เอนไซม์ (enzyme)
DESCRIPTION
เอนไซม์ (Enzyme). บริษัท ไทย เซมเทค จำกัด. To protect the environment. เทคโนโลยีชีวภาพ เพื่อ รักษาสิ่งแวดล้อม. www.zymetec.com. 02-450 6038. Made in USA. ความเป็นมาของ เอนไซม์. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
เอนไซม์� (Enzyme)
To protect the environment.เทคโนโลยี�ชี�วภาพ เพ��อรั�กษาสิ่��ง
แวดล�อมwww.zymetec.com
Made in USA.
บริ�ษั ท ไทยเซม์เทค จำ��กั ด
02-450 6038
คว�ม์เป็�นม์�ของ เอนไซม์�เอนไซม์�ถู�กัน��ม์�ใช้�คริ งแริกั ในป็" ค.ศ. 1878 ซ$%งม์&กั�ริใช้�ใน
กั�ริเริ'งป็ฏิ�กั�ริ�ย�กั�ริหม์ กัน� �ต�ลของย&สต� พบว'�ส�ม์�ริถูเริ'งป็ฏิ�กั�ริ�ย�ให�เริ.วข$ น
ค��ว'� Enzyme ม์�จำ�กัภ�ษั�กัริ&กั แป็ลว'� In yeast
- เอนไซม์�เป็�นโป็ริต&นท&%ม์&ล กัษัณะกั�อนกัลม์ ท&%ถู�กัส งเคริ�ะห�ข$ นเพ3%อท��หน��ท&%ต วเริ'งป็ฏิ�กั�ริ�ย�เคม์&ต'�งๆในกัริะบวนกั�ริเม์ต�บอล�ซ$ม์ของส�%งม์&ช้&ว�ต โดยม์&กั�ริท��ง�นท&%คล��ยคล$งกั นกั บกั�ริท��ง�นของคะตะล�สต�
เอนไซม� (Enzyme) เอนไซม� ค�อ สิ่ารัท��เรั ง
ปฏิ�ก�รั�ยีาโดยีท#าหน�าท��เป%น catalyst ม�ความจำ#าเพาะก�บ substrate สิ่)ง โดยีเอนไซม�ท#างานเรั งปฏิ�ก�รั�ยีาโดยีลดพล�งงานกรัะตุ้+�น สิ่ วนใหญ่ เป%นสิ่ารัอ�นทรั�ยี�กล+ มโปรัตุ้�น แบ งเป%น 2 ชีน�ด ค�อ1. เอนไซม�ท��ท#างานภายีในเซลล� (endoenzyme หรั�อ intracellular enzyme)2. เอนไซม�ท��ท#างานภายีนอกเซลล� (exoenzyme หรั�อ extracellular enzyme)
เอนไซม�ปรัะกอบด�วยีสิ่ วนท��เป%น โปรัตุ้�น หรั�อ apoenzyme รัวมก�บสิ่ารัอ�นทรั�ยี� ท��เรั�ยีกว า coenzyme จำ.งเป%นเอนไซม�ท��สิ่มบ)รัณ์� หรั�อ holoenzyme ในบางครั�0งอาจำม�ไอออนท��สิ่#าค�ญ่ในการัท#างานของเอนไซม�เรั�ยีกว า cofactor
การัท#างานของเอนไซม�
ล กัษัณะพ�เศษัของเอนไซม์�ท&%แตกัต'�งจำ�กัคะตะล�สต�1 . ม์&คว�ม์จำ��เพ�ะ (selectivity) ต'อป็ฏิ�กั�ริ�ย�และซ บส
เตริท โดยท&%เอนไซม์�หน$%งจำะท��ง�นได�ข$ นอย�'กั บโคริงสริ��งของซ บสเตริทท&%จำะส�ม์�ริถูจำ บได�พอเหม์�ะภ�ยในริ'อง
2. ม์&คว�ม์ส�ม์�ริถูในกั�ริเริ'งได�ส�งม์�กั โดยบอกัเป็�นค'�หม์5นเว&ยน (turnover number) ซ$%งหม์�ยถู$ง จำ��นวนส�ริต งต�นท&%ท��ป็ฏิ�กั�ริ�ย�เป็ล&%ยนเป็�นผล�ตผลของป็ฏิ�กั�ริ�ย�ใน 1 หน'วยเวล� เม์3%อใช้�เอนไซม์� 1 โม์เลกั5ล โดยเอนไซม์�ต'�งๆจำะม์&ค'�น& อย�'ริะหว'�ง 10 – 108 ต'อว�น�ท&
