(~ POSGRADO EN

\) CIENCIAS CI CY ( BIOLOCiiCAS

Centro de Investigación Científica de Yucatán, A. C.

Posgrado en Ciencias Biológicas ·

DESARROLLO Y CARACTERIZACIÓN DE UN SISTEMA DE PROPAGACIÓN DE CEDRO ROJO (Cedrela odorata L.) MEDIANTE EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA EN BIORREACTORES DE INMERSIÓN TEMPORAL

Tesis que presenta

ALFREDO DOMINGUEZ HERNÁNDEZ

En opción al título de

MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTIFICA DE YUCATÁN, A. C.

POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

RECONOCIMIENTO

CIENCIAS BIOLÓGICAS

Por medio de la presente, hago constar que el trabajo de tesis titulado "DESARROLLO

Y CARACTERIZACIÓN DE UN SISTEMA DE PROPAGACIÓN DE CEDRO

ROJO (Cedrela odorata L.) MEDIANTE EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA EN

BIORREACTORES DE INMERSIÓN TEMPORAL" fue realizado en los laboratorios

de la Unidad de Biotecnología del Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.

bajo la dirección del Dr. Manuel L. Robert Díaz, dentro de la opción de Ciencias Biológicas

y Biotecnología de plantas, perteneciente al Programa de Posgrado en Ciencias

Biológicas de este Centro.

Atentamente

Dr. Osear A Moreno Valenzuela Director Académico

Mérida, Yucatán, México, 25 de Octubre de 201 1.

DECLARACIÓN DE PROPIEDAD

Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos

Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las

actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para

desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación

Científica de Yucatán, A.C., y que a razón de lo anterior y en contraprestación de los

servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados, dicha información, en términos

de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial , le pertenece

patrimonialmente a dicho Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya

manifestado, reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollos

tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo correspondiente a dicha información, le

pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación Científica, A.C., y en el mismo

tenor, reconozco que si derivaren de este trabajo productos intelectuales o desarrollos

tecnológicos, en lo especial , estos se regirán en todo caso por lo dispuesto por la Ley

Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo

expuesto en la presente Declaración.

IBQ. Alfredo Dominguez Hernández

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a mis asesores Manuel Luis Robert Díaz y Yuri Jorge Peña Ramírez

por su apoyo incondicional y orientación durante la realización de este trabajo, además

por compartir su conocimiento conmigo y estar al pendiente hasta el final.

. Al Biol. Fel ipe Alonso Barredo Pool y al IBQ. Israel García Sheseña por toda su

ayuda con las técnicas histológicas y la microscopía electrónica de barrido.

A quienes siempre están a mi lado a pesar de estar tan lejos y nunca dudaron que

llegaría a este momento, a mis padres les agradezco todo su amor y cada uno de sus

consejos que me han dado.

A mis compañeros del laboratorio de biorreactores: Miguel , Gastón, Kelly, Juan,

Carlos, y Énder por sus aportaciones y comentarios sobre el trabajo. También a Sara

Murguía por su apoyo tan eficiente en las cuestiones administrativas y de oficina, gracias.

A mis amigos con los que pasamos buenos momentos haciendo aún más divertido

e interesante este camino del posgrado: Max, Ángel, Perfecto, Antonio, Huijara y Martín.

No podía faltar mi estimada lleana gracias por todo, sin tu ayuda no hubieran sido

posibles muchas cosas, entre ellas llegar a este momento culminante, gracias de nuevo.

A Heidy Guadalupe con quien hemos pasado odiseas pero aún seguimos de pie,

gracias por tu cariño y amistad, aquí estoy cuando lo necesites.

A todos mis amigos y compañeros de la comunidad "tengo sed" que de una u otra

forma han colaborado con la realización de este trabajo se los dedico con mucho cariño y

aprecio.

Índice

Índice

ÍNDICE DE FIGURAS ....... .... ............. ......... .. ..... ... .. ....... .. ..... ..... ..... .... ... ..... .. .. ..... ..... .... ..... 11

ÍNDICE DE TABLAS .. .... ........ ... ....... ... .... ..... .. ... ..... .... ... ..... .... .. .... ... .... .. .... ... .... ...... .......... . IV

ABREVIATURAS ...... ... .... ...... .. .... ... ... .. ... ...... ... .. .. .... .. ..... ..... ... ... ... .. ..... .. ...... ... ... ... ...... .. .. .. IV

RESUMEN .... ..... ............... .... .. .. .. ......... .. ... .... ....... .. .......... ..... .. .... ..... .. ... .... ... ... ... .... .. .... ..... 1

INTRODUCCIÓN ......... ... ...... ... ....... ... ....... .... .. .... .... .. .. ..... ..... ...... ... .... .. ..... .... ........ .......... .. . 5

1.1. CEDRO ROJO ....... .. ... ... ... .... ...... .... ... .. ...... .... ..... .... ..... ... ..... .. .... .... .. ...... ....... ..... 7 1.2. BIOLOGÍA DE LA ESPECIE ...... .. ...... .. .. .. .... .... .... .. .. .... .... .. ....... .... ........ .. .. .. .. .. .... 7 1.3. USOS E IMPORTANCIA ECONÓMICA .. ... .. .. ...... .. .. .. .. .. .. .... .. .......... .. ...... ......... .. 8 1.4. PROBLEMÁTICA DEL CULTIVO ...... .. .. ............. .. .. .......... .. .. .... .. ...... .. .. .. .... .. ... ... 9 1.5. LA BIOTECNOLOGÍA COMO ALTERNATIVA PARA EL MEJORAMIENTO VEGETAL .... ....... ...... ........ .... .. .. ... .. ....... ..... ... .. .. ..... .. ....... ..... ..... .. .. ........ ..... .. .... .... ..... ... 11

1.5.1. CULTIVO IN VITRO .. ... .. ... ... ..... .... .... ... ...... ..... .... .. .... ................... ........ .... .. .. 12 1.5.2. EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA (ES) .. .... .... ..... .. .. ...... ...... .. .......... ......... .. .. .. .. 13 1. 5. 3. VÍA DE REGENERACIÓN POR ES .. ...... .... .... .. .. .. .... ........ ... .. .. .... .... ............ 14 1.5.4. TIPOS DE ES ..... .. ..... ...... .. .... .. .. ......... .. ...... ... ... ...... .... ..... .. ...... ......... ........ .... 15 1. 5. 5. FACTORES QUE AFECTAN LA ES .. .. .............. .. ..... .. .. ... .. .... .... .. .. .. ............ . 15 1.5.6. CARACTERISTICAS DE UN EMBRIÓN SOMÁTICO ................ .. ........ ......... 16 1.5. 7. LA ES COMPARADA CON LA EMBRIOGÉNESIS CIGÓTICA. ........... ....... 16

1.6. SISTEMAS DE MICROPROPAGACIÓN .... .. ... ............ .. ...... .. .. .. .. .......... ... ........ 17 1. 6. 1. BIORREACTORES DE INMERSIÓN TEMPORAL .................... ... .... ............ 18 1.6.2. BIORREACTORES DE INMERSIÓN TEMPORAL RITA® ...... .. .. .. .... .. ...... .... 18 1.6.3. FUNCIONAMIENTO DEL EQUIPO .. .... ...... .... ...... ...... .... ... .... ... .... ... .. .. ........ . 19

1.7. ANTECEDENTES DE LA ES EN ESPECIES MADERABLES .. ..... ........ .... .. .... .. 21 1. 7.1. ANTECEDENTES DE LA ES EN CEDRO ROJO .... .... .. .. .......... ...... ........ ... .. 21

2. JUSTIFICACIÓN .... .... ... .... ...... .. ... .. .... .... ..... .... .... ....... .. ..... ... ... .. .... ....... .. ... ...... ...... ... 25

3. OBJETIVOS ..... ... ..... ...... .... .. .... ......... .. ....... ... ....... ....... .. .... .... ..... ... ..... ... .... .. .. .. .... ..... 27

3.1. OBJETIVO GENERAL .. .... .... .... .. .. .... ...... ...... .. .... .... .... .. .. .. .. .. .... .. .. .. ... ..... .... .. .. .. 27 3.2. OBJETIVOS PARTICULARES ...... .. ... .. ......... ..... .. .... .... ........ .. ................ .... ...... 27

4. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ...... .. ...... ..... ...... .. ... ...... ... ... .... .... ... ... ....... .. ..... .... ... . 29

5. METODOLOGÍA .. ... .. ... ..... ..... ....... .... ....... ... .. ......... ....... .... ... ... .... ......... .. ... ....... ....... . 31

5.1. SELECCIÓN Y COLECTA DEL MATERIAL VEGETAL .. ................................... 31 5.2. DESINFECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL ...... .. .... .... .......... .... ......... .. ...... .. .. 31 5.3. EXTRACCIÓN DE LOS EMBRIONES CIGÓTICOS Y ESTABLECIMIENTO IN VITRO .. .... .......... .............. .. ... ......... ........ .. .... .. .. ... ... ........ ... ..... ......... .... ..... ... ... .. ...... ....... 32 5.4. MEDIO DE INDUCCIÓN ... .. ...... .. ...... ...... ... .... ..... ... ........ ...... ...... ... ...... .. ..... .. .... . 32 5.5. ANÁLISIS DE ESTRUCTURAS EMBRIOGÉNICAS .. ... .. ... ...... .. .... .. .. .. .. .... .... .. . 33

5.5.1. ANÁLISIS HISTOLÓGICOS .. .. ..... ..... ...... .. ..... .. .... .. ........ .. ...... .. ... .. ..... ...... .. .. 33 5.5.2. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO (MEB). ...... ...... .. .... .......... .. . 34

5.6. ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS EN SISTEMAS DE INMERSIÓN TEMPORAL RITA. ... .... .... ....... .. .... .. ....... ......... ........ .. ....... ... .. ... .. .... ...... .... ... .... ....... ...... 34 5.7. GERMINACIÓN DE EMBRIONES SOMÁTICOS ... ...... .... .. .. .. .... .... .... .. .. .. ......... 35

Índice

6. RESULTADOS ... .......... ... .. ...... ..... ...... .......... ...... .... .... ... ... .. ..... .... ... ........ ....... ..... ..... . 37

6.1. ESTABLECIMIENTO IN VITRO E INDUCCIÓN DE LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA ... ...... ........ ........... ....... ... ...... ....... .. .. ... .. ..... ..... .. .......... .... ... .......... ... ........ .... 37 6.2. DESARROLLO DE EMBRIONES SOMÁTICOS Y ANÁLISIS ESTRUCTURAL 39 6.3. PROLIFERACIÓN DE LAS MASAS EMBRIOGÉNICAS EN EL SISTEMA RITA41 6.4. COMPARACIÓN DE EFICIENCIA SISTEMA SEMISÓUDO vs SISTEMA RITA43 6.5. GERMINACIÓN DE EMBRIONES SOMÁTICOS .. ............ .......... .... .. ...... .. .. ...... 45

7. DISCUSIÓN ... .... .... .. ...... ..... ..... ...... ... .... ... ...... ..... ... ... ......... ... ... .... .... .. .. .... .... ... ........ . 47

8. CONCLUSIONES ... ..... .. .... .... .......... .... ... ...... .. .... ..... .... ... .... ....... .. ... ...... .... ............... 51

9. BIBLIOGRAFÍA .. .... ...... ..... .. ... .. ..... ... .... .. ..... ... ..... ...... .' .......... ... .. .... ... ................ .... .... 53

1 O. ANEXO ... .... .... ... ... .... ... .... .. .... .... ...... ....... .. ..... ............ ... ....... ... ... .. ..... ...... ..... ..... ....... 61

ANEXO 1.TABLA DE COMPOSICIÓN DEL MEDIO MS (MURASHIGUE & SKOOG, 1962). 61

Índice de Figuras

Figura 1. Árbol de cedro rojo, hojas, frutos inmaduros, fruto maduro abierto . .. .. ...... .. .... .. .. 8

