Αντιγραφή του DNA

"It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material."

Τρία μοντέλα αντιγραφής του DNA

Υπερφυγοκέντρηση

Πείραμα Meselson και Stahl (1957)

6

Παρατήρηση της ημισυντηρητικής αντιγραφής του DNA στους ευκαρυώτες.

Διακρίνονται χρωμοσώματα-αρλεκίνοι από κύτταρα ωοθήκης κινέζικου χάμστερ. Τα κύτταρα είχαν επωαστεί κατά τη διάρκεια δύο κυτταρικών κύκλων παρουσία του αναλόγου βάσης 5-βρομοδεοξυουριδίνη και ακολούθησε χρώση χρωμοσωμάτων. Τα βέλη δείχνουν τις θέσεις όπου έχει συμβεί ανασυνδυασμός.

Αντιγραφή DNA

• Στο E. coli τα 5 X 106 ζεύγη βάσεων του απλού χρωμοσώματός του αντιγράφονται σε λιγότερο από 1 ώρα, όσο παίρνει να διαιρεθεί για να σχηματιστούν δύο θυγατρικά κύτταρα.

• Ένα ανθρώπινο κύτταρο χρειάζεται μόνο λίγες ώρες για την αντιγραφή των 6,8 X 109 ζευγών βάσεων για να διαιρεθεί σε δυο θυγατρικά κύτταρα.

• Αυτή η διαδικασία είναι αξιοσημείωτα ακριβής, με μόνο ένα λάθος ανά δισεκατομμύριο βάσεων που αντιγράφονται.

• Πάνω από 10 ένζυμα και άλλες πρωτεΐνες εμπλέκονται στη διαδικασία αντιγραφής του DNA.

8

Έναρξη της αντιγραφής του DNA

• The replication of a DNA molecule begins at special sites, origins of replication.

• In bacteria, this is a single specific sequence of nucleotides that is recognized by the replication enzymes. – These enzymes separate the strands, forming a replication

“bubble”. – Replication proceeds in both directions until the entire molecule is

copied.

10

Διαδοχικά στιγμιότυπα της έναρξης της αντιγραφής του DNA σε γειτονικές μονάδες αντιγραφής ενός ευκαρυωτικού χρωμοσώματος.

11

DNA της Drosophila melanogaster κατά την αντιγραφή.

(α) Ηλεκτρονιομικρογραφία στην οποία φαίνονται οι αντιγραφικές θηλιές γειτονικών μονάδων αντιγραφής (ρεπλικόνια). (β) Σχηματική ερμηνεία της παραπάνω ηλεκτρονιομικρογραφίας.

In eukaryotes, there may be hundreds or thousands of origin sites per chromosome. – At the origin sites, the DNA strands separate

forming a replication “bubble” with replication forks at each end. The strands are separated by an enzyme called DNA helicase.

– The replication bubbles elongate as the DNA is replicated and eventually fuse.

Origin of DNA Replication

14

Έναρξη της αντιγραφής στην E. coli.

Η εναρκτήρια πρωτεΐνη DnaA προ- σδένεται στο oriC (αντιγραφέας) και διεγείρει την αποδιάταξη του DNA. Επιστρατεύονται οι DNA ελικάσες και αρχίζουν να ξετυλίγουν το DNA για να σχηματιστούν δύο διχάλες αντιγραφής με διάταξη κεφαλής προς κεφαλή.

Η DNA πολυμεράση III καταλύει την επιμήκυνση της αλυσίδας στην αντιγραφική διχάλα.

Τα νουκλεοτίδια ευθυγραμμίζονται με τις συμπληρωματικές τους βάσεις στην αλυσίδα-μήτρα και προστίθενται προς το άκρο που μεγαλώνει η νέα αλυσίδα με την πολυμεράση. – Ο ρυθμός επιμήκυνσης είναι περίπου 500

νουκλεοτίδια το δευτερόλεπτο στα βακτήρια και 50 το δευτερόλεπτο στα ανθρώπινα κύτταρα.

