เอนไซม์ (enzyme)

52
เเเเเเเ (Enzyme) To protect the environment. เเเเเเเเเเเเเเเ เเเเเ เเเเเเเเเเเเเเเเ www.zymetec.com Made in USA. เเเเเเ เเเเเเเเเ เเเ 02-450 6038

Upload: dextra

Post on 04-Jan-2016

288 views

Category:

Documents


2 download

DESCRIPTION

เอนไซม์ (Enzyme). บริษัท ไทย เซมเทค จำกัด. To protect the environment. เทคโนโลยีชีวภาพ เพื่อ รักษาสิ่งแวดล้อม. www.zymetec.com. 02-450 6038. Made in USA. ความเป็นมาของ เอนไซม์. - PowerPoint PPT Presentation

TRANSCRIPT

เอนไซม์� (Enzyme)

To protect the environment.เทคโนโลยี�ชี�วภาพ เพ��อรั�กษาสิ่��ง

แวดล�อมwww.zymetec.com

Made in USA.

บริ�ษั ท ไทยเซม์เทค จำ��กั ด

02-450 6038

คว�ม์เป็�นม์�ของ เอนไซม์�เอนไซม์�ถู�กัน��ม์�ใช้�คริ งแริกั ในป็" ค.ศ. 1878 ซ$%งม์&กั�ริใช้�ใน

กั�ริเริ'งป็ฏิ�กั�ริ�ย�กั�ริหม์ กัน� �ต�ลของย&สต� พบว'�ส�ม์�ริถูเริ'งป็ฏิ�กั�ริ�ย�ให�เริ.วข$ น

ค��ว'� Enzyme ม์�จำ�กัภ�ษั�กัริ&กั แป็ลว'� In yeast

- เอนไซม์�เป็�นโป็ริต&นท&%ม์&ล กัษัณะกั�อนกัลม์ ท&%ถู�กัส งเคริ�ะห�ข$ นเพ3%อท��หน��ท&%ต วเริ'งป็ฏิ�กั�ริ�ย�เคม์&ต'�งๆในกัริะบวนกั�ริเม์ต�บอล�ซ$ม์ของส�%งม์&ช้&ว�ต โดยม์&กั�ริท��ง�นท&%คล��ยคล$งกั นกั บกั�ริท��ง�นของคะตะล�สต�

เอนไซม� (Enzyme) เอนไซม� ค�อ สิ่ารัท��เรั ง

ปฏิ�ก�รั�ยีาโดยีท#าหน�าท��เป%น catalyst ม�ความจำ#าเพาะก�บ substrate สิ่)ง โดยีเอนไซม�ท#างานเรั งปฏิ�ก�รั�ยีาโดยีลดพล�งงานกรัะตุ้+�น สิ่ วนใหญ่ เป%นสิ่ารัอ�นทรั�ยี�กล+ มโปรัตุ้�น แบ งเป%น 2 ชีน�ด ค�อ1. เอนไซม�ท��ท#างานภายีในเซลล� (endoenzyme หรั�อ intracellular enzyme)2. เอนไซม�ท��ท#างานภายีนอกเซลล� (exoenzyme หรั�อ extracellular enzyme)

เอนไซม�ปรัะกอบด�วยีสิ่ วนท��เป%น โปรัตุ้�น หรั�อ apoenzyme รัวมก�บสิ่ารัอ�นทรั�ยี� ท��เรั�ยีกว า coenzyme จำ.งเป%นเอนไซม�ท��สิ่มบ)รัณ์� หรั�อ holoenzyme ในบางครั�0งอาจำม�ไอออนท��สิ่#าค�ญ่ในการัท#างานของเอนไซม�เรั�ยีกว า cofactor

การัท#างานของเอนไซม�

ล กัษัณะพ�เศษัของเอนไซม์�ท&%แตกัต'�งจำ�กัคะตะล�สต�1 . ม์&คว�ม์จำ��เพ�ะ (selectivity) ต'อป็ฏิ�กั�ริ�ย�และซ บส

เตริท โดยท&%เอนไซม์�หน$%งจำะท��ง�นได�ข$ นอย�'กั บโคริงสริ��งของซ บสเตริทท&%จำะส�ม์�ริถูจำ บได�พอเหม์�ะภ�ยในริ'อง