Figura 2. Embriogénesis somática vs embriogénesis cigótica (adaptada de Zimmerman) . ... ... .. .... ..... ....... .. ... ... ....... .. .... .. ... ... .... .. ........... ... .... .. .......... ........ ........ ......... ........ ...... ....... . 17

Figura 3. Flujo de aire en el sistema RITA. Muestra como la entrada y salida del aire es regulado por un electro-válvula de 3 vías, en la inmersión se abre permitiendo el flujo de aire alimentado por la bomba y en la aireación esta se cierra al momento de apagarse el equipo (tomado de VITROPIC S.A, RITA® http://pagesperso-orange. fr/vitropic/rita/es/fonction . htm) ... .. .. .. .... .... ... ....... ... ...... .. ... ... ......... .. .... ........ .......... . 19

Figura 4. Funcionamiento del sistema RITA. 1) Los explantes son colocados en el recipiente sobre la base de poliuretano; 2) es inyectado el aire a una presión de 0,2 bares ascendiendo el medio y desplazando la atmósfera preexistente; 3) los explantes son sumergidos en el medio durante el tiempo programado; 4) pasado el periodo de inmersión la bomba se apaga y la presión del aire disminuye descendiendo el medio (VITROPIC S .A, RITA® http://pagesperso-orange. fr/vitropic/rita/es/fonction . htm) ........ ... ..... ............. . 20

Figura 5. Caracterización de callos proembriogénicos. Tipo A: algodonoso, blanquecino; tipo B: compactos, verde oscuros y de baja velocidad de crecimiento; tipo C: cristalinos, verde claro; tipo D: estructuras amorfas de color café oscuro; tipo E: con apariencia de tejido muerto sin embargo por dentro son viables; tipo F: disgregables, globulares, translúcidos, amarillo claro y con alta velocidad de crecimiento (Dominguez, 2008) .. ...... 23

Figura 6. Fruto, semilla y embrión cigótico de cedro rojo ....... ........ .. .. .... .... .. .... .......... ...... 32

Figura 7. Frutos inmaduros de cedro. Proceso de disección del fruto y embrión cigótico inmaduro extraído en campana de flujo laminar ... ........ .. .. ........ .... .. .... .. .. .. .. ........ .... .. .. .... 37

11

Índice

Figura 8. Callo embriogénico con apariencia friable de color amarillo ........ ................ .... .. 38

Figura 9. Inducción de embriogénesis somática después de 28 semanas. A) callo embriogénico; B) embrión globular-corazón ; C) embrión cotiledonario inicial; D) embrión coti1edonario convertido .......... ... ... .... .. .... ...... .... .. .... ... .. .. ...... .. ..... .. ...... ..... ... .... .... ....... .. .. .. 38

Figura 1 O. Embriones somáticos en proceso desincronizado, presentando varias etapas de desarrollo disgregándose en el medio de cultivo al no tener conexión vascular con el tejido materno .... ..... ...... ...... ... ...... ........ ... ..... ... ........ ........... .. ........ ........ .. ......... .. ...... .. ....... 39

Figura 11. Análisis ultraestructural de embriones somáticos. Escalas: a, b, 100 ¡.Jm, e, h 200 ¡.Jm ... ....... .. ... .. ....... .... ...... ...... ...... .. ... ... ... ............... .... .............. : ... ... .. ......................... 40

Figura 12. Respuesta de los callos bajo diferentes tiempos y frecuencias de inmersión .. 43

Figura 13. Comparación del sistema semisólido vs inmersión temporal. .... ........ .... .. ....... 44

Figura 14. Morfología de embriones somáticos en medio semisólido e inmersión temporal. A) Estructura embriogénica en medio semisólido, B) Embriones en estado cotiledonar en sistema de inmersión temporal. .. ........ .... ...... ............................................ 44

Figura 15. Embrión somático maduro con formación de embriones globulares en la parte radical. .... ..... .. ... .. .. ......... ......... ... ... .. .. ..... ......... ............................................... ... .... ........... 45

Figura 16. Secuencia de germinación de un embrión somático de cedro rojo. A) Embrión somático en estado cotiledonar; B) embrión germinado de cedro rojo ; C) plántula de cedro rojo en invernadero ....... ... ... ... ........ ... ........ .. .. .... ... ........ ..... ......... .. ..... ... ......... ... .. .. ........ ... . 46

111

Índice

Índice de Tablas

Tabla 1. Clasificación taxonómica del cedro rojo .. ...... ..... .... ..... ............................ ........... .. 7

Tabla 2. Características morfológicas del individuo muestreado .... .. .... .. ........ ................ .. 31

Tabla 3. Tiempos y frecuencias de inmersión en el sistema RITA en medio MS líquido sin RCV .... ..... ... ... .. .. ....... ... .. ....... ... ... ...... ... .... .... ...... .. ..... ......... .. ... ........................ .... .. ....... .... 35

Tabla 4. Concentraciones de los RCV empleadas para la maduración y germinación de los embriones somáticos ................. ... ..... ....... ... ... ...... .... ........................... .................... .. 36

Tabla 5. Incremento de biomasa en gramos en los diferentes tiempos y frecuencias de inmersión en sistema RITA con medio MS sin RCV . .. .... ................................ ......... ........ 42

l V

Abreviaturas

Ácido 2,4-diclorofenoxiacetico Ácido 3,6-dicloroanisico Ácido indolacético Ácido indolbutírico Ácido naftalenacético Bencilaminopurina Comisión nacional forestal Cultivo de tejidos vegetales Embriogénesis somática Masa proembriogénica Medio Murashige and Skoog Organización internacional de maderas tropicales Organización de las naciones unidas para la alimentación y la agricultura Recipiente de inmersión temporal automatizado Regulador de crecim iento vegetal Zeatina

2,4-D Dicamba AlA AIB ANA BAP CONAFOR CTV ES MPE MS ITTO

FAO

RITA

RCV ZEA

RESUMEN

Al comienzo del siglo XX Haberlandt propuso que si todas las células de un

organismo tenían la misma información genética que la célula inicial , serían capaces de

volver a expresar el patrón de desarrollo embriogénico hasta formar auténticos embriones

de origen somático. Esta posibilidad se verificó en células del parénquima de ra íz de

zanahoria a finales de los años 50, y desde entonces se ha ampliado a cientos de

especies diferentes. Las primeras especies forestales en las que se logró esta expresión

denominada "totipotencia de las células" fueron Santalum albumen el caso de frondosas

(Rao, 1965), y Picea abies (Chalupa, 1985; Hackman y von Arnold , 1985) y Larix decidua

(Nagmani y Bonga, 1985) en el caso de coníferas. Desde entonces se han regenerado

cientos de especies forestales por embriogénesis somática. Actualmente esta técnica está

siendo aplicada a cultivos tropicales maderables de alta importancia económica, como lo

son algunos miembros de la familia de las Meliáceas entre los que se encuentra el cedro

rojo (Cedrela odorata L.) , segunda especie forestal tropical más importante del mundo

solo después de la caoba (Swietenia macrophyl/a J.), estimada por su madera la cual es

resistente a la putrefacción y a los insectos, la especie se usa en una amplia gama de

productos, incluyendo la construcción y trabajos de gabinete, muebles e instrumentos

musicales, tiene una alta demanda para reforestación y plantaciones comerciales en el

sureste de México.

La presente investigación tuvo como objetivo desarrollar un sistema de

embriogénesis somática en Cedrela odorata, el cual puede ser empleado para la

micropropagación a gran escala así como en estudios de tipo bioquímico, molecular y

anatómico del desarrollo del embrión somático, de la misma forma en aplicaciones de

transformación genética para llevar a cabo mejoras en la planta. El proceso de la

embriogénesis somática fue caracterizado mediante microscopía electrónica de barrido e

histología con la finalidad de observar las estructuras anatómicas y morfológicas del

desarrollo del embrión somático. También se establecieron masas embriogénicas en

sistemas de inmersión temporal RITA® con el fin de acelerar la reproducción y conversión

de una o más etapas del proceso de la embriogénesis somática.

1

La embriogénesis somática en C. odorata, se indujo de forma indirecta a partir de

masas proembriogénicas, derivadas de embrión cigótico inmaduro después de 24

semanas de cultivo usando medio Murashige and Skoog suplementado con 13.57 IJM de

Dicamba. Mediante análisis histológicos y por microscopía electrónica de barrido de las

masas indiferenciadas, se comprobó la presencia de grupos de células embriogénicas

que pasan por todos los estadios hasta llegar a formar embriones somáticos con una

estructura bipolar sin presentar conexión vascular con el tejido materno. Se logro

incrementar la biomasa en un 300 % después de 4 semanas, usando medio Murashige

and Skoog en el sistema de inmersión temporal RITA® con 3 minutos de inmersión y una

frecuencia de 4 horas. Por otro lado con 1 minuto de inmersión y frecuencia de 4 horas se

observo un mayor desarrollo de los embriones somáticos a estadio cotiledonar.

Este trabajo sienta las bases para la optimización y el escalamiento en

biorreactores para una eficiente propagación clonal, además de la manipulación genética

de esta especie.

2

ABSTRACT

At the beginning of the twentieth century Haberlandt proposed that if all the cells of

an organism had the same genetic information as the initial cell , would be able to re­

express the embryogenic development pattern to form authentic embryos of somatic

origin. This possibility was verified in cells of carrot root parenchyma in the late 50's, and

since then has expanded to hundreds of different species. The first tree species was

achieved in this expression called "totipotent cells" were Santalum album in the case of

hardwoods (Rao, 1965) and Picea abies (Chalupa, 1985; Hackman and von Arnold, 1985)

and Larix decidua (Nagmani and Bonga, 1985) in the case of conifers. Since then

hundreds of forest species have been regenerated by somatic embryogenesis. Currently

this technique is being applied to tropical crops of high economic importance of timber, as

are sorne members of the family Meliaceae found between red cedar (Cedrela odorata L.) ,

second largest tropical forest species of the world only after the mahogany (Swietenia

macrophylla J.) , estimated for timber which is resistant to putrefaction and insects, the

species is used in a wide range of products, including construction and cabinet work,

furniture and musical instruments has a high demand for reforestation and commercial

plantation in southeastern Mexico.

The present investigation had the goal to develop a system of somatic

embryogenesis in Cedrela odorata, which can be used for large-scale micropropagation

and studies such as biochemical, molecular or anatomical in the somatic embryo

development, in the same way applications genetic transformation to carry out

improvements at the plant. The process of somatic embryogenesis was characterized by

scanning electron microscopy and histology in order to observe the anatomical and

morphological structures of somatic embryo development. Embryogenic masses were also

established in temporary immersion RITA ® in order to speed up the playback and

conversion of one or more stages of somatic embryogenesis.

Somatic embryogenesis in C. odorata, was induced indirectly from proembryogenic

mass, immature zygotic embryo-derived after 24 weeks of culture using Murashige and

Skoog medium supplemented with 13.57 mM of Dicamba. By histological analysis and

scanning electron microscopy of undifferentiated masses, it was found the presence of

3

----------------------------

embryogenic cell clusters that pass through all stages up to form somatic embryos with a

bipolar structure without vascular connection with the present maternal tissue. Biomass

increase was achieved by 300% after 4 weeks using Murashige and Skoog in the

temporary immersion system with RITA ® 3 minutes of immersion and a frequency of 4

hours. On the other side with 1 minute of immersion and frequency of 4 hours there was a

further development of cotyledonary stage somatic embryos.

This work lays the foundation for optimizing and scaling in bioreactors for efficient

clonal propagation, as well as genetic manipulation of this specie.

4

Introducción

INTRODUCCIÓN

Cedrela odorata Linnaeus (Meliaceae), conocido como cedro o cedro hembra en

español , es la especie del género Cedre/a de mayor importancia comercial y extensión.