16

Η κατάλυση της επιμήκυνσης της αλυσίδας του DNA από την DNA πολυμεράση.

18

Η κατάλυση της επιμήκυνσης της αλυσίδας του DNA από την DNA πολυμεράση.

Επιδιόρθωση λαθών

20

Το πρόβλημα της πλήρους αντιγραφής ενός γραμμικού χρωμοσώματος στους ευκαρυώτες.

21

Το πρόβλημα της πλήρους αντιγραφής ενός γραμμικού χρωμοσώματος στους ευκαρυώτες.

(α) Σχηματική αναπαράσταση ενός δίκλωνου μορίου DNA που αντιστοιχεί σε ένα χρωμόσωμα ευκαρυωτικού κυττάρου. (β) Μετά την ημισυντηρητική αντιγραφή, οι νεοσυντιθέμενες αλυσίδες DNA που είναι συνδεδεμένες με δεσμούς υδρογόνου με τις αλυσίδες-μήτρες φέρουν εκκινητές RNA στα 5΄ άκρα τους. (γ) Οι εκκινητές RNA αφαιρούνται από την DNA πολύμεράση Ι που συμπληρώνει τα κενά και η DNA λιγάση ενώνει τα γειτονικά τμήματα Okazaki. Εντούτοις, στα δύο τελομερή εξακολουθούν να υπάρχουν χάσματα στα 5΄ άκρα των νέοσυντιθέμενων αλυσίδων. Τα χάσματα προκύπτουν από την αφαίρεση των εκκινητών RNA, επειδή δεν μπορούν να συμπληρωθούν με σύνθεση νέου DNA.

22

Η δράση της DNA λιγάσης στο κλείσιμο της εγκοπής μεταξύ δύο γειτονικών τμημάτων DNA (τμήματα Okazaki) για το σχηματισμό μιας μακρύτερης ομοιοπολικά συνεχούς αλυσίδας. Η DNA λιγάση καταλύει το σχηματισμό ενός φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ του 3΄-ΟΗ και της 5΄-φωσφορικής ομάδας σε κάθε πλευρά της εγκοπής, σφραγίζοντάς την.

Κλείσιμο της εγκοπής μεταξύ δύο γειτονικών τμημάτων DNA

Μοντέλο του μοριακού μηχανισμού αντιγραφής

Μηχανισμός αντιγραφής (συνέχεια)

25

Μοντέλο του σωματίου αντιγραφής, του συμπλόκου των κύριων πρωτεϊνών της αντιγραφής, με το DNA στην αντιγραφική διχάλα.

Η DNA πολυμεράση ΙΙΙ στη μήτρα της καθυστερημένης αλυσίδας (επάνω μέρος εικόνας) μόλις ολοκληρώνει τη σύνθεση ενός τμήματος Okazaki.

The Okazakis and the Kornbergs

Ανακεφαλαίωση

• Η ικανότητα του κυττάρου να διατηρεί τάξη μέσα σ' ένα χαώδες περιβάλλον στηρίζεται στον ακριβή διπλασιασμό της τεράστιας ποσότητας των γενετικών πληροφοριών που μεταφέρονται στο DNA του.

• Καθένας από τους δύο κλώνους του DNA δρα ως εκμαγείο για τη σύνθεση του άλλου κλώνου. Συνεπώς, μια διπλή έλικα DNA μεταφέρει τις ίδιες πληροφορίες σε καθέναν από τους κλώνους της.

• Ένα μόριο DNA διπλασιάζεται (αντιγράφεται) με πολυμερισμό νέων συμπληρωματικών κλώνων χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο τον καθένα από τους παλαιούς κλώνους της διπλής έλικας του DNA. Αυτή η διεργασία της αντιγραφής του DNA, κατά την οποία από το αρχικό μόριο παράγονται δύο ταυτόσημα μόρια DNA, επιτρέπει την αντιγραφή και μεταβίβαση των γενετικών πληροφοριών από ένα κύτταρο σ' ένα θυγατρικό κύτταρο και από τους γονείς στους απογόνους τους.

