НАРЕДБА № 44 ОТ 7 ОКТОМВРИ 2002 Г. ЗА ВЗЕМАНЕ НА...

НАРЕДБА № 44 ОТ 7 ОКТОМВРИ 2002 Г. ЗА ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИ ИМЕТОДИ ЗА АНАЛИЗ ПРИ КОНТРОЛ НА ФУРАЖИТЕ

Издадена от Министерството на земеделието и горите

Обн. ДВ. бр.109 от 20 Ноември 2002г., изм. ДВ. бр.7 от 23 Януари 2007г.

Глава първа.ОБЩА РАЗПОРЕДБА

Чл. 1. С тази наредба се уреждат редът за вземане на проби и методите за анализ приконтрол на фуражите.

Глава втора.ВЗЕМАНЕ И ОБРАЗУВАНЕ НА ПРОБИ

Чл. 2. Вземането на проби се извършва от инспектори на Главната дирекция за контролна фуражите (ГДКФ) в Националната служба по зърното и/или от инспектори на Националнатаветеринарномедицинска служба (НВМС).

Чл. 3. (1) За вземане на проби се използват уреди, изработени от материали, невлияещина фуражите, от които се взема пробата.

(2) За вземане на единични проби се използват уредите, посочени в приложение № 1.

Чл. 4. От партидите фуражи се вземат следните видове проби:1. единична проба (извадка);2. сборна проба (изходна);3. редуцирана сборна проба (средна проба);4. крайна проба (лабораторна).

Чл. 5. (1) За контрол на фуражите се използват партиди с размери, които даватвъзможност за вземане на достатъчно проби, представителни за всички части на партидата.

(2) В зависимост от вида на фуража и размера на партидата се вземат минимален бройединични проби съгласно приложение № 2.

(3) Когато не могат да бъдат взети единични проби от всички части на партидата порадинейния размер или местоположение, за размер на партидата се приема само частта, от която савзети единичните проби.

Чл. 6. (1) Пробите се вземат и образуват по възможно най-бърз начин, който изключватяхното замърсяване и изменение в сравнение с останалата част на партидата.

(2) За вземане и образуване на проби се използват почистени и подсушени инструменти,работни повърхности и съдове.

(3) Инспекторите вземат нужните предпазни мерки за предотвратяване изменението насъстава, замърсяването и повреждането на пробата по време на транспорт и съхранение

Чл. 7. (1) Единичните проби при контрол на вещества или субстанции, разпределениравномерно във фуражите, се вземат произволно от цялата партида. Те трябва да са с еднаквотегло или обем.

(2) При вземане на единични проби от насипни фуражи, които са в съдове над 100 kg,партидата мислено се разделя на равни части и се взема необходимият брой проби съгласноприложение № 2.

(3) При вземане на единични проби от опаковани фуражи от всяка опаковка се взема частот съдържанието.

(4) При вземане на единични проби от течни или полутечни смесими фуражи от всякаопаковка или съд се взема най-малко една проба. Единичната проба се взема следхомогенизиране съдържанието на фуража.

(5) При вземане на единични проби от течни и полутечни фуражи, които не могат да сесмесват, се вземат проби от различни височини на съдовете съгласно приложение № 2. В тезислучаи обемът на сборните проби е минимум 10 l.

(6) При вземане на единични проби от фуражи на блокчета или "буци за лизане" от всекифуражен блок или "буца за лизане" се взима по една част.

Чл. 8. (1) От единичните проби, взети от една партида, се образува само една сборнапроба, с изключение на сборната проба за анализ на нежелани или забранени вещества, която сеобразува съгласно приложение № 3.

(2) Сборните проби се образуват от единичните проби съгласно приложение № 4. Приобразуване на сборна проба единичните проби се размесват добре.

Чл. 9. (1) При образуване на сборни проби от фуражи, включващи нежелани илизабранени вещества, които са разпределени неравномерно, партидата се разделя мислено натолкова части, колкото са сборните проби, посочени в приложение № 3. Общият брой единичнипроби, взети от партидата, се разпределя приблизително равномерно в тези части, като във всякасборна проба се включват единични проби, взети от различни части на партидата.

(2) Сборните проби от фуражи, включващи нежелани или забранени вещества, които саразпределени неравномерно в партидата, са не по-малки от 4 kg или 4 l.

Чл. 10. (1) Сборните проби се образуват чрез смесване до получаване на еднородна смес.Буците се начупват отделно от останалия материал, след което се смесват с него.

(2) За образуване на крайна проба може да се образува редуцирана сборна проба, катосборната проба се намали до 2 kg или 2 l чрез механичен разделител или чрез разчетворяване.

Чл. 11. (1) От всяка сборна проба или редуцирана сборна проба се образуват най-малкотри крайни проби.

(2) Според вида на партидата минималното количество на крайната проба се определясъгласно приложение № 5.

Чл. 12. (1) Крайните проби се съхраняват в чисти и сухи опаковки или съдове, които непропускат влага и се затварят добре. При възможност се използват съдове, които се затварятхерметически.

(2) Съдовете по ал. 1 се пломбират или запечатват така, че при отваряне на съда да сенаруши целостта на пломбата или печата.

Чл. 13. (1) При вземане на проби се съставя протокол за вземане на проби в триекземпляра, в който се посочват видът и номерът на партидата, от която са взети.

(2) Всяка крайна проба се придружава от екземпляр от протокола по ал. 1.

Чл. 14. (1) Крайните проби се означават с етикети, които съдържат:

1. име и адрес на инспектора;2. дата на образуване на крайната проба;3. номер и дата на протокола за вземане на проби;4. описание на фуража;5. номер на пломбата или печата.(2) В етикета могат да се включат и други данни за пробата.

Чл. 15. Инспекторите изпращат една крайна проба на лабораторията, която ще извършианализите, втората крайна проба се предава за съхранение на собственика на партидата, а третатасе съхранява от контролния орган за евентуален арбитражен анализ.

Глава трета.МЕТОДИ ЗА АНАЛИЗИ

Чл. 16. При контрол на качеството и на съдържанието на вещества във фуражите пробитесе анализират по методите, посочени в приложение № 6.

Чл. 17. (1) Методите за анализ по приложение № 6 се прилагат за всички видове фуражи.(2) Когато някой от методите има специално приложение при анализа на определени

видове фуражи, то е посочено в точка "Наблюдения" на съответния метод.

Чл. 18. (1) За анализ на всяко вещество във фуражите се използва един от методите поприложение № 6.

(2) Когато за анализ на едно вещество могат да се използват два или повече метода,включени в приложение № 6, изборът на метод се извършва от лабораторията, която правианализа. Избраният метод се означава в анализното свидетелство.

Чл. 19. При описание на методите за анализ в приложение № 6 са посочени само уредитеи апаратите, които са специални или са по специален стандарт, без да се посочва оборудването,което е обичайно за лаборатории за анализ.

Чл. 20. (1) Лабораторията отразява резултатите от проведените анализи в анализносвидетелство.

(2) Резултатите от анализа представляват средна стойност от поне две изследвания.Резултатите от анализа са с такава точност, каквато методът за анализ позволява.

Допълнителни разпоредби

§ 1. По смисъла на тази наредба:1. "Партида" е определено количество фураж, представляващо еднородна маса, което е

продукт на непрекъснат производствен процес и се предлага на пазара като цяло.2. "Единична проба"(извадка) е определена част от партидата фуражи, която се взема

еднократно от определено място на партидата и служи за съставяне на сборна (изходна) проба.3. "Сборна проба"(изходна) е общото количество от всички единични проби (извадки),

взети от една партида.4. "Редуцирана сборна проба" е представителната част от формираната сборна (изходна)

проба.

5. "Крайна проба" (лабораторна) е определено количество от формираната сборна(изходна) или редуцираната сборна проба.

Заключителни разпоредби

§ 2. Наредбата се издава на основание чл. 11, ал. 3 от Закона за фуражите (обн., ДВ, бр.82 от 1999 г.; изм., бр. 101 от 2000 г.).

§ 3. Изпълнението на наредбата се възлага на ръководителите на Националната службапо зърното и Националната ветеринарномедицинска служба.

Приложение № 1 към чл. 3, ал. 2

Уреди за вземане на единична проба

А. Ръчни уреди:1. сонди за вземане на проби с дълъг прорез или камери, съответстващи на размера на

партидата и на размера на частиците на веществата;2. лопатки с равна основа и огънат под прав ъгъл нагоре кант.Б. Механичен уред за вземане на проби от веществата по време на производствения

процес - автоматичен пробовземач.В. Уреди за вземане на единични проби от течни или полутечни вещества:1. пипета;2. уред за черпене с устройство за затваряне.Г. Делителни устройства за създаване на редуцирани, сборни и крайни проби:1. делителен конус;2. делител многоулеен.


Минимален брой единични проби, взимани от партидите

Вид и количество на Минимален брой единичнипартидата проби (извадки)

1. Твърди вещества неопа-ковани (насипни) и веще-ства в съдове над 100 kg:

Силаж от зелен фураж, 20листа от цвекло, сенои слама

Ливадни растения 50

Други вещества

До 2,5 t 7

Над 2,5 t Корен квадратен от 20-кратното тегло на парти-дата, изразено в тонове,максимум 40

2. Опаковани вещества

2.1. Опаковки със 4съдържание до 1 kg

2.2. Опаковки със съдър-жание над 1 kg:

2.2.1. Партиди от 1 до 4 От всяка опаковкаопаковки

2.2.2. Партиди от 5 до 16 4опаковки

2.2.3. Партиди над 16 Корен квадратен от броя наопаковки опаковките, закръглен до

цели числа, максимум 20

3. Течни или полутечни Съдовевещества:

3.1. В съдове с вмести-мост над 1 l

3.1.1. Партиди до 4 съда От всички съдове3.1.2. Партиди от 5 до 416 съда

3.1.3. Партиди над 16 съда Корен квадратен от броя насъдовете, съставляващипартидата, максимум 20

3.2. Съдове с вместимост 4до 1 l

4. Фуражни блокчета и По 1 от партида от 25 еди-буци за близане ници - максимум 4


Минимален брой сборни проби за анализ на нежелани или забранени вещества

Вид и размер на парти- Минимален брой сборнидата, тон/опаковки (изходни) проби, взети от

една партида

Насипни, неопаковани:До 1 t 1Над 1 t до 10 t 2Над 10 t до 40 t 3Над 40 t 4

Опаковани:До 16 опаковки 1От 17 до 200 опаковки 2От 201 до 800 опаковки 3Над 800 опаковки 4


Минимално тегло на сборните проби

Вид и количество на Минимално тегло на сбор-партидата ната (изходната) проба

1. Насипни, неопаковании фуражи в съдове:- Сено, слама 1 kg- Други фуражи 4 kg2. Опаковани фуражи2.1. В опаковки съссъдържание до 1 kg Съдържанието на 4 опаковки2.2. В опаковки съссъдържание над 1 kg 4 kg3. Течни или полутечнифуражи:3.1. В съдове с вмести-мост до 1 l Съдържание на 4 съда3.2. В съдове с вмести-мост над 1 l 4 l4. Фуражни блокчета ибуци за близане4.1. С единично теглодо 1 kg 4 броя4.2. С единично теглонад 1 kg 4 kg5. Добавки 200 g или 200 ml6. Премикси 1 kg или 1 l


Минимално тегло на крайните проби

Вид партида Минимално тегло на край-на (лабораторна) проба

1. Твърди фуражи:Сено, слама 250 gЛивадни растения, зеленифуражи, зелен силаж идруги сочни фуражи 1 kgДруги фуражи 0,5 kg2. Течни или полутечнифуражи 0,5 l3. Добавки 50 g4. Премикси 250 g

Приложение № 6 към чл. 16

(Доп. - ДВ, бр. 7 от 2007 г.)

МЕТОДИ ЗА АНАЛИЗ

ОБЩИ ИЗИСКВАНИЯ

А. Подготовка за анализ

Процедурите по подготовка на пробите за анализ се отнасят до крайните проби, които саизпратени на контролните лаборатории, след като са взети в съответствие с изискванията наНаредбата за методите за вземане на проби при официалния контрол на фуражите.