Es un árbol del Neotrópico, encontrándose en los bosques subtropical o tropical húmedas

o estacionalmente secas, desde la latitud 26° N en la costa pacífica de México, a través

de la América Central y las Indias Occidentales, hasta las tierras bajas y el pie de los

cerros de la mayoría de la América del Sur hasta una elevación de 1,200 m, con su límite

sureño alrededor de la latitud 28° S en Argentina.

La madera del cedro tiene una alta demanda, debido a que es atractiva,

moderadamente liviana (con un peso específico de 0.4) y su uso primario es para

artículos caseros. El duramen del cedro contiene una resina aromática y repelente a los

insectos que es la fuente de sus nombres populares: cedro, cedro hembra y "spanish

cedar" (su aroma es similar al de los verdaderos cedros, del género Cedrus). La madera

es fácil de trabajar, es resistente a la pudrición en contacto con el suelo como altamente

resistente a las termitas, haciéndola adecuada para la construcción en el exterior. El cedro

tendría un mayor uso si se pudiera cultivar exitosamente en plantaciones (Cintron, 1990).

Cedre/a odorata es una especie forestal tropical que está incluida en la lista de

especies de prioridad por la FAO, razón por la cual, la conservación , estudios de

variabilidad genética, propagación y uso sostenible de esta especie cobra especial

importancia. Esta especie tiene una madera de gran valor en el mercado, y por su

sobreexplotación existen pocas alternativas para recuperar en el corto plazo una riqueza

genética. Por otro lado los intentos para establecer en gran escala plantaciones puras de

cedro han fallado en el país debido al ataque de la plaga Hypsipy/a grande/la (Zeller);

lepidóptero barrenador de yemas, constituye una de las plagas forestales más severas

que reduce el valor comercial de la madera (Cintron, 1990).

Actualmente la carencia de variedades altamente productivas y tolerantes a

factores bióticos y abióticos, en conjunto con la falta de disponibilidad en calidad y

consistencia suficiente para iniciar plantaciones comerciales, constituyen una limitante

para su aprovechamiento comercial a gran escala.

5

Introducción

Los sistemas de regeneración in vitro para la reproducción de plantas basados en

embriogénesis somática además de permitir una reproducción eficiente en otros sistemas

forestales (Jain y col. 1995), constituye la base para la implementación de sistemas

eficientes de transferencia de genes para mejora genética moderna. Esta vía de

regeneración consiste, en la obtención de auténticas semillas somáticas, que tienen su

origen en células somáticas de la planta donante, las cuales se reprograman y siguen un

patrón de desarrollo idéntico al del embrión de origen cigótico. Al nd ser la célula inicial

producto de un proceso de recombinación y fusión de gametos, se conserva íntegramente

el genotipo de la planta donante. Actualmente, esta vía de regeneración cumple con los

requisitos para lograr una óptima propagación vegetativa, y por tanto se considera como

la más adecuada para la micropropagación de especies forestales (Merkle y Dean, 2000;

Sutton, 2002) .

Sin embargo, la producción de plantas clonadas por embriogénesis somática con

fines operativos, tiene que pasar por el desarrollo del cultivo en medio líquido y la

utilización de biorreactores. El cultivo en medio líquido presenta indudables ventajas sobre

el medio semisólido: hay una mayor disponibilidad de los nutrientes y se difunden mejor

los metabol itos excretados por los tejidos. Además, debido a la ausencia de la

interferencia del gelificante, se pueden medir con más facilidad y en forma continua

variaciones en el pH, conductividad , iones, etc., al tiempo que se puede reemplazar por

medio fresco con más facilidad. Sin embargo el cultivo en medio líquido presenta

problemas, como las dificultades de aireación y la inducción de fenómenos de vitrificación

en los tejidos. La técnica de inmersión temporal puede resolver dichos problemas; se ha

comprobado que diferentes frecuencias de inmersión, tienen también efectos de

regulación morfogénica, particularmente en embriogénesis somática (Etienne y Berthouly,

2002). Por ello los sistemas de cultivo en medio líquido utilizando técnicas de inmersión

temporal , se están siendo muy úti les permitiendo el escalamiento de los cultivos.

En este trabajo se llevó a cabo la inducción del proceso embriogénico en Cedrela

odorata y se analizaron los d.iferentes estadios de desarrollo mediante técnicas

histológicas y de microscopia electrónica de barrido. De igual forma se establecieron ®

cultivos en biorreactores de inmersión temporal RITA .

6

Capitulo 1

1. GENERALIDADES

1.1. CEDRO ROJO

El árbol de cedro rojo fue descrito originalmente por Linneo en 1759 en su obra

Sistema Naturae de acuerdo a Cronquist (1981 y 1988) y su clasificación taxonómica esta

descrita en la Tabla 1.

Claslftaclón Tu0fti61Rica

División: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsidae

Sub clase: Rosidae

Orden: Sapindales

Familia: Meliáceas

Género: Cedrela

Especie: Cedrela odorata

Tabla 1. Clasificación taxonómica del cedro rojo.

Cedre/a odorata es una especie tropical maderable que se distribuye en el bosque

tropical perennifolio, tropical subcaducifolio, tropical caducifolio y bosque mesófilo de

montaña (CONAFOR 2000). Su rango de distribución natural va desde el norte de México

(latitud 26° N) hasta Argentina (latitud 28° S), incluyendo el caribe (Styles 1981 , Navarro

1999, CAB 2000) .

En México el hábitat óptimo del cedro rojo se encuentra a altitudes que van desde

los O hasta los 1, 700 metros sobre el nivel del mar, los estados que c~entan con esta

especie de forma natural son: Campeche, Colima, Chiapas, Durango, Guerrero, Hidalgo,

Jalisco, Michoacán, Nayarit, Oaxaca, Puebla, Querétaro, Quintana Roo, San Luis Potosí,

Sinaloa, Sonora, Tabasco, Tamaulipas, Veracruz y Yucatán (FUMIAF, 2005) .

1.2. BIOLOGÍA DE LA ESPECIE

Cedrela odorata L. es un árbol que alcanza los 40 m de altura y un diámetro del

tronco a la altura del pecho (DAP) de 0.6 a 2.5 m. Copa ancha y redonda, con fuste recto,

7

Capítulo 1

corteza externa amarga de color rojizo y fisurada (Figura 1 ). La corteza interna es de color

rosada, posee olor a ajo y sabor amargo. Hojas compuestas, alternas paripinnadas y

grandes, hasta de 1 m de largo, con foliolos de 4.5 a 14 cm opuestos o alternos. Las flores

masculinas y femeninas son de color crema verdoso, se encuentran en la misma

inflorescencia, colocadas en panículas terminales o axilares de 30 a 35 cm.

Los frutos tienen forma de cápsulas de 4 a 7 cm de largo que se abren en cinco

carpelos. En estado inmaduro poseen un color verde y al madurar se tornan café oscuro y

entonces el fruto se desprende liberando las semillas (Figura 1 ). Cada fruto contiene

alrededor de 20 a 25 semillas pequeñas aladas y alargadas, miden de 1.2 a 4 cm de largo

y entre 5 a 8 mm de ancho. El embrión es recto, comprimido, color blanco o crema, ocupa

gran parte de la semilla y tiene dos cotiledones grandes (Salas, 1993; Satis y col. 1999;

Pennington y col. 1998).

Figura 1. Árbol de cedro rojo, hojas, frutos inmaduros, fruto maduro abierto.

1.3. USOS E IMPORTANCIA ECONÓMICA

El cedro rojo es una especie forestal considerada valiosa a nivel internacional

debido a la calidad de su aromática madera, alcanzado altos precios en el mercado

mundial solo detrás de la caoba (Swietenia macrophylla King) (ITTO, 2010).

Tanto la madera como los frutos tienen importancia artesanal para la elaboración

de artículos torneados y esculturas. La madera es apropiada para fabricar elementos no

8

Capítulo 1

estructurales de exteriores e interiores, muebles de calidad y artículos de fantasía y

artesanía (Echenique-Marique y Plumptre, 1990; Anon, 2004). Se utiliza para cajas de

cigarros, roperos y armarios resistentes a los insectos, tablillas para techados, canoas,

lápices (Andrade, 2004), e instrumentos musicales (Ricker y Daly, 1997), en particular

guitarras (INBio, 1999). También se utiliza en aparatos de precisión y como aromatizante

(Andrade, 2004).

Por otro lado de manera de manera empírica y cultural la infusión de las hojas es

usada como medicina para dolor de muelas, oídos y disentería, el tallo es antipirético,

abortivo; el látex es empleado como expectorante contra la bronquitis (FUMIAF, 2005). La

planta ha sido utilizada contra la fiebre y la diabetes (Martins y col. 2003). Se ha

observado una actividad para combatir el paludismo en extractos de madera de C.

odorata (MacKinnon y col. 1997), y ha resultado eficaz en pruebas in vivo (Ornar y col.

2003).

Por su elevado valor comercial, su fácil adaptabilidad y sus efectos restauradores

al medio ambiente, durante los últimos años las plantaciones forestales con cedro rojo

han proliferado en nuestro país. Sin embargo la demanda nacional ha sido creciente

cubriendo sólo un 29% de la demanda demostrando con esto la falta de competitividad del

sector maderero al no poder satisfacer el consumo interno, lo que ha llevado a un

aumento de las importaciones y por lo tanto a una balanza comercial negativa cada vez

más grande en el sector, que para 2007 llegó a ser de 5,593 millones de dólares

(CONAFOR, 2009).

La falta de competitividad del sector se debe a varios factores que tienen que ver

con la baja productividad de los bosques naturales respecto a la productividad que se

obtiene de plantaciones forestales comerciales, incendios, plagas y la tala ilegal,

(Coordinación General De Producción y Productividad, programa operativo anual 2009).

1.4. PROBLEMÁTICA DEL CULTIVO

En 1981 esta especie fue incluida por la FAO en la lista de especies de prioridad,

debido a la creciente escasez ocasionada por su excesivo consumo (Lahera y col. 1995),

de igual forma la especie fue considerada en 1997 por la Union for Nature Conservation

9

Cap ítulo 1

en la red list como especie vulnerable por la tala selectiva (Hilton-Taylor, 2000, IUCN

2004) . Entre los principales problemas que afectan a esta especie podemos destacar:

10

• Sobreexplotación y tala selectiva: esta especie ha sufrido una significativa

sobreexplotación desde hace mas de dos siglos (ITTO 2002; Cavers y col. 2004;

Lamb y col. 2005) y ahora su distribución de forma natural ha disminuido hasta el

punto de que raramente se encuentran grandes árboles de buena forma y tamaño

(Pennington, 1981; Navarro y col. 2004). En donde aún hay selvas, el cedro rojo

está amenazado por la tala selectiva que se enfoca al 90% o más de los árboles

comercialmente aprovechables, reduciendo las densidades poblacionales a casi

cero en escala local y regional.

• Pérdida de diversidad genética: La tala inmoderada de poblaciones naturales

pueden resultar en la pérdida de individuos con características genéticas

deseables (Cornelius y Watt 2003, De la Torre y col. 2008), posiblemente esto

explique por qué los materiales disponibles para restauración o establecimiento de

plantaciones comerciales son altamente susceptibles al ataque de plagas, ya que

la deforestación reduce la diversidad genética de especies a través de la

eliminación de la variación, la interrupción del flujo de genes y el aislamiento

(Bawa y Dayanandan, 1998).

• Prácticas de propagación ineficientes: Por otro lado las prácticas tradicionales

de propagación, para el establecimiento de plantaciones comerciales de esta

especie han evitado incrementar la competitividad y la diversificación del mercado,

por ejemplo la carencia de semillas certificadas que garanticen material elite a los

agriculto'res, para la obtención de más altos rendimientos en la producción de

madera. Pocas han sido las innovaciones tecnológicas introducidas a la fecha para

desarrollar técnicas silvícolas que proporcionen el material para abastecimientos

futuros.