• Καθώς αντιγράφεται ένα μόριο DNA, οι δύο κλώνοι του διαχωρίζονται για να σχηματίσουν μια ή περισσότερες διχάλες αντιγραφής σε σχήμα Υ. Στη διχάλα αντιγραφής εντοπίζεται το ένζυμο DNA πολυμεράση, το οποίο συνθέτει έναν νέο συμπληρωματικό κλώνο DNA πάνω σε κάθε πατρικό κλώνο, παράγοντας έτσι δύο νέα δίκλωνα μόρια.

• Η DNA πολυμεράση αντιγράφει ένα εκμαγείο DNA με αξιοσημείωτη πιστότητα κάνοντας λιγότερο από 1 λάθος ανά ΙΟ7 αντιγραφόμενες βάσεις. Αυτό είναι εφικτό επειδή το ένζυμο απαλείφει τα δικά του λάθη πολυμερισμού, ενώ μετακινείται κατά μήκος του DNA.

• Η DNA πολυμεράση συνθέτει νέο DNA μόνο προς μια κατεύθυνση. Έτσι, στη διχάλα αντιγραφής συνεχώς αντιγράφεται μόνο ο ένας από τους δύο κλώνους (προπορευόμενος κλώνος). Στον καθυστερημένο κλώνο, νέο DNA συντίθεται από την πολυμεράση ασυνεχώς. Συγκεκριμένα, το ένζυμο συνθέτει βραχέα τμήματα DNA τα οποία αργότερα συρράπτονται από το ένζυμο λιγάση του DNA για το σχηματισμό ενός συνεχούς κλώνου DNA.

Ανακεφαλαίωση (συνέχεια)

Ανακεφαλαίωση (συνέχεια)

• Η DNA πολυμεράση ελέγχει την πιστότητα του αντιγράφου και γι' αυτό το λόγο δεν έχει τη δυνατότητα ν' αρχίζει τη σύνθεση μιας νέας αλυσίδας DNA. Η σύνθεση του DNA αρχίζει με μια RNA πολυμεράση γνωστή ως πριμάση. η οποία συνθέτει βραχέα τμήματα RNA που αποκαλούνται εκκινητές, τα οποία στη συνέχεια απομακρύνονται και αντικαθίστανται από DNA.

• Η αντιγραφή του DNA προϋποθέτει τη συνεργασία πολλών πρωτεϊνών οι οποίες σχηματίζουν μια πολυενζυμική μηχανή αντιγραφής που εντοπίζεται στη διχάλα αντιγραφής και καταλύει τη σύνθεση του DNA.

• Οι γενετικές πληροφορίες αποθηκεύονται σταθερά στις αλληλουχίες του DNA χάρη στη λειτουργία ποικίλων ενζύμων επιδιόρθωσης του DNA. τα οποία συνεχώς «σαρώνουν» το DNA, επιδιορθώνουν τα σφάλματα αντίγραφής και αντικαθιστούν τα νουκλεοτίδια που έχουν υποστεί βλάβη. Το DNA επιδιορθώνεται εύκολα επειδή ο ένας κλώνος μπορεί να επιδιορθωθεί χρησιμοποιώντας τον άλλο ως εκμαγείο.

31

Αμφίδρομη αντιγραφή κυκλικών μορίων DNA.

32

Η διαδικασία της αντιγραφής δίκλωνων κυκλικών μορίων DNA μέσω του μηχανισμού κυλιόμενου κύκλου.

Η δύναμη που ξετυλίγει την 5΄ ουρά προέρχεται από την κίνηση του σωματίου αντιγραφής, το οποίο προωθείται από την ελικάση που διαθέτει.

33

Η δομή του χρωμοσώματος λ είναι διαφορετική ανάλογα με το στάδιο του λυτικού κύκλου κατά τη μόλυνση του βακτηρίου E. coli.

