基于 DArT 技术的杜仲遗传多样性及基因型识别研究

姓名：洪义欢 学号： D08034

导师：陈建民教授

1 、研究背景及意义

2 、研究目标3 、研究内容4 、拟解决的关键问题及可行性分析5 、本研究的特色与创新之处 6 、年度研究计划及预期研究结果7 、研究基础

杜仲自古便以名贵中药材而著称

传统中药中主要以皮为主，收获方式以砍伐剥皮为主，造成杜仲种质资源的严重破坏和丢失。

1 、研究背景及意义

杜仲浑身是宝，可根据不同用途选育优良树种 (药用成分含量高、含胶量高、产皮量高、速生等 ) ，但是参照标准很难确定，开发受限。

面临的危机：杜仲种质资源濒临灭绝。优良树种的选育困难。

研究方法的选择：

对杜仲的遗传多样性进行分析采用现代分子生物学方法

了解物种起源、预测种源适应性、估算基因资源分布、进行种质资源开发与利用、确定核心种质并保存、进行杂交育种的亲本选择

遗传多样性的研究意义

不受季节、环境、组织、器官及植物发育阶段的限制；

不影响目标性状的表达；多表现为共显性，可以十分方便的对隐性性状进行选择；

不受基因表达与否的限制；在基因组上分布广、数量多 (几乎是无限的 )；

所需要的材料少。

现代分子生物学方法的优点

利用现代分子生物学方法对杜仲遗传多样性研究还处于非常低级的水平，查阅相关文献，仅寥寥数篇。

对杜仲的种质资源及遗传多样性研究结果也不够确定。

研究水平：

找寻一个合适的分子生物学研究方法显得尤为重要。

研究杜仲的遗传变异、杜仲的演变进化、杜仲栽培类型的分组、杜仲种质资源开发与利用、确定杜仲核心种质并保存、进行杂交育种的亲本选配。

研究意义：

DArT （ Diversity arrays technology ）方法的优点：高通量的特点；一个阵列可同时检测发布在基因组中的几百个多态性位点；

不需要预先知道 DNA 序列信息 ;重复性稳定，实验可靠，受染色体倍数性和基因组大小的影响很小；

低成本。

DArT应用了微阵列平台技术

（ 1 ）分析杜仲在不同居群内部及居群间的遗传分化情况，为杜仲种质资源的遗传多样性及保护提供基础资料和对策。

（ 2 ）为栽培杜仲的基因型鉴定提供分子标记，为优良杜仲居群的扩繁和进一步选育杜仲优良品种提供遗传基础。

（ 3 ）从细胞水平探讨杜仲的遗传多样性，为构建不同产地杜仲的亲缘关系提供形态学证据。

2 、研究目标

（ 1）利用 DArT方法获得具有多态性的分子标记

（ 2）多态性的分子标记分析杜仲不同居群内部及居群间的遗传分化

（ 3）通过对不同产地杜仲的花粉和叶片进

行显微和亚显微结构观察，从细胞水平分析不同产地杜仲的遗传多样性和亲缘关系

3 、研究内容

多样性微阵列的制作

利用 DArT 方法获得具有多态性的分子标记

多态性分子标记的筛选

利用 DArT 方法获得具有多态性的分子标记

测序及发展 PCR分子标记

利用 DArT 方法获得具有多态性的分子标记

挑取克隆转化子

测序插入片段的序列信息

设计引物

扩增不同样本基因组 DNA

确定有多态性的分子标记

多态性的分子标记分析杜仲不同居群内部及居群间的遗传分化

不同居群和不同采样点的杜仲基因组 DNA

发展的多态性的分子标记筛选基因组 DNA

电泳分离 PCR产物，统计分析条带的多态性

进行系统发生树的构建

确定居群内及居群间的遗传分化情况

细胞水平分析不同产地杜仲的遗传多样性和亲缘关系

对不同产地杜仲的花粉和叶片进行显微和亚显微结构观察

利用形态学特征并结合分子标记

研究不同产地杜仲的遗传多样性和亲缘关系

杜仲的取材代表性 需要了解各个地区的杜仲分布，可通过实地取材，对材料的来源明确，便于与其药效分析对应。

4、拟解决的关键问题及可行性分析

多样性微阵列的制作 利用接头相匹配的引物对阳性转化子进行扩增， PCR产物利用 Qiagen 纯化试剂盒纯化或异丙醇沉淀；干燥后溶于印迹缓冲液中，将每个转化子扩增产物固定到 20张相同玻片上，该工作可由上海生物芯片有限公司帮助完成。

杂交信号扫描、分析与数据处理 可采用 Affymetrix418 扫描仪进行杂交信号扫描，相关软件分析杂交点荧光信号强度。

将同一个克隆点与不同探针杂交结果的比较后记录结果，找出所选材料中具有多态性的克隆转化子。

5 、本研究的特色与创新之处（ 1 ）选材的独特性杜仲为独种属科植物，极具药用价值。由于人们的滥采导致杜仲濒临灭绝。

通过对现在杜仲居群的遗传多样性研究有利于保存种质资源。

相比于其他植物的遗传多样性研究，有关杜仲的遗传多样性研究还处于非常低级的水平。

（ 2 ）研究方法的新颖性国外已经有人成功将此技术应用到水稻、拟南芥、小麦、大麦等材料中，杜仲未见相关研究报道。

DArT 技术具有优越性，对于亲缘关系稀少的孤立种属植物材料较其他分子标记更具有适用性。

（ 3）为杜仲遗传改良研究和应用提供基础资料，对杜仲居群的遗传改良研究具有开创性

利用杜仲叶片和花粉的显微和亚显微结构差异进行杜仲居群的分组，筛选多态性标记与杜仲形态差异进行相关分析，对杜仲居群进行科学分组。

6 、年度研究计划及预期研究结果 年度研究计划2009.1 － 2009.8杜仲的取材；基因组 DNA 的限制性酶切片段的克隆。2009.9 － 2010.5杜仲叶片和花粉的显微和亚显微结构观察；微阵列杂交及信号检测。2010.6 － 2010.10 分离有多态性的分子标记；不同杜仲材料的亚显微结构差异分析。2010.11 － 2011.4利用多态性的分子标记筛选不同地区的杜仲材料；分子标记与亚显微结构相结合对杜仲进行科学分组。

预期研究结果

1. 明确不同地区的杜仲居群之间的遗传多样性；2.获得 30个以上的具有多态性的克隆转化子；3.获得 DArT分子标记转化为依赖于 PCR的多态性的分子标记；4.分子标记和形态结构差异相结合，对不同地区的杜仲进行科学分组。

7 、研究基础 工作基础 熟悉掌握了分子生物学方面的大部分技术和细胞水平上染色体制片及染色体物理定位研究技术。

大麦的耐湿性状的 SSR分子标记与定位研究，掌握了多态性分子标记的筛选方法和统计学分析方法。

多种植物的分子细胞遗传研究，熟悉掌握了在玻片上进行相关杂交的技术。

在植物细胞形态结构与功能的研究中所使用的显微和亚显微结构观察技术成熟。

工作条件 本实验室具备分子生物学研究的常用设备：如冷冻高速离心机、凝胶成像系统、 PCR 仪、核酸杂交炉、超低温冰箱、自动化光照培养箱、 Beckman 双波长分光光度仪、荧光光度仪、 Olympus 荧光显微镜等，可满足本研究中有关的分子杂交等工作的需要。

另外还具备开展植物形态结构研究用的实验设备，如石蜡切片机、冰冻切片机、各类显微镜等。

扬州大学测试中心有超薄切片机，透射电子显微镜和扫描电子显微镜及其相应的配套设备，可以满足本项目亚显微结构的观察。

Thanks

请各位老师和同学批评指正！