• Ataque de plagas: El ataque de plagas como Hypsipy/a grande/la Zeller (lnsecta:

Pyralidae) también conocido como el barrenador de las meliáceas es una de las

plagas forestales tropicales más estudiadas. Sin embargo, hasta la fecha continúa

siendo el principal obstáculo para el establecimiento de plantaciones comerciales

Capítulo 1

con especies de meliáceas como el cedro rojo (Cornelius y Watt 2003), debido a . que la larva de esta polilla deposita sus huevecillos en los primordios de los

arboles jóvenes destruyendo los tejidos suaves que no están lignificados (Briceño­

Vergara, 1997; O'Neil y col. 2001 ; Valera, 1997), generando como consecuencia la

perdida de la dominancia apical y la proliferación de yemas laterales. El ataque de

esta plaga rara vez mata a la planta sin embargo la excesiva ramificación del árbol

imposibilita el uso comercial de su madera, eliminando el valor económico del

árbol (Briceño-Vergara, 1997).

Actualmente, las plantaciones de cedro rojo son sometidas a aplicaciones

intensivas de agroquímicos, sin embargo las personas que aplican estos métodos han sido

víctimas de fuertes intoxicaciones además de aumentar el riesgo de contaminación

ambiental.

Algunos autores han sugerido insistentemente que el mejor camino para combatir

esta plaga puede ser a través de la búsqueda y selección de plantas resistentes a su

ataque mediante un programa de mejoramiento genético de C. odorata (INIFAP, 1997). Se

han observado mecanismos naturales de resistencia sugiriendo la existencia de individuos

de C. odorata con cierto grado de tolerancia en contra del ataque de H. grande/la , lo cual

aumentaría la posibilidad de que individuos tolerantes puedan ser clonados mediante

técnicas biotecnológicas como el cultivo in vitro (Cornelius y Watt, 2003).

1.5.LA BIOTECNOLOGÍA COMO ALTERNATIVA PARA EL

MEJORAMIENTO VEGETAL

El mejoramiento genético de especies forestales usando técnicas tradicionales es

un proceso muy lento debido a sus largos periodos de vida, el tamaño de los arboles, la

recalcitrancia de las semillas, la diversidad genética y la incompatibilidad sexual (Park,

2002) . La biotecnología vegetal y en particular, el cultivo de tejidos ofrecen una amplia

gama de alternativas para resolver estos problemas. Las técnicas de micropropagación

son disponibles para la rápida producción de nuevas variedades y clones para

plantaciones, así como para el rescate de variedades en peligro de extinción. Estas

técnicas también están disponibles para la producción de líneas certificadas sanas la cual

11

Capítulo 1

podría ser considerada como un medio par~ evitar la dispersión de enfermedades. El

implementar técnicas de micropropagación para esta especie sería de gran utilidad.

1.5.1. CULTIVO /N VITRO

El cultivo de tejidos es la ciencia del crecimiento de las células vegetales, tejidos u

órganos aislados de la planta madre en un medio artificial, mediante .la cual se regeneran

plantas llamadas microplantas (George y col. 2008). Es decir, consiste en cultivar

pequeños segmentos de una planta (explante) sobre un medio de cultivo, con el propósito

de regenerar plantas completas, o mantener células desdiferenciadas.

La propagación in vitro fue propuesta por Gottlieb Haberlandt ( 1902) cuando

hipotetizó que puede generarse una planta funcional y completa a partir de una sola

célula, denominando a este evento totipotencialidad de células somáticas, para

rediferenciarse y desarrollar nuevos centros meristemáticos que son capaces de

regenerar una planta normal (Ziv, M. 1999), o que pueden formar tallos, raíces o

embriones somáticos de acuerdo con la competencia que posean y al estímulo que

reciban (Olmos y col. 2004). La regeneración de las plantas puede darse por 2 rutas

morfogénicas:

• Vía Organogénica

Cultivo de yemas o meristemos preexistentes

Regeneración de nuevos brotes por organogénesis

• Vía embriogénica

Inducción de embriones somáticos.

Los primeros dos métodos permiten la formación vía organogénesis de brotes

unipolares y tendrán que ser enraizados en un proceso de múltiples pasos (Thorpe y col.

1991 ). El término organogénesis aplicado al cultivo in vitre de tejidos vegetales se refiere a

la formación de novo de órganos en los explantes cultivados. Entre los órganos que se

pueden formar las raíces, los brotes adventicios, los cuales son estructuras similares a

una yema y tienen la capacidad de originar una nueva planta después de elongarse y

formar las raíces.

12

Capítulo 1

1.5.2. EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA (ES)

La embriogénesis somática (ES) es un proceso en el que una estructura bipolar

(que asemeja a un embrión cigótico) se desarrolla a partir de una célula no cigótica, sin

presentar conexión vascular con el tejido original (Von Arnold y col. 2002). La ES es la

más clara expresión del fenómeno de totipotencia celular enunciado por Haberland en

1902 (citado por Etienne y col. 1999; Solano, 2001 ). La totipotencia, es la capacidad de

las células para formar un nuevo individuo genéticamente idéntico a la célula madre

(Berthouly, 1997).

Desde la primera observación de la formación de un embrión somático en

suspensiones celulares de Daucus carota por Steward y col. (1958) y Reinert (1959), el

potencial de la ES ha sido aplicado a 300 especies de plantas aproximadamente,

pertenecientes a varias familias (Rojas-Herrera y col. 2002).

La ES es una herramienta muy útil para la propagación de plantas y consiste en la

habilidad de las células competentes para cambiar su ruta de diferenciación a fin de

convertirse en embriones somáticos (William y Maheswaran 1986).

En el caso de las dicotiledóneas, un embrión somático es morfológicamente similar

a un embrión cigótico, sobre todo en su desarrollo evolutivo desde proembrión, fase

globular, corazón , torpedo y fase cotiledonar o embrión maduro (Yasuda y col. 2000) .

En los estados iniciales, el suspensor está en menor desarrollo en embriones

somáticos (quizás un reflejo de inutilidad en condiciones in vitre) . Otra diferencia

importante es que el embrión cigótico forma un eje embrional con el meristemo apical

preparándose para la dormancia. Mientras que el embrión somático no sufre desecación

ni dormancia, así la ES se dirige a formar de una célula , una planta sin interrupción

(Merckle, 1990).

Xu y Bewley (1992) con la ayuda de un microscopio electrót:~ico describieron los

contrastantes patrones de desarrollo entre los embriones somáticos y cigóticos,

destacando un desarrollo lento en los estados tempranos y un desarrollo más rápido en

los estados tardíos del embrión somático en comparación con el cigótico; otra diferencia

13

Capítulo I

fue la falta de suspensor bien definido y la formación de múltiples cotiledones mal

desarrollados en embriones somáticos.

Las aplicaciones de la ES son la eliminación viral, propagación clonal ,

conservación de genes, fertilización in vitro, inducción de mutación para diversidad

genética, transformación genética, producción de metabolitos secundarios, cultivo de

protoplastos e hibridización somática (lshii , 1998).

Las principales limitaciones del uso de la ES para la propagación son las bajas

tasas de multiplicación, la producción de variantes somaclonales, la maduración

incompleta, la germinación baja y no sincrónica y el numero bajo de vitroplantas

sembradas en el campo según Merkle (1995).

1.5.3. VÍA DE REGENERACIÓN POR ES

La regeneración de plantas vía embriogénesis somática incluye cinco pasos (Van

Arnold y col. 2002) :

14

a) Iniciación del cultivo embriogénico por cultivo del explante primarioen medio

suplementado con . reguladores de crecimiento vegetal principalmente auxinas

al igual que citocininas.

b) Proliferación del cultivo embriogénico en medio sólido o líquido suplementado

con reguladores de crecimiento en una cantidad similar a la de inicio.

e) Premaduración de embriones somáticos en medio libre de reguladores de

crecimiento vegetal, esto inhibe la proliferación y estimula la formación y el

desarrollo temprano de los embriones somáticos.

d) Maduración de embriones somáticos por cultivo en medio suplementados con

ABA y/o teniendo un reducido potencial osmótico.

e) Regeneración de plantas en medio libre de reguladores de crecimiento.

Capítulo 1

1.5.4. TIPOS DE ES

Los embriones somáticos pueden generarse por dos vías:

• de forma directa a partir de células embriogénicas desarrolladas directamente

del explante (sin la intervención de la fase de callo),

• o de manera indirecta, a partir de tej ido desdiferenciado con desorganizados

ciclos mitóticos no embriogénicos (fase de callo) interpuestos entre el explante

de tejido diferenciado y estructuras embriogénicas reconocidas (Williams y

Maheswaran , 1986; Merkle, 1990).

• La embriogénesis secundaria se refiere al uso de embriones somáticos como

explantes para inducir ciclos repetitivos de embriogénesis, lo que incrementa

las tasas de multiplicación. Tiene la ventaja de ser independiente del explante,

adecuada para la automatización, alta tasa de multiplicación y reproducibilidad

(Vasic y col. 2001 ).

1.5.5. FACTORES QUE AFECTAN LA ES.

El contenido de auxinas y de nitrógeno en el medio de cultivo son generalmente los

factores más importantes en la inducción de la embriogénesis somática. Igual de

importante es la concentración endógena de hormonas del explante, ya que estas influyen

en la capacidad embriogénica. Existen evidencias de que las concentraciones externas de

auxinas o el balance auxinas/citocininas en el cultivo primario de cultivo, es crítico para la

inducción de la actividad mitótica y para la redeterminación epigenética de las células

involucradas en el desarrollo embriogénico. En la mayoría de los casos el regulador de

crecimiento con acción de auxina 2,4-D (2,4-diclorofenoxiacético) es usado en la

inducción de la embriogénesis somática, pero no es el único compuesto utilizado. En el

proceso de embriogénesis somática, generalmente se requieren dos etapas, la de

inducción y la de expresión, la primera con presencia de auxinas y la segunda con bajas

dosis o nula concentración de estas mismas.

15

Capitulo 1

1.5.6. CARACTERISTICAS DE UN EMBRIÓN SOMÁTICO

La característica más distintiva de un embrión somático, es que constituye un

nuevo individuo con estructura bipolar (raíz y brote) capaz de originar una planta

completa. Según Sannasgala (1989), Escalant y Teisson (1989), el embrión somático

presenta las siguientes características:

• Tiene autonomía frente al tejido generador (protegido generalmente por una

epidermis). Histológicamente se plantea que no tiene conexión vascular con el

tejido que le dio origen, por lo que pueden ser separados fácilmente de éste.

• Es una estructura bipolar con un ápice radical, apical y cotiledones.

• Presenta bandas procambiales entre los ápices.

Según Parrott (1993), la inducción del estado embriogénico somático incluye la

inducción de los mismos mecanismos genéticos que conllevan a la embriogénesis

cigótica.

La ES ha sido descrita como un fenómeno muy complicado para el cual la

naturaleza y las características fisiológicas y temporales de los explantes son cruciales

para el éxito. La ES se ha inducido principalmente a partir de explantes como: embriones

cigóticos maduros (Xie y col. 2001; Pinto y col. 2002), brotes epicórmicos (Hernández y

col. 2003), cotiledones y radículas (Tang, 2000) y semillas maduras (Kim y col. 1997;

Murthy y col. 1998).

1.5.7. LA ES COMPARADA CON LA EMBRIOGÉNESIS CIGÓTICA.

La ES es un proceso biológico por medio del cual se obtienen embriones

somáticos a partir de células somáticas. Estos embriones somáticos se desarrollan al

pasar por las fases globular, torpedo y cotiledonar en dicotiledóneas similares a las del

embrión cigótico (Ammirato, 1983). Los embriones somáticos presentan una estructura

bipolar, con meristemos apicales y radicales en extremos en un mismo eje, en donde las

características morfológicas son parecidas a las encontradas en los embriones cigóticos

como se observa en la Figura 2 (Denchev y col. 1992; Abdelnour and Escalant, 1994;

Solano, 2001).