Пробите трябва да са взети по такъв начин, че отделените за анализ количества, както ерегламентирано в аналитичните методи, да са хомогенни и представителни за крайните проби.

Всички необходими процедури при взимането на пробата се извършват така, че вмаксимална степен да се избегне замърсяването на пробата и промените в нейния състав.Смилането, разбъркването и пресяването се извършват възможно най-бързо, при минималнотоизлагане на пробата на въздух и светлина. Не трябва да се използват смилащи устройства, коитомогат значително да нагреят пробата. Препоръчително е фуражите, които са особеночувствителни към топлина, да се смилат ръчно. Необходимо е да се вземат предпазни меркиизползваната апаратура да не представлява източник на остатъчно замърсяване. Съдържаниетона влага се измерва преди и след изготвянето на пробата, ако при подготовката на пробата сепромени съдържанието на влага.

Окончателната проба се разбърква добре механично или на ръка и се разделя на двееднакви части (ако е възможно, се използва методът на четвъртинките). Запазва се едната отчастите в подходящ чист, сух съд, снабден с непропускаща въздух запушалка, а другата част илипредставителна част от нея, не по-малко от 100 g, се подготвя по следния начин:

1. Храни, които непосредствено подлежат на смиланеАко не е предвидено друго в методите за анализ, цялата проба се пресява през сито с

квадратни отвори с размер 1 mm2 (в съответствие с препоръките на ISO R565) след смилането й,ако това е необходимо. Желателно е да се избягва прекалено ситното смилане.

Пресятата проба се разбърква и се поставя в подходящ чист, сух съд, снабден снепропускаща въздух запушалка. Разбърква се отново, преди да се отдели предназначеното заанализ количество.

2. Храни, които подлежат на смилане след изсушаванеАко не е предвидено друго в методите за анализ, пробата се изсушава, докато

съдържанието на влага е от порядъка 8 - 12 % в съответствие с предварителната процедура заизсушаване, описана в начина за установяване на водното съдържание, след което се прилага т. 1.

3. Течни или полутечни храниПробата се поставя в подходящ чист, сух съд, снабден с непропускаща въздух

запушалка. Разбърква се добре непосредствено преди отделяне на предназначеното за анализколичество.

4. Други храни

Пробите, които не могат да се приготвят чрез една от описаните процедури, сеобработват чрез всяка друга процедура, която гарантира, че отделените за анализиранеколичества са хомогенни и представителни за окончателната проба.

5. Съхраняване на пробитеПробите се съхраняват при температура, която не променя техния състав. Пробите,

предназначени за анализ на витамини или вещества, които са особено чувствителни къмсветлината, се съхраняват в съдове от кафяво стъкло.

Б. Реактиви и апаратура, използвани при методите за анализ

1. Ако не е предвидено друго в методите за анализ, всички аналитични реактиви трябвада бъдат аналитично чисти (ан.ч.). При изследване за остатъчни елементи чистотата на

реактивите се установява посредством специален тест. В зависимост от получените резултатиможе да се изисква допълнително пречистване на реактивите.

2. При всяка посочена в аналитичните методи процедура, включваща подготовката наразтвори, разреждане, изплакване или измиване, без да се посочва естеството на използванияразтворител или разредител, се предполага, че трябва да се използва вода. Като общо правиловодата трябва да бъде деминерализирана или дестилирана. В някои конкретни случаи, посочени вметодите за анализ, тя трябва да се подложи на специални процедури или пречистване.

3. По отношение на обичайното оборудване в контролните лаборатории самоспециалните или изискващите специална употреба инструменти или апаратура се посочват ваналитичните методи. Те трябва да бъдат чисти, особено в случаите, когато се изследваналичието на вещества в много малки количества.

В. Прилагане на методите за анализ и отразяване на резултатите

1. По принцип се възприема един метод за анализ на всяко вещество в храните заживотни. Ако са възприети няколко различни метода, използваният от контролната лабораторияконкретен метод трябва да бъде посочен в отчета на резултатите от анализа.

2. Посоченият в отчета резултат от анализа трябва да представлява средна стойност,получена от минимум две процедури по установяване на вещества, при извършването на които саизползвани две различни части на пробата с достатъчна повторяемост.

Според регламентирания в метода за анализ начин този резултат се изразява чрезсъответния брой значими цифри, като при необходимост се коригира спрямо воднотосъдържание на окончателната проба преди подготовката.

МЕТОДИ ЗА АНАЛИЗ

I. Метод за определяне на циановодородна киселина

1. Цел и обхватТози метод дава възможност да се определи съдържанието на циановодородната

киселина, свободна и свързана под формата на гликозиди, в храни за животни и в частност впродукти, производни на ленено семе, брашно от маниока и някои видове бобови култури.

2. ПринципПробата се суспендира във вода. Циановодородната киселина се освобождава под

действие на ензими, увлича се чрез парна дестилация и се събира в определен обем подкисленразтвор на сребърен нитрат. Сребърният цианид се разделя чрез филтруване и излишниятсребърен нитрат се титрува с разтвор на амониев тиоцианат.

3. Реактиви

3.1. Суспензия от сладки бадеми: счукват се двадесет сладки бланширани бадема в 100ml вода с температура 37 до 40°C. Необходима е увереност, че в 10 ml от суспензията нямациановодородна киселина, като се използва хартия от натриев пикрот или се извършва празнапроба като описаната в последния абзац на т. 5.

3.2. 10 % разтвор (w/v) на натриев ацетат, неутрален към фенолфталейн.3.3. Емулсия на антипенител (напр. силикон)3.4. Азотна киселина, d: 1,40.3.5. Разтвор на сребърен нитрат - 0,02 N.3.6. Разтвор на амониев тиоцианат - 0,02 N.3.7.Наситен разтвор на амониев ферисулфат.

3.8. Амониев хидроокис, d: 0,985.4. Апаратура4.1. Сушилня термостат, нагласен на 38°C.4.2. Апарат за парна дестилация.4.3. 1000 ml колби с плоско дъно със стъклена запушалка с шлиф.4.4. Маслена баня.4.5. Бюрета, градуирана на 1/20 ml.5. ПроцедураПретеглят се 20 g от пробата с точност до 5 ml, поставят се в 1-литрова плоскодънна

колба и се добавят 50 ml вода и 10 ml суспензия от сладки бадеми (3.1). Колбата се запушва и сепоставя в сушилня при 38°C за 16 h. След това се охлажда до стайна температура и се добавят 80ml вода, 10 ml разтвор на натриев ацетат (3.2) и една капка антипенителна емулсия (3.3).

Колбата се свързва към апарат за парна дестилация и се поставя в маслена баня,предварително доведена до температура малко над 100°C. Дестилират се 200 до 300 ml течност,като се пуска мощен поток пара през колбата и внимателно се загрява маслената баня.Дестилатът се събира в ерленмайерова колба, защитена от светлината и съдържаща точно 50 ml0,02 N (3.5) разтвор на сребърен нитрат и 1 ml азотна киселина (3.4). Необходимо е да се внимавакраят на удължителя на хладника да е потопен в разтвора сребърен нитрат.

Съдържанието се прехвърля на ерленмайеровата колба в 500 ml мерителна колба,допълва се с вода, разбърква се и се филтрува. Вземат се 250 ml от филтрата, добавят се около 1ml разтвор на амониев ферисулфат (3.7) и се титрува обратно излишният сребърен нитрат с 0,02N (3.6) разтвор на амониев тиоцианат от градуираната на 1/20 ml бюрета.

Ако е необходимо, може да се направи празна проба чрез същата процедура, приложенакъм 10 ml суспензия на сладки бадеми (3.1), като пробата не се анализира.

6. Изчисляване на резултатитеАко празната проба покаже, че е бил погълнат 0,02 N разтвор на сребърен нитрат,

стойността на този обем се изважда от обема, погълнат от дестилата на пробата. 1 ml 0,02 Nразтвор на сребърен нитрат отговаря на 0,54 mg HCN. Резултатът се изразява като процент запробата.

7. НаблюдениеАко пробата съдържа голямо количество сулфиди (напр. бобови култури), се образува

черна утайка от сребърен сулфид, който се филтрува заедно с утайката от сребърен цианид.Образуването на тази утайка води до загуба на 0,02 N сребърен нитрат, чийто обем трябва да сеизвади от обема, използван за изчисляването на съдържанието HCN. За тази цел:

Утайката се обработва върху филтъра с 50 ml амониев хидроокис (3.8), за да се разтворисребърният цианид. Остатъкът се промива с разреден амониев хидроокис и след това се определясребърното му съдържание. Получената стойност се преобразува в ml 0,02 N разтвор на сребъреннитрат.

Съдържанието HCN на пробата може да се определи и чрез титруване на подкисленияамонячен филтрат с азотна киселина.

II. Метод за определяне на калций

1. Цел и обхватМетодът дава възможност да се определи общото съдържание на калций в храни за

животни.2. ПринципКалцият се опепелява, пепелта се обработва със солна киселина и калцият се утаява като

калциев оксалат. Утайката се разтваря в сярна киселина и се титрува оксаловата киселина, която

се получава с разтвор на калиев перманганат.3. Реактиви3.1. Солна киселина A.R., d: 1,143.2. Азотна киселина A.R., d: 1,403.3. Сярна киселина A.R., d:1,133.4. Амониев хидроокис A.R.,d: 0,983.5. Студен наситен разтвор на амониев оксалат A.R.3.6. 30 % разтвор (w/v) лимонена киселина A.R.3.7. 5 % разтвор (w/v) амониев хлорид A.R.3.8. 0,04 % разтвор (w/v) бром-крезол зелено3.9. 0,1 N разтвор калиев перманганат4. Апаратура4.1. Електрическа муфелна пещ с въздушна циркулация и термостат.4.2. Платинови, кварцови или порцеланови тигли за опепеляване.4.3. Стъклени филтърни тигли с пористост G4.5. Процедура5 g от пробата или повече се претеглят (ако е необходимо) с точност до mg, като се

накалява при 550°C и се прехвърля пепелта в 250 mg бехерова чаша.Добавят се 40 ml солна киселина (3.1), 60 ml вода и няколко капки азотна киселина (3.2).

Довежда се до кипене и се задържа при температурата на кипене в продължение на тридесетминути. Охлажда се и разтворът се прехвърля в 250 ml мерителна колба. Промива се, обемът седовежда до мярката с вода, хомогенизира се и се филтрува.

С помощта на пипета се прехвърля в 250 ml бехерова чаша аликвотна част, съдържаща10 до 40 mg калций според предполагаемото калциево съдържание. Добавя се 1 ml разтвор налимонена киселина (3.6) и 5ml амониев хлорид (3.7).

Обемът трябва да бъде до приблизително 100 ml с вода. Довежда се до кипене, добавя се8 - 10 капки разтвор на бром-крезол зелено (3.8) и 30 ml горещ разтвор на амониев оксалат (3.5).Ако се получи утайка, тя се разтваря, като се добавят няколко капки солна киселина (3.1).

Неутрализира се много бавно с амониев хидроокис (3.4), като се бърка непрекъснато,докато рН стане 4,4 до 4,6, т.е. когато индикаторът смени цвета си. Бехеровата чаша се поставя вкипяща водна баня и се изчакват 30 min, така че образуваната утайка да падне на дъното.Бехеровата чаша се изважда от водната баня. Оставя се да престои един час и се филтрува презфилтърен тигел G4.

Бехеровата чаша и тигелът се промиват с вода до пълно отстраняване на излишнияамониев оксалат (липсата на хлориди в промивните води показва, че промиването е достатъчно).Утайката се разтваря върху филтъра в 50 ml гореща сярна киселина (3.3). Тигелът се промива сгореща вода и филтратът се довежда до около 100 ml. Нагрява се до 70 - 80°C и се титрува накапки с разтвор на калиев перманганат (3.9), докато се появи розово оцветяване, което се задържаедна минута.

6. Изчисляване на резултатите1 ml калиев перманганат 0,1 N отговаря на 2,004 mg калций. Полученият резултат се

изразява като процент за пробата.7. Наблюдения7.1. При много ниски съдържания на калций се процедира, както следва: утайката

калциев оксалат се отфилтрува през свободна от пепели филтърна хартия. След промиванефилтърът се изсушава и се накалява при 550°C в платинов тигел. Остатъкът се разтваря отново вняколко капки сярна киселина (3.3), изпарява се до сухо, накалява се отново при 550°C и сепретегля. Ако W е теглото на получения калциев сулфат, калциевото съдържание на аликвотнатачаст, взета като проба, е W.0,2944.