โคริงสริ��งของเอนไซม์� เอนไซม์�ม์&ขน�ดต งแต' 12,000 ถู$ง กัว'� 1 ล��นด�ลต น
ส'วนใหญ่'เป็�นส�ริป็ริะกัอบโป็ริต&น โคริงสริ��งของเอนไซม์�แบ'งได� 2 ช้น�ด ค3อ
1 . โป็ริต&นธริริม์ด� (simple protein) เป็�นโป็ริต&นท&%ม์&กัริดอะม์�โนเป็�นองค�ป็ริะกัอบอย'�งเด&ยว เอนไซม์�พวกัน& ม์&โคริงสริ��งเป็�นทริงกัลม์
2 . โป็ริต&นริวม์ต วกั บส�ริอ3%น (conjugated protein) ป็ริะกัอบด�วยกัริดอะม์�โนริวม์กั บส�ริอ3%นท&%ไม์'ใช้'โป็ริต&น ท&%เริ&ยกัว'�โคแฟกัเตอริ� (cofactor) จำ$งจำะส�ม์�ริถูท��ง�นได�อย'�งสม์บ�ริณ� เริ&ยกัเอนไซม์�กัล5'ม์น& ว'� holoenzyme ถู��แยกัโคแฟกัเตอริ�ออกัจำะท��ให�เอนไซม์�กัล5'ม์น& จำะไม์'ส�ม์�ริถูท��ง�นได�อย'�งสม์บ�ริณ�เริ&ยกัว'� อะโพเอนไซม์� (apoenzyme)
Apoenzyme + Cofactor = Holoenzyme
Inorganic เช้'น Fe 2+ ion etc.
Organic เช้'น vitamin เริ&ยกั coenzyme
โคแฟกัเตอริ� แบ'งได�เป็�น 2 พวกัค3อ1 . ส�ริอน�นทริ&ย�หริ3อไอออนของโลหะ (metal ions) หริ3อ
เกัล3อแริ'ม์&โคริงสริ��งง'�ยๆได�แกั' Fe 2+ , Mg 2+ , Mn 2+ เป็�นต�น
2 . ส�ริอ�นทริ&ย�หริ3อโคเอนไซม์� เป็�นโม์เลกั5ลอ�นทริ&ย�ม์&โคริงสริ��งซ บซ�อน ท&%ม์&ขน�ดเล.กัและทนต'อคว�ม์ริ�อนได�ด& โคเอนไซม์�ส'วนใหญ่'จำะเป็�นว�ต�ม์�นท&%ละล�ยน� � ท��หน��ท&%ในกั�ริย��ยหม์�'ต'�งๆ เช้'น หม์�'ไฮโดริเจำน อะม์�โน ฟอสเฟต
โดยถู�� โคเอนไซม์�จำ บกั บอะโพเอนไซม์�อย'�งหลวม์ๆ เริ&ยกั โคเอนไซม์�กัล5'ม์น& ว'� ซ บสเตริทริ'วม์ (cosubstrate) แต'ถู��โคเอนไซม์�จำ บกั นอย'�งแน'นหน�กั บเอนไซม์�ด�วยพ นธะโคว�เลนต� จำะถู�กัเริ&ยกัว'�หม์�'พริอสเทต�กั (prostetic group)
เอนไซม์�ท&%ผล�ตโดยริ'�งกั�ย แบ'งได�เป็�น 2 กัล5'ม์ ค3อ1 . เอนไซม์�ย'อยอ�ห�ริ (digestive enzyme) ท��หน��ท&%
ย'อยอ�ห�ริภ�ยในริะบบท�งเด�นอ�ห�ริเพ3%อส'งส�ริอ�ห�ริไป็ย งเซลล�ต'�งๆในริ'�งกั�ริ ได�แกั'1.1 เอนไซม์�โป็ริต&เอส (protease) ย'อยโป็ริต&น1.2 เอนไซม์�ไลเป็ส (Lipase) ย'อยไขม์ น1.3 เอนไซม์�อะไม์เลส (amylase) ย'อยแป็;ง
2. เม์ต�บอล�คเอนไซม์� (metabolic enzyme) ม์&อย�'ในเซลล�ท5กัเซลล�ในท5กัอว ยวะ เอนไซม์�น& จำะท��หน��ท&%เกั&%ยวกั บท5กัป็ฏิ�กั�ริ�ย�ท&%เกั�ดข$ นในริ'�งกั�ย ม์&หน��ท&%ซ'อม์แซม์ส'วนท&%ส$กัหริอ ช้'วยริะบบภ�ม์�ค5�ม์กั น