16

Capítulo 1

En el caso de las dicotiledoneas, un embrión somático es morfológicamente similar

a un embrión cigótico, sobre todo su desarrollo evolutivo desde proembrión, fase globular,

corazón , torpedo y cotiledonar o embrión maduro (Yasuda y col. , 2000) , y en

monocotiledóneas pasan por los estados globular, escutelar y· coleoptilar (Gray, 1997).

EMBRIOGENESIS CIGÓTICA

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Cre:amtr:nto

Figura 2. Embriogénesis somática vs embriogénesis cigótica (adaptada de Zimmerman).

1.6. SISTEMAS DE MICROPROPAGACIÓN

La micropropagación consiste en la propagación (multiplicación vegetativa) de un

genotipo a gran escala a través del empleo de técnicas de cultivo de tejidos. Esta técnica

es utilizada, en la actualidad, en cientos de laboratorios de todo el mundo para la

producción de millones de plantas de interés comercial.

Micropropagación en medio semisólido: La adición de un gelificante (agar, gelrite,

fitagel , etc) a los medios de cultivos crea un substrato sobre el cual las plantas crecen y

se multiplican. A pesar de las ventajas de la micropropagación como la rápida

propagación, la uniformidad del material clonado y la eliminación de enfermedades, el

hacer uso de los gelificantes, las continuas transferencias a nuevos contenedores y la

mano de obra hacen de éste un proceso caro. Por lo que es necesario desarrollar

métodos alternativos.

17

Capítulo 1

Micropropagación en medio líquido: El cultivo en medio Hquido es considerado como

una solución para reducir los costos de la micropropagación a gran escala . Ofrece varias

ventajas como la eliminación del gelificante, el medio puede ser fácilmente removido, su

esterilización puede ser por filtración, pero su principal desventaja es el alto índice de

vitrificación que produce en los tejidos.

1.6.1. BIORREACTORES DE INMERSIÓN TEMPORAL

Los biorreactores de inmersión temporal son una buena opción para

complementar este método debiendo ser optimizado para cada especie y fase del cultivo.

Su uso podría ser la mejor manera de escalar un proceso de micropropagación,

particularmente de la embriogénesis somática (Etienne y col. 2006). Obteniendo no solo

un eficiente sistema de multiplicación, sino también rápido y económico; debiendo sobre

todo, generar plantas de la mejor calidad que sobrevivan al transplante a condiciones ex

vitro.

El problema de vitrificación (hiperhidricidad) causado por la inmersión continua del

tejido vegetal en el medio líquido puede ser solucionado mediante el método de inmersión

temporal consistente en una fase de inmersión total de los tejidos alternada con otra de

aeración drenando el medio de cultivo.

Los sistemas de inmersión temporal aportan efectos positivos en la

micropropagación durante la proliferación de brotes, microesquejes, microtuberización y

ES, mejorando la calidad de las plantas obtenidas. La duración del tiempo de inmersión y

la frecuencia de la misma, son los parámetros más decisivos para la eficiencia del

sistema. Optimizar el volumen de los nutrientes del . medio y el volumen del contenedor

también mejora la eficacia para la producción de brotes.

1.6.2. BIORREACTORES DE INMERSIÓN TEMPORAL RITA®.

Teisson y col. (1995) diseñaron un "biorreactor de inmersión temporal" al cual

denominaron RITA por sus siglas en francés, este sistema de inmersión temporal

proporciona un manejo simple de las plantas y el medio, además de una nutrición

mejorada debido a que la planta está en contacto con el medio durante la inmersión, y lo

restante de aireación. Hay una disminución de la asfixia en la planta y una renovación

18

Capítulo 1

completa de la atmósfera del cultivo en cada inmersión. Se puede tener control del

proceso morfológico modificando la frecuencia y la duración de la inmersión.

El equipo consta de un vaso que contiene el medio nutritivo y una base de plástico

a media altura con orificios que soporta una esponja de poliuretano donde se colocan los

explantes, además de una conexión vertical que esta al centro del vaso, por la cual entra

y sale el flujo de aire que proporciona la bomba compresora. Este sistema, es

automatizado con el reloj de una computadora que permite la programación de los

tiempos de inmersión y aireación del sistema, mediante un dispositivo de distribución de

aire con una electro-válvula de tres vías que está directamente conectado a la bomba

compresora inyectando un litro de aire por minuto a una presión de 0,2 bar. El aire que

entra en cada biorreactor Rita® está esterilizado por filtros (Figura 3).

--+ INMERSIÓN o I'J !1

l l l lh t

~ ~

Electro·válvula AIREACIÓN de 3 vías '

®Bomba !:?Electroválvula

Figura 3. Flujo de aire en el sistema RITA. Muestra como la entrada y salida del aire es regulado por un electro-válvula de 3 vías, en la inmersión se abre permitiendo el flujo de aire alimentado por la bomba y en la aireación esta se cierra al momento de apagarse el equipo (tomado de VITROPIC S.A, RITA® http://pagesperso-orange.fr/vitropic/rita/es/fonction.htm)

1.6.3. FUNCIONAMIENTO DEL EQUIPO

Una vez instalado el equipo adecuadamente los explantes se colocan sobre el

disco de la esponja de poliuretano y se mantendrá en dos diferentes fases:

19

Capítulo 1

Fase emergida. Esta fase es la de mayor duración donde el explante se mantiene libre del

medio líquido y regularmente las horas dependen de la especie.

Fase sumergida. La duración de esta fase se define por experimentación pero siempre es

corta: Puede variar de 1 minuto por día hasta 4 veces 15 minutos por día.

Una sobrepresión de aire estéril, aplicada en la parte baja del recipiente, permite al

medio de cultivo subir a la parte alta donde se encuentran los explantes. El aire inyectado

permite la oxigenación del medio. Pasado el tiempo de inmersión, la bomba de aire se

apaga. Las presiones se equilibran, y el medio vuelve a bajar por gravedad a la parte

inferior. Por capilaridad, una fina película de medio se mantiene en contacto sobre los

explantes (Figura 4).

Figura 4. Funcionamiento del sistema RITA. 1) Los explantes son colocados en el recipiente sobre la base de poliuretano; 2) es inyectado el aire a una presión de 0,2 bares ascendiendo el medio y desplazando la atmósfera preexistente; 3) los explantes son sumergidos en el medio durante el tiempo programado; 4) pasado el periodo de inmersión la bomba se apaga y la presión del aire disminuye descendiendo el medio (VITROPIC S.A, RITA® http://pagesperso­orange. fr/vitropic/rita/es/fonction . htm).

Este biorreactor, que permite además automatizar el sistema, ha sido empleado

con éxito en varios cultivos como el café, caucho, plátano, piña, palma de aceite y cítricos

(Escalant, y col. 1994; Alvard , y col. 1993; Etienne, y col. 1997; Teisson y Alvard, 1998).

20

Capítulo 1

1.7.ANTECEDENTES DE LA ES EN ESPECIES MADERABLES

En especies maderables la ES ofrece ventajas únicas como los más altos

promedios de producción de propágulos por un solo evento de inducción (Pullman y

Johnson 2002; Yildirim y col. 2006), criopreservación de callos embriogénicos (Park,

2002), rejuvenecimiento (Von Aderkas y Bonga, 2000; Ravindra y Nataraja 2007), la

capacidad de producir semillas artificiales (Aquea y col. 2008) y muy marcadamente un

bajo promedio de producción de plantas quiméricas derivadas de experimentos de

transformación genética (Bajaj 1995; Álvarez y Ordás, 2007).

La ES ha sido demostrada en algunos géneros y especies de árboles tropicales

tales como Santalum album, Citrus, Mangifera indica (Jain y col. 1995), y Theobroma

cacao (Maximova y col. 2002).

Entre las especies maderables de origen tropical la ES ha sido reportada para

Eucalyptus (Pinto y col. 2002; Titan y col. 2007), Hevea brasiliensis (Bianc y col. 1999) y

algunos miembros de la familia de las Meliaceas tales como Melia azedarach (Vila y col.

2003; Vila y col. 2007), Azadirachta indica (Shrikhande y col. 1993; Su y col. 1997;

Murthy y Saxena, 1998; Akula y col. 2003; Rout, 2005), Swietenia macrophylla (Maruyama

e lshi , 2009) y Cedrela fissilis (Vila y col. 2009).

1. 7 .1. ANTECEDENTES DE LA ES EN CEDRO ROJO

Hasta la fecha existen algunos reportes en los cuales se ha intentado inducir la

embriogénesis somática en esta especie, como el caso de Muñoz (2003) quien reportó

que el explante que mejor respondió a la inducción de la embriogénesis somática, fue el

entrenudo proveniente de plántulas germinadas in vitro, en medio MS (Murashigue y

Skoog, 1962) con 90.49 IJM de 2,4-D (Ácido 2,4-Diclorofenoxiacético) y 20 mi L-1 de

endospermo líquido de coco, alcanzando un posible estadio globular pero sin llegar a la

formación completa de un embrión somático.

Arellano-Rivas en el 2007 planteó una metodología de propagación para Cedrela

odorata a través de embriogénesis somática y el cultivo de ápices, estableciendo que los

mejores resultados en cuanto a la formación y apariencia de callo embriogénico se

observaron al utilizar 9 1-JM de 2,4-D y 2.25 IJM de cinetina en medio 85 (Gamborg, 1968),

21

Capitulo 1

empleando como explante el cotiledón, donde al igual que en el trabajo anterior, real izado

por Muñoz (2003), se presentaba una cantidad considerable de embriones en etapa

globular pero de igual forma sin desarrollar a las siguientes etapas.

Previamente, nuestro equipo de trabajo reportó (Dominguez, 2008) un protocolo de

ES para C. odorata, en el cual después de hacer una variedad muy amplia de

experimentos con diferentes tipos de explantes (cotiledones, hipocotilos, embriones

cigótico maduros e inmaduros) y RCV's (2,4-D, BAP, Dicamba) se obtuvieron diferentes

tipos de callos como respuesta a las inducciones como se muestra en la Figura 5.

Sin embargo a partir de embriones cigóticos inmaduros, empleando medio MS con

la adición 13.57 1-1M de Dicamba, observamos la inducción de un tipo de callo friable

proembriogénico (Figura 5F) y posteriormente la formación y desarrollo de los embriones

somáticos (Dominguez, 2008; Peña y col. 201 0), en este evento se presentó alrededor de

un 23% de respuesta de los explantes. A las 28 semanas de cultivo se pudo observar la

presencia de todos los estadios de la embriogénesis somática, globular, corazón, torpedo

y cotiledonar, sin embargo los embriones en estado cotiledonar no presentaron desarrollo

de raíces.

Con el objetivo de desarrollar un método eficiente de inducción de ES y la

regeneración de plántulas de embriones somáticos como herramienta para la propagación

clonal , criopreservación y mejoramiento genético, reportamos el establecimiento y la

caracterización de un protocolo para la inducción de la embriogénesis somática y la

regeneración de plántulas de Cedrela odorata.

22

Capítulo!

Figura 5. Caracterización de callos proembriogénicos. Tipo A: algodonoso, blanquecino; tipo B: compactos, verde oscuros y de baja velocidad de crecimiento; tipo C: cristalinos , verde claro; tipo D: estructuras amorfas de color café oscuro; tipo E: con apariencia de tejido muerto sin embargo por dentro son viables; tipo F: disgregables, globulares, translúcidos, amarillo claro y con alta velocidad de crecimiento (Dominguez, 2008).

