DR) = Log ( RO / Rtest )

RO = Intensity of light reflected by standard reflectorby standard reflector

Rtest = Intensity of light reflected by test sample

Barium sulface-coated surface


A = log ( 1 / T ) or A = log ( Io / It )

Transmittion density / Absorption / Opitical density

Kubelka-Munk-Theory

The theory works best for optically thick materials where>50% of light is reflected and<20% of light is transmitted.

dXdX

Xx

iTiR

Backing Reflectance

Paper Reflectance

I0IR


R is the absolute reflectance of sampled layerk is the molar absorption coefficient of the sample surfaces is the scattering coefficient of the sample surface

Compounds ( A+

Cl- )

heat สามารถดูดกลืน hvGround state

Combustion process

A+ vapor + e

- ------> A

o vapor

สามารถดูดกลืน hv

A* vapor

Ground state

Excited state ( unstable )

hv heat

OxygenOxide

High temperature


Vaporized atoms in the group state (Ao ) absorb light at very narrowly defined wavelengths. [ 0.001 - 0.01 nm ]

Excited state ( unstable )Oxygen

Oxide

เครื่องวดัคาการดูดกลืนแสงของอะตอมอิสระAtomic absorption spectrophotometer

กระตุนโมเลกุลสารใหอยูในรูปอะตอมอิสระแลววัดคาดูดกลืนแสงของอะตอมอิสระ หลอดใหพลังงานแสงของระบบการวัดเปนหลอดท่ีใหแสงความยาวคลื่นเดียว ซึ่งเรียกวา Hollow cathode lamp

Hollow-cathode lamp

Chopper

Burner

Monochromator

Photomultiplier tube

Readout device

Line spectrum light


Chopper

Sample solution

Atomization = convert chemicals to atomic vaporNebulization= convert solution to a fine spray or aerosol

Burner

200-400Volt

200-400

Specific metalSpecific metal salt

Inert gasElectrical coil Inert gas

Energy lamp for Atomic absorption spectrophotometer

Electrodes Discharge LampHollow cathode lamp

Volt200-400

Volt


Electrodes Discharge Lamp

(EDL)

Hollow cathode lamp

Burner head

Flow spoiler retaining

Type of burner Total consumption burner

Premix burner ( laminar-flow burner )

Fuel gas

Oxidant

Flow spoiler

retaining screw

Nebulizer adjusting knob

Burner head locking ring

Pressure relief vents


Sample capillary

Nebulizer

Nebulizer oxidant

Flow spoileradjusting knob

To waste

Emission interference

Ao + heat ---------------------> A*

hv

80% 20%

Hollow-cathode lamp Chopper Burner

Monochromator


Readout device

Line spectrum light


lamp

Sample solution

ชวยแกไขปญหา emission interference

Flame atomic absorption spectrophotometer

Flameless atomic absorption spectrophotometer

Hydride generated atomic absorption spectrophotometer

Temperature up to 2,300o

C

Hydride generated atomic absorption spectrophotometer

HgH2 Hollow-cathode

Monochromator


Readout device

Line spectrum light

Cell


HgH2 cathode lamp

ChopperSample solution

Hydride generator Carrier gas

Sample solution apply to

Graphite furnace atomic absorption spectrophotometer

Platform or tube made form carbon

Hollow-cathode lamp

Monochromator


Readout device

Line spectrum light


lampChopper High Voltage apply

( temperature up to 2,700o C )

ใชวัด Na / K / Ca

เครื่องวัดการเปลงแสงของอะตอมอิสระAtomic emission photometer

วัดความเขมแสงท่ีเปลงออกมาจากอะตอมอสิระที่ถูกเผาดวยเปลวไฟ

Burner

Wavelength selector( filters)

Photomultiplier

Readout device

Emission light


Burner Photomultiplier tube

Sample solution

Direct type and Internal standard typeof flame photometer

filtersCoincident device

Readout device

burner detectors

Coincident device


Internal standard : lithium or cesium

Sample and standard are diluted with a constant concentration of internal standard