2. ม์&คว�ม์ส�ม์�ริถูในกั�ริเริ'งได�ส�งม์�กั โดยบอกัเป็�นค'�หม์5นเว&ยน (turnover number) ซ$%งหม์�ยถู$ง จำ��นวนส�ริต งต�นท&%ท��ป็ฏิ�กั�ริ�ย�เป็ล&%ยนเป็�นผล�ตผลของป็ฏิ�กั�ริ�ย�ใน 1 หน'วยเวล� เม์3%อใช้�เอนไซม์� 1 โม์เลกั5ล โดยเอนไซม์�ต'�งๆจำะม์&ค'�น& อย�'ริะหว'�ง 10 – 108 ต'อว�น�ท&

โคริงสริ��งของเอนไซม์� เอนไซม์�ม์&ขน�ดต งแต' 12,000 ถู$ง กัว'� 1 ล��นด�ลต น

ส'วนใหญ่'เป็�นส�ริป็ริะกัอบโป็ริต&น โคริงสริ��งของเอนไซม์�แบ'งได� 2 ช้น�ด ค3อ

1 . โป็ริต&นธริริม์ด� (simple protein) เป็�นโป็ริต&นท&%ม์&กัริดอะม์�โนเป็�นองค�ป็ริะกัอบอย'�งเด&ยว เอนไซม์�พวกัน& ม์&โคริงสริ��งเป็�นทริงกัลม์

2 . โป็ริต&นริวม์ต วกั บส�ริอ3%น (conjugated protein) ป็ริะกัอบด�วยกัริดอะม์�โนริวม์กั บส�ริอ3%นท&%ไม์'ใช้'โป็ริต&น ท&%เริ&ยกัว'�โคแฟกัเตอริ� (cofactor) จำ$งจำะส�ม์�ริถูท��ง�นได�อย'�งสม์บ�ริณ� เริ&ยกัเอนไซม์�กัล5'ม์น& ว'� holoenzyme ถู��แยกัโคแฟกัเตอริ�ออกัจำะท��ให�เอนไซม์�กัล5'ม์น& จำะไม์'ส�ม์�ริถูท��ง�นได�อย'�งสม์บ�ริณ�เริ&ยกัว'� อะโพเอนไซม์� (apoenzyme)

Apoenzyme + Cofactor = Holoenzyme

Inorganic เช้'น Fe 2+ ion etc.

Organic เช้'น vitamin เริ&ยกั coenzyme

โคแฟกัเตอริ� แบ'งได�เป็�น 2 พวกัค3อ1 . ส�ริอน�นทริ&ย�หริ3อไอออนของโลหะ (metal ions) หริ3อ

เกัล3อแริ'ม์&โคริงสริ��งง'�ยๆได�แกั' Fe 2+ , Mg 2+ , Mn 2+ เป็�นต�น

2 . ส�ริอ�นทริ&ย�หริ3อโคเอนไซม์� เป็�นโม์เลกั5ลอ�นทริ&ย�ม์&โคริงสริ��งซ บซ�อน ท&%ม์&ขน�ดเล.กัและทนต'อคว�ม์ริ�อนได�ด& โคเอนไซม์�ส'วนใหญ่'จำะเป็�นว�ต�ม์�นท&%ละล�ยน� � ท��หน��ท&%ในกั�ริย��ยหม์�'ต'�งๆ เช้'น หม์�'ไฮโดริเจำน อะม์�โน ฟอสเฟต

โดยถู�� โคเอนไซม์�จำ บกั บอะโพเอนไซม์�อย'�งหลวม์ๆ เริ&ยกั โคเอนไซม์�กัล5'ม์น& ว'� ซ บสเตริทริ'วม์ (cosubstrate) แต'ถู��โคเอนไซม์�จำ บกั นอย'�งแน'นหน�กั บเอนไซม์�ด�วยพ นธะโคว�เลนต� จำะถู�กัเริ&ยกัว'�หม์�'พริอสเทต�กั (prostetic group)

Active และ Enzyme-substrate complex

เอนไซม์�ท&%ผล�ตโดยริ'�งกั�ย แบ'งได�เป็�น 2 กัล5'ม์ ค3อ1 . เอนไซม์�ย'อยอ�ห�ริ (digestive enzyme) ท��หน��ท&%

ย'อยอ�ห�ริภ�ยในริะบบท�งเด�นอ�ห�ริเพ3%อส'งส�ริอ�ห�ริไป็ย งเซลล�ต'�งๆในริ'�งกั�ริ ได�แกั'1.1 เอนไซม์�โป็ริต&เอส (protease) ย'อยโป็ริต&น1.2 เอนไซม์�ไลเป็ส (Lipase) ย'อยไขม์ น1.3 เอนไซม์�อะไม์เลส (amylase) ย'อยแป็;ง

2. เม์ต�บอล�คเอนไซม์� (metabolic enzyme) ม์&อย�'ในเซลล�ท5กัเซลล�ในท5กัอว ยวะ เอนไซม์�น& จำะท��หน��ท&%เกั&%ยวกั บท5กัป็ฏิ�กั�ริ�ย�ท&%เกั�ดข$ นในริ'�งกั�ย ม์&หน��ท&%ซ'อม์แซม์ส'วนท&%ส$กัหริอ ช้'วยริะบบภ�ม์�ค5�ม์กั น

เอนไซม์�แบ'งได� 2 ป็ริะเภทค3อ1 . ไอโซเอนไซม์� หริ3อ ไอโซไซม์� (isoenzyme หริ3อ

isozyme) เป็�นเอนไซม์�ท&%ม์&โคริงสริ��งแตกัต'�งกั นแต'ส�ม์�ริถูเริ'งป็ฏิ�กั�ริ�ย�เด&ยวกั นได�

2 . อ ลโลสเตอริ�กัเอนไซม์� (allosteric enzyme) หริ3อ เอนไซม์�ควบค5ม์ (regulatory enzyme) เป็�นเอนไซม์�ท&%ป็ริะกัอบด�วยหน'วยย'อยๆหล�ยหน'วยริ'วม์กั น เช้'น หน'วยย'อยเริ'ง (catalytic enzyme) ส�ริท&%ม์&อ�ทธ�พลต'อกั�ริควบค5ม์กั�ริท��ง�นของเอนไซม์�เหล'�น& เริ&ยกัว'� ต วควบค5ม์ (effector หริ3อ modulator หริ3อ regulator)

ต วควบค5ม์ ม์& 2 ช้น�ด ค3อ 2.1 ต วเริ'ง (activator) ท��ให�เอนไซม์�ท��ง�นได�ด&ข$ น เริ&ยกั positive modulator2.2 ต วย บย ง (inhibitor) ท��ให�เอนไซม์�ท��ง�นได�ช้��ลง เริ&ยกัว'� negative modulator

บริ�เวณของเอนไซม์�ท&%ม์&ต วควบค5ม์ เริ&ยกั บริ�เวณควบค5ม์ (regulatory site หริ3อ allosteric site)

เริ&ยกั เอนไซม์�ท&%ม์&ท งบริ�เวณเริ'งและบริ�เวณควบค5ม์ว'� อ ลโลสเตอริ�กัเอนไซม์�

กั�ริเริ&ยกัช้3%อต�ม์แบบส�ม์ ญ่ (recommended name)ม์&หล กัเกัณฑ์�ด งน& ค3อ1 . เริ&ยกัต�ม์ช้3%อของซ บสเตริทท&%เอนไซม์�เริ'งป็ฏิ�กั�ริ�ย� แล�ว

ลงท��ยด�วยค��ว'� “ase” เช้'น เอนไซม์�เริ'งป็ฏิ�กั�ริ�ย�กั�ริสล�ยย�เริ&ย เริ&ยกัว'�เอนไซม์�ย�ริ&เอส (Urease)

2. เริ&ยกัต�ม์ช้น�ดของป็ฏิ�กั�ริ�ย�แล�วลงท��ยด�วยค��ว'� “ase” เช้'นเอนไซม์�ออกัซ�เดส (oxidase) เริ'งป็ฏิ�กั�ริ�ย�ออกัซ�เดช้ นของซ บสเตริทท&%ม์& O2

3. เริ&ยกัต�ม์ข�อท&% 1 และ 2 ริวม์กั น เช้'น ไกัลซ&นด&ค�ริ�บอกัซ�เลส (glycinedecarboxylase)

4. เริ&ยกัต�ม์ช้3%อเฉพ�ะไม์'ส ม์พ นธ�กั บซ บสเตริทหริ3อป็ฏิ�กั�ริ�ย�ท&%เกั&%ยวข�อง เช้'นเพป็ซ�น (pepsin) เป็�นเอนไซม์�ย'อยโป็ริต&น เป็�นต�น

กั�ริเริ&ยกัช้3%อเอนไซม์�ต�ม์ริะบบ (systemic name)ต�ม์ข�อตกัลงของกัริริม์�ธ�กั�ริเอนไซม์�น�น�ช้�ต� ได�ม์&กั�ริ

เริ&ยกัช้3%อต�ม์ต วเลข โดยม์&ล กัษัณะค3อ

EC xx.xx.xx.xx (อ กัษัริ x ค3อต วเลข)

Enzyme functional class

subclass

Sub sub

class

ล��ด บท&%

เช้'น EC 2.7.3.2

2 = ช้น�ดเอนไซม์� transferase

7 = ช้น�ดย'อยของริห สต วท&% 1 หม์�ยถู$งกั�ริย��ยหม์�'ฟอสเฟต

3 = ช้น�ดย'อยของริห สต วท&% 2 หม์�ยถู$งกั�ริแบ'งย'อยของหม์�'ฟอสเฟต

2 = ริห สเฉพ�ะต วของเอนไซม์�ช้น�ดน น

การัแบ งเอนไซม�ตุ้ามชีน�ดของปฏิ�ก�รั�ยีา1. oxidoreductase ป็ฏิ�กั�ริ�ย�ออกัซ�เดช้ น-ริ&ด กัช้ น กั�ริ

ถู'�ยทอดอ�เล.กัตริอน

2. transferase ย��ยหม์�'ฟ>งกั�ช้ นจำ�กัส�ริหน$%ง ไป็อ&กัส�ริหน$%ง

3. hydrolase ไฮโดริไลซ�ส แยกัพ นธะด�วยน� �4. lyases เต�ม์พ นธะค�'5. isomerase ไอโซเม์อริ�ไริเซช้ น6. ligases สริ��งพ นธะโดยสล�ย ATP

รั)ปรั างโมเลก+ลของเอนไซม�

กัลไกักั�ริท��ง�นของเอนไซม์�ให� E = Enzyme S = Substrate P = Product ES = Enzyme เม์3%อจำ บกั บ Substrate EP = Enzyme เม์3%อผล�ต Product และย งคงจำ บกั น

อย�'

ข�0นตุ้อนแรัก : เอนไซม� E รัวมตุ้�วก�บสิ่ารัตุ้�0งตุ้�น S ได�เป%นสิ่ารัปรัะกอบ ES E + S ES

การัท#างานของเอนไซม�

ข�0นตุ้อนท��สิ่อง : สิ่ารัปรัะกอบ ES เก�ดการัเปล��ยีนแปลงเป%น ES*

ES* EP

การัท#างานของเอนไซม�

EPES*

ข�0นตุ้อนท��สิ่าม :เก�ด สิ่ารัปรัะกอบ รัะหว างเอนไซม�ก�บผลผล�ตุ้

ข�0นตุ้อนท��สิ่+ดท�ายี :ได�ผลผล�ตุ้ออกมา และได�เอนไซม�กล�บมาเหม�อนเด�ม

EP E + P

จำลน�ศ�สตริ�ของเอนไซม์�

E + S ES E + P k1

k 3

k2

k 4

จำลนศาสิ่ตุ้รั�ของเอนไซม� เอนไซม์�ท��ป็ฏิ�กั�ริ�ย�กั บส บสเตริท เกั�ดเป็�นเอนไซม์�-ส บส

เตริทคอม์เพลกัซ�กั'อนแล�วจำ$งสล�ยในข นตอนท&% 2 ให�ผลผล�ต และเอนไซม์�กัล บค3นม์� อ ตริ�เริ.วของป็ฏิ�กั�ริ�ย�ในกั�ริเป็ล&%ยน S ไป็เป็�น P ข$ นอย�'กั บอ ตริ�เริ.วในกั�ริ เป็ล&%ยน ES ไป็เป็�น P และ E น %นค3อ อ ตริ�เริ.วในกั�ริเกั�ด P จำะข$ นอย�'กั บคว�ม์เข�ม์ข�นของ ES

เม์3%อ k1 k2 k3 และ k4 ค3อ ค'�คว�ม์เริ.วคงท&% (velocity constant) หริ3อ ค'�อ ตริ�เริ.วคงท&% (rate constant) ของป็ฏิ�กั�ริ�ย�ท ง 4

ท&% steady state อ ตริ�เริ.วในกั�ริเกั�ด ES จำะเท'�กั บอ ตริ�เริ.วในกั�ริสล�ย ES ท��ให� [ES] คงท&% จำะได�

สม์กั�ริไม์ค&ล�ส-เม์นเทน (Michaelis-Menten constant) แสิ่ดงถึ.ง ความสิ่�มพ�นธ์�รัะหว างอ�ตุ้รัาเรั6วของปฏิ�ก�รั�ยีา และความ

เข�มข�นของ S เม��อทรัาบ Vmax และ KM

Vmax ค3อ คว�ม์เริ.วส�งส5ด (maximum velocity) ของกั�ริท��ง�นของเอนไซม์�

KM ค3อ ค'�คงท&%ไม์ค&ล�ส-เม์นเทน (Michaelis-Menten constant) ของป็ฏิ�กั�ริ�ย�ของเอนไซม์�ท&% steady state ม์&หน'วยเป็�นโม์ล/ล�ตริ

V = Vmax[S] KM + [S] ท�� V = Vmax /2 หรั�อ ครั.�งหน.�งของความเรั6วสิ่)งสิ่+ด (half

maximal) จำะได� KM = [S]

สิ่มการัไลน�ว�เวอรั�-เบอรั�ก เป็�นสม์กั�ริจำ�กักั�ริกัล บสม์กั�ริไม์ค&ล�ส-เม์นเทน 1 = KM .

1 + 1 v Vmax

[S] Vmax

เม��อเข�ยีนกรัาฟรัะหว าง 1/v และ [S] จำะได�กรัาฟเสิ่�นตุ้รังท��ม�ความชี�น = KM/Vmax และจำ+ดตุ้�ดแกน 1/v ค�อ 1/Vmax และจำ+ตุ้�ดแกน 1/[S] ค�อ -1/KM ท#าให�สิ่ามารัถึหาค า KM และ Vmax ท��ถึ)กตุ้�องได�

Enzyme Kinetics

Increase the substrate concentration,observe the change of enzyme activity

Substrate concentrationExam Chapters

Score

Enzym

e activity

Student A

Student B

Student C

0 1 2 3 4 0 1 2 3 4

Juang RH (2004) BCbasics

Increase Substrate C

oncentration

21 3 4 5 6 7 80

0 2 4 6 8

Substrate (mmole)

Product

80

60

40

20

0

S+E

P

(in a fixed period of time)

Juang RH (2004) BCbasics

Essential of Enzyme Kinetics

E S+ P+

Steady State Theory

In steady state, the production and consumption of the transition state proceed at the same rate. So the concentration of transition state keeps a constant.

SE E

Juang RH (2004) BCbasics

Constant ES Concentration at Steady State

S P

EES

Reaction Time

Concentration

Juang RH (2004) BCbasics

An Example for Enzyme Kinetics (Invertase)

Vmax

Km S

vo

1/S

1vo

Double reciprocal Direct plot

1) Use predefined amount of Enzyme → E

2) Add substrate in various concentrations → S (x ,y)

3) Measure Product in fixed Time (P/t) → vo (y, y)

4) (x, y) plot get hyperbolic curve, estimate → Vmax

5) When y = 1/2 Vmax calculate x ([S]) → Km

1Vmax

- 1 Km

1/2

Jua

ng

RH

(2

00

4)

BC

ba

sics

A Real Example for Enzyme KineticsD

ata

no

1234

0.250.501.02.0

0.420.720.800.92

Absorbance v (mmole/min)[S]

0.210.360.400.46

(1) The product was measured by spectroscopy at 600 nm for 0.05 per mmole(2) Reaction time was 10 min

VelocitySubstrate Product Double reciprocal

1/S 1/v421

0.5

2.081.561.351.16

→→ → →

1.0

0.5

0

v

Dire

ct p

lot

Dou

ble

reci

proc

al 2.0

1.0

0

1/v

-4 -2 0 2 41/[S]

0 1 2[S]

1.0

-3.8

Jua

ng

RH

(2

00

4)

BC

ba

sics

ป8จำจำ�ยีท��ควบค+มการัท#างานของเอนไซม�1.คว�ม์เข�ม์ข�นของเอนไซม์�2.คว�ม์เข�ม์ข�นของส�ริต งต�น หริ3อซ บสเตริต (substrate)3.ค'�คว�ม์เป็�นกัริด-เบส (pH)4.อ5ณหภ�ม์� (optimum temperature) การัยี�บยี�0งการัท#างานของเอนไซม�- การัยี�บยี�0งแบบถึาวรัInhibiter ท��ให�ส'วน active site เป็ล&%ยนแป็ลงไป็ เอนไซม์�ไม์'ส�ม์�ริถูกัล บส�'ในสภ�พท&%ท��ง�นได�อ&กั- การัยี�บยี�0งท��กล�บค�นได� 1.กั�ริย บย งแบบแข'งข น โดยต วย บย งม์&โคริงสริ��งคล��ยกั บซ บสเตริตท��ให� ส�ม์�ริถูแย'งจำ บกั บเอนไซม์�ได� 2.กั�ริย บย งแบบไม์'แข'งข น โดยส�ริเคม์&บ�งช้น�ดไป็จำ บกั บส'วน cofactor ท��ให�เอนไซม์�ไม์'ส�ม์�ริถูท��ง�นได�

การัยี�บยี�0งแบบถึาวรั

การัยี�บยี�0งแบบแข งข�น การัยี�บยี�0งแบบไม แข งข�น

ป8จำจำ�ยีท��ม�ผลตุ้ อการัท#างานของเอนไซม� 1. อ+ณ์หภ)ม� เม์3%ออ5ณหภ�ม์�ส�งข$ น แอกัต�ว&ต&ของเอนไซม์�จำะเพ�%ม์ข$ น

เริ3%อยๆ จำนถู$งจำ5ดส�งส5ดหน$%ง (temperature optimum) แล�วจำะลดลง ซ$%งจำ��เพ�ะต�ม์ช้น�ดของเอนไซม์� ส'วนใหญ่'อย�'ในช้'วงอ5ณหภ�ม์� 25–40 oC แต'ท&%อ5ณหภ�ม์� ส�งกัว'�จำ5ดน& ม์�กัๆ เอนไซม์�จำะเกั�ดกั�ริเส&ยแอกัต�ว&ต&ท�งช้&วภ�พ

2. pH จำ5ดท&%ท��ให�เอนไซม์�ม์&แอกัต�ว&ต&ส�งส5ด เริ&ยกัว'� pH optimum ซ$%งส'วนใหญ่'อย�'ในช้'วง pH 6-7.5 ถู�� pH ส�ง หริ3อต�%�เกั�นไป็จำะท��ให�เกั�ดกั�ริส�ญ่เส&ยแอกัต�ว&ต&ท�งช้&วภ�พ

3. ความเข�มข�นของเอนไซม � ท&%คว�ม์เข�ม์ข�นของส บสเตริทม์�กัเกั�นพอ (excess) อ ตริ�เริ.วของป็ฏิ�กั�ริ�ย� จำะเพ�%ม์ข$ น เม์3%อคว�ม์เข�ม์ข�นของเอนไซม์�เพ�%ม์ข$ น

4. ความเข�มข�นของสิ่�บสิ่เตุ้รัท เม์3%อคว�ม์เข�ม์ข�นของเอนไซม์�คงท&% ท&%คว�ม์เข�ม์ข�นของส บสเตริทน�อยๆ ป็ฏิ�กั�ริ�ย�จำะ เกั�ดข$ นด�วยอ ตริ�เริ.วม์�กัจำนกัริะท %งถู$งคว�ม์เข�ม์ข�นของส บสเตริทจำ5ดหน$%งท&%อ ตริ�เริ.วของ ป็ฏิ�กั�ริ�ย�จำะคงท&% คว�ม์เริ.วของป็ฏิ�กั�ริ�ย�ท&%ส�งส5ด เริ&ยกัว'� คว�ม์เริ.วส�งส5ด (Vmax)

ตุ้�วยี�บยี�0งเอนไซม�แบ'งออกัได�เป็�น 2 ป็ริะเภท1. ตุ้�วยี�บยี�0งแบบผ�นกล�บไม ได� (irreversible

inhibitor) เกั&%ยวกั บกั�ริท��ล�ยหริ3อเป็ล&%ยนแป็ลง functional group 1 หม์�'หริ3อม์�กักัว'�ท&%จำ��เป็�นส��หริ บแอกัต�ว&ต&บนโม์เลกั5ลของเอนไซม์� ซ$%งต วย บย งแบบน& จำะจำ บ กั บเอนไซม์�อย'�งแน'นท งแบบโคว�เลนท�และนอนโคว�เลนท� เช้'น กั�ริย บย งเอนไซม์�ไซโคลออกัซ�จำ�เนส (cyclooxygenase) โดยย�แอสไพริ�น (aspirin หริ3อ acetyl salicylate)

2. ตุ้�วยี�บยี�0ง แบบผ�นกล�บได� (reversible inhibitor) แบ'งเป็�น 3 ช้น�ด

2.1 ตุ้�วยี�บยี�0งแบบแข งข�น (competitive inhibitor) หม์�ยถู$ง ส�ริท&%ส�ม์�ริถูเข�� ไป็แย'งส บสเตริทจำ บท&%บริ�เวณแอกัต&ฟบนโม์เลกั5ลของเอนไซม์� แล�วท��ให�แอกัต�ว&ต&ในกั�ริเริ'งป็ฎิ�กั�ริ�ย� ของเอนไซม์�ลดลง โดยค'� KM เป็ล&%ยน แต' Vmax คงท&% เช้'น กัริดม์�โลน�กัส�ม์�ริถูจำ บเอนไซม์�ซ กัซ�น�กั ด&ไฮโดริเจำเนส (succinic dehydrogenase) ในป็ฏิ�กั�ริ�ย�กั�ริออกัซ�ไดส�กัริดซ กัซ�น�กัไป็เป็�นกัริด ฟ�ม์�ริ�กั เพริ�ะม์&โคริงสริ��งคล��ยกั บกัริดซ กัซ�น�กั

2.2 ตุ้�วยี�งยี�0งแบบไม แข งข�น (noncompetitive inhibitor) หรั�อตุ้�วยี�บยี�0ง แบบผสิ่ม (mixed inhibitor) โดยต วย บย งช้น�ดน& จำะเข��ไป็จำ บท&%บริ�เวณอ3%นบนโม์เลกั5ลของ เอนไซม์�ท&%ไม์'ใช้'บริ�เวณเริ'ง เช้'นบริ�เวณควบค5ม์ ท��ให�โคริงริ'�งของเอนไซม์�เป็ล&%ยนแป็ลงไป็ ท��ให�บริ�เวณเริ'งเป็ล&%ยนไป็จำ$งท��ง�นไม์'ได� เช้'น Cu2+ Hg2+ และ Ag+ หริ3ออน5พ นธ� (derivative) ของม์ นส�ม์�ริถูท��ป็ฏิ�กั�ริ�ย�กั บ หม์�'-SH ของซ�สเตอ&นท��ให�โคริงริ�ป็ส�ม์ม์�ต� (three dimensional conformation) ท&%จำ��เพ�ะของเอนไซม์�เส&ยไป็ ในกัริณ& noncompetitive inhibitor ค'� Vmax เป็ล&%ยนแป็ลง(ลดลง) ส'วน KM ไม์'เป็ล&%ยนแป็ลง

2.3 การัยี�บยี�0งแบบอ�นคอมเพตุ้�ตุ้�ฟ (uncompetitive inhibition) กั�ริย บย ง แบบน& เกั�ดข$ นเม์3%อต วย บย งเข��ริวม์เฉพ�ะกั บเอนไซม์�ส บสเตริทคอม์เพลกัซ�เท'�น นแบบไม์'ผ นกัล บ เกั�ดเป็�น ESI คอม์เพลกัซ� ซ$%งจำะไม์'ได�ผลผล�ตเกั�ดข$ น ล กัษัณะเหม์3อนกั บกั�ริย บย งแบบไม์'แข'งข น โดยไม์'เกั�ดกั�ริ ผ นกัล บ (reversible) เม์3%อเพ�%ม์คว�ม์เข�ม์ข�นของส บสเตริท ค'� Vmax ลดลง และค'� Km ลดลง แต'คว�ม์ช้ นไม์'เป็ล&%ยนแป็ลง

Enzyme Inhibition (Mechanism)

I

I

S

S

S I

I

I II

S

Competitive Non-competitive Uncompetitive

EE

Different siteCompete for

active siteInhibitor

Substrate

Ca

rtoo

n G

uid

eEq

uatio

n an

d De

scrip

tion

[I] binds to free [E] only,and competes with [S];increasing [S] overcomesInhibition by [I].

[I] binds to free [E] or [ES] complex; Increasing [S] cannot overcome [I] inhibition.

[I] binds to [ES] complex only, increasing [S] favorsthe inhibition by [I].

E + S → ES → E + P + I↓EI

E + S → ES → E + P + + I I↓ ↓EI + S →EIS

↑ ↑

E + S → ES → E + P + I ↓ EIS

EI

S X

Juang RH (2004) BCbasics

Km

Enzyme Inhibition (Plots)

I II Competitive Non-competitive Uncompetitive

Dir

ect

Plo

tsD

ou

ble

Rec

ipro

cal

Vmax Vmax

Km Km’ [S], mM

vo

[S], mM

vo

I I

Km [S], mM

Vmax

I

Km’

Vmax’Vmax’

Vmax unchangedKm increased

Vmax decreasedKm unchanged

Both Vmax & Km decreased

I

1/[S]1/Km

1/vo

1/ Vmax

I

Two parallellines

I

Intersect at X axis

1/vo

1/ Vmax

1/[S]1/Km 1/[S]1/Km

1/ Vmax

1/vo

Intersect at Y axis

= Km’