23

Capítulo 11

2. JUSTIFICACIÓN

A la fecha no existe un protocolo eficiente de regeneración in vitro vía

embriogénesis somática para Cedrela odorata, la conversión. a plántula de los embriones

somáticos en estado cotiledonar reportados por Domínguez en 2008 no se llevó cabo,

tampoco el desarrollo de raíces, por lo anterior proponemos reproducir y establecer un

sistema de regeneración de cedro rojo mediante embriogénesis somática, realizar una

caracterización morfológica del proceso embriogénico por medio de análisis histológicos y

con microscopía electrónica de barrido para observar la formación y conglomeración de las

estructuras embrionarias; al mismo tiempo establecer las mejores condiciones para el

escalamiento del cultivo en sistemas de inmersión temporal; todo esto con miras a futuro

para el mejoramiento genético, propagación masiva y criopreservación de la especie.

25

Capítulo III

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GENERAL

Desarrollar y caracterizar un sistema de propagación de cedro rojo (Cedre/a odorata L.)

mediante embriogénesis somática en biorreactores de inmersión temporal.

3.2. OBJETIVOS PARTICULARES

~ Reproducir el protocolo de inducción de embriogénesis somática en C.

odorata reportado por Dominguez, 2008.

~ Caracterizar morfológicamente el sistema de regeneración a través de

técnicas histológicas y microscopía electrónica de barrido.

~ Generar un eficiente método de propagación mediante embriogénesis

somática en Cedrela odorata.

27

4. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL .

Dicamba, ABA, GA3

Selección y colecta de material

Inducción de callo embriogénico

Mantenimiento de embriones somáticos

Multiplicación y desarrollo en biorreactores

\l Germinación de

embriones somáticos

Capítulo IV

.---... Análisis histológico

----t

Análisis por MEB

Tiempo de inmersión

Frecuencia de inmersión

29

Capítulo V

5. METODOLOGÍA

5.1. SELECCIÓN Y COLECTA DEL MATERIAL VEGETAL

Siguiendo las recomendaciones descritas por Longman (1993) la recolección del

material vegetal (frutos inmaduros) se llevo a cabo a partir de un ejemplar elite con

características fenológicas deseables, local izado en poblaciones naturales en el municipio

de Acayucan , Veracruz, México (GPS 18° 02'35.9T'N. 94° 51' 16.44 " W).

Los frutos fueron colectados directamente de un árbol previamente seleccionado

de aproximadamente 1 O años de edad, a los que cuyos parámetros morfológ icos fueron

como lo indica la Tabla 2:

Parámetros Medida Moñológicos (m)

Diámetro a la altura del 1m

pecho (DAP)

Alto del fuste hasta la 1 a 3m

ramificación

Altura 20m

Tabla 2. Características morfológicas del individuo muestreado.

Los frutos contenían alrededor de 15 a 20 semillas en los cuales ya se lograba

distinguir el embrión . Se verificó que las capsulas no presentaran algún tipo de daño

mecánico o hendidura por la cual pudiera ser una vía de contaminación.

5.2. DESINFECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL

Los frutos inmaduros fueron transportados al laboratorio y desinfectados

superficialmente lavándolos en agua corriente con detergente comercial. Posteriormente

los materiales fueron incubados durante tres horas en una solución al 40% (v/v)

preparado a partir de una solución comercial de hipoclorito de sodio al 5.5 % de cloro libre

(Cioralex; Allen), seguido de varios enjuagues con agua destilada desionizada estéri l

(Dominguez, 2008), y llevados a la campana de flujo laminar con la finalidad de abrirlos

bajo condiciones asépticas.

31

Cap ítulo V

5.3. EXTRACCIÓN DE LOS EMBRIONES CIGÓTICOS y

ESTABLECIMIENTO IN VITRO

Una vez que los frutos fueron trasladados a la campana de flujo laminar, se

cortaron longitudinalmente con el bisturí separando los carpelos que contienen a las

semillas, mismas que fueron retiradas con unas pinzas estériles. Para extraer los

embriones, se realizó un pequeño corte en el extremo radicular y aplicando una ligera

presión sobre el lado opuesto para que salga el embrión (Figura 6).

Figura 6. Fruto, semilla y embrión cigótico de cedro rojo.

5.4. MEDIO DE INDUCCIÓN

Los embriones extraídos, se inocularon en el medio de inducción MS (Murashigue

& Skoog, 1962) (ver anexo 1) + 13.57 !JM de Dicamba, 80mM de sacarosa y 0.25%(m/v)

de gelrite para inducir callos embriogénicos. El pH del medio fue ajustado a 5. 7 con

soluciones de KOH 0.2N y HCI 0.1 N, para después, esterilizarlos en un autoclave a 1,46

Kg .cm·2 durante 20 minutos. Los cultivos fueron subcultivados en medio fresco cada 4

semanas. Las condiciones del cuarto de cultivo fueron de 16 horas luz y 8 de oscuridad

climatizado a 27 ± 2°C, con una intensidad lumínica de 70 ¡Jmol M-2 s-1, y una humedad

relativa del40%.

Una vez realizada la inducción después de 9 semanas, los cultivos fueron

analizados y las diferentes estructuras indiferenciadas generadas fueron clasificadas de

acuerdo a su apariencia, color y textura. Solo las estructuras callogénicas que

presentaban la apariencia y similitud con los reportados por Dominguez (2008) , (callos

tipo 4F) , fueron subcultivados en medio fresco cada 3 semanas durante 12 semanas.

32

Capítulo V

5.5. ANÁLISIS DE ESTRUCTURAS EMBRIOGÉNICAS

5.5.1 . ANÁLISIS HISTOLÓGICOS

Para realizar este análisis se tomaron muestras de callos embriogénicos de 9

semanas de cultivo.

• FIJACIÓN.

El fijador FAA: se preparó mezclando 100 mi L-1 de formaldehído, 50 mi/L de Ácido

Acético, 500 mi L-1 Alcohol , y 350 mi L-1 de agua destilada (se preparó el día que se utilizó)

se dividió en viales y se puso en refrigeración a 4°C. Las muestras de tejidos

embriogénicos se colocaron en los viales con solución FAA y se dejaron 4 días, 24 horas

de infiltración a temperatura ambiente y los días restantes a vacío constante a 4°C.

Después de los 4 días se eliminó la solución por decantación y se enjuagó con agua

destilada para eliminar el fijador.

• DESHIDRATACIÓN.

Una vez que se retiró la solución de FAA y se enjuagaron los tejidos y se añadió

una serie de soluciones de etanol de 30%, 50%, 70%, 85%, 96% y alcohol absoluto, 1

hora para cada cambio de solución de etanol al vacío y 4°C., el etanol absoluto se dividió

en dos tiempos de media hora al vacío y 4°C.

• PREINFIL TRACIÓN.

Se retiró completamente el etanol absoluto mediante decantación y con la ayuda

de una pipeta pasteur y se adicionó la resina JB4 (JB-4 Kit de Incorporación, Polyscience)

solución A (JB-4 Embedding monomer) + catalizador (peróxido de benzoilo Plasticized) 48

h. a vacío y 4°C, después se llevó a cabo la infiltración con la resina JB4 solución A +

catalizador+ solución B (JB-4 Embedding) por 4 días.

33

apítuto ================================================================================ ~

• CORTE Y TINCIÓN.

Cuando la resina polimerizó completamente se hicieron cortes de 0.03-0.05 mm en

el micrótomo (Microtome Blades Disposable). Las laminillas se flotan en un cristalizador y

con la ayuda de una pequeña pinza se recogieron en un portaobjetos, secando las

muestras en una placa de calentamiento. Posteriormente se realizó el proceso de tinción

de los portaobjetos con las muestras con 0.05% de azul de toluidina, después de 2 o 3

minutos se enjuagan con agua para eliminar el exceso de colorante; una vez coloreadas

las muestras de azul se contrastó con el reactivo de PAS (Schiff-Ácido Periódico) durante

5 minutos lo que da un color rojo y posteriormente fueron enjuagadas nuevamente con

agua para eliminar el exceso de colorante; finalmente fueron observadas y fotografiadas

con un microscopio Olympus BX42 equipado con una cámara CCD.

5.5.2. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO (MEB)

Para realizar estudios ultraestructurales y analizar callos embriogénicos en varios

estadios de desarrollo, los callos embriogénicos fueron colocados en una solución de

fosfatos y deshidratados a través de una serie de concentraciones crecientes de alcohol

(30%, 50%, 70%, 85%, 96% y 100% v/v) , por 60 m in al vacío en un desecador,

posteriormente las muestras se llevaron a punto crítico secándolas a una presión de 1070

psi con C02 (Balzres CPD 020 Critica! Point Dryer; Bai-Tec, Schalksmuhle, Germany) a

una temperatura de -30 oc durante 2 minutos.

El espacio dejado por el etanol es ocupado por el C02 líquido el cual

posteriormente se sublima dejando el espacio celular intacto. Posteriormente las muestras

se colocaron sobre una base con cinta doble adherente para cubrirlas con una capa de

oro (Metalizador Dentan vaccum, Modelo Desk 11) de 120 nm y luego se realizaron las

observaciones la muestra a 10-20 kV utilizando un microscopio electrónico de barrido

Zeiss DSM 940A (Zeiss, Oberkochen, Germany).

5.6. ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS EN SISTEMAS DE

INMERSIÓN TEMPORAL RITA.

Con la finalidad de sincronizar las masas embriogénicas e inducir la germinación

de los embriones somáticos se establecieron cultivos en los biorreactores de inmersión

34

Capítulo V

temporal RITA. Se colocaron aproximadamente 100 mg de tejido (masas embriogénicas)

en los recipientes que contenían 250 mi de medio MS líquido sin RCV, experimentando

con varios tiempos y frecuencias de inmersión (Tabla 3), empleando 2 repeticiones para

cada tratamiento. El material fue incubado en un cuarto en fotoperiodo de 16 horas luz y 8

de oscuridad climatizado a 27±2 °C con una Intensidad lumínica de 70 ¡Jmoi.M-2 s-1 y una

Humedad relativa del 40%. Se espera que las masas embriogénicas se incrementen en

peso y evolucionen en sus diferentes estadios hasta alcanzar una sincronización en el

estado cotiledonar. Los controles serán realizados bajo las mismas condiciones en medio

semisólido.

TIEMPO DE FRECUENCIA DE

INMERSIÓN INMERSIÓN EN HORAS. EN

MINUTOS 2 4 6 8

1 T1 T2 T3 T4

3 T5 T6 T7 T8

Tabla 3. Tiempos y frecuencias de inmersión en el sistema RITA en medio MS líquido sin RCV

De la misma forma que el experimento anterior se realizaron otras pruebas con los

mismos tiempos y frecuencias de inmersión pero empleando el regulador de crecimiento

Dicamba a una concentración de 13.57 IJM (ya que esta fue la concentración con la que

se realizó la inducción de la embriogénesis somática) esperando ver la respuesta de las

masas embriogénicas en su incremento en peso fresco y en la sincronización del cultivo.

5.7. GERMINACIÓN DE EMBRIONES SOMÁTICOS

Para tratar de inducir la germinación de los embriones somáticos se emplearon

concentraciones de ABA y GA3 tal como lo muestra la tabla 4. El medio de inducción fue

el MS, 80mM de sacarosa y 0.25%(m/v) de gelrite. El pH del medio fue ajustado a 5.7 con

soluciones de KOH 0.2N y HCI 0.1 N, para después, esterilizarlos en un autoclave a 1 ,46

Kg .cm-2 durante 20 minutos. Las condiciones del cuarto de cultivo fueron de 16 horas luz y

8 de oscuridad climatizado a 27± 2°C, con una intensidad lumínica de 70 ¡Jmol M-2 s-1, y

una humedad relativa del 40%.

35

Capitulo V

Concentración RCV (IJM)

o 1 3 5

GA3 T1 T2 T3 T4

ABA T5 T6 T? T8

Tabla 4. Concentraciones de los RCV empleadas para la maduración y germinación de los embriones somáticos.