7.2. Ако пробата съдържа само минерални субстанции, се разтваря в солна киселина, безпървоначално да се накалява. В случай на продукти, като например калциево-алуминиев фосфат,които трудно се разтварят в киселина, те се стопяват чрез алкален процес, преди субстанцията дасе разтвори, както следва: пробата за анализ се смесва добре в платинов тигел със смес пет пътитеглото на пробата, която смес се състои от равни количества калиев карбонат и натриевкарбонат. Внимателно се нагрява, докато сместа се стопи напълно. Охлажда се и се разтваря всолна киселина.

7.3. Ако магнезиевото съдържание на пробата е високо, калциевият оксалат се утаявавтори път.

III. Метод за определяне на карбонати

1. Цел и обхватМетодът позволява определяне на количеството карбонати, които обикновено се

изразяват като калциев карбонат, в повечето храни за животни.В някои случаи обаче (напр. с железен карбонат) трябва да се използва специален метод.2. ПринципКарбонатите се разлагат в солна киселина; освободеният въглероден двуокис се събира в

градуирана тръба и обемът му се сравнява с този, освободен при същите условия от познатоколичество калциев карбонат A.R.

3. Реактиви3.1. Солна киселина, d: 1,103.2. Калциев карбонат A.R.3.3. Сярна киселина, приблизително 0,1 N, оцветена с метил червено4. АпаратураАпарат Шайблер-Дитрих (вж. схемата) или равностоен на него

5. Процедура

В зависимост от съдържанието карбонати в пробата част от пробата се претегля, както епосочено:

- 0,5 g за продукти, съдържащи от 50 до 100 % карбонати, изразени като калциевкарбонат;

- 1g за продукти, съдържащи от 40 до 50 % карбонати, изразени като калциев карбонат;- 2 до 3 g за други продукти.Частта от пробата се поставя в специалната колба 4 на апарата, снабдена с малка

тръбичка от нетрошлив материал, съдържаща 10 ml солна киселина (3.1), и колбата се свързва сапарата. Трипътният кран се завърта 5, така че тръбата 1 да се свързва откъм външната страна.Като се използва подвижната тръба 2, която е пълна с оцветена сярна киселина (3.3) и свързанакъм градуираната тръба 1, нивото на течността се довежда до нулевата марка. Кранът 5 сезавърта, така че тръбите 1 и 3 да се свържат. Необходимо е да се провери дали нивото е на нула.

Солната киселина (3.1) се довежда бавно върху частта от пробата, като се накланяколбата 4. Налягането се изравнява, като тръбата 2 се сваля надолу. Колбата 4 се бълникадотогава, докато престане напълно отделянето на въглероден двуокис.

Налягането се възстановява, като се въвежда течността отново до едно и също ниво втръби 1 и 2. След няколко минути, когато обемът газ стане постоянен, се прави отчитането.

Необходимо е да се направи контролна проба при същите условия с 0,5 g калциевкарбонат (3.2).

6. Изчисляване на резултатитеСъдържанието в грамове карбонати, изразено като % калциев карбонат в пробата, се

изчислява по формулата:

V.100,

T.2W

където:

V е ml CO2, отделено на порция от пробата;Т - ml CO2, отделено при 0,5g CaCO3 A.R.;W - теглото на порцията от пробата, в грамове.7. Наблюдения7.1. Когато частта от пробата тежи повече от 2 g, първо се поставя 15 ml дестилирана

вода в колбата 4 и се смесва преди началото на анализа. Същият обем вода се използва законтролната проба.

7.2. Ако използваният апарат има обем, различен от този на апарата Шайблер-Дитрих,частта, взета от пробата и от контролната субстанция, и изчисляването на резултатите трябва дасе пригодят съответно.

IV. Метод за определяне на сурова пепел

1. Цел и обхватТози метод позволява определянето на сурова пепел в храни за животни.2. ПринципПробата се накалява при 550°C; остатъкът се претегля.3. Реактиви20 % разтвор (w/v) на амониев нитрат4. Апаратура

4.1. нагревателна плоча4.2. електрическа муфелна пещ с термостат4.3. тигли за накаляване, изработени от платина или сплав на платина и злато (10 % Pt, 90

% Au), правоъгълни (60 x 40 x 25mm) или кръгли (диаметър 60 до 75mm, височина 20 до 25mm).5. ПроцедураОколо 5 g от пробата (2,5 при продукти, които имат склонност да набъбват) се претеглят

с точност до mg и се поставят в тигел за накаляване, който е бил предварително накален итариран. Тигелът се поставя върху нагревателна плоча и се нагрява постепенно, докатосубстанцията се овъгли. Тигелът се поставя в муфелна пещ, нагласена на 550° С ± 50°C. Задържасе при тази температура дотогава, докато се получи бяла, светлосива или червеникава пепел,която изглежда свободна от карбонатсъдържащи частици. Тигелът се поставя в ексикатор, оставясе да се охлади и се претегля незабавно.

6. Изчисляване на резултатитеТеглото на остатъка се изчислява, като се извади тарираното тегло.Резултатът се изразява като процент за пробата.7. Наблюдения7.1. Пепелта на субстанции, които трудно се опепеляват, трябва да бъде подложена на

първоначално накаляване в продължение на поне три часа, да се охлади и след това да се добавятняколко капки 20 % разтвор на амониев нитрат (внимателно, за да се избегне разпрашаването напепелта или образуването на бучици). Накаляването продължава след изсушаване в сушилнята.Операцията се повтаря колкото се налага, за да стане пълно опепеляване.

7.2. При субстанции, устойчиви към обработката, описана в 7.1, се процедира, кактоследва: след накаляване за 3 часа пепелта се поставя в гореща вода и се филтрува през малък,свободен от пепели филтър. Филтърът и съдържанието му се опепеляват в първоначалния тигел.Филтратът се поставя в охладен тигел, изпарява се до сухо, опепелява се и се претегля.

7.3. В случай на масла и мазнини една проба от около 25 g се претегля в подходящ поразмери тигел. Субстанцията се карбонизира, като пламъкът се поднася към нея с парче свободнаот пепели филтърна хартия. След изгарянето се навлажнява с колкото е възможно по-малко вода,изсушава се и се опепелява, както е описано в т. 5.

V. Метод за определяне на пепел, която е неразтворима в солна киселина

1. Цел и обхватТози метод позволява определянето на количеството минерални субстанции,

неразтворими в солна киселина, в храни за животни. В зависимост от естеството на пробатамогат да се приложат два метода:

1.1. метод А - приложим към прости органични храни за животни и към повечетосъставни храни за животни;

1.2. метод Б - приложим към минерални вещества и смеси и към съставни храни заживотни, чието съдържание субстанции, неразтворими в солна киселина, определено по метод А,е по-голямо от 1 %.

2. Принцип2.1. метод А - пробата се опепелява, пепелта се кипва в солна киселина и неразтворимият

остатък се филтрува и претегля;2.2. метод Б - пробата се обработва със солна киселина; разтворът се филтрува, остатъкът

се опепелява и така получената пепел се обработва по метод А.

3. Реактиви3.1. солна киселина 3 N;

3.2. 20 % разтвор (w/v) трихлороцетна киселина;3.3. 1 % разтвор(w/v) на трихлороцетна киселина.4. Апаратура4.1. гореща плоча;4.2. електрическа муфелна пещ с термостат4.3. тигли за опепеляване, изработени от платина или сплав на платина и злато (10 % Pt,

90 % Au), правоъгълни (60 x 40 x 25 mm) или кръгли (диаметър 60 до 75 mm, височина 20 до 25mm).

5. Процедура5.1. метод А:Пробата се опепелява по метода, описан за определянето на сурова пепел. Може да се

използва и пепелта, получена от този анализ.Пепелта се поставя в 250 до 400 ml бехерова чаша, като се използват 75 ml солна

киселина 3 N (3.1). Довежда се бавно до кипене спокойно в продължение на 15 min. Горещиятразтвор се филтрува през филтърна хартия, свободна от пепели, и се промива остатъкът с горещавода до липса на видима киселинна реакция. Филтърът се изсушава с остатъка и се опепелява втариран тигел при температура не по-ниска от 550°C и не по-висока от 700°C. Охлажда се вексикатор и се претегля.

5.2. метод Б:5 g от пробата с точност до mg се претегля и се поставя в 250 до 400 ml бехерова чаша.

Добавят се последователно 25 ml вода и 25 ml солна киселина 3 N (3.1), смесват се и се изчаквада престане кипенето. Добавят се още 50 ml солна киселина 3 N (3.1). Изчаква се да спреотделянето на газ и след това бехеровата чаша се поставя в кипяща водна баня и се оставя там впродължение на 30 min или по-дълго, ако се налага, за да се хидролизира напълно и нишестето,което може да присъства.

Филтрува се, докато пробата е гореща, през филтър, свободен от пепел, и филтърът сепромива с 50 ml гореща вода (вж. наблюдение 7). Филтърът с остатъка се поставят в тигел заопепеляване, изсушава се и се опепелява при температура не по-ниска от 550°C и не по-висока от700°C. Пепелта се поставя в 250 до 400 ml бехерова чаша, като се използват 75 ml солна киселина3 N (3.1); продължава се, както е описано във втория абзац на 5.1.

6. Изчисляване на резултатитеТеглото на остатъка се изчислява, като тарираното тегло се изважда. Резултатът се

изразява в проценти за пробата.7. НаблюдениеАко филтруването се окаже трудно, за подновяване на анализа 50-те ml солна киселина 3

N (3.1) се заместват с 50 ml 20 % трихлороцетна киселина (3.2) и филтърът се промива с горещ 1% разтвор на трихлороцетна киселина (3.3).

VI. Метод за определяне на хлор от хлориди

1. Цел и обхватТози метод позволява определянето на съдържанието хлор в хлориди, които са

разтворими във вода, обикновено изразявани като натриев хлорид. Той е приложим към всичкихрани за животни.

2. ПринципХлоридите се разтварят във вода. Ако продуктът съдържа органични вещества, той се

избистря. Разтворът се подкислява леко с азотна киселина и хлоридите се утаяват под формата насребърен хлорид с помощта на разтвор от сребърен нитрат. Излишният сребърен нитрат сетитрува с разтвор на амониев тиоцианат по метода на Фолхард.

3. Реактиви:3.1. разтвор на амониев тиоцианат 0,1 N;3.2. разтвор на сребърен нитрат 0,1 N;3.3. наситен разтвор на амониев ферисулфат;3.4. азотна киселина D:1.38;3.5. диетилов етер A.R.;3.6. ацетон A.R.;3.7. Карез I разтвор: разтваря се във вода 21,9 g цинков ацетат, Zn(CH23COO)2,2H2O и 3

g ледена оцетна киселина. Допълва се до 100 ml с вода;3.8. Карез II разтвор: разтваря се 10,6 g калиев фероцианид, K4Fe(CN)6,3H2O. Допълва

се до 100 ml с вода;3.9. активен въглен A.R., свободен от хлориди и неабсорбиращ хлориди.4. Апаратураклатачна машина (Шутел): прибл. 35 до 40 оборота в min.5. Процедура5.1. Приготвяне на разтвораСпоред естеството на пробата се приготвя разтвор, както е показано в 5.1.1, 5.1.2 или

5.1.3. Същевременно е необходимо да се направи празна проба без подлежащото на анализвещество.

5.1.1. Проби, свободни от органични веществаПретегля се с точност до mg една проба от не повече от 10 g, съдържаща не повече от 3 g

хлор под формата на хлориди. Поставя се с 400 ml вода в 500 ml мерителна колба приприблизително 20°C. Разклаща се 30 min в шутела, довежда се до марката, хомогенизира се и сефилтрува.

5.1.2. Проби, съдържащи органични вещества без продуктите, описани в 5.1.3.Претегят се около 5 g от пробата с точност до mg и се поставят с 1g активен въглен в 500

mg мерителна колба. Добавят се 400 ml вода с температура около 20°C и 5 ml разтвор I Карез(3.7), разбъркват се и после се добавят 5 ml разтвор II Карез (3.8). Разклаща се 30 min в шутела,довежда се до марката, хомогенизира се и се филтрува.

