(Fito)hormony i przewodzenie sygnałów u roślin

Phytohormones and Signal Transduction (ST)

in plants

Hormony roślinne

• Związki organiczne o niewielkiej masie cząsteczkowej, które wpływają na odpowiedź fizjologiczną na bodźce środowiskowe, działają w niewielkich stężeniach (zwykle poniżej 10-7 M). Nie są bezpośrednio zaangażowane w procesy metaboliczne i rozwojowe, ale wpływają na ich przebieg i kierunek.

• Hormony roślinne są stosowane na dużą skalę w rolnictwie, ogrodnictwie i biotechnologii, do modyfikowania wzrostu i rozwoju roślin.

• Regulują lub integrują wiele procesów komórkowych i fizjologicznych w tym: Podział komórkowy, Wzrost komórek na objętość, Różnicowanie komórek, Kwitnienie, Dojrzewanie owoców, Ruch (tropizmy), Spoczynek nasion, Kiełkowanie nasion, Starzenie się, Opadanie liści, Przewodzenie szparkowe

Czy termin ‘hormon’, w odniesieniu do substancji roślinnych, jest uzasadniony?

Hormony roślinne

• Tylko małe cząsteczki• Produkowane w całej roślinie• Działają głównie na cele lokalne

(sąsiadujące komórki i tkanki)• Efekty danego hormonu różnią się w

zależności od interakcji z innymi hormonami

• Brak centralnej regulacji

Roślinne regulatory wzrostu?

Hormony zwierzęce

• Peptydy/białka oraz małe cząsteczki• Produkowane w wyspecjalizowanych

‘gruczołach’• Działają głównie na cele odległe• Efekty danego hormonu silnie

specyficzne• Regulowane przez centralny system

nerwowy

Klasyfikacja hormonów roślinnych

Główne klasy hormonów roślinnych

• Auksyny

• Cytokininy

• Gibereliny

• Kwas abscysynowy (ABA)

• Etylen

Substancje ‘hormono-podobne’ produkowane przez rośliny

• Poliaminy

• Kwas jasmonowy

• Kwas salicylowy

• Brassinosteroidy

• Florigeny

• Fitochrom (fotoreceptor)

• Tlenek azotu

Auksyny• Stymuluje: wydłużanie komórek, podział

komórek w kambium, i w kombinacji z cytokininami, w kulturach tkankowych, różnicowanie elementów naczyniowych, inicjację korzenia na uciętej łodzydze, inicjację korzeni w kulturach tkankowych.

• Pośredniczy w odpowiedziach tropicznych (zaginanie pędu/korzeni) w odpowiedzi na światło i siłę ciężkości.

• Wytwarzana w stożku wzrostu, hamuje pąki boczne.

• Opóźnia starzenie liści

• Może hamować lub promować (poprzez stymulację etylenem) opadanie liści i owoców.

• Indukuje zawiązywanie i wzrost owocu (u niektórych roślin)

• Opóźnia dojrzewanie owoców

• Stymuluje wzrost organów kwiatu

• Stymuluje wytwarzanie etylenu

IAA- kwas indolilo-3-octowy, pochodna tryptofanu

Auksyna wytwarzana w nasionach powoduje wzrost owocu

Rozwój normalnyPo usunięciu nasiion

Auksyna dodana pousunięciu nasion

Cytokininy

• Stymulują: podziały komórkowe

• Stymulują morfogenezę – inicjację pędu/tworzenie pąka w kulturach tkankowych

• Stymulują wzrost pędów bocznych – likwidują dominację apikalną.

• Stymulują ekspansje liści wynikającą z powiększania komórek.

• U niektórych gatunków wzmagają otwieranie aparatów szparkowych.

• Stymulują przekształcenie etioplastów w chloroplasty poprzez stymulacje syntezy chlorofilu.

Zeatyna, pochodnaadeniny

Współdziałanie i anatgonizm auksyny i cytokininy

Cytokinina(kinetyna)

Auksyna

Gibereliny

• Stymuluje: • wydłużanie pędu przez stymulację

podziałów i wydłużania komórek.