Διαδοχικά στιγμιότυπα της έναρξης της αντιγραφής του DNA σε γειτονικές μονάδες αντιγραφής ενός ευκαρυωτικού χρωμοσώματος.

35

Το παράδειγμα αφορά τα τελομερή του πρωτοζώου Tetrahymena. Η διαδικασία περιγράφεται στο κείμενο. (α) Ως συνέ- πεια προηγούμενων κύκλων αντιγραφής, το χρωμόσωμα φέρει στο 5΄ άκρο ένα χάσμα, το οποίο δημιουργήθηκε κατά την αφαίρεση του εκκινητή RNA. (β) Πρόσ- δεση της τελομεράσης στην προεξέχουσα τελομερική επανάληψη στο άκρο του χρωμοσώματος. (γ) Σύνθεση τμήματος DNA τριών νουκλεοτιδίων στο άκρο του χρωμοσώματος, χρησιμοποιώντας το RNA-μήτρα της τελομεράσης. (δ) Η τελο- μεράση μετακινείται με τέτοιο τρόπο ώστε το RNA-μήτρα να μπορεί να υβριδοποιείται ξανά στη νέοσυντιθέμενη αλληλουχία TTG, χρησιμοποιώντας όμως βάσεις της διπλανής μονάδας επανάληψης της μήτρας.

Σύνθεση τελομερικών επαναλήψεων από την τελομεράση.

36

(ε) Η τελομεράση καταλύει τη σύνθεση μιας νέας τελομερικής επανάληψης, χρησιμοποιώντας το RNA-μήτρα. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται, για να προστεθούν περισσότερες τελομερικές επαναλήψεις. (στ) Μετά την απομάκρυνση της τελομεράσης, το επιμηκυσμένο άκρο χρησιμοποιείται ως μήτρα για τη σύνθεση DNA από έναν εκκινητή RNA. (ζ) Μετά την απομάκρυνση του εκκινητή, το χρωμόσωμα είναι μακρύτερο απ’ ό,τι ήταν στην αρχή και έχει ένα νέο προεξέχον 3΄ άκρο.

Σύνθεση τελομερικών επαναλήψεων από την τελομεράση.

37

Συναρμολόγηση νουκλεοσωμάτων μετά το πέρασμα μιας αντιγραφικής διχάλας.

38

Απεικονίζονται δύο ομόλογες διπλές έλικες DNA που συμμετέχουν στη διαδικασία του ανασυνδυασμού. Ένθετο: Ηλεκτρονιομικρογραφία ενδιάμεσης δομής Holliday με περιο- χή μονόκλωνου DNA στη θέση της διακλάδωσης. (David Dressler, Oxford University, UK. Από τη δημοσίευση Proc. National Academy of Sciences USA 75: 605, 1978.)

Μοντέλο Holliday για τον αμοιβαίο γενετικό ανασυνδυασμό.

39

Ηλεκτρονιομικρογραφία ενδιάμεσης δομής Holliday με περιο- χή μονόκλωνου DNA στη θέση της διακλάδωσης. (David Dressler, Oxford University, UK. Από τη δημοσίευση Proc. National Academy of Sciences USA 75: 605, 1978.)

40

(1) Γονικά ομόλογα δίκλωνα μόρια DNA. (2) Ο ανασυνδυασμός μεταξύ των δύο εσωτερικών χρωματίδων δημιουργεί δύο στικτά δίκλωνα προϊόντα με ένα αταί- ριαστο ζεύγος νουκλεοτιδίων στο καθένα. (3) Τα αταίριαστα ζεύγη επιδιορθώ- νονται και στις δύο θέσεις με εκτομή και σύνθεση DNA. (4) Από τις δύο μειω- τικές διαιρέσεις προκύπτει μία τετράδα στην οποία παρατηρείται μετατροπή υπέρ του αλληλομόρφου m+ (αναλογία 3:1 αντί της αναμενόμενης 2:2).

Γονιδιακή μετατροπή με επιδιόρθωση αταίριαστου ζεύγους σε δύο θέσεις.