Juang RH (2004) BCbasics

หน'วยว ดกั�ริท��ง�นของเอนไซม์�1 . หน'วยเอนไซม์� หม์�ยถู$ง จำ��นวนเอนไซม์�ท&%ท��ให�ป็ริ�ม์�ณ

ของผล�ตภ ณฑ์�เกั�ดข$ นหริ3อป็ริ�ม์�ณของซ บสเตริทลดลง ม์&ค'�เป็�น ไม์โคริโม์ลต'อน�ท& หน'วยส�กัล (international unit, IU หริ3อ U)

1.0 IU ค3อ แอคต�ว�ต&ของเอนไซม์�หริ3อป็ริ�ม์�ณของเอนไซม์�ท&%เริ'งกั�ริเป็ล&%ยน 1.0 ไม์โคริโม์ลของซ บสเตริทใน 1 น�ท&ท&%อ5ณหภ�ม์� 25 º Cค�ท�ล (katal : kat) หม์�ยถู$ง ป็ริ�ม์�ณของเอนไซม์�ท&%เริ'งกั�ริเป็ล&%ยนแป็ลง 1

โม์ลของซ บสเตริทใน 1 ว�น�ท& หน'วยท&%น�ยม์ใช้� ค3อ µkat , nkat, pkat

1 kat = 1/60 U = 1.67 x 10 -2 U

2. หน'วยแอคต�ว�ต&เฉพ�ะ (specific activity) หม์�ยถู$ง หน'วยเอนไซม์� ต'อ 1 ม์�ลล�กัริ ม์ของโป็ริต&น ใช้�ในกั�ริห�คว�ม์บริ�ส5ทธ�@ของเอนไซม์�

Enzyme Kinetics

vo=Vmax [S]Km + [S]

Km Vmax &

E1E2E3

1st order

zero order

Competitive

Non-competitive

Uncompetitive

Direct plot

Double reciprocal

Bi-substrate reaction alsofollows M-M equation, butone of the substrate shouldbe saturated when estimate the other

Affinity withsubstrate

Maximumvelocity Inh

ibition

Activity

Observe vo change under various [S], resulted plotsyield Vmax and Km

k3 [Et]

kcatTurn overnumber

kcat / Km

Activity Unit

1 mmolemin

Specific Activity

unitmg

Significance

Juang RH (2004) BCbasics

Significance of Enzyme Kinetics

vo =Vmax [S]

Km + [S]

Obtain Vmax and Km

[S] = Low → High [S] = Fixed concentration

zero order

1st order

E3

E2E1

Proportional to

enzyme concentration

v0 = Vmax × K = k3 [Et] × K

Juang RH (2004) BCbasics

Km = [S]

Km + [S] = 2 [S]

Vmax

2=

Vmax [S]

Km + [S]

Km: Affinity with Substrate

If vo =Vmax

2

S2S1 S3

S1 S2 S3

Vmax

1/2

When using different substrate

Affinity changesKm

vo =Vmax [S]

Km + [S]

Jua

ng

RH

(2

00

4)

BC

ba

sics

Km: Hexokinase Example

Glucose + ATP → Glc-6-P + ADP

1

2

3

4

5

6

Glucose Allose Mannose Substratenumber

Km = 8 8,000 5 mM

CHO H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

CHO H-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

CHO HO-C-H HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

Juang RH (2004) BCbasics

Turn Over Number, kcat

vo =Vmax [S]

Km + [S]

(vo)E + S ES E + P

k2

k1 k3

When substrate excess, k3 = kcat, turn over number (t.o.n)

When [substrate] is low

=k3 [E][S]

Km + [S]=

Km

k3 [E][S]

Omit the [substrate] Substrate specificityStart from M-M eq.

Second order(IV)

Juang RH (2004) BCbasics

Turn Over Numbers of Enzymes

Catalase H2O2

Carbonic anhydrase HCO3-

Acetylcholinesterase Acetylcholine

40,000,000

400,000

140,000

b-Lactamase Benzylpenicillin 2,000

Fumarase Fumarate 800

RecA protein (ATPase) ATP 0.4

Enzymes Substrate kcat (s-1)

The number of product transformed from substrate by one enzyme molecule in one second

Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.263

Enzyme Activity Unit

Reaction time (min)P

rodu

ct [P

]0 10 20 30 40

Slopetan

S → P mmole

vo = [P] / min

Unit =

Activity Units

Protein (mg)

t

mmole/min

yx

yx = tan

Jua

ng

RH

(2

00

4)

BC

ba

sics

Specific Activity =