• wypuszczanie pędu kwiatowego i kwitnienie w długim dniu

• Przerywa spoczynek nasion u roślin wymagających stratyfikacji lub światła do indukcji kiełkowania.

• Stymuluje wytwarzanie enzymów (a-amylazy) w kiełkujących ziarnach zbóż w celu mobilizacji rezerw nasienia.

• Może powodować partenokarpiczny rozwój owocu (bez nasion).

• Może opóźniać starzenia w liściach i owocach cytrusów..

GA3 – kwas giberelinowy

Fenotypy mutantów Arabidopsis w genach kodujących receptory: auksyny i gibereliny

• A. Roślina dzika (wt) ( z prawej) i poczwórny mutant w genach kodujących elementy receptora ( z lewej)

• B. podziały komórkowe w hypophysis (zaczątek korzenia i czapeczki) silnie ograniczone (z prawej) w porównaniu z wt.

• C. Mutant w genie gid1 (receptor giberelin) u ryżu ( z lewej), wt – z prawej (insert – powiększenie mutanta). Wzrost w mutancie silnie ograniczony.

ABA• Stymuluje zamykanie szparek (susza

indukuje syntezę ABA).

• Hamuje wzrost pędu, ale nie korzenia (może nawet stymulować wzrost korzenia).

• Indukuje syntezę białek zapasowych w nasionach.

• Hamuje efekt giberelin na syntezę de novo α-amylazy.

• Wywiera pewien wpływ na indukcję i utrzymywanie spoczynku nasion.

• Indukuje transkrypcję genów, w szczególności kodujących inhibitory proteinaz, w odpowiedzi na zranienie (to tłumaczy rolę w obronie przed patogenami).

Kwas abscysynowy,pochodna szlaku terpenoidów

Etylen

• H2C=CH2

• Wytwarzany z aminokwasu metioniny poprzez cykliczny pośrednik (kwas 1-aminocyklopropano karboksylowy – ACC)

•

• Stymuluje wychodzenie ze spoczynku.

• Stymuluje wzrost, różnicowanie pędu i korzenia.

• Stymuluje opadanie liści i owoców.

• Stymuluje otwieranie kwiatów.

• Stymuluje starzenie kwiatów i owoców.

• Stymuluje dojrzewanie owoców.

Fenotypy mutantów w genach kodujących receptory fitohormonów

• Mutanty w receptorach (w porównaniu z wt):

• A. Brassinosteroidów• B. Etylenu• C. Cytokininy• D. Cytokininy ( pokrój)• D – Cytokininy - przekształcone

komórki wiązek korzeniowych –dół.• E. ABA (mutant w genie fca – z

prawej) kwitnie później.

Mechanizm działania auksyn i giberelin

Kompleks proteasomu

Białko Della

Receptor auksyny

Receptor gibereliny

Jeden z domniemanych receptorów ABA

• Przy niskim stężeniu ABA, FCA i FY oddziałują i wspólnie zapobiegają nagromadzaniu się FLC, negatywnego regulatora kwitnienia

• Oddziaływanie ABA z FCA odblokowuje FLC

Szlaki sygnałowe etylenu i cytokininy

Białko „histidine phosphotransfer protein”

Potencjalne sensory stresów abiotycznych (chłód, susza, zasolenie)Dwuskładnikowa kinaza histydynowa

•   Dwuskładnikowy system transferu fosforanu

• Składa się z dimerycznego transbłonowego sensora – kinazy histydynowej (składnik I)- termosensor i cytoplaz- matycznego regulatora odpowiedzi (składnik II).

• Domena kinazowa dwuskładnikowej kinazy histydynowej jest modułem 250-aminokwasowym,z czterema konserwowanymi blokami sekwencji ulokowanymi w domenie wiążącej ATP (N, G1 , F i G2).

Hormonalna regulacja kiełkowania

Przewodzenie sygnałów (Signal Transduction)-podstawowe pojęcia

• ST = proces przetwarzana jednego rodzaju sygnału (bodźca) w inny.