5.1.3. Готвени храни за животни, ленено кюспе и брашно, продукти, богати на лененобрашно, и други продукти, богати на растителен клей или в колоидални субстанции (напримердекстринирано нишесте).

Разтворът се приготвя, както е описано в 5.1.2, но не се филтрува. Декантира се (ако сеналага, се центрофугира), изваждат се 100 ml от бистрата течност и се прехвърлят в 200 mlмерителна колба. Смесва се с ацетон (3.6) и се довежда до марката с този разтворител,хомогенизира се и се филтрува.

5.2. ТитруванеС помощта на пипета се прехвърлят в ерленмайерова колба от 25 ml до 100 ml от

филтрата (в зависимост от предполагаемото хлорно съдържание), получен, както е описано в5.1.1, 5.1.2 или 5.1.3. Аликвотната част не трябва да съдържа повече от 150 mg хлор (Cl).Разрежда се, ако се налага, до не по-малко от 50 ml с вода, добавят се 5 ml азотна киселина (3.4),20 ml наситен разтвор на амониев ферисулфат (3.3) и две капки разтвор на амониев тиоцианат(3.1). Прехвърля се с помощта на бюрета, запълнена до нулевата марка. С помощта на бюретаразтворът се прехвърля на сребърния нитрат (3.2) по такъв начин, че да се получи излишък от 5ml. Добавят се 5 ml диетилов етер (3.5) и се разбъркват силно (шейкър), за да коагулира утайката.

Титрува се излишният сребърен нитрат с разтвора на амониевия тиоцианат (3.1)дотогава, докато червено-кафеникавото оцветяване се задържи 1 min.

6. Изчисляване на резултатитеКоличеството хлор (w), изразено като натриев хлорид, налично в обема на филтрата, взет

за титруване, се изчислява по следната формула:

W = 5,845 (V1 - V2) mg,

където:

V1 е добавеният разтвор на сребърен нитрат C, 1 N, ml;V2 - разтворът на амониев тиоцианат 0,1 N, използван за титруване, ml.Ако празната проба показва, че разтворът на сребърен нитрат 0,1 N е изчерпан, тази

стойност се приспада от обема (V1 - V2).7. Наблюдения7.1. Титруването може да се извърши и потенциометрично.7.2. При продукти, които са много богати на масла и мазнини, първо се обезмаслява с

диетилов етер или петролеев етер;7.3. При рибна храна титруването може да се извърши по метода на Мор.

VII. Метод за определяне на горчично масло

1. Цел и обхватТози метод позволява определянето на съдържанието горчично масло в кейкове от

brassica и sinapis видовете и в съставни храни, които съдържат кейкове, приготвени от тезивидове, изразено като алил изотиоцианат, който може да бъде уловен с пара.

2. ПринципПробата се суспендира във вода. Горчичното масло се освобождава под действието на

ензими, улавя се чрез дестилация с етанол и се събира в разреден амоняк. Разтворът се обработвана горещо с определен обем сребърен нитрат, след което се охлажда и филтрува. Излишниятсребърен нитрат се титрува с разтвор на амониев тиоцианат.

3. Реактиви

3.1. бял синап (sinapis alba);3.2. 95 до 96 % етанол (v/v);3.3. антипенителна емулсия (напр. силикон);3.4. амониев хидроокис, d: 0,958;3.5. разтвор на сребърен нитрат 0,1 N;3.6. разтвор на амониев тиоцианат 0,1 N;3.7. азотна киселина D: 1,40;

3.8. наситен разтвор на амониев ферисулфат.4. Апаратура:4.1. плоскодънни 500 ml колби със стъклени запушалки с шлиф;4.2. дестилационен апарат с хладник и съоръжение, предотвратяващо улавянето на

капки.5. ПроцедураПретеглят се 10 g от пробата с точност до mg, поставят се в 500 ml плоскодънна колба и

се добавят 2 g фино смлян бял синап (3.1) (източник на ензим) и 200 ml вода с температура 20°C.Kолбата се запушва и се държи при температура 20°C около 2 h, като често се разклаща. Добавятсе 40 ml етанол (3.2) и една капка антипенителна емулсия (3.3). Дестилират се около 150 ml и сесъбира дестилатът в 250 ml мерителна колба, съдържаща 20 ml амониев хидроокис (3.4), като севнимава краят на хладника да е потопен в течността. Добавят се към амонячния разтвор 50 ml 0,1

N разтвор на сребърен нитрат (3.5) (или повече, ако се налага). Поставя се малка фунийка върхумерителната колба и сместа се нагрява на кипяща водна баня един час. Оставя се да се охлади,допълва се до марката с вода, разбърква се и се филтрува. Изваждат се 100 ml от бистрияфилтрат, добавят се 5 ml азотна киселина (3.7) и около 5 ml амониев ферисулфат (3.8). Титрува сеизлишният сребърен нитрат с 0,1 N разтвор на амониев тиоцианат (3.6).

Прави се празна проба по същата процедура с 2 g фино смлян бял синап,без пробата заанализ.

6. Изчисляване на резултатитеОбемът 0,1 N сребърен нитрат се изважда, поет от празната проба, от обема, поет от

пробата. Получената стойност дава броя ml сребърен нитрат 0,1 N, поет от горчичното масло впробата. 1 ml AgNO3 0,1 N отговаря на 4,956 mg алил изотиоцианат. Резултатът се извежда катопроценти за пробата.

VIII. Метод за определяне на лактоза

1. Цел и обхватТози метод позволява определянето на съдържанието лактоза в храни за животни,

съдържащи повече от 0,5 % лактоза.2. ПринципЗахарите се разтварят във вода. Разтворът се подлага на ферментация под действие на

saccharomyces cerevisiae, които дрожди не засягат лактозата. След избистряне и филтруванесъдържанието лактоза във филтрата се определя по метода Луф-Шорл.

3. Реактиви:3.1. суспензия на saccharomyces cervisiae - суспендират се 25 g пресни дрожди в 100ml

вода. Суспензията издържа максимум една седмица в хладилник;3.2. разтвор Карез I - разтварят се във вода 21,9 цинков ацетат Zn(CH3COO).2,2H2O и 3 g

ледена оцетна киселина, допълват се до 100 ml с вода;3.3. разтвор Карез II - разтварят се във вода 10,6 g калиев фероцианид K4Fe(CN6).3H2O,

допълват се до 100 ml с вода;3.4. реагент на Луф-Шорл:С внимателно разбъркване се изсипва лимонена киселина (3.4.2) в разтвора натриев

карбонат (3.4.2); добавя се разтвора меден сулфат (3.4.1) и се допълва до 1 l с вода, оставя се дапрестои една нощ и се филтрува; проверява се нормалността на така получения реактив (Cu 0,1N; Na2CO32N). рН на разтвора трябва да е приблизително 9,4;

3.4.1. разтвор на меден сулфат - разтварят се 25 g меден сулфат А.R. CuSO4.5H2O,свободен от желязо, в 100 ml вода;

3.4.2. разтвор на лимонена киселина: разтварят се 50 g лимонена киселина A.R.C6H8O7,H2O в 50 ml вода;

3.4.3. разтвор на натриев карбонат: разтварят се 143, 8 g безводен натриев карбонат A.R.в около 300 ml гореща вода; оставя се да се охлади;

3.5. гранулирана пемза на късове, кипната в солна киселина, промита с вода и изсушена;3.6. 30 % разтвор (w/v) натриев йодид;3.7. 6 N сярна киселина;3.8. 0,1 N разтвор на натриев тиосулфат;3.9. нишестен разтвор - прибавя се смес от 5 g разтворимо нишесте в 30 ml вода към 1l

кипяща вода; кипва се 3 min, оставя се да се охлади и ако е необходимо, се добавят 10 mgживачен йодид като консервант.

4. АпаратураВодна баня с термостат, нагласен на 3 - 40°C

5. ПроцедураПретегля се 1 g от пробата с точност до mg и се поставя тази порция от пробата в 100 ml

мерителна колба. Добавят се 25 до 30 ml вода. Поставя се колбата в кипяща водна баня за 30 minи след това се охлажда до приблизително 35°C. Добавят се 5 ml от дрождената суспензия (3.1) исе хомогенизира. Оставя се колбата да престои 2 h на водна баня при температура 38 - 40°C.Охлажда се до около 20°C.

Добавят се 2,5 ml разтвор Карез I (3.2), бърка се 30 sec , след това се добавят 2,5 mlразтвор Карез II (3.3) и отново се бърка 30 sec. Допълва се до 100 ml с вода, разбърква се и сефилтрува. С помощта на пипета се взема част от филтрата - не повече от 25 ml и за предпочитанесъс съдържание на лактоза от 40 до 80 ml - и се прехвърля в 300 ml ерленмайерова колба. Ако енеобходимо, допълва се до 25 ml с вода.

Прави се празна проба по същия начин с 5 ml дрождена суспензия (3.1).Съдържанието на лактоза по метода на Луф-Шорл се определя, както следва: прибавят се

точно 25 ml реагент на Луф-Шорл (3.4) и две гранули пемза (3.5). Бърка се на ръка, докато сенагрява на открит пламък със средна височина и течността се довежда до кипене за около 2 min.Ерленмайеровата колба се поставя веднага върху телена мрежа с отвор около 6 cm в диаметър,покрита с азбест, под която е запален пламък. Пламъкът се регулира така, че да се нагрява самоосновата на ерленмайеровата колба. Поставя се обратен хладник към ерленмайеровата колба.Кипи се точно 10 min. Охлажда се веднага в студена вода и след около 5 min се титрува, кактоследва:

добавят се 10 ml разтвор на калиев йодид (3.6) и веднага след това (внимателно, защотоима опасност от обилно образуване на пяна) се добавят 25 ml сярна киселина 6 N (3.7); титрува сес разтвор на натриев тиосулфат 0,1 N (3.8) до появяване на матовожълт цвят, добавя сенишестеният индикатор (3.9) и се завършва титруването.

Извършва се същото титруване с точно измерена смес от 25 ml реагент на Луф-Шорл(3.4) и 25 ml вода след добавяне на 10 ml разтвор на калиев йодид (3.6) и 25 ml сярна киселина 6N (3.7) без кипене.

6. Изчисляване на резултатитеНа базата на приложената таблица се определя количеството лактоза в mg, което

съответства на разликата между резултатите от двете титрувания, изразено в ml на тиосулфатенразтвор 0,1 N.

Резултатът се изразява като части от дехидратирана лактоза в процент от пробата.7. НаблюденияЗа продукти, съдържащи повече от 40 % ферментируема захар, се използват повече от 5

ml дрождена суспензия (3.1).

Таблица на стойностите за 25 ml реагент на Луф-Шорл mol 0.1 N Na2S2O, нагряване 2min, кипене 10 min

0.1 N Глюкоза, Лактоза Малтоза 0.1 NNa2S2O фруктоза, C12H22O11 C6H12O6 Na2S2O

инвертнизахари

C6H12O6

ml mg разлика mg разлика mg разлика ml

1 2,4 2,4 3,6 3,7 3,9 3,9 1

2 4,8 2,4 7,3 3,7 7,8 3,9 2

3 7,2 2,5 11,0 3,7 11,7 3,9 3

4 9,7 2,5 14,7 3,7 15,6 4,0 4

5 12,2 2,5 18,4 3,7 19,6 3,9 5

6 14,7 2,5 22,1 3,7 23,5 4,0 6

7 17,2 2,6 25,8 3,7 27,5 4,0 7

8 19,8 2,6 29,5 3,7 31,5 4,0 8

9 22,4 2,6 33,2 3,8 35,5 4,0 9

10 25,0 2,6 37,0 3,8 39,5 4,0 10

11 27,6 2,7 40,8 3,8 43,5 4,0 11

12 30,3 2,7 44,6 3,8 47,5 4,1 12

13 33,0 2,7 48,4 3,8 51,6 4,1 13

14 35,7 2,8 52,2 3,8 55,7 4,1 14

15 38,5 2,8 56,0 3,9 59,8 4,1 15

16 41,3 2,9 59,9 3,9 63,9 4,1 16

17 44,2 2,9 63,8 3,9 68,0 4,2 17

18 47,1 2,9 67,7 4,0 72,2 4,3 18

19 50,0 3,0 71,7 4,0 76,5 4,4 19

20 53,0 3,0 75,7 4,1 80,9 4,5 20

21 56,0 3,1 79,8 4,1 85,4 4,6 21

22 59,1 3,1 83,9 4,1 90,0 4,6 22

23 62,2 80,0 94,6 23

IХ. Метод за определяне на калий

1. Цел и обхватТози метод позволява определяне на количеството калий в храни за животни.2. ПринципПробата се накалява и пепелта се разтваря в солна киселина. Натриевото съдържание на разтвора се

определя чрез пламъчна фотометрия в присъствието на цезиев хлорид и алуминиев нитрат. Добавянето на тезисубстанции до голяма степен елиминира преченето от примесващи се елементи.