En este experimento se evaluaran la elongación del embrión y la formación de

raíces ya que la conversión de un embrión somático se lleva a cabo cuando el embrión

tiene una apariencia de estructura bipolar, empieza la formación de brotes con hojas

verdaderas, elongación del tallo y de la raíz y la formación de raíces secundarias según lo

describen Litz y Jarret (1991 );

36

Capítulo VI

6. RESULTADOS

6.1. ESTABLECIMIENTO IN VITRO E INDUCCIÓN DE LA

EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA

La metodología de desinfección reportada por Domínguez (2008) para los frutos

inmaduros de cedro fue eficiente debido a que no hubo presencia de microorganismos

contaminates en el proceso de extracción del embrión, ni al momento de su inoculación

en el medio de cultivo. La solución de hipoclorito de sodio al 40% por un tiempo de 3

horas es suficiente para eliminar cualquier amenaza de contaminación. Basado en lo

reportado por Dominguez en el 2008 se llevó a cabo la inducción de la embriogénesis

somática a partir de embriones cigóticos inmaduros de cedro rojo como explantes (Figura

7).

Figura 7. Frutos inmaduros de cedro. Proceso de disección del fruto y embrión cigótico inmaduro extraído en campana de flujo laminar.

La inducción de la embriogénesis somática fue realizada en medio semisólido MS

+ 13.57 !JM de Dicamba obteniendo, después de 9 semanas, masas callosas con

variaciones en color, textura, apariencia y friabilidad. Se observaron estructuras friables

globulares de color amarillo claro, disgregables que se generaron en el tejido materno y

que continuaron en crecimiento (Figura 8). Mientras que otros tipos de callo se

necrosaban y morían. Este tipo de estructuras fueron similares a las reportadas en el

2008 por Dominguez,

37

Capítulo VI

Figura 8. Callo embriogénico con apariencia friable de color amarillo

Figura 9. Inducción de embriogénesis somática después de 28 semanas. A) callo embriogénico; B) embrión globular-corazón ; C) embrión cotiledonario inicial; D) embrión cotiledonario convertido.

En la Figura 9 podemos observar claramente diferentes estadios del desarrollo los

embriones somáticos, en la Figura 9A se observa el explante inicial después de 28

semanas de cultivo en medio MS con Dicamba que empieza a generar estructuras de

38

Capítulo VI

aparitincia disgregable las cualtiS siguen creciendo y separándose del tejido materno con

el paso del tiempo. En la Figura 98 podemos observar la formación de estructuras

globulares claramente disgregables del explante original. En la Figura 9C a las 30

semanas de cultivo se pueden apreciar nuevas etapas del desarrollo de la embriogénesis

somática como son las formas de corazón, torpedo y torpedo cotiledonar, también se

observa una leve apariencia de vitrificación; en la Figura 90 se puede ver la formación de

un embrión somático cotiledonar en proceso de maduración, sin embargo también se

observa la presencia de una nueva formación de estructuras embrionarias secundarias en

la parte que corresponde a la generación de la radícula del embrión somático

6.2. DESARROLLO DE EMBRIONES SOMÁTICOS Y ANÁLISIS

ESTRUCTURAL

Las masas embriogénicas obtenidas fueron analizadas por MEB. En la Figura 11A

donde se logran observar células somáticas en aparente división mitótica, también se

visualiza como forman estructuras que darán lugar a la generación de tejidos. Estas

masas embriogénicas se encuentran en continua división celular, dando lugar al proceso

de embriogénesis somática repetitiva (Merkle y col. 1990) (Figura 1 0), el cual ocurre

cuando los embriones somáticos primarios, en vez de madurar normalmente hasta

plántulas dan origen a ciclos sucesivos de embriones somáticos, que provienen

comúnmente de células superficiales de los cotiledones ó del hipocotilo.

Figura 1 O. Embriones somáticos en proceso desincronizado, presentando varias etapas de desarrollo disgregándose en el medio de cultivo al no tener conexión vascular con el tejido materno.

39

Capítulo VI

Figura 11 . Anál isis ultraestructural de embriones somáticos. Escalas: a, b, 100 ¡Jm, e, h 200 IJm.

40

Capítulo VI

La Figura 11A muestra grupos de células que muestran actividad mitótica (flechas).

La Figura 11 8 muestra una vista más general de A donde se pueden observar múltiples

zonas meristemáticas con activas y continuas divisiones celulares. La Figura 11 C es un

típico embrión globular que presenta la formación de una estructura diferenciada a partir

de agregados celulares que forman el suspensor. En este punto los embriones globulares

comienzan a diferenciarse como lo indica la formación de una capa de células

protodérmicas (p) en la superficie del embrión.

En el panel 11 D se observa la formación de un embrión corazón-torpedo donde se

puede ver que se genera a partir de masas de células isodiamétricas indeferenciadas con

núcleos definidos, citoplasma denso y una típica actividad mitótica de callo embriogénico.

En 11 E se presenta el corte de un embrión con el inicio del desarrollo de estructuras

cotiledonarias, una capa de células protodérmicas y la completa separación del tejido

materno. En la Figura 11 F se muestra el desarrollo de embriones con forma típicas de

corazón a partir de callo embriogénico. Se puede observar la presencia de estructuras

simétricas no fasciadas.

En 11 G se muestra un agregado de células embriogénicas con un desarrollo

asincrónico de embriones en diferentes estadios de desarrollo, desde grupos de células

hasta estructuras cotiledonares. H es una preparación histológica de un brote apical de un

embrión germinado mostrando su tejido conductivo bien diferenciado así como una capa

dérmica.

6.3. PROLIFERACIÓN DE LAS MASAS EMBRIOGÉNICAS EN EL

SISTEMA RITA

Con el fin de incrementar la biomasa, sincronizar los cultivos e inducir la

germinación de los embriones somáticos. Se realizaron experimentos empleando el

sistema de inmersión temporal RITA con medio MS y en ausencia de RCV. En este

sistema se observó lo siguiente: el aumento de la biomasa varía con los tiempos y

frecuencias de inmersión que se manejaron en el sistema, en la tabla 5 podemos observar

que con 1 minuto de inmersión de las masas embriogénicas en el medio líquido y una

frecuencia de inmersión de 4 horas se observa un incremento en el peso fresco después

de 4 semanas en el medio de cultivo. Esto es debido a que las masas proembriogénicas

41

Capítulo VI

se desarrollan principalmente a etapas de torpedo y cotiledonares incrementando su

volumen (Figura 12A). Por otro lado, con 3 minutos de inmersión y una frecuencia de 4

horas la biomasa aumenta hasta 3 veces su peso y volumen después de 4 semanas de

establecido el cultivo (tabla 5), en este punto el cultivo parece sincronizarse mayormente

en estadio globular ya que incrementa el peso pero no se logran observar estadios más

desarrollados (Figura 128).

Con una menor frecuencia de inmersión (cada 2 horas) también se registra un

incremento de biomasa sin embargo es mucho menor en comparación a la que se obtiene

con 1 y 3 de inmersión con frecuencia de 4 horas, en este tratamiento los tejidos

adquieren una apariencia de hiperhidricidad, siendo sensibles y muy frágiles (Figura 12C).

Por otro lado los tejidos con mayor espaciamiento de tiempo entre cada inmersión

presentaron un decremento en el peso de la biomasa (frecuencias de 6 y 8 horas); aquí

los tejidos presentaron características de inanición adquiriendo una apariencia

blanquecina y partes necrosadas (Figura 120).

FRECUENCIA DE INMERSIÓN EN HORAS TIEMPO DE INMERSIÓN

2 4 6 8 EN MINUTOS Peso fresco en mg

1 120 75 80

3 126 90 100

Tabla 5. Incremento de biomasa en gramos en los diferentes tiempos y frecuencias de inmersión en sistema RITA con medio MS sin RCV. ·

42

Capítulo VI

Figura 12. Respuesta de los callos bajo diferentes tiempos y frecuencias de inmersión.

6.4. COMPARACIÓN DE EFICIENCIA SISTEMA SEMISÓLIDO vs

SISTEMA RITA

Al comparar el grado de conversión de los embriones a sus diferentes estadios

(globular, corazón , torpedo, cotiledonar), tanto en el sistema semisólido como con el mejor

tiempo de inmersión temporal donde se alcanzó la mayor sincronización del cultivo (1 min

de inmersión/frecuencia de 3 h) bajo las mismas condiciones de cultivo (medio MS sin

RCV en condiciones de fotoperiodo), podemos observar que existe una significativa

diferencia entre los dos. En medio semisólido existe una mayor proporción de embriones

somáticos en estado globular (Figura 14A) en comparación con el sistema de inmersión

temporal (Figura 13) , pero los estadios más avanzados como el torpedo y cotiledonar se

encuentran en mayor proporción en el sistema RITA que en el semisólido (Figura 148).

43

Capitulo VI

80

70 1/)

60 Q) r::: o 50 ·;: .e

40 E Q)

30 Q) "C

20 ~ o

10

o

L_

cantidad de embriones por estad íos

GLOBULAR CORAZÓN TORPEDO COTILEDONAR

• semisólido

o RITAs

Figura 13. Comparación del sistema semisólido vs inmersión temporal.

Figura 14. Morfología de embriones somáticos en medio semisólido e inmersión temporal. A) Estructura embriogénica en medio semisólido, B) Embriones en estado cotiledonar en sistema de inmersión temporal.

Por otro lado los experimentos realizados con el regulador Dicamba no superaron

los resultados de los experimentos sin RCV (datos no mostrados).

44

Capítulo VI

6.5. GERMINACIÓN DE EMBRIONES SOMÁTICOS

En los experimentos realizados con los RCV ABA y GA3 (1, 3, 5 mg/L) no se logró

la germinación de ningún embrión somático, solo se pudo observar que presentaban una

aparente maduración, ya que los cotiledones tomaron una coloración más verde y se

desarrollan pero la radícula no se desarrolla, se empiezan a generar nuevos ciclos de

división dando lugar de nuevo a embriones en estado globular como lo muestra la Figura

15.

Figura 15. Embrión somático maduro con formación de embriones globulares en la parte radical.

La Figura 15 muestra un embrión somático en estado cotiledonar invidualizado en

medio de cultivo semisólido MS con 3 mg/L de GA3 , aquí se muestra que los cotiledones

están desarrollados sin embargo la parte de la radícula fue sustituida por la formación de

nuevas masas embriogénicas.

Con respecto a la germinación de los embriones somáticos aun no se logra

establecer bien un protocolo , sin embargo nuestro grupo (Peña y col. 201 O) ha obtenido

eventos de germinación como se muestra en la Figura 16.

45

Capítulo VI

Figura 16. Secuencia de germinación de un embrión somático de cedro rojo. A) Embrión somático en estado cotiledonar; B) embrión germinado de cedro rojo; C) plántula de cedro rojo en invernadero.

Estos resultados se han obtenido tratando los embriones somáticos con

concentraciones de 3.8 IJM de ABA, aunque el porcentaje de germinación es muy bajo,

apenas un 12 % de conversión, de las cuales sobreviven el 75 % en el proceso de

transferencia a campo.

46

Capítulo VII

7. DISCUSIÓN

En la actualidad el cedro rojo es la segunda especie forestal tropical más

importante del mundo, existen varias limitantes para su aprovechamiento comercial a gran

escala, entre las que se encuentran la carencia de variedades altamente productivas, la

falta de disponibilidad en calidad y cantidad de materiales para iniciar plantaciones

comerciales y la tolerancia a factores bióticos (ataque del barrenador de yemas) y

abióticos. Para dar solución a estos problemas se requiere de s.istemas de cultivo in vitro,

ya sea para la propagación de las plantas elite producidas, o para regenerar

transformantes que lleven los genes de interés.

La presente investigación tuvo como objetivo general establecer y caracterizar un

sistema de regeneración in vitro de embriones somáticos de Cedrela odorata. Hasta la

fecha no hay reportes de protocolos de regeneración de esta especie vía ES. En nuestro

caso los primeros experimentos estuvieron encaminados a establecer el protocolo

explorando diferentes condiciones para generar embriones somáticos (Dominguez, 2008).