• Czas: ST obejmuje procesy trwające od milisekund do sekund.• Kaskada sygnałowa (szlak wtórnych przekaźników) = bodziec

inicjujący łańcuch wydarzeń obejmujących wiele enzymów i innych cząsteczek. Efekt: słaby bodziec uwalnia silną odpowiedź.

• ST u jednokomórkowców – spektrum sposobów reakcji na zmienne warunki środowiska

• ST u wielokomórkowców – ma podłoże w procesach na poziomie komórki. Inne mechanizmy reakcji na bodźce, rośliny vs zwierzęta.

Ogólny schemat szlaku przewodzenia sygnału

1) Odebranie sygnału;2) Uruchomienie (indukcja) pierwszej grupy wtórnych przekaźników

(np. fosforany inozytolu, reaktywne formy tlenu - ROS);3) Modulacja przez wtórne przekaźniki pierwszej grupy poziomu

wtórnych przekaźników następnej grupy, np. poziomu wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca 2+ ;

4) Inicjacja (na ogół) kaskady fosforylacji białek;5) Docelowa modyfikacja (na ogół przez fosforylację/defosforylację) białek bezpośrednio zaangażowanych w ochronę komórki lub

będących czynnikami transkrypcyjnymi kontrolującymi specyficznie reagujące na dany sygnał (np. stres) zestawy genów;

6) Udział produktów tych genów w wytwarzaniu substancji regulatorowych, np. hormonów roślinnych (ABA), etylenu, czy kwasu salicylowego (S.A.)

Ogólny schemat przewodzenia sygnałów u roślin na przykładzie reakcji na stresy abiotyczne (zimno, susza, zasolenie)

Pierwotna indukcja przekaźników wtórnych może indukować wtórne pętle sygnałowe

Sygnały/bodźce zewnątrzkomórkoweRodzaje, sposób działania

• Cząsteczki substancji obecne w środowisku komórki. Temperatura, światło, siła osmotyczna, prąd elektryczny, ciśnienie, zranienie.

• Większość substancji w zewnętrznym środowisku ma hydrofilowy charakter, nie przechodzi przez błonę komórkową (wyjątek, np. steroidy), ale może z nią oddziaływać. Bardzo wiele wiąże się (dokowanie) do białek receptorowych w błonie, posiadających wystające na zewnątrz domeny, co indukuje zmiany w konformacji całej cząsteczki przenoszące się do domeny wewnętrznej i inicjuje wydarzenia wewnątrz komórki.

• Receptory są b. specyficzne w stosunku do ligandów. Nawet drobna zmiana w budowie ligandu uniemożliwia wiązanie. Substancje o budowie bardzo zbliżonej do rzeczywistych ligandów mogą być inhibitorami.

Rośliny potrzebują wielu sensorów, aby wyczuwać stresy abiotyczne

• Podstawowe stresy abiotyczne: niska temperatura, susza i wysokie zasolenie oddziałują na wiele różnych elementów komórki.

• Niska temperatura, susza: ograniczenie mechaniczne, zmiany aktywności makrocząsteczek, zmniejszony potencjał osmotyczny środowiska komórkowego

• Wysokie zasolenie: zmiany w przewodnictwie jonowym, zmiana warunków osmotycznych.

• Nie istnieją pojedyncze wyspecjalizowane sensory stresów abiotycznych. Pojedynczy sensor może jedynie regulować odnogę drogi sygnałowej reagując na wybrany element działania stresu (np. niska temperatura zmienia płynność błony. Sensor wykrywający tę zmianę inicjuje kaskadę sygnałową w odpowiedzi na zmianę płynności błony, ale nie kontroluje sygnalizacji zainicjowanej przez wewnątrzkomórkowe białko, którego konformacja lub aktywność została zmieniona przez niska temperaturę).