3. Реактиви:3.1. солна киселина A.R., d:1,12;3.2. цезиев хлорид A.R.;3.3. алуминиев нитрат Al (NO3)3.9H2O, реагент за общо приложение;3.4. калиев хлорид, безводен A.R.;3.5. пълнител - във вода се разтварят 50 g цезиев хлорид (3.2), добавят се и 250 g алуминиев нитрат(3.3),

разрежда се до 1 l с вода и се хомогенизира. Съхранява се в пластмасови шишета;3.6. стандартен калиев разтвор - във вода се разтваря 1,907 g калиев хлорид (3.4), добавят се 5 ml солна

киселина (3.1), допълва се до 1 l с вода и се хомогенизира, съхранява се в пластмасови шишета, 1 ml от този разтворсъдържа 1,00 ml калий.

4. Апаратура:4.1. платинови, кварцови или порцеланови тигли за опепеляване, снабдени (ако се налага) с капаци;4.2. електрическа муфелна пещ с термостат;4.3. пламъчен фотометър.5. Процедура:5.1. Анализ на пробата

Като общовалидно правило се претеглят 10 g от пробата с точност до 10 mg, поставя се в тигел и сеопепелява при 450°C в продължение на 3 h. След охлаждане пепелта се прехвърля количествено в 500 ml мерителна

колба, като се използват от 250 до 300 ml вода и след това 50 ml солна киселина (3.1). Когато отделянето навъглероден двуокис престане съвсем, разтворът се нагрява и се държи при температура около 90°C в продължениена 2 h, като отвреме навреме се разбърква. След охлаждане до стайна температура се допълва до марката с вода,разбълниква се и се филтрува. В 100 ml мерителна колба се прехвърля една аликвотна част от филтрата, съдържащамаксимум 1,0 ml калий, добавят се 10,0 mg пълнител (3.5), допълва се до марката с вода и се хомогенизира. В случайна по-големи съдържания на калий разтворът, подлежащ на анализ, се разрежда в подходящо съотношение, преди дасе прибави пълнителят.

Като насока за проба от около 10 g се ползва таблицата:

Предполагаемо Разтворимост Аликвотна частсъдържание на от разтвора в mlкалий в пробата

(% К)

до 0.1 - 50

от 0.1 до 0.5 - 10

от 0.5 до 1.0 - 5

от 1.0 до 5.0 1:10 10

от 5.0 до 10.0 1:10 5

от 10.0 до 20.0 1:20 5

5.2. Калибрираща криваПоставят се 10 ml от стандартния разтвор (3.6) в 250 ml мерителна колба, напълва се до марката с вода и се

хомогенизира. В 100 ml мерителни колби се поставят 5, 10, 15, 20 и 25 ml от този разтвор, отговарящи съответно наколичества калий 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1,0 mg. Серията се завършва с празна проба, несъдържаща стандартен разтвор.Към всяка колба се добавя по 10 ml пълнител (3.5), допълва се до марката с вода и се хомогенизира. Измерванията сеизвършват както е посочено в 5.1. Калибриращата крива е обикновено линейна до концентрации на калий от 1 mg в100 ml разтвор.

6. Изчисляване на резултатитеРезултатът се изразява като процент за пробата.7. НаблюденияЗа да се елиминира влиянието на примесващи елементи, невинаги се налага да се прибавя пълнител (3.5).

Х. Метод за определяне на натрий

1. Цел и обхватТози метод позволява определянето на съдържанието натрий в храни за животни.2. ПринципПробата се опепелява и пепелта се разтваря в солна киселина. Натриевото съдържание на разтвора се

определя чрез пламъчна фотометрия в присъствието на цезиев хлорид и алуминиев нитрат. Добавянето на тезисубстанции в голяма степен елиминира влиянието на примесни елементи.

3. Реактиви:3.1. солна киселина A.R. d:1.12;3.2. цезиев хлорид A.R.;3.3 алуминиев нитрат Al (NO3)3.9H2O, реагент за общо приложение;3.4. натриев хлорид, безводен A.R.;3.5. пълнител - във вода се разтварят 50 g цезиев хлорид (3.2), добавят се 250 g алуминиев нитрат (3.3),

разрежда се до 1 l с вода и се хомогенизира; съхранява се в пластмасови шишета;3.6. стандартен натриев разтвор - във вода се разтварят 1,907 g натриев хлорид (3.4), добавят се 5 ml солна

киселина (3.1), допълва се до 1 l с вода и се хомогенизира; съхранява се в пластмасови шишета; 1 ml от този разтворсъдържа 1,00 mg натрий.

4. Апаратура:4.1. платинeни, кварцови или порцеланови тигли за опепеляване, снабдени, ако се налага, с капаци;4.2. електрическа муфелна пещ с термостат;4.3. пламъчен фотометър.5. Процедура:

5.1. Анализ на пробаКато общо правило се претеглят 10 g от пробата с точност до 10 mg, поставят сe в тигел (4.2) и се

опепеляват при 450°C за 3 h. Препоръчително е да се избягва прегряване (възпламеняване). След охлаждане пепелтасе прехвърля количествено в 500 ml мерителна колба, като се използват 250 - 300 ml вода и след това 50 ml солнакиселина (3.1). Когато отделянето на въглероден двуокис престане съвсем, разтворът се нагрява и се оставя притемпература около 90°C в продължение на два часа, като отвреме навреме се разбърква. След охлаждане до стайнатемпература се допълва до марката с вода, разбълниква се и се филтрува. В 100 ml мерителна колба се прехвърляедна аликвотна част от филтрата, съдържаща максимум 1,0 mg натрий, добавят се 10,0 mg пълнител (3.5), допълва седо марката с вода и се хомогенизира. В случай на по-големи съдържания натрий разтворът, подлежащ на анализ, серазрежда в подходящо съотношение, преди да се прибави пълнителят.

Като насока за проба от около 10 g се ползва следната таблица:

Предполагаемо Разтворимост Аликвотна частсъдържание на от разтвора в ml

(% N)

до 0.1 - 50

от 0.1 до 0.5 - 10

от 0.5 до 1.0 - 5

от 1.0 до 5.0 1:10 10

от 5.0 до 10.0 1:10 5

от 10.0 до 20.0 1:20 5

5.2. Калибрираща криваПоставят се 10 ml от стандартния разтвор (3.6) в 250 ml мерителна колба, напълва се до марката с вода и се

хомогенизира. В 100 ml мерителни колби се поставят 5, 10, 15, 20 и 25 ml от този разтвор, отговарящи съответно наколичества натрий 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1,0 mg. Серията се завършва с празна проба, несъдържаща стандартен разтвор.Към всяка колба се добавят по 10 ml пълнител (3.5), допълва се до марката с вода и се хомогенизира. Измерваниятасе извършват както е посочено в 5.1. Калибриращата крива е обикновено линейна до концентрации натрий 1 mg в100 ml разтвор.

6. Изчисляване на резултатитеРезултатът се изразява като процент за пробата.7. Наблюдения:7.1. За продукти, съдържащи повече от 4 % натрий, е за предпочитане да се опепели субстанцията за 2 h в

тигел с капак. След охлаждане се добавя вода, пепелта се превръща в суспензия с помощта на платиново телче,изсушава се и се опепелява отново за 2 h в тигела с капак.

7.2. Ако пробата се състои само от минерални субстанции, тя се разтваря без предварително опепеляване.

ХI. Метод за определяне на захар

1. Цел и обхватТози метод позволява определянето на съдържанието на редуциращи захари и общи захари след инверсия,

изразени като глюкоза или, когато е подходящо, като захараза, преобразувано с коефициент 0,95. Той е приложимкъм съставни храни за животни. За другите храни за животни са предвидени специални методи. Когато се налага,лактозата трябва да се измерва отделно и да се отчита при изчисляването на резултатите.

2. ПринципЗахарите се екстрахират в разреден етанол; разтворът се избистря с разтвори на Карез I и II. След

отстраняване на етанола количествата преди и след инверсията се определят по метода на Луф-Шорл.3. Реактиви:3.1. 40 % етанол (v/v) d: 0,948 при 20°C, неутрализиран спрямо фенолфталейн;3.2. Карез разтвор I - във вода се разтварят 21,9 g цинков ацетат Zn(CH3COO)2.2H2O и 3 g ледена оцетна

киселина, допълва се до 100 ml с вода;3.3. разтвор Карез II - във вода се разтварят 10,6 g калиев фероцианид K4Fe(CN6).3H2O, допълва се до 100

ml с вода;3.4. 0,1 % разтвор (w/v) метилоранж;3.5. 4 N солна киселина;

3.6. 0,1 N солна киселина;3.7. 0,1 N разтвор на натриев хлорид;3.8. реагент на Луф-Шорл - при внимателно разбъркване се изсипва разтворът на лимонената киселина

(3.8.2) в разтвора на натриевия карбонат (3.8.3); добавя се разтворът на меден сулфат (3.8.1) и се допълва до 1 l свода; оставя се да престои една нощ и се филтрува; проверява се нормалността на така получения реактив (Cu 0,1 N;Na2CO32N). рН на разтвора би трябвало да има стойност приблизително 9,4;

3.8.1. разтвор на меден сулфат - в 100 ml вода се разтварят 25 g меден сулфат А. R. CuSO4.5H2O,несъдържащ желязо;

3.8.2. разтвор на лимонена киселина - в 50 ml вода се разтварят 50 g лимонена киселина A.R. C6H8O7.H2O;3.8.3. разтвор на натриев карбонат - в около 300 ml гореща вода се разтварят 143,8 g безводен натриев

карбонат A.R.; оставя се да се охлади;3.9. 0,1 N разтвор на натриев тиосулфат;3.10. нишестен разтвор - смес от 5 g разтворимо нишесте в 30 ml вода се прибавя към 1 l кипяща вода; кипи

се 3 min, оставя се да се охлади и ако е необходимо, се добавят 10 mg живачен йодид като консервант;3.11. 6 N сярна киселина;3.12. 30 % разтвор (w/v) калиев йодид;3.13. гранулирана пемза на късове, кипната в солна киселина, промита с вода и изсушена;3.14. 3-метилбутан-L-ол.4. Апаратура:Миксер (барабан) - приблизително 35 до 40 оборота в min.5. Процедура5.1. Екстрахиране на пробатаПретеглят се 2,5 g от пробата с точност до mg и се поставят в 250 ml мерителна колба. Добавят се 200 ml

етанол (3.1) и се смесват в барабана за 1 h. Добавят се 5 ml разтвор на Карез I (3.2) и се разбърква 1 min. Добавя серазтвор на Карез II (3.3) и отново се разбърква 1 min. Допълва се до марката с етанол (3.1), хомогенизира се и сефилтрува. Отделят се 200 ml от филтрата и се изпарява до почти половината обем, за да се отстрани по-голямата частот етанола. Остатъкът се прехвърля след изпаряването количествено в 200 ml мерителна колба с помощта на горещавода, охлажда се, допълва се до марката с вода, хомогенизира се и се филтрува, ако се налага. Този разтвор ще сеизползва за определянето на количеството редукторни захари и след инверсия, на общите захари.

5.2. Определяне на редукторни захариС помощта на пипета се вземат не повече от 25 ml от разтвора, съдържащ по-малко от 60 mg редукторни

захари, изразени като глюкоза. Ако се налага, се допъла до 25 ml с дестилирана вода и се определя съдържанието наредукторни захари по метода на Луф-Шорл. Резултатът се изразява като процентно съдържание на глюкоза впробата.

5.3. Определяне на общи захари след инверсияС помощта на пипета се взимат 50 ml от разтвора и се прехвърлят в 100 ml мерителна колба. Добавят се

няколко капки разтвор на метилоранж (3.4), след това внимателно и с непрекъснато бъркане се добавят 4 N солнакиселина (3.5), докато течността стане определено червена. Добавят се 15 ml 0,1 N солна киселина (3.6), колбата сепотапя в силно кипяща водна баня и се оставя 30 min. Охлажда се бързо до около 20°C и се добавят 15 ml 0,1 Nразтвор на натриев хидроокис (3.7). Допълва се до 100 ml с вода и се хомогенизира. Взимат се не повече от 25 ml,съдържащи по-малко от 60 mg редукторни захари, изразени като глюкоза. Ако се налага, се допълва до 25 ml сдестилирана вода и се определя съдържанието на редукторни захари по метода на Луф-Шорл. Резултатът се изразявакато проценти глюкоза или когато е подходящо - захароза, като се умножава по коефициент 0,95.

5.4. Титруване по метода на Луф-ШорлС помощта на пипета се взимат 25 ml от реагента на Луф-Шорл (3.8) и се прехвърлят в 300 ml

ерленмайерова колба; добавят се точно 25 ml от избистрения захарен разтвор. Добавят се 2 гранули пемза (3.13),нагрява се с бъркане на ръка на открит пламък със средна височина и течността се довежда до кипене за около 2 min.Ерленмайеровата колба се поставя веднага върху покрита с азбест телена мрежа с отвор с диаметър около 6 cm, подкоято е запален пламък. Необходимо e пламъкът да се регулира по такъв начин, че да се нагрява само основата наерленмайеровата колба. Поставя се обратен хладник към ерленмайеровата колба. Кипи се точно 10 min. Охлажда севеднага в студена вода и след около 5 min се титрува, както следва:

Добавят се 10 ml разтвор на калиев йодид (3.12) и веднага след това (внимателно, защото има опасност отобилно образуване на пяна) се добавят и 25 ml 6 N сярна киселина (3.11). Титрува се с 0,1 N разтвор на натриевтиосулфат (3.9), докато се появи мътно жълто оцветяване, добавя се и нишестеният индикатор (3.10) и титруванетосе завършва.

Същото титруване се извършва с точно премерена смес от 25 ml реагент на Луф-Шорл (3.8) и 25 ml водаслед добавяне на 10 ml разтвор на калиев йодид (3.12) и 25 ml 6 N сярна киселина (3.11), без кипене.

6. Изчисляване на резултатитеС помощта на таблицата се установява количеството глюкоза в mg, което съответства на разликата между

стойностите на двете титрувания, изразена в mg натриев тиосулфат 0,1 N.Резултатът се изразява като процент за пробата.7. Специални процедури7.1. В случай на храни за животни, богати на меласа, и други храни, които не са особено хомогенни, се

претеглят 20 g и се поставят в 500 ml вода в мерителна колба от 1 l. Разбърква се един час в барабан. Избистря се среагенти Карез I и II (3.2 и 3.3), както е описано в 5.1, като се използват четирикратни количества от всеки реагент.Допълва се до марката с 80 % етанол (v/v).

Хомогенизира се и се филтрува. Отстранява се етанолът, както е описано в 5.1. Ако няма декстринизиранонишесте, се допълва до марката с дестилирана вода.

7.2. В случай на меласа и прости храни за животни, които са богати на захар и почти не съдържат нишесте(рожкови, сушено цвекло и др.), се претеглят 5 g, поставят се в 250 ml мерителна колба, добавят се 200 mlдестилирана вода и се бълника в барабан 1 h или повече, ако се налага. Избистря се с помощта на реагенти Карез I(3.2) и Карез II (3.3), както е описано в 5.1. Допълва се до марката със студена вода, хомогенизира се и се филтрува.За да се определи количеството общи захари, се процедира по описанието в 5.3.

8. Наблюдения8.1. За да се избегне образуването на пяна, е добре да се добави (независимо от обема) приблизително 1 ml

3-метилбутан-L-ол (3.14) преди кипенето с реагент на Луф-Шорл.8.2. Разликата между съдържанието на общи захари след инверсия, изразени като глюкоза, и съдържанието

на редукторни захари, изразени като глюкоза, умножена по 0,95, дава процентното съдържание захароза.8.3. За да се определи съдържанието на редукторните захари, без лактозата, може да се използват два

метода:8.3.1. за приблизително изчисляване се умножава по 0,675 съдържанието на лактоза, установено по друг

аналитичен метод, и полученият резултат се изважда от съдържанието на редукторните захари;8.3.2. за точно изчисление на редукторни захари, без лактоза, за двете крайни определения може да се

използва една и съща проба: единият анализ се прави с част от разтвора, получен по 5.1, а другият - с част отразтвора, получен при определянето на лактоза по метода, посочен за тази цел (след фермениране на другите видовезахар и избистряне).

И в двата случая количеството налична захар се определя по метода на Луф-Шорл и се изчислява в mgглюкоза. Едната от стойностите се изважда от другата и разликата се изразява в проценти за пробата.

Пример:Двата взети обема за всяко определение отговарят на проба от 250 mg.В първия случай се консумират 17 ml натриев тиосулфатен разтвор 0,1 N, отговарящи на 44,2 mg глюкоза;

във втория - 11 ml, отговарящи на 27,6 mg глюкоза.Разликата е 16,6 mg глюкоза.Съдържанието редукторни захари (без лактоза), изчислено като глюкоза по този начин, e:

4.16,6

= 6,64 %.

10

Таблица на стойностите за 25 ml реагент на Луф-Шорл mol 0.1 N Na2S2O, нагряване 2 min, кипене 10 min



C6H12O6


1 2,4 2,4 3,6 3,7 3,9 3,9 1

2 4,8 2,4 7,3 3,7 7,8 3,9 2

3 7,2 2,5 11,0 3,7 11,7 3,9 3

4 9,7 2,5 14,7 3,7 15,6 4,0 4

5 12,2 2,5 18,4 3,7 19,6 3,9 5

6 14,7 2,5 22,1 3,7 23,5 4,0 6

7 17,2 2,6 25,8 3,7 27,5 4,0 7

8 19,8 2,6 29,5 3,7 31,5 4,0 8

9 22,4 2,6 33,2 3,8 35,5 4,0 9

10 25,0 2,6 37,0 3,8 39,5 4,0 10

11 27,6 2,7 40,8 3,8 43,5 4,0 11

12 30,3 2,7 44,6 3,8 47,5 4,1 12

13 33,0 2,7 48,4 3,8 51,6 4,1 13

14 35,7 2,8 52,2 3,8 55,7 4,1 14

15 38,5 2,8 56,0 3,9 59,8 4,1 15

16 41,3 2,9 59,9 3,9 63,9 4,1 16

17 44,2 2,9 63,8 3,9 68,0 4,2 17

18 47,1 2,9 67,7 4,0 72,2 4,3 18

19 50,0 3,0 71,7 4,0 76,5 4,4 19

20 53,0 3,0 75,7 4,1 80,9 4,5 20

21 56,0 3,1 79,8 4,1 85,4 4,6 21

22 59,1 3,1 83,9 4,1 90,0 4,6 22

23 62,2 80,0 94,6 23

ХII. Метод за определяне на карбамид

1. Цел и обхватТози метод позволява определянето на съдържанието карбамид в храни за животни.2. ПринципПробата се суспендира във вода с избистрящ агент. Суспензията се филтрува. Съдържанието карбамид във

филтрата се определя след добавяне на 4-диметиламинобензалдехид (4-DMAB) чрез измерване на оптичнатаплътност при дължина на вълната 420 nm.

3. Реактиви:3.1. разтвор на 4-диметиламинобензалдехид - в 100 ml 96 % етанол се разтварят 1,6 g 4-DMAB A.R. и се

добавят 10 ml солна киселина A.R. (d: 1,19); този реактив се съхранява максимално две седмици;3.2. Карез разтвор I - във вода се разтварят 21,9 g цинков ацетат Zn(CH3COO) 2.2H2O и 3 g ледена оцетна

киселина; допълва се до 100 ml с вода;3.3. разтвор Карез II - във вода се разтвaрят 10,6 g калиев фероцианид K4Fe(CN6).3H2O; допълва се до 100

ml с вода;3.4. активен въглен A.R., който не абсорбира карбамид (да се провери);3.5. 0,1 % разтвор (w/v) карбамид A.R.4. Апаратура:4.1. миксер (барабан) - приблизително 35 до 40 оборота в min;4.2. епруветки - 160 x 16 mm със стъклени запушалки с шлиф;4.3. спектрофотометър.5. Процедура5.1. Анализ на пробаПретеглят се 2 g проба с точност до mg и се поставят с 1 g активен въглен (3.4) в 500 ml мерителна колба.

Добавят се 400 ml вода и по 5 ml разтвор на Карез I (3.2) и разтвор на Карез II (3.3). Разбъркват се 30 min в барабан.Допълва се до марката с вода, разклаща се и се филтрува.

Взимат се 5 ml от прозрачните безцветни филтрати, поставят се в епруветки със стъклени запушалки сшлиф, добавят се 5 ml 4-DMAB разтвор (3.1) и се смесва. Епруветките се поставят в гореща водна баня при 20°C.След 15 min се измерва оптичната плътност на изследвания разтвор със спектрофотометър при 420 nm. Сравнява се спразната проба от реактиви.

5.2. Калибрираща криваВзимат се обеми от 1, 2, 4, 5 и 10 ml от карбамидния разтвор (3.5), поставят се в 100 ml мерителни колби и

се допълват до марката с вода. Взимат се по 5 ml от всеки разтвор, добавят се 5 ml 4-D:AB (3.1) разтвор към всяка от

тях, хомогенизира се и се измерва оптичната плътност, както е показано по-горе, в сравнение с контролен разтвор,съдържащ 5 ml 4-DMAB и 5 ml вода, свободна от карбамид.Построява се калибриращата крива.

6. Изчисляване на резултатитеКоличеството карбамид в пробата се определя, като се използва калибриращата крива.Резултатът се изразява в проценти за пробата.7. Наблюдения7.1. В случай на съдържание карбамид над 3 %, пробата се намалява до 1 g или първоначалният разтвор се

разрежда така, че да няма повече от 50 mg карбамид в 500 ml.7.2. В случай на ниско съдържание карбамид пробата се увеличава дотогава, докато филтратът остава

прозрачен и безцветен.7.3. Ако пробата съдържа просто азотно съединение (например аминокиселини), оптичната плътност

трябва да се измерва при 435 nm.

ХIII. Изчисляване на уреазната активност на продукти, производни на соята

1. Цел и обхватАнализът позволява да се изчисли уреазната активност на продукти, производни на соята, и да се провери

дали тези продукти са били обработени достатъчно добре.2. ПринципУреазната активност се изчислява чрез количеството амонячен азот, освободено от 1 g продукт за минута

при 30°C от разтвор на карбамид.3. Реактиви:3.1. 0,1 N солна киселина;3.2. 0,1 N натриев хидроокис;3.3.фосфатен буфер (натриева основа) 0,05, съдържащ на 1000 ml 4,45 g двунатриев фосфат

(Na2HPO4.2H2О) и 3,40 g монокалиев фосфат (KH2PO4);3.4. прясно приготвен карбамиден пълнител, съдържащ 30,0 g карбамид на 1000 ml фосфатен буфер (3.3);

рН 6,9 - 7,0.4. Апаратура:4.1. апарат за потенциометрично титруване или високочувствителен рН-метър (0,02pH) с магнитна

бъркалка;4.2. водна баня с термостат, нагласен точно на 30°C;4.3. епруветки със стъклени запушалки с шлиф, 150 x 18 mm.5. ПроцедураОколо 10 g от пробата се смилат (напр. в мелничка за кафе) така, че да преминават през сито с отвори 0,2

mm. Претеглят се 0,2 g от смляната проба с точност до mg, поставят се в епруветка със стъклена запушалка с шлиф исе добавят 10 ml фосфатен пълнител (3.4). Запушва се веднага и енергично се разклаща. Епруветката се поставя наводна баня, нагласена точно на 30°C, и се разклаща енергично. Епруветката се поставя на водна баня, точно на 30°Cи се задръжа там 30 min. Веднага се добавят 10 ml от 0,1 N солна киселина (3.1), охлажда се бързо до 20°C исъдържанието на епруветката се прехвърля количествено в съд за титруване, като се промива два пъти с по 5 mlвода. С помощта на стъклен електрод (4.1) се титрува веднага до рН 4,7 с 0,1 N разтвор натриев хидроокис (3.2) чрезелектрометрия.

Празна проба се приготвя, както следва:Проба от 0,2 g, претеглена с точност до mg, се поставя бързо в епруветка със стъклена запушалка с шлиф,

добавят се 10 ml 0,1 N солна киселина (3.1) и след това 10 ml фосфатен пълнител (3.4). Eпруветката се охлаждаведнага в ледена вода и се оставя в нея 30 min. При тези условия се извършва прехвърляне на съдържанието наепруветката в съда за титруване, като се използва 0,1 N разтвор натриев хидроокис (3.2) до рН 4,7.

6. Изчисление:Уреазната активност се изчислява по формулата 1 ml от 0,1 N NaOH = 18 mg теобромин.7. Наблюдение:7.1. Този метод е подходящ за уреазна активност до 1 mg N /G/min при 30°C. За продукти с по-голяма

активност размерът на пробата трябва да се намали на 50 g.7.2. Продукти, съдържащи повече от 10 % сурови мастни вещества, трябва първо да бъдат обезмаслени на

студено.

ХIV. Метод за определяне на суров протеин

1. Цел и обхват:Чрез този метод може въз основа на съдържанието на азот, измерен по метода на Kjeldahl, да се определи

съдържанието на суровия протеин в продукти за изхранване на животни.2. Принцип:Пробата се разлага чрез мокро изгаряне. Киселият разтвор се неутрализира с разтвор на натриева основа.

Отделеният амоняк се улавя чрез дестилация и се събира в известно коли-чество сярна киселина, излишъкът от коятосе титрува с разтвор на натриева основа.

3. Реактиви:3.1. калиев сулфат ч.з.а.;3.2. катализатор - меден окис CuO, ч.з.а. или прекристализиран меден сулфат CuSO4.5H2O ч.з.а. или живак

или живачен окис HgO ч.з.а.;3.3. гранулиран цинк, ч.з.а.;3.4. сярна киселина, ч.з.а., плътност 1,84;3.5. сярна киселина, 0,1 ;3.6. сярна киселина, 0,5 N;3.7. индикатор метилрот - 300 mg метилрот се разтварят в 100 ml етанол, 95 - 96 % (о/о);3.8. разтвор на натриева основа, 40 % (т/о);3.9. разтвор на натриева основа, 0,1 %;3.10. разтвор на натриева основа, 0,25 N;3.11. наситен разтвор на натриев сулфид, ч.з.а.;3.12. разтвор на натриев тиосулфат, Na2S2O3.5H2O, ч.з.а., 8 % (т/о);3.13. гранулирана пемза, измита със солна киселина и накалена.4. Апаратура:апаратура за разлагане на пробата чрез изгаряне и за дестилиране по метода на Kjeldahl (виж наблюдение

7.1).5. Процедура:5.1. РазлаганеПретегля се 1 g от пробата с точност до mg и се пренася в колбата на апарата за изгаряне. Прибавят се 10 g

калиев сулфат (3.1), подходящо количество от катализатора (3.2) (0,3 до 0,4 g от медния окис или 0,9 до 1,2 g отмедния сулфат; или капка живак или 0,6 до 0,7 g живачен окис), 25 ml сярна киселина (3.4) и няколко гранули пемза(3.11). Хомогенизира се. Отначало колбата внимателно се нагрява, като се разклаща от време на време, докатомасата се овъгли и престане да се образува дим; тогава се усилва нагряването, докато течността постепенно започнеда кипи. Внимава се да не се прегреят стените и към тях да не прилепнат органични частици. След като разтворът сеизбистри и обезцвети (или цветът стане светлозелен, ако е използван катализатор, съдържащ мед), кипенетопродължава още един час, след което се оставя да изстине.

5.2. ДестилацияВнимателно се добавят 250 - 350 ml вода, разбърква се, докато се разтворят напълно сулфатите; оставя се

да изстине; добавят се няколко гранули цинк (3.3).В приемната колба на дестилационната апаратура се наливат точно 25 ml 0.1 N (3.5) или 0,5 N (3.6) сярна

киселина в зависимост от предполагаемото количество азот (виж наблюдение 7.2) и се добавят няколко капкииндикатор метилрот (3.7).

Колбата се съединява с хладника на дестилационната апаратура и краят на хладника се потапя надълбочина най-малко 1 cm в течността, която се намира в приемната колба (виж наблюдение 7.3). Чрезизпускателната фуния в колбата се наливат бавно 100 ml 4 0 % разтвор на натриева основа (3.8). Ако е използванживак, съдържащ катализатор, се добавят също или 10 ml разтвор на натриев сулфид (3.11), или 25 ml разтвор нанатриев тиосулфат (3.12).

Колбата се нагрява така, че за 30 min да се дестилират около 150 ml течност. В края на дестилацията рН наразтвора се проверява с лакмусова хартия. Ако реакцията е алкална, дестилацията продължава. Прекъсва се, когатодестилатът стане неутрален според лакмусовата хартия. По време на дестилацията се наблюдава оцветяването исъдържанието на приемната колба се разклаща от време на време. Ако течността стане жълта, незабавно се добавяточно определено количество 0,1 N (3.5) или 0,5 N (3.6) сярна киселина.

5.3. ТитруванеИзлишъкът от сярна киселина в приемната колба се титрува с 0,1 N (3.9) или 0,25 N (3.10) разтвор на

натриева основа в зависимост от нормалността на използваната сярна киселина, докато цветът стане бледожълт.5.4. Проверка на методаЗа да се провери дали реактивите не съдържат азот, се прави празна проба (дестилиране и титруване, като

се пропускат пробите, които трябва да бъдат анализирани). За да се провери точността на метода, се провеждатанализи (разлагане, дестилиране и титруване) на 1,5 до 2,0 g ацетанилид ч.з.а. (точка на топене 114 (грядуса поЦелзий); % N:10,36) в присъствие на 1 g захароза, несъдържаща азот; 1 g ацетанилид е еквивалентен на използванетона 14,80 ml 0,5 N сярна киселина.

6. Пресмятане на резултатите

Определя се обемът на използваната сярна киселина. Един ml 0,1 N сярна киселина съответства на 1,4 mgазот. Количеството на азота се умножава по коефициент 6,25. Резултатът се изразява като процент от пробата.

Повторяемост.Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени с една и съща проба, не трябва да

надвишават:• 0,2 като абсолютна стойност - при съдържание на суров протеин, по-малко от 20 %;• 1,0 % като относителна стойност - при съдържание не по-малко от 20 % и не по-голямо от 40 %;• 0,4 като абсолютна стойност - при съдържание повече от 40 %.7. Наблюдения.7.1. Може да бъде използвана апаратура, при която се налага прехвърляне между етапите на изгаряне и

дестилация. Ако се използва такава апаратура, прехвърлянето трябва да бъде извършено без загуби.7.2. При продукти с ниско азотно съдържание обемът на 0,1 N сярна киселина, която се поставя в

приемната колба, може (ако е необходимо) да бъде намален до 10 или 15 ml и да се допълни до 25 ml с вода.7.3. Ако колбата на дестилационния апарат не е снабдена с изпускателна фуния, натриевата основа се

прибавя непосредствено преди свързването на колбата с хладника, като течността се налива бавно по стената накондензора, така че да не се смеси с киселия разтвор.

ХV. Метод за определяне на влага

1. Цел и обхватТози метод дава възможност да се определя съдържанието на влага в храните за животни.Той не обхваща анализа на млечни продукти, използвани като директни храни за животни, анализа на

минерални субстанции и смеси, съставени преобладаващо от минерални вещества, анализа на животински ирастителни мазнини и масла или анализа на маслодайни семена и маслодайни плодове.

2. ПринципПробата се изсушава при точно определени условия, които варират в съответствие с характера на храните

за животни. Загубата на маса се определя чрез претегляне. Необходимо е да се извърши предварително изсушаване,когато се работи с твърди храни за животни с високо съдържание на влага.

3. Апарати:3.1. мелница от материал, който не абсорбира влага и е лесен за почистване, позволява бързо, равномерно

раздробяване, без да предизвиква някакво значително затопляне, пpедотвратява контакт с външния въздух,доколкото е възможно, и отговаря на изискванията, посочени в 4.1.1 и 4.1.2 (примерно: чук или водно-охлаждани имикромелници/трошачки, сгъваеми конусни мелници, бавнооборотни или мелници/трошачки със зъбчати колела);

3.2. аналитична везна с точност до 0,5 mg;3.3. сухи контейнери от некорозиращ метал или от стъкло с капаци, осигуряващи херметично затваряне;

работна повърхност, позволяваща пробите за тест да бъдат разстлани на около 0,3 g/cm2;3.4. електрически нагрявана изотермична сушилня (± 1°C), подходящо вентилирана и осигуряваща бързо

регулиране на температурата - (За изсушаване на зърнени растения, брашно, булгур и едро смляно брашно пещтатрябва да има такъв температурен капацитет, че когато е предварително поставена на 131°C, тя да се върне на тазитемпература за по-малко от четиридесет и пет минути, след като максималният брой проби за тест е поставен вътре,за да се суши едновременно. Вентилацията трябва да бъде такава, че когато колкото може повече проби от житникултури, които тя може да побере, са изсушени за два часа, резултатът да се различава от този, получен след четиричаса сушене, с по-малко от 0,715 %.);

3.5. електически нагреваема вакуум сушилня с регулиране, снабдена с маслена помпа и/или механизъм завкарване на горещ сух въздух или изсушаващ агент (напр. калциев окис);

3.6. сушилня с плътна перфорирана метална или порцеланова плоча (чиния), съдържаща ефикасенизсушаващ агент - ексикатор.

4. ПроцедураОписаните операции се извършват веднага след отварянето на пакетите с пробите. Анализът се извършва

най-малко два пъти.4.1. Подготовка4.1.1. Храни за животни, различни от тези, отнасящи към посочените в 4.1.2 и 4.1.3. Взима се най-малко 50

g от пробата. Ако е необходимо, се разтрошават или се разделят по такъв начин, че да се избегне всякаква вариация всъдържанието на влага (виж 6).

4.1.2. Житни растения шрот и булгурВзимат се най-малко 50 g oт пробата. Смила се на частици, от които най-малко 50 % минават през

мрежесто сито с отвори 0,75 mm така, че да се получи не повече от 10 % остатък върху мрежесто сито с отвори сразмер 1 mm.

4.1.3. Храни за животни в течна форма или във вид на каша (in liquid or paste form), храни за животни,

състоящи се предимно от масла и мазнини.Взимат се около 25 g oт пробата, претеглят се с точност до 10 mg, добавя се подходящо количество

безводен пясък, претеглено с точност до 10 mg, и се бърка, докато се получи един хомогенен продукт.4.2. Сушене4.2.1. Храни за животни, различни от тези, отнасящи към 4.2.2 и 4.2.3. Претеглят се един контейнер (3.3) с

неговия капак с точност до 0,5 mg. В претегления контейнер с точност до 1 mg се претеглят около 5 g oт пробата иравномерно се разстилат. Поставя се бързо контейнерът без неговия капак в пещта, предварително загрята до 103°C.За да се предпази температурата в сушилнята от ненужно спадане, контейнерът се внася колкото е възможнопо-бързо. Оставя се да се суши за 4 h, смятани от времето, когато температурата в сушилнята се върне на 103°C.Отстранява се капакът на контейнера, отстранява се от сушилнята, оставя да изстине от 30 до 45 min вексикатора(3.6) и се претегля с точност до 1 mg. Храни за животни, съставени предимно от масла и мазнини, сесушат в пещта допълнително 30 min при 130°C. Разликата между двете претегляния не трябва да надвишава 0,1 % oтвлагата.

4.2.2. Едро смляно брашно/булгур и шрот (groats and meal)Претеглят се един контейнер (3.3) и неговият капак с точност до 0,75 mg. В претегления контейнер се

претегля с точност до 1 mg около 5 g oт смляната проба и се разпростира равномерно. Контейнерът без неговиякапак се поставя в пещта, предварително загрята до 130°C. За да се предпази температурата в сушилнята от ненужноспадане, контейнерът се внася колкото е възможно по-бързо. Оставя се да се суши 2 h, считано от момента, когатотемпературата в пещта се върне до 130°C. Капакът се поставя обратно върху контейнера, последният се отстраняваот пещта, оставя се да изстине от 30 до 45 min в сушилнята (3.6) и се претегля с точност до 1 g.

4.2.3.Комбинирани храни за животни, съдържащи повече от 4 % захароза и лактоза (sucrose or lactose):директни храни за животни, като плод от рожкови (locust beans), хидролизирани житни продукти, малцови семена,сушени резени от захарно цвекло, риба и разтворими захари; комбинирани храни за животни, съдържащи повече от25 % минерални соли, вкл. вода от кристализация.

Претеглят се един контейнер (3.3) с неговия капак с точност до 0,75 mg. В претегления контейнер сепретеглят с точност до 1 mg около 5 g oт пробата и се разпростират равномерно. Контейнерът се поставя без неговиякапак във вакуум сушилнята (3.5), предварително загрята до между 80°C и 85°C. За да се предпази температуратавъв вакуум сушилнята от ненужно спадане, контейнерът се внася колкото е възможно по-бързо.

Налягането се повишава до 100 Torr и се оставя да се суши 4 h при това налягане или в струя от горещ, сухвъздух; или използвайки сушилен агент (около 300 g за 20 проби). В последния момент вакуумната помпа сеизключва, когато е достигнато предписаното налягане. Времето за сушене се отчита от момента, когатотемпературата в сушилнята се върне на 80°C дo 85°C. Пещта внимателно се връща обратно до атмосферно налягане.Пещта се отваря, веднага се поставя капакът на контейнеpa, отстранява се контейнерът от сушилнята, оставя се даизстине от 30 дo 45 min в сушилнята (3.6) и се претегля с точност до 1 mg. Суши се допълнително 30 min във вакуумсушилнята при 80°C до 85°C и се претегля отново. Разликата между двете претегляния не трябва да надвишава 0,71% влага.

4.3. Предварително изсушаване4.3.1. Храни за животни, различни от тези, включени в т. 4.3.2Твърдите храни за животни с високо съдържание на влага, което прави трудно раздробяването им, трябва

да бъдат обект на предварително изсушаване, както следва:Претеглят се 50 g oт нераздробената мостра с точност до 10 mg (компресирани или агломерирани храни за

животни могат да бъдат грубо разделени, ако е необходимо) в подходящ контейнер (напр. една алуминиева чиния сразмери 20 x 12 cm и с 0,75 cm ръб). Оставя се да се суши в сушилня при 60°C до 70°C, докато съдържанието навлага намалее между 8 и 12 %. Отстранява се от пещта, оставя се да изстине непокрито в лабораторията за 1 h и сепретегля с точност до 10 mg. Раздробява се веднага, както е посочено в т. 4.1.1, и се изсушава, както е посочено в4.2.1 или 4.2.3 в съответствие с вида на фуража.

4.3.2. Житни растения / CerealsЗърно със съдържание на влага над 17 % трябва да бъде предмет на предварително изсушаване, както

следва: претеглят се 50 g несмляно зърно с точност до 10 mg в подходящ контейнер (например една алуминиевачиния с размери 20 x 12 cm с ръб от 0,5 cm). Оставя се да се изсуши за 5 дo 7 min в пещ при 130°C. Отстранява се отпещта, оставя се да изстине непокрито в лабораторията за 2 h и се претегля с точност до 10 mg. Смила се веднага,както е посочено в т. 4.1.2, и се изсушава, както е посочено в т. 4.2.2.

5. Калкулиране на резултатитеСъдържанието на влага като процент на пробата се изчислява чрез използване на следните формули:5.1. Изсушаване без предварително изсушаване:

100

(E - m) .

E

където:E е началната маса от пробата за тест, в g;m - масата на сухата проба за тест, в g.5.2. Сушене с предварително изсушаване

където:E е началната маса на пробата за тест след предварително изсушаване, в g,M' - масата на пробата за тест след раздробяване или смилане, в g;m - масата на изсушената проба за тест, в g.5.3. ПовторяемостРазликата между резултатите от две паралелни измервания, извършени върху една и съща проба, не би

следвало да надвишава 0,2 % влага.6. НаблюдениеАко се докаже, че раздробяването е необходимо и ако се види, че това намалява съдържанието на влага в

продукта, резултатите от анализа на компонентите на храната за животни трябва да бъдат коригирани на базата насъдържанието на влага на пробата в нейното начално състояние.

ХVI. Метод за определяне на амоняк ( volatile nitrogenous bases)

A. МИКРОДИФУЗИЯ1. Цел и и обхватТози метод дава възможност да се определи съдържанието на летливи азотни основи, проявяващи се като

амоняк (ammonia), в храните за животните.2. ПринципПробата се екстрахира с вода и разтворът се избистря и филтрира. Амонякът се измества чрез

микродифузия, използувайки разтвор на калиев карбонат, събран в разтвор от борна киселина, и се титрува със сярнакиселина.

3. Реактиви:3.1. 20 % (w/v) разтвор на трихлороцетна киселина;3.2. индикатор - разтварят се 33 mg oт бромкресол грюн (bromocresol green) и 65 mg метил рот в 100 ml 95

% - 96 % (v/v) етанол;3.3. разтвор на борна киселина / Boric acid solution:в градуирана колба от 1 l се разтварят 10 g борна киселина чиста за анализ в 200 ml 95 - 96 % (v/v) етанол и

700 ml вода; прибавят се 10 ml oт индикатора (3.2); смесва се и ако е необходимо, се установява цветът на разтворадо леко червено чрез добавяне разтвор на натриев хидроокис / sodium hydroxide. 1 ml oт този разтвор ще фиксирамаксимум 300 g от NH3;

3.4. разтвор на наситен калиев карбонат / Saturated potassium carbonate solution:разтварят се 10 g калиев карбонат A. R. в 100 ml вряща вода; оставя се да изстине и се филтрира;3.5. сярна киселина 0,02 N.4. Aпарати:4.1. миксер (въртящ се барабан) - приблизително при скорост от 35 до 40 оборота в min;4.2. чашка на Конвей (glass or plastic Conway cells) (виж фигурата):

4.3. градуирани стъкленици - 1/100 ml.5. ПроцедураПретеглят се 10 g oт пробата с точност до 1 mg и се поставят със 100 ml вода в една градуирана колба от

200 ml. Разбърква се в миксера 30 min. Добавят се 50 ml разтвор на трихлороцетна киселина (3.1), допълва се донужния обем с вода, енергично се разклаща и се филтрира през един нагънат филтър / pleated filter.

Използва се пипета, внася се 1 ml разтвор на борна киселина (3.3) в централната част на клетката наКонуей и 1 ml от филтрата на пробата във външната камера на чашката (crown of the cell). Покрива се частично съссмазания капак. Капва се 1 ml разтвор на наситен калиев карбонат (3.4) бързо в чашката и капакът се затваря, така чечашката да е херметично затворена. Разклаща се внимателно чашката на Конуей хоризонтално, така че дватареактива да се смесят.

Оставя се да действа (incubate) или за най-малко 4 h при стайна температура, или за 1 h при 40°C.Използва се градуирана колба (4.3), летливите основи се титруват в разтвор от борова киселина със сярна

киселина 0,02 N (3.5).Прави се бланков тест (празен тест), като се прилага същата процедура, но без проба, която да бъде

анализирана.6. Калкулиране на резултатите1 ml oт H2SO4 0,02 N отговаря на 0,34 mg oт амоняк.Резултатите се изразяват като процент от пробата.ПовторяемостРазликата между резултатите от две паралелни измервания, извършени върху една и съща проба, не следва

да надвишават:10 %, в относителна стойност/value - при съдържание на амоняк, по-малко от 1,0 %;0,1 %, в абсолютна стойност - при съдържание на амоняк 1,0 % или повече.7. Наблюдение

Ако съдържанието на амоняк в пробата превишава 0,76 %, началният филтрат се разрежда.Б. ЧРЕЗ ДЕСТИЛАЦИЯ1. Цел и и обхватТози метод дава възможност да се определи съдържанието на амоняк (volatile nitrogenous bases),

проявяващи се като амоняк, рибно брашно, несъдържащо практически урея. Той е приложим само при съдържаниена амоняк, по-малко от 0,25 %.

2. ПринципПробата се извлича с вода и разтворът се избистря и филтрува. Амонякът са отделя при точката на кипене

чрез добавяне на магнезиев окис и се събира в точно определено количество сярна киселина, излишъкът от която сетитрува остатъчно с разтвор на натриев хидроокис (sodium hydroxide).

3. Реактиви:3.1. 20 % (w/v) разтвор на трихлороцетна киселина;3.2. магнезиев окис /Magnesium oxide ЧИСТ ЗА АНАЛИЗ;3.3. емулсия против образуването на пяна - например силикон;3.4. сярна киселина 0,1 N;3.5. разтвор на натриев хидроокис (Sodium hydroxide solution) 0,1 N;3.6. 0,3 % (w/v) разтвор на метил червен в 95 % - 96 % (v/v) етанол.4. Апаратура:4.1. миксер(Mixer - tumbler): приблизително 35 до 40 оборота min;4.2. дестилационен апарат от Келдалов тип (Kjeldahl type).5. ПроцедураПретеглят се 10 g oт пробата с точност до 1 mg и се поставя с 100 ml вода в градуирана колба от 200 ml.

Смесва се в миксера 30 min. Добавят се 50 ml разтвор на трихлороцетна киселина (3.1), допълва се до обема с вода,разклаща се енергично и се филтрира през нагънат филтър.

Взема се едно количество от чист филтрат, подходящо за предполагаемото съдържание на летливи азотниоснови (100 ml обикновено са достатъчни). Разрежда се до 200 ml и се добавят 2 g магнезиев окис (3.2) и няколкокапки от емулсия против пяна (3.3). Разтворът би трябвало да е алкален към лакмусова хартия, в противен случай седобавя малко магнезиев окис (3.2). Дестилират се около 150 ml oт разтвора в апарата на Kjeldahl и дестилатът сесъбира в една колба на Ерленмайер (Erlenmeyer), съдържаща точно измерен обем (25 дo 50 ml) от сярна киселина 0,1N (3.4). Докато се извършва дестилацията, се избягва претоплянето на страните. Разтворът на сярната киселина секипва за 2 min, охлажда се и излишъкът от сярна киселина се титрува обратно с разтвор на натриев хидроокис 0,1 N(3.5) в присъствието на метил рот като индикатор (methyl red indicator) (3.6).

Извършва се празен тест, като се следва същата процедура, но без проба, която да бъде анализирана.6. Калкулиране на резултатите1 ml H2SO4 0,1 N съответствува на 1,7 mg амоняк. Резултатът се изразява като процент от пробата.ПовторяемостРазликата между резултатите от две паралелни измервания, извършени върху една и съща проба, не би

следвало да надхвърля в относителна стойност (relative value) 10 % амоняк.

ХVII. Метод за определяне общото съдържание на фосфор

ФОТОМЕТРИЧЕН МЕТОД1. Цел и обхватТози метод дава възможност да се определи съдържанието на общ фосфор в храните за животни. Той е

особено подходящ за анализа на нискофосфорни продукти. В определени случаи (продукти, богати на фосфор) можеда бъде използван гравиметричен метод.

2. ПринципПробата се минерализира или чрез сухо горене (при органични храни за животни), или чрез киселинно

смилане ( при минерални комбинирани или течни храни за животни), поставена в киселинен разтвор. Разтворът сетретира с молибдованадиев (molybdovanadate) реактив. Оптическата плътност на така образувания жълт разтвор сеизмерва в спектрофотометър (spectra-photometer) при 430 nm.

3. Реактиви:3.1. калциев карбонат ЧИСТ ЗА АНАