基因操作 (gene manipulation)分子選殖 (molecular cloning) 之目的，是要大量複製一段指定的核酸片段。在此過程中，所有的核酸片段均分別被植入載體，然後轉入宿主細胞，在其中大量複製，放大這些核酸片段的數目。同時，因為一個宿主細胞只能讓一種核酸大量複製 (1 plasmid, 1 cell) ，因此所得到的大量核酸，也是均質的核酸分子。

當一個含有目標核酸的載體進入宿主細胞，載體複製數目可達數百個 (x 100) ；同時因為細胞本身的分裂，在培養基上長成菌落，每菌落可達數千個細胞 (x 1,000) 。 因此一特定核酸可經由此種過程，由一個分子放大成數十萬個分子；再以專一性探針或篩選方式，挑出含有所要基因的菌落。

如此，利用分子選殖手法把一段核酸數目放大，並得到純質的核酸片段，是基因操作的基本精神。包括基因選殖及表現 (Gene cloning and expression, 基因轉殖 )、基因治療 (Gene therapy) 、生物資訊學 (Genomics & bioinformatics) 、生物晶片 (Biochips) 、反義基因 (Antisense technique) 、 PCR 基因放大 (PCR technology)

載體的條件：具有複製起點， DNA 才可以在宿主細胞中進行複製。必須相當小才能易於操作。具有許多限制酶作用位置以供選殖 DNA 片段使用。具有選擇性的標記可以用來顯示外來 DNA 是否已經被插入載體中，

或追蹤重組 DNA 是否已轉移至細胞中。

選殖載體選殖載體(cloning vector)(cloning vector)

pGEM-T vector

經 Taq DNA 聚合酶擴增後的 PCR 產物末端都帶有單個 A。正是基於這一原理， pGEM 質粒經 EcoR V 切成平端後，在開口端加上一個 T製成 T載體，一方面避免了自身環化 (Self ligation) ，另一方面由於 T-A 互補，從而提高了 T載體與 PCR 產物之間的連接效率。由於 T-A 克隆只需純化 PCR 產物，因而操作較為簡便。含絲狀噬菌體 f1 的複製起始區 (f1 phage region) ，用於產生環狀 ssDNA藉以提高 DNA拷貝數 .

含有 T7 和 SP6 RNA 聚合酶啟動子來提高轉錄效果 .

在 MCS(Multiple cloning size)區域具有編碼β-半乳糖苷酶的基因 (LacZ) ，插入失活α-肽可在指示平板上通過藍、白菌落直接篩選重組菌落。

T7 RNA Polymerase

基本上是由 T7 phage ( 一種噬菌體 )中發現的一種 RNA 聚合酶 ,分子量約 99kD

a基於這種噬菌體的生長特性，研究學者發現它的 RNA 聚合酶有很強的轉錄活性，很適合用來放在質體中大量表現我們所想要的基因，乃至於最後作出蛋白來純化。所以眾多的生技公司將它放置在表現載體中，利用它強而有力的活性，能大量作出目標的基因。專門催化 5‘→3’方向的 RNA形成過程。T7 RNA 聚合酶具有高度啟動子專一性，且只會轉錄 T7噬菌體中位於 T7 啟動子下游的的 DNA 或 DNA 複製品。此酵素在合成 RNA 的過程中，需要 DNA模板與鎂離子（ Mg2+ ）作為輔因子。牛血清蛋白（ bovine serum albumin ， BSA）及精胺（ spermidine）對此酵素具促進效果。 噬菌體之 RNA 聚合酶如 SP6、 T3及 T7多由一條多胜月太（ polypeptide）所構成，在轉錄反應時所需辨認的 promoter 長度僅 20 bp左右，加上轉錄起始位置明確，轉錄效能良好，成了目前進行胞外轉錄反應時的最佳選擇。欲進行胞外轉錄反應時，僅需將目標基因選殖至帶有 SP6、 T3或 T7 promoter 的轉錄載體，即可運用 SP6、 T3或 T7 RNA polymerases 活性在試管內合成正（ sense）或反股（ antisense） RNA 。

DNA 重組成功的篩選方法 -菌落藍白篩選

確認載體成功進入細菌 使用抗生素標記

確認基因有接入載體 lacZ基因被插壞

RR

誘導物

無作用之抑制劑

乳糖操作組

半乳糖苷酶 滲入酶 乙醯基轉化酶

(Klein et al.2003)

P OCAP

X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranoside )

半乳糖苷酶

確定 DNA 重組成功的方法

TA cloning常見之定序問題 Ligation 效率不佳之問題。

TA cloning 是利用 non-proofreading DNA polymerase ( 例如 :Taq.Tfl.Tth 等 )會在 PCR 產物 3’端加上一個 A的特性，作選殖。 但是具許多文獻指出 Taq.Tfl.Tth 等酵素不僅會在 3’端加一個 A， 有一半機率則會加上一個 G。

有 3’→5’外切核酸酶的 DNA polymerase ( 例如 Pfu.Vent) 不能 用於 TA clone 。

TA cloning 可能會有正反接之問題。 TA cloning 定序曾經發生過 T7 primer 有 multiple binding site.