Potencjalne sensory stresów abiotycznych (chłód, susza, zasolenie)Ca 2+

• Wszystkie trzy stresy indukują przejściowy wpływ Ca 2+ do cytoplazmy - kanały odpowiedzialne za wpływ Ca 2+ są jednym z potencjalnych sensorów (temperatura, płynność błony, przebudowa cytoszkieletu)

Kanał wapniowy w błonie komórkowej

Sygnały wewnątrzkomórkowe(wtórne przekaźniki)

• Heterotrimeryczne białka G• Małe GTPazy• Cykliczne nukleotydy (cAMP, cGMP)• Jony wapnia (Ca 2+ )• Reaktywne formy tlenu (ROS)

• Pochodne fosfoinozytoli: trifosforan fosfatydyloinosytolu (PIP 3) ,

trifosforan inozytolu (IP 3)

• Diacyloglicerol (DAG), • Różne kinazy i fosfatazy białkowe

Sygnałami indukowanymi wtórnie mogą być także hormony roślinne

Białka G

• Pełna nazwa białek G ( G protein) to „białka wiążące GTP (GTP-binding protein), ponieważ w stanie aktywnym wiążą GTP (trifosforan guanozyny).  Istnieją dwa rodzaje białek G: heterotrimeryczne białka G i monomeryczne białka G (small G proteins). Receptory sprzężone z białkiem G są sprzężone z heterotrimerycznym białkiem G

W skład heterotrimerycznego białka G wchodzą trzy podjednostki: α, β

i γ.  W stanie nieaktywnym podjednostka α jest związana z GDP

Cykl aktywacji i deaktywacji heterotrimerycznego białka G

Różnorodne szlaki przekazywania sygnałów związane z receptorami sprzężonymi z białkiem G

Cykliczne nukleotydy

• cAMP i cGMP występują u roślin i odgrywają rolę w regulacji błonowych kanałów jonowych

Kanały dla jonów jednowartościowych

Fosforany inozytolu

Uproszczony schemat transdukcji sygnałów u zwierząt

Główne typy sygnalizacji w stresach abiotycznych

Kinazy białkowe MAP w sygnalizacji u zwierząt

Indukcja syntezy kwasu abscysynowego (ABA) jako rezultat przekazywania sygnałów w stresie abiotycznym

Tested genes

Sieć regulatorowa ekspresji genów w odpowiedzi na chłód, stres osmotyczny (np. susza) i wysokie zasolenie(K. Nakashima and K. Yamaguchi-Shinozaki)

Przekazywanie sygnałów w komórkach szparkowych (guard cells)

• GC umożliwiają funkcjonowanie otworów w aparatach szparkowych w epidermie liści i pędów. Otwory kluczowe dla pobierania CO2 do lisci do fotosyntezy. W zamian, rośliny tracą tą drogą do atmosfery (transpiracja) 95% posiadanej wody.

• Mechanizmy przewodzenia sygnałów w GC integrują bodźce hormonalne, sygnały świetlne, status wody, CO2, temperatury i innych warunków środowiska aby modulować otwarcie szparki w celu regulacji wymiany gazowej i transpiracji.

• GC stanowią zaawansowany model badawczy przewodzenia sygnałów u roślin.

Zamykanie szparek

• ABA syntetyzowany w odpowiedzi na stres suszy, inicjuje zamykanie szparek i hamuje ich otwieranie.

• Inne czynniki powodujące zamykanie: ciemność i wzrost stężenia CO2

Przewodzenie sygnałów świetlnych i otwieranie szparek

• Otwieranie szparek napędzane jest usuwaniem H+ za pośrednictwem protonowej (H+)-ATPazy błonowej, aktywowanej auksyną, światłem czerwonym i światłem niebieskim.

• GC mają autonomiczne receptory światła indukujące otwarcie szparek.

• Aktywacja (H+)-ATPazy błonowej przez te receptory powoduje hiperpolaryzację błony komórkowej, co wywołuje pobieranie K+ via specyficzne kanały pobierające K+ do środka. Równolegle, stymulacja metabolizmu skrobi prowadzi do akumulacji w GC aktywnego osmotycznie bursztynianu. Dodatkowo, w GC rośnie poziom sacharozy. W początkowym okresie dnia głównym elementem podtrzymującym otwarcie jest K+, w późniejszym natomiast sacharoza.

Niektóre mediatory w szlaku sygnalizacji związanym z regulacja otworów szparkowych przez ABA

Rola ABA - schemat

Mechanizm reakcji stresowej u roślin

Oznaczenia niektórych czynników w szlaku ABA

• AtRac1 – GTPaza z rodziny Rho• ROS – reaktywne formy tlenu• S1P – fosforan sfingozyny• ICa2+ - błonowy kanał wapniowy• MAPK – kinaza MAP• AAPK – kinaza białkowa aktywowana ABA• Ga – podjednostka a heterotrimerycznego białka G• Nt-Syr1 – syntaksyna związana z wędrówka przez błony• PLC – fosfolipaza C• PLD – fosfolipaza D• cADPR – cykliczna adenozynodifosforyboza• IP6 – heksafosforan inozytolu• ABH2 – białko wiążące się do czapeczki (cap) mRNA• ABI1 i ABI2 – fosfatazy fosfobiałek

BIP2(3-32)

HD2A

ATSWI3C

ATSWI3A ATSWI3B

FCA

ATSWI3D

AtBRM

ATSWP73A

HD2B

PRL2 AMIDASE

PRL1

BSH

CobW

PIRIN

Farrona et. al., 2004

SAHH

Interactions identifiedIn Csaba Koncz’ laboratory Interactions verified inpGBT9/pGAD424 systemInteractions verified in pGBT9/pACT2 systemWeak interactions identified in pGBT9/pACT2 system

Interactions identified by other researchers from our laboratoryin the pGBT9/pGAD424 system

Proteins studied in Csaba Koncz’ laboratory

Core subunits of theSWI/SNF chromatin remodeling complex except for ATPase plus the FCA protein

Proteins identified through the yeast two hybrd screen

ATPase

BIP1(1-57)

EBF1

SRC2

ANAC102

JMJC

RPT3

AAA

ATGP4

Di19

COP9

E3

ATAF2

ARM

BIP3(3-45)

RPL12

esterase family protein

BIP5 (1-30)

BIP4(3-46)

BIP6(11-16)

BIP7(11-17)

MTO3

XRCC4

AKIN 10/11

Analysis of 9 days old atswi3c-1 seedlings on 1/2 MS medium

containing different ABA concentration

0,0 0,5 1,0 2,0 μM ABA

wt

atswi3c-1

Wniosek: mutant atswi3c jest nadwrażliwy na ABA

Germination of atswi3c-1 mutant on gibberellins, 10 days old seedlingsGibberellins 5 mg/l

wt atswi3c-1

- gib - gib + gib+ gib

Wniosek: mutant atswi3c reaguje normalnie na gibereliny

5 mm

5 mm

5 mm

5 mm

5 mm

Figure 1. Dark-grown eer1 seedlings have an enhanced ethyleneresponse when exposed to the ethylene precursor ACC. Dark-grownwild-type and eer1seedlings treated with either 10 mM AVG, 0 mM ACC (nt, no treatment), or 10 mM ACC for 3.5 d.

Example of ethylene hypersensitivity

The Arabidopsis eer1 Mutant Has Enhanced Ethylene Responses in the Hypocotyl and Stem1Paul B. Larsen2 and Caren Chang* Plant Physiology, February 2001, Vol. 125, pp. 1061–1073,

Analysis of 7 days old atswi3c-1 seedlings on 1/2 MS medium

containing 50 μM ACC or ethephon (dark germination)

wt

atswi3c-1

darkness0,5% sugar

50 μM ACC

atswi3c-1 plants treated with ACC and ethephon show thickened hypocotyls and stronger twisting than wt plants

50 mg/ml ethephon

Analysis of atswi3c phenotype – crosses: ethylene signalling pathway

Stepanova & Alonso, 2005

mutant used for crosseswith atswi3c

wt

6 days old plants turned 90 and grown 4 days further

o

prl-1

Analysis of geotropic answer of wt and prl-1 plants

prl-1 mutant answers to turning platesin similar way as wt plants

angle 96o angle 90

o

6 days old plants turned 90 and grown 4 days further

o

wt atswi3c-1

**

*

*

* *

* heterozygote

Analysis of geotropic answer of wt and atswi3c-1 plants

atswi3c-1 mutant does not answer to turning plates(lack of geotropism? random answer)

angle 96o

angle 177o