เอนไซม์�แบ'งได� 2 ป็ริะเภทค3อ1 . ไอโซเอนไซม์� หริ3อ ไอโซไซม์� (isoenzyme หริ3อ
isozyme) เป็�นเอนไซม์�ท&%ม์&โคริงสริ��งแตกัต'�งกั นแต'ส�ม์�ริถูเริ'งป็ฏิ�กั�ริ�ย�เด&ยวกั นได�
2 . อ ลโลสเตอริ�กัเอนไซม์� (allosteric enzyme) หริ3อ เอนไซม์�ควบค5ม์ (regulatory enzyme) เป็�นเอนไซม์�ท&%ป็ริะกัอบด�วยหน'วยย'อยๆหล�ยหน'วยริ'วม์กั น เช้'น หน'วยย'อยเริ'ง (catalytic enzyme) ส�ริท&%ม์&อ�ทธ�พลต'อกั�ริควบค5ม์กั�ริท��ง�นของเอนไซม์�เหล'�น& เริ&ยกัว'� ต วควบค5ม์ (effector หริ3อ modulator หริ3อ regulator)
ต วควบค5ม์ ม์& 2 ช้น�ด ค3อ 2.1 ต วเริ'ง (activator) ท��ให�เอนไซม์�ท��ง�นได�ด&ข$ น เริ&ยกั positive modulator2.2 ต วย บย ง (inhibitor) ท��ให�เอนไซม์�ท��ง�นได�ช้��ลง เริ&ยกัว'� negative modulator
บริ�เวณของเอนไซม์�ท&%ม์&ต วควบค5ม์ เริ&ยกั บริ�เวณควบค5ม์ (regulatory site หริ3อ allosteric site)
เริ&ยกั เอนไซม์�ท&%ม์&ท งบริ�เวณเริ'งและบริ�เวณควบค5ม์ว'� อ ลโลสเตอริ�กัเอนไซม์�
กั�ริเริ&ยกัช้3%อต�ม์แบบส�ม์ ญ่ (recommended name)ม์&หล กัเกัณฑ์�ด งน& ค3อ1 . เริ&ยกัต�ม์ช้3%อของซ บสเตริทท&%เอนไซม์�เริ'งป็ฏิ�กั�ริ�ย� แล�ว
ลงท��ยด�วยค��ว'� “ase” เช้'น เอนไซม์�เริ'งป็ฏิ�กั�ริ�ย�กั�ริสล�ยย�เริ&ย เริ&ยกัว'�เอนไซม์�ย�ริ&เอส (Urease)
2. เริ&ยกัต�ม์ช้น�ดของป็ฏิ�กั�ริ�ย�แล�วลงท��ยด�วยค��ว'� “ase” เช้'นเอนไซม์�ออกัซ�เดส (oxidase) เริ'งป็ฏิ�กั�ริ�ย�ออกัซ�เดช้ นของซ บสเตริทท&%ม์& O2
3. เริ&ยกัต�ม์ข�อท&% 1 และ 2 ริวม์กั น เช้'น ไกัลซ&นด&ค�ริ�บอกัซ�เลส (glycinedecarboxylase)
4. เริ&ยกัต�ม์ช้3%อเฉพ�ะไม์'ส ม์พ นธ�กั บซ บสเตริทหริ3อป็ฏิ�กั�ริ�ย�ท&%เกั&%ยวข�อง เช้'นเพป็ซ�น (pepsin) เป็�นเอนไซม์�ย'อยโป็ริต&น เป็�นต�น
กั�ริเริ&ยกัช้3%อเอนไซม์�ต�ม์ริะบบ (systemic name)ต�ม์ข�อตกัลงของกัริริม์�ธ�กั�ริเอนไซม์�น�น�ช้�ต� ได�ม์&กั�ริ
เริ&ยกัช้3%อต�ม์ต วเลข โดยม์&ล กัษัณะค3อ
EC xx.xx.xx.xx (อ กัษัริ x ค3อต วเลข)
Enzyme functional class
subclass
Sub sub
class
ล��ด บท&%
เช้'น EC 2.7.3.2
2 = ช้น�ดเอนไซม์� transferase
7 = ช้น�ดย'อยของริห สต วท&% 1 หม์�ยถู$งกั�ริย��ยหม์�'ฟอสเฟต
3 = ช้น�ดย'อยของริห สต วท&% 2 หม์�ยถู$งกั�ริแบ'งย'อยของหม์�'ฟอสเฟต
2 = ริห สเฉพ�ะต วของเอนไซม์�ช้น�ดน น
การัแบ งเอนไซม�ตุ้ามชีน�ดของปฏิ�ก�รั�ยีา1. oxidoreductase ป็ฏิ�กั�ริ�ย�ออกัซ�เดช้ น-ริ&ด กัช้ น กั�ริ
ถู'�ยทอดอ�เล.กัตริอน
2. transferase ย��ยหม์�'ฟ>งกั�ช้ นจำ�กัส�ริหน$%ง ไป็อ&กัส�ริหน$%ง
3. hydrolase ไฮโดริไลซ�ส แยกัพ นธะด�วยน� �4. lyases เต�ม์พ นธะค�'5. isomerase ไอโซเม์อริ�ไริเซช้ น6. ligases สริ��งพ นธะโดยสล�ย ATP
รั)ปรั างโมเลก+ลของเอนไซม�
กัลไกักั�ริท��ง�นของเอนไซม์�ให� E = Enzyme S = Substrate P = Product ES = Enzyme เม์3%อจำ บกั บ Substrate EP = Enzyme เม์3%อผล�ต Product และย งคงจำ บกั น
อย�'
ข�0นตุ้อนแรัก : เอนไซม� E รัวมตุ้�วก�บสิ่ารัตุ้�0งตุ้�น S ได�เป%นสิ่ารัปรัะกอบ ES E + S ES
การัท#างานของเอนไซม�
ข�0นตุ้อนท��สิ่อง : สิ่ารัปรัะกอบ ES เก�ดการัเปล��ยีนแปลงเป%น ES*
ES* EP
การัท#างานของเอนไซม�
EPES*
ข�0นตุ้อนท��สิ่าม :เก�ด สิ่ารัปรัะกอบ รัะหว างเอนไซม�ก�บผลผล�ตุ้
ข�0นตุ้อนท��สิ่+ดท�ายี :ได�ผลผล�ตุ้ออกมา และได�เอนไซม�กล�บมาเหม�อนเด�ม
EP E + P
จำลนศาสิ่ตุ้รั�ของเอนไซม� เอนไซม์�ท��ป็ฏิ�กั�ริ�ย�กั บส บสเตริท เกั�ดเป็�นเอนไซม์�-ส บส
เตริทคอม์เพลกัซ�กั'อนแล�วจำ$งสล�ยในข นตอนท&% 2 ให�ผลผล�ต และเอนไซม์�กัล บค3นม์� อ ตริ�เริ.วของป็ฏิ�กั�ริ�ย�ในกั�ริเป็ล&%ยน S ไป็เป็�น P ข$ นอย�'กั บอ ตริ�เริ.วในกั�ริ เป็ล&%ยน ES ไป็เป็�น P และ E น %นค3อ อ ตริ�เริ.วในกั�ริเกั�ด P จำะข$ นอย�'กั บคว�ม์เข�ม์ข�นของ ES
เม์3%อ k1 k2 k3 และ k4 ค3อ ค'�คว�ม์เริ.วคงท&% (velocity constant) หริ3อ ค'�อ ตริ�เริ.วคงท&% (rate constant) ของป็ฏิ�กั�ริ�ย�ท ง 4
ท&% steady state อ ตริ�เริ.วในกั�ริเกั�ด ES จำะเท'�กั บอ ตริ�เริ.วในกั�ริสล�ย ES ท��ให� [ES] คงท&% จำะได�
สม์กั�ริไม์ค&ล�ส-เม์นเทน (Michaelis-Menten constant) แสิ่ดงถึ.ง ความสิ่�มพ�นธ์�รัะหว างอ�ตุ้รัาเรั6วของปฏิ�ก�รั�ยีา และความ
เข�มข�นของ S เม��อทรัาบ Vmax และ KM
Vmax ค3อ คว�ม์เริ.วส�งส5ด (maximum velocity) ของกั�ริท��ง�นของเอนไซม์�
KM ค3อ ค'�คงท&%ไม์ค&ล�ส-เม์นเทน (Michaelis-Menten constant) ของป็ฏิ�กั�ริ�ย�ของเอนไซม์�ท&% steady state ม์&หน'วยเป็�นโม์ล/ล�ตริ
V = Vmax[S] KM + [S] ท�� V = Vmax /2 หรั�อ ครั.�งหน.�งของความเรั6วสิ่)งสิ่+ด (half
maximal) จำะได� KM = [S]
สิ่มการัไลน�ว�เวอรั�-เบอรั�ก เป็�นสม์กั�ริจำ�กักั�ริกัล บสม์กั�ริไม์ค&ล�ส-เม์นเทน 1 = KM .
1 + 1 v Vmax
[S] Vmax
เม��อเข�ยีนกรัาฟรัะหว าง 1/v และ [S] จำะได�กรัาฟเสิ่�นตุ้รังท��ม�ความชี�น = KM/Vmax และจำ+ดตุ้�ดแกน 1/v ค�อ 1/Vmax และจำ+ตุ้�ดแกน 1/[S] ค�อ -1/KM ท#าให�สิ่ามารัถึหาค า KM และ Vmax ท��ถึ)กตุ้�องได�
Enzyme Kinetics
Increase the substrate concentration,observe the change of enzyme activity
Substrate concentrationExam Chapters
Score
Enzym
e activity
Student A
Student B
Student C
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4
Juang RH (2004) BCbasics
Increase Substrate C
oncentration
21 3 4 5 6 7 80
0 2 4 6 8
Substrate (mmole)
Product
80
60
40
20
0
S+E
↓
P
(in a fixed period of time)
Juang RH (2004) BCbasics
Essential of Enzyme Kinetics
E S+ P+
Steady State Theory
In steady state, the production and consumption of the transition state proceed at the same rate. So the concentration of transition state keeps a constant.
SE E
Juang RH (2004) BCbasics
Constant ES Concentration at Steady State
S P
EES
Reaction Time
Concentration
Juang RH (2004) BCbasics
An Example for Enzyme Kinetics (Invertase)
Vmax
Km S
vo
1/S
1vo
Double reciprocal Direct plot
1) Use predefined amount of Enzyme → E
2) Add substrate in various concentrations → S (x ,y)
3) Measure Product in fixed Time (P/t) → vo (y, y)
4) (x, y) plot get hyperbolic curve, estimate → Vmax
5) When y = 1/2 Vmax calculate x ([S]) → Km
1Vmax
- 1 Km
1/2
Jua
ng
RH
(2
00
4)
BC
ba
sics
A Real Example for Enzyme KineticsD
ata
no
1234
0.250.501.02.0
0.420.720.800.92
Absorbance v (mmole/min)[S]
0.210.360.400.46
(1) The product was measured by spectroscopy at 600 nm for 0.05 per mmole(2) Reaction time was 10 min
VelocitySubstrate Product Double reciprocal
1/S 1/v421
0.5
2.081.561.351.16
→→ → →
1.0
0.5
0
v
Dire
ct p
lot
Dou
ble
reci
proc
al 2.0
1.0
0
1/v
-4 -2 0 2 41/[S]
0 1 2[S]
1.0
-3.8
Jua
ng
RH
(2
00
4)
BC
ba
sics
ป8จำจำ�ยีท��ควบค+มการัท#างานของเอนไซม�1.คว�ม์เข�ม์ข�นของเอนไซม์�2.คว�ม์เข�ม์ข�นของส�ริต งต�น หริ3อซ บสเตริต (substrate)3.ค'�คว�ม์เป็�นกัริด-เบส (pH)4.อ5ณหภ�ม์� (optimum temperature) การัยี�บยี�0งการัท#างานของเอนไซม�- การัยี�บยี�0งแบบถึาวรัInhibiter ท��ให�ส'วน active site เป็ล&%ยนแป็ลงไป็ เอนไซม์�ไม์'ส�ม์�ริถูกัล บส�'ในสภ�พท&%ท��ง�นได�อ&กั- การัยี�บยี�0งท��กล�บค�นได� 1.กั�ริย บย งแบบแข'งข น โดยต วย บย งม์&โคริงสริ��งคล��ยกั บซ บสเตริตท��ให� ส�ม์�ริถูแย'งจำ บกั บเอนไซม์�ได� 2.กั�ริย บย งแบบไม์'แข'งข น โดยส�ริเคม์&บ�งช้น�ดไป็จำ บกั บส'วน cofactor ท��ให�เอนไซม์�ไม์'ส�ม์�ริถูท��ง�นได�
การัยี�บยี�0งแบบถึาวรั
การัยี�บยี�0งแบบแข งข�น การัยี�บยี�0งแบบไม แข งข�น
ป8จำจำ�ยีท��ม�ผลตุ้ อการัท#างานของเอนไซม� 1. อ+ณ์หภ)ม� เม์3%ออ5ณหภ�ม์�ส�งข$ น แอกัต�ว&ต&ของเอนไซม์�จำะเพ�%ม์ข$ น
เริ3%อยๆ จำนถู$งจำ5ดส�งส5ดหน$%ง (temperature optimum) แล�วจำะลดลง ซ$%งจำ��เพ�ะต�ม์ช้น�ดของเอนไซม์� ส'วนใหญ่'อย�'ในช้'วงอ5ณหภ�ม์� 25–40 oC แต'ท&%อ5ณหภ�ม์� ส�งกัว'�จำ5ดน& ม์�กัๆ เอนไซม์�จำะเกั�ดกั�ริเส&ยแอกัต�ว&ต&ท�งช้&วภ�พ
2. pH จำ5ดท&%ท��ให�เอนไซม์�ม์&แอกัต�ว&ต&ส�งส5ด เริ&ยกัว'� pH optimum ซ$%งส'วนใหญ่'อย�'ในช้'วง pH 6-7.5 ถู�� pH ส�ง หริ3อต�%�เกั�นไป็จำะท��ให�เกั�ดกั�ริส�ญ่เส&ยแอกัต�ว&ต&ท�งช้&วภ�พ
3. ความเข�มข�นของเอนไซม � ท&%คว�ม์เข�ม์ข�นของส บสเตริทม์�กัเกั�นพอ (excess) อ ตริ�เริ.วของป็ฏิ�กั�ริ�ย� จำะเพ�%ม์ข$ น เม์3%อคว�ม์เข�ม์ข�นของเอนไซม์�เพ�%ม์ข$ น
4. ความเข�มข�นของสิ่�บสิ่เตุ้รัท เม์3%อคว�ม์เข�ม์ข�นของเอนไซม์�คงท&% ท&%คว�ม์เข�ม์ข�นของส บสเตริทน�อยๆ ป็ฏิ�กั�ริ�ย�จำะ เกั�ดข$ นด�วยอ ตริ�เริ.วม์�กัจำนกัริะท %งถู$งคว�ม์เข�ม์ข�นของส บสเตริทจำ5ดหน$%งท&%อ ตริ�เริ.วของ ป็ฏิ�กั�ริ�ย�จำะคงท&% คว�ม์เริ.วของป็ฏิ�กั�ริ�ย�ท&%ส�งส5ด เริ&ยกัว'� คว�ม์เริ.วส�งส5ด (Vmax)
ตุ้�วยี�บยี�0งเอนไซม�แบ'งออกัได�เป็�น 2 ป็ริะเภท1. ตุ้�วยี�บยี�0งแบบผ�นกล�บไม ได� (irreversible
inhibitor) เกั&%ยวกั บกั�ริท��ล�ยหริ3อเป็ล&%ยนแป็ลง functional group 1 หม์�'หริ3อม์�กักัว'�ท&%จำ��เป็�นส��หริ บแอกัต�ว&ต&บนโม์เลกั5ลของเอนไซม์� ซ$%งต วย บย งแบบน& จำะจำ บ กั บเอนไซม์�อย'�งแน'นท งแบบโคว�เลนท�และนอนโคว�เลนท� เช้'น กั�ริย บย งเอนไซม์�ไซโคลออกัซ�จำ�เนส (cyclooxygenase) โดยย�แอสไพริ�น (aspirin หริ3อ acetyl salicylate)
2. ตุ้�วยี�บยี�0ง แบบผ�นกล�บได� (reversible inhibitor) แบ'งเป็�น 3 ช้น�ด
2.1 ตุ้�วยี�บยี�0งแบบแข งข�น (competitive inhibitor) หม์�ยถู$ง ส�ริท&%ส�ม์�ริถูเข�� ไป็แย'งส บสเตริทจำ บท&%บริ�เวณแอกัต&ฟบนโม์เลกั5ลของเอนไซม์� แล�วท��ให�แอกัต�ว&ต&ในกั�ริเริ'งป็ฎิ�กั�ริ�ย� ของเอนไซม์�ลดลง โดยค'� KM เป็ล&%ยน แต' Vmax คงท&% เช้'น กัริดม์�โลน�กัส�ม์�ริถูจำ บเอนไซม์�ซ กัซ�น�กั ด&ไฮโดริเจำเนส (succinic dehydrogenase) ในป็ฏิ�กั�ริ�ย�กั�ริออกัซ�ไดส�กัริดซ กัซ�น�กัไป็เป็�นกัริด ฟ�ม์�ริ�กั เพริ�ะม์&โคริงสริ��งคล��ยกั บกัริดซ กัซ�น�กั
2.2 ตุ้�วยี�งยี�0งแบบไม แข งข�น (noncompetitive inhibitor) หรั�อตุ้�วยี�บยี�0ง แบบผสิ่ม (mixed inhibitor) โดยต วย บย งช้น�ดน& จำะเข��ไป็จำ บท&%บริ�เวณอ3%นบนโม์เลกั5ลของ เอนไซม์�ท&%ไม์'ใช้'บริ�เวณเริ'ง เช้'นบริ�เวณควบค5ม์ ท��ให�โคริงริ'�งของเอนไซม์�เป็ล&%ยนแป็ลงไป็ ท��ให�บริ�เวณเริ'งเป็ล&%ยนไป็จำ$งท��ง�นไม์'ได� เช้'น Cu2+ Hg2+ และ Ag+ หริ3ออน5พ นธ� (derivative) ของม์ นส�ม์�ริถูท��ป็ฏิ�กั�ริ�ย�กั บ หม์�'-SH ของซ�สเตอ&นท��ให�โคริงริ�ป็ส�ม์ม์�ต� (three dimensional conformation) ท&%จำ��เพ�ะของเอนไซม์�เส&ยไป็ ในกัริณ& noncompetitive inhibitor ค'� Vmax เป็ล&%ยนแป็ลง(ลดลง) ส'วน KM ไม์'เป็ล&%ยนแป็ลง
2.3 การัยี�บยี�0งแบบอ�นคอมเพตุ้�ตุ้�ฟ (uncompetitive inhibition) กั�ริย บย ง แบบน& เกั�ดข$ นเม์3%อต วย บย งเข��ริวม์เฉพ�ะกั บเอนไซม์�ส บสเตริทคอม์เพลกัซ�เท'�น นแบบไม์'ผ นกัล บ เกั�ดเป็�น ESI คอม์เพลกัซ� ซ$%งจำะไม์'ได�ผลผล�ตเกั�ดข$ น ล กัษัณะเหม์3อนกั บกั�ริย บย งแบบไม์'แข'งข น โดยไม์'เกั�ดกั�ริ ผ นกัล บ (reversible) เม์3%อเพ�%ม์คว�ม์เข�ม์ข�นของส บสเตริท ค'� Vmax ลดลง และค'� Km ลดลง แต'คว�ม์ช้ นไม์'เป็ล&%ยนแป็ลง
Enzyme Inhibition (Mechanism)
I
I
S
S
S I
I
I II
S
Competitive Non-competitive Uncompetitive
EE
Different siteCompete for
active siteInhibitor
Substrate
Ca
rtoo
n G
uid
eEq
uatio
n an
d De
scrip
tion
[I] binds to free [E] only,and competes with [S];increasing [S] overcomesInhibition by [I].
[I] binds to free [E] or [ES] complex; Increasing [S] cannot overcome [I] inhibition.
[I] binds to [ES] complex only, increasing [S] favorsthe inhibition by [I].
E + S → ES → E + P + I↓EI
←
↑
E + S → ES → E + P + + I I↓ ↓EI + S →EIS
←
↑ ↑
E + S → ES → E + P + I ↓ EIS
←
↑
EI
S X
Juang RH (2004) BCbasics
Km
Enzyme Inhibition (Plots)
I II Competitive Non-competitive Uncompetitive
Dir
ect
Plo
tsD
ou
ble
Rec
ipro
cal
Vmax Vmax
Km Km’ [S], mM
vo
[S], mM
vo
I I
Km [S], mM
Vmax
I
Km’
Vmax’Vmax’
Vmax unchangedKm increased
Vmax decreasedKm unchanged
Both Vmax & Km decreased
I
1/[S]1/Km
1/vo
1/ Vmax
I
Two parallellines
I
Intersect at X axis
1/vo
1/ Vmax
1/[S]1/Km 1/[S]1/Km
1/ Vmax
1/vo
Intersect at Y axis
= Km’
Juang RH (2004) BCbasics
หน'วยว ดกั�ริท��ง�นของเอนไซม์�1 . หน'วยเอนไซม์� หม์�ยถู$ง จำ��นวนเอนไซม์�ท&%ท��ให�ป็ริ�ม์�ณ
ของผล�ตภ ณฑ์�เกั�ดข$ นหริ3อป็ริ�ม์�ณของซ บสเตริทลดลง ม์&ค'�เป็�น ไม์โคริโม์ลต'อน�ท& หน'วยส�กัล (international unit, IU หริ3อ U)
1.0 IU ค3อ แอคต�ว�ต&ของเอนไซม์�หริ3อป็ริ�ม์�ณของเอนไซม์�ท&%เริ'งกั�ริเป็ล&%ยน 1.0 ไม์โคริโม์ลของซ บสเตริทใน 1 น�ท&ท&%อ5ณหภ�ม์� 25 º Cค�ท�ล (katal : kat) หม์�ยถู$ง ป็ริ�ม์�ณของเอนไซม์�ท&%เริ'งกั�ริเป็ล&%ยนแป็ลง 1
โม์ลของซ บสเตริทใน 1 ว�น�ท& หน'วยท&%น�ยม์ใช้� ค3อ µkat , nkat, pkat
1 kat = 1/60 U = 1.67 x 10 -2 U
2. หน'วยแอคต�ว�ต&เฉพ�ะ (specific activity) หม์�ยถู$ง หน'วยเอนไซม์� ต'อ 1 ม์�ลล�กัริ ม์ของโป็ริต&น ใช้�ในกั�ริห�คว�ม์บริ�ส5ทธ�@ของเอนไซม์�
Enzyme Kinetics
vo=Vmax [S]Km + [S]
Km Vmax &
E1E2E3
1st order
zero order
Competitive
Non-competitive
Uncompetitive
Direct plot
Double reciprocal
Bi-substrate reaction alsofollows M-M equation, butone of the substrate shouldbe saturated when estimate the other
Affinity withsubstrate
Maximumvelocity Inh
ibition
Activity
Observe vo change under various [S], resulted plotsyield Vmax and Km
k3 [Et]
kcatTurn overnumber
kcat / Km
Activity Unit
1 mmolemin
Specific Activity
unitmg
Significance
Juang RH (2004) BCbasics
Significance of Enzyme Kinetics
vo =Vmax [S]
Km + [S]
Obtain Vmax and Km
[S] = Low → High [S] = Fixed concentration
zero order
1st order
E3
E2E1
Proportional to
enzyme concentration
v0 = Vmax × K = k3 [Et] × K
Juang RH (2004) BCbasics
Km = [S]
Km + [S] = 2 [S]
Vmax
2=
Vmax [S]
Km + [S]
Km: Affinity with Substrate
If vo =Vmax
2
S2S1 S3
S1 S2 S3
Vmax
1/2
When using different substrate
Affinity changesKm
vo =Vmax [S]
Km + [S]
Jua
ng
RH
(2
00
4)
BC
ba
sics
Km: Hexokinase Example
Glucose + ATP → Glc-6-P + ADP
1
2
3
4
5
6
Glucose Allose Mannose Substratenumber
Km = 8 8,000 5 mM
CHO H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH
CHO H-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C-OH H2-C-OH
CHO HO-C-H HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH
Juang RH (2004) BCbasics
Turn Over Number, kcat
vo =Vmax [S]
Km + [S]
(vo)E + S ES E + P
k2
k1 k3
When substrate excess, k3 = kcat, turn over number (t.o.n)
When [substrate] is low
=k3 [E][S]
Km + [S]=
Km
k3 [E][S]
Omit the [substrate] Substrate specificityStart from M-M eq.
Second order(IV)
Juang RH (2004) BCbasics
Turn Over Numbers of Enzymes
Catalase H2O2
Carbonic anhydrase HCO3-
Acetylcholinesterase Acetylcholine
40,000,000
400,000
140,000
b-Lactamase Benzylpenicillin 2,000
Fumarase Fumarate 800
RecA protein (ATPase) ATP 0.4
Enzymes Substrate kcat (s-1)
The number of product transformed from substrate by one enzyme molecule in one second
Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.263