En especies forestales la embriogénesis somática es complicada por las

características fisiológicas y temporales de los explantes los cuales son cruciales para el

establecimiento del cultivo. En nuestro trabajo se utilizaron embriones cigóticos inmaduros

como fuentes de explantes para la inducción de la ES. Existen varios reportes del empleo

de embriones cigóticos inmaduros como principal fuente de explantes para el

establecimiento de protocolos de embriogénesis somática en meliáceas (Shrikhande y col.

1993; Rout 2005; Vila y col. 2007).

Algunas observaciones previas sugieren que la presencia de reguladores del

crecimiento exógenos puede modificar la concentración de los reguladores del

crecimiento endógenos de la planta (Jiménez y Thomas, 2006). La mayoría de los

sistemas embriogénicos requieren una elevada concentración de auxinas, en nuestro

caso se empleó el Acido 3,6-dicloro-2-metoxi-benzoico (Dicamba) el cual ha sido

reportado como iniciador en la inducción de la ES en otras especies tropicales tales como

Eucalyptus grandis (Titen y col. 2007) y E. globulus (Pinto y col. 2002).

47

Capítulo VII

Las estructuras generadas a partir del proceso de inducción sugieren que se trata

de callos proembriogénicos; tanto los embriones cigóticos como somáticos comparten la

misma ontogenia, ambos embriones pasan por los estados globular, torpedo y cotiledonar

para el caso de las especies dicotiledóneas (Ammirato, 1987; Litz and Jarret, 1991 ; Finer,

1994). La observación microscópica reveló que más del 50% del callo genera agregados

de embriones somáticos en todos sus estados de desarrollo.

Por otro lado se observó que existe otro fenómeno en el cual estas masas

proembriogénicas se separan del tejido materno generando más estructuras asincrónicas

desde la etapa globular hasta torpedo, pero que poseen mayor friabilidad que el callo

unido al tejido madre, estas estructuras son de un color amarillo más intenso. Basados en

estos resultados podemos demostrar que el método de inducción reportado por

Dominguez (2008) es reproducible .

La conversión de un embrión somático se lleva a cabo cuando el embrión tiene

una apariencia de estructura bipolar, empieza la formación de brotes con hojas

verdaderas, elongación del tallo y de la raíz y la formación de raíces secundarias según lo

describen Litz y Jarret (1991 ); sin embargo en nuestros experimentos no se llevo a cabo

la elongación de la raíz. Analizando el hecho de que en ninguno de los sistemas de cultivo

se haya observado el desarrollo de raíces probablemente se debió a que inducir el

desarrollo de estas requiere de una relación alta de auxina-citocinina (Villalobos y Thorpe,

1991 ; Salisbury y Ross, 1994). Otros autores han reportado altas concentraciones de ABA

por encima de 98 !JM (Vales y col. 2007) y han evaluado su efecto con algunos

osmoreguladores como el polietylenglicol (Yildirim y col. 2006) o manitol (Uddin y col.

1990; Pullman y col. 2003) y diferentes fuentes de carbón (Bianc y col. 1999; Vila y col.

2007).

Con respecto a la germinación de embriones somáticos se ha reportado que a

bajas concentraciones de GA3 (aproximadamente de 1 mg L-1) se induce la conversión de

ME a plántulas en especies leñosas como el mango, según Laxmi y col. (1999) y en

Azadirachta indica donde se empleó una concentración de 3 mg L-1 (Gyana, 2005). Los

experimentos realizados en nuestro grupo, con los cuales se obtuvieron eventos de

germinación han sido repetidos, pero hasta la fecha no se ha logrado un método eficiente.

48

Capítulo VII

Se ha estudiado que el efecto de algunos reguladores como el hidrolizado de caseína y

endospermo líquido de coco (Rugkhla y Jones, 1998) favorecen el acondicionamiento de

las plantas en condiciones in vitre. Para mejorar las tasas de conversión , puede ser

importante tener en cuenta el momento de la transferencia ex vitre, dado que en algunas

especies se ha observado que la transferencia de los embriones recién germinados

proporciona mejores tasas que las de plantas inicialmente desarrolladas in vitre (Merkle y

Watson-Pauley, 1994).

Otro punto importante es la formación de estructuras globulares en la parte basal

del embrión en estado cotiledonar, lo cual ocurre en muchas angiospermas, sobre todo

cuando los embriones alcanzan este estado de diferenciación, este proceso de

embriogénesis recurrente se basa en la proliferación de la caliptra del embrión somático

primario que genera, tras una meristematización en múltiples zonas de su superficie,

desarrollos embriogénicos secundarios de tipo multicelular (Puigderrajols y col. 1996).

Otros autores opinan que esto ocurre cuando los embriones somáticos primarios no

maduran normalmente hasta plántulas y en lugar de ello dan origen a ciclos sucesivos de

embriones somáticos, que provienen comúnmente de células superficiales de los

cotiledones ó hipocotilo (Merkle y col. 1990).

Para el caso del establecimiento de los cultivos embriogénicos en el sistema de

inmersión temporal RITA, se ha comprobado que diferentes frecuencias de inmersión, con

el estrés ayuno-nutrición que propician , tienen también efectos de regulación morfogénica,

particularmente en embriogénesis somática (Etienne and Berthouly, 2002) . Esta técnica

ha mostrado grandes posibilidades para regular el desarrollo, en medio líquido, de

embriones somáticos de diferentes especies, sincroniza·ndo cultivos, impidiendo la

aparición · de embriogénesis secundaria y estimulando la maduración (Cabasson y col. ,

1997; Etienne Y. col. , 1997).

Vemos que el posible estrés causado por la ausencia de elementos nutritivos,

como en el caso de las masas embriogénicas que estuvieron con 1 minuto de inmersión y

una frecuencia de 8 horas, puede ejercer un efecto negativo en el desarrollo de los

embriones somáticos por inanición, perdiendo peso y tomando una apariencia de tejido

muerto tal como lo menciona Fernández-Guijarro y col. (1994) .

49

Capítulo VIl

Por el contrario los callos embriogénicos que permanecieron con 3 minutos de

inmersión con frecuencia de 2 horas, presentan síntomas de hiperhidricidad (vitrificación)

reflejo del excesivo contacto con el medio liquido, por lo que la entrada de agua a las

células es elevada provocando que se vuelvan transparentes y sensibles al contacto.

De acuerdo a los resultados obtenidos en el sistema de inmersión temporal RITA

(Figura 13), se puede ver que existe una mayor sincronización del cultivo en comparación

con el sistema semisólidó. En el sistema RITA hay un incremento en el número de

embriones en los estados corazón y torpedo dando lugar a una mayor conversión de

embriones a estado cotiledonar (la suma de los estadios corazón, torpedo y cotiledonar da

aproximadamente un 50% de embriones en estadio avanzado) , en cambio en el

semisólido el grado de avance en sus estadios es menor ya que existe un incremento en

la formación de embriones en estado globular siendo menos los embriones que alcancen

el siguiente estadio de desarrollo (embriones en etapas corazón, torpedo y cotiledonar

suman solo un 30% mientras globulares son un 70%). A pesar de lograr obtener un

tiempo de inmersión/aireación en el cual se incrementa la biomasa y otro donde se

desarrollen los embriones hasta etapa cotiledonar, no se observó el desarrollo de raíces

funcionales.

En los sistemas de inmersión temporal el periodo de inmersión es muy importante

porque determina la absorción de los nutrientes y el control de la hiperhidricidad. Los

tiempos varían considerablemente dependiendo de la especie por ejemplo 1 hora de

inmersión con una frecuencia de 6 horas fueron necesarios para la eficiente tuberización

de la papa, pero en cambio para café y el árbol de goma solo basto 1 minuto de inmersión

por cada 12 horas de aireación para la estimulación de la embriogénesis somática como

lo reportan Etienne y col. (1997a, b). El desarrollo de un eficiente protocolo de

regeneración de embriogénesis somática para C. odorata es necesario para la

transferencia de genes de resistencia a insectos, tolerancia a estrés abiótico, velocidad de

crecimiento, ganancia de biomasa, todos ellos elementos clave para el mejoramiento

genético de esta especie que podrían permitir el establecimiento de plantaciones

comerciales para la producción de madera. Con estas acciones se podría aliviar la presión

de la tala inmoderada sobre las poblaciones naturales, la cual es la meta para la

conservación y proliferación de la diversidad genética.

50

Capitulo VIII

8. CONCLUSIONES

Se determinó que la desinfección de los frutos inmaduros debe llevarse a cabo

incubándolos durante tres horas en una solución al 40% (v/v) preparado a partir de una

solución comercial de hipoclorito de sodio al 5.5 % de cloro libre (Cioralex; Allen), seguido

de varios enjuagues con agua destilada desionizada estéril.

Se desarrolló un protocolo reproducible para la inducción de la ES a partir de

embriones cigóticos inmaduros de C. odorata con la adición de 3 mgl-1 de Dicamba

(13.57 IJM) al medio de cultivo MS.

Se caracterizó el proceso de ES mediante estudios histológicos y por microscopía

electrónica de barrido determinando los estadios de desarrollo de los embriones

somáticos.

Se obtuvieron eventos de germinación de los ES en medio MS con

concentraciones de 3.8 1JM de ABA después de 4 semanas de cultivo, obteniendo un 12%

de conversión y un 75% de sobrevivencia a campo.

Se establecieron cultivos en el sistema de inmersión temporal RITA sincronizando

el desarrollo de los embriones en estadios avanzados (corazón, torpedo, cotiledonar 50%

en comparación con el sistema semisólido donde solo el 30% alcanzan estas etapas) , con

un tiempo de 1 minuto de inmersión y una frecuencia de 4 horas en un periodo de 4

semanas, en medio MS basal sin reguladores.

Con el sistema de inmersión temporal RITA se logró un aumento en biomasa de

aproximadamente un 300 % de proliferación , con un tiempo de 3 minutos de inmersión y

una frecuencia de 4 horas en un periodo de 4 semanas, en medio MS basal sin

reguladores.

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Capítulo IX

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60

Capítulo X

10. ANEXO

Anexo 1. Tabla de composición del medio MS (Murashigue & Skoog, 1962).

Cantidades para un NOMBRE DEL

FORMULA P.M. (g) litro en

COMPUESTO Masa (mg) Moles (mM)

Compuesto inorgánicos Macro nutrientes Nitrato de K NOs 101.108 1900 18.792 potasio Nitrato de NH4N03 80.04 1650 20.615 amonio Cloruro de KCI2.2H20 147.02 440 2 .993 calc io Sulfato de MgS04.1H20 246.498 370 1.501 magnesio Fosfato de KHzP04.HzO 136.09 170 1.249 potasio monobásico M icronutrientes Sulfato MnS04.H20 169.01 16.9 0.1 manganeso Sulfato de zinc ZnS04.?HzO 287.54 8.6 0.0299 Aci do bórico H3B0 3 61 .86 6.2 0.1 002 Yoduro de Kl 166.01 0.83 40999x1o-;j potasio Sulfato de cobre CuS0.4SH20 249.68 251JQ 0.11JM Molibdato de Na2Mo04.2H20 241.95 2501-19 1.031-JM sodi.o Cloruro de CoCb.6H20 237.93 25 j.Jg 0.1051JM cobalto Sulfato ferroso FeS04.7HzO 278.028 27.8 0.0999 Na2EDTA C1oH14N201oNa2.2H20 372.30 37.3 0.1002 Compuestos orgánicos Aminoácidos Glicina C2HsN02 75.07 2.0 0.0266 Vitaminas Myo-inositol CsH120s 180.2 100 0 .555 Tiamina-HCI C12H11CIN4oS.HCI 337 .3 0.1 2.964x10-4 Ac. Nicotínico C6HsNOz 123.1 0.5 4 .062x1o-~

Piridoxina-HCI CsH1N03.HCI 205 .6 0.50 2.432x1o-j

61