เครื่องวดัการเรอืงแสงของสารละลายFluorescent photometerIlluminometer or Chemiluminescent photometer

ScatteredAbsorbed

TransmittedLight

No loss of energy

No change of energysame wavelength before

Energy loss

Some energy loss and


same wavelength before and after it interacts with the matter

Some energy loss andReemitted light

Fluorescence and Phosphorescence

First monochromator Excitation slit

Fluorescent photometer or Fluorometerวัดความเขมแสงท่ีเปลงออกมาของสารละลายหลังจากถูกกระตุน

ดวยคลื่นแสง

monochromator

Second monochromator

Light source

Emission slit

Sample in cuvette

Detector


Detector

Readout device

Illuminometer or Chemiluminescent photometer

วัดความเขมของแสงท่ีเปลงออกมากหลังจากเกิดปฏิกิริยาเคมี

Emission slit

Sample in cuvette

monochromator

Emission slit

Readout device

Photo Detector

Luminol (5-amino 2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione)

peroxidase


Readout device peroxidase

hv 400 - 450 nm

Luciferin ( 6-hydroxybenzothiazole )

Oxidized Luminol

Enhancer เชน

จะทาํให Intensity ของ emitted light มากขึ้น

Low intensity

เครื่องวดัแสงกระเจิงจากโลเลกุลสารNephelometer : วัดความเขมแสงท่ีกระเจิงไปจากแนวระนาบ

เดียวกับคลื่นแสงท่ีกระตนประมาณ 15-90 องศา

Turbidimeter : วัดความเขมแสงท่ีกระเจิงในแนวระนาบเดียวกับคลื่นแสงท่ีกระตุน

= 15-90

Light source

Collimating len

Slit

Filter

Sample Cuvette

Stray light trapsSignal

q


Particle diameters of Antigen-antibodies complex :250 - 1,500 nm

ความยาวคล่ืนท่ีใชวัด => 320 - 650 nm

Stray light traps

DetectorSignal

Monochromator

แมสสเปกโตรเมทร ี(Mass spectrometry หรือ MS) เทคนคิในการวิเคราะหผลการวัดสัดสวนมวลตอประจุ (mass-to-charge ratio) ของอนุภาคที่มีประจุ เพื่อระบุมวลของอนุภาค สวนประกอบของธาตใุนสารประกอบตัวอยางหรือในโมเลกลุ และเพื่อแสดงถึงโครงสรางทางเคมีของโมเลกุล เชน เพปไทด และสารประกอบทางเคมีอืน่ๆเครือ่ง MS จะทําใหสารประกอบเคมกีลายเปนประจุ (ionize) หรือโมเลกุลที่มีประจุขึ้นมาและวัดสัดสวนมวลตอประจุของมัน

Mass Spectrometry (MS)

และวัดสัดสวนมวลตอประจุของมัน

GC-MS = Gas chromatography – Mass spectrometryLC-MS = Liquid chromatography – Mass spectrometryHPLC-MS = High pressure Liquid chromatography – Mass spectrometryICP-MS = Inductively Coupled Plasma – Mass Spectrometry

MSGCLC

LC-MS

LC-MS-MS

Picture from URL:http://www.tau.ac.il/chemistry/amirav/lcms.shtmlPicture from URL: http://www.asca-berlin.de/company.html

4s

3pn3 = 0

3s

2pn2 = 0

2s

4s

3pn3 = 0

3s

2p n2 = 4

2s

4s

3pn3 = 0

3s

2p n2 = 6

2s

6C121H1

8O16

Ionization of methanol molecule


2s

1s n1 = 1

2s

1s n1 = 2

2s

1s n1 = 2

1 Unpaired electron 2 Unpaired electron 2 Unpaired electron

CH3OH

Electron ionization (EI)

+ 1 electron

CH2OH+ + HMolecular ion

or Radical cation

CH3+ + OH

CH3OH+

mass/charge ratio(m/z or m/e)

ของ CH2OH+ และ CH3+ มีคาแตกจางกนั

+ 2 electron

Ion repeller

Electron trap

Ionization chamber

at + 10,000 voltsPositive ions beam

AccelerationDeflection

Electromagnet to producevariable magnetic field

Basic components of Mass Spectrometry

1 23


Electrical heatedmetal coil

Electrons

Intermediate plate

Final plateat 0 volts

Vaporized sample

To vacuum pumpFor no air molecules

Positive ionIon beam

Ion beam

FromGC, LC, HPLC, ICP

Wire to amplifier

Positive ionIon beam

Metal box

Electrons

Metal boxDetection

From URL http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html

Wire to amplifier

Amplifier

4

5 Monitor

mass/charge ratio(m/z or m/e)

Gas sample enters here Ions accelerate

towards charged slit

Magnetic fielddeflects lightest ionsmost

Filament currentionizes the gas


Picture form URL:http://antoine.frostburg.edu/chem/senese/101/glossary/m.shtml

Detect separated ionsBy mass expose film

Magnet

Picture from URL:http://www.nature.com/nature/journal/v404/n6778/fig_tab/404576a0_F1.html

Gas Chromatograph Mass Spectrometer (GC-MS)


Niemann HB, et al. Nature 438, 779-784 (8 December 2005) | doi:10.1038/nature04122; Received 2 June 2005; Accepted 3 August 2005; Published online 30 November 2005. Available from URL:

http://www.nature.com/nature/journal/v438/n7069/full/nature04122.html

Ionization Method Advantages Disadvantages

Protonation(positive ions)

many compounds will accept a proton to become ionized

many ionization sources such as ESI, APCI, FAB, CI and MALDI will generate these species

some compounds are not stable to protonation (i.e. carbohydrates) or cannot accept a proton easily (i.e. hydrocarbons)

Cationization(positive ions)

many compounds will accept a cation, such as Na+ or K+ to become ionized

many ionization sources such as ESI, APCI, FAB and MALDI will generate these species

tandem mass spectrometry experiments on cationized molecules will often generate limited or no fragmentation information


FAB and MALDI will generate these species fragmentation information

Deprotonation(negative ions)

most useful for compounds that are somewhat acidic

many ionization sources such as ESI, APCI, FAB and MALDI will generate these species

compound specific

Transfer of charged molecule to gas phase(positive or negative ions)

useful when the compound is already charged many ionization sources such as ESI, APCI,

FAB and MALDI will generate these species

only for precharged ions

Electron ejection(positive ions)

observed with electron ionization and can provide molecular mass as well as fragmentation information

• often generates too much fragmentation

• it can be unclear whether the highest mass ion is the molecular ion or a mass ion is the molecular ion or a fragment

Electron capture(negative ions)

• observed with electron ionization and can provide molecular mass as well as fragmentation information

often generates too much fragmentation

it can be unclear whether the highest mass ion is the molecular ion or a fragment

Available from URL:http://masspec.scripps.edu/mshistory/whatisms_details.php#ionization

Ionization Source Acronym Event

Electrospray ionization ESI evaporation of charged droplets

Nanoelectrospray ionization nanoESI evaporation of charged droplets

Atmospheric pressure chemical ionization APCI corona discharge and proton transfer

Matrix-assisted laser desorption/ionization MALDI photon absorption/proton transfer


Matrix-assisted laser desorption/ionization MALDI photon absorption/proton transfer

Desorption/ionization on silicon DIOS photon absorption/proton transfer

Fast atom/ion bombardment FAB ion desorption/proton transfer

Electron ionization EI electron beam/electron transfer

Chemical ionization CI proton transfer

Available from URL:http://masspec.scripps.edu/mshistory/whatisms_details.php#ionization

เครื่องวัดความเข มแสง (photometers) 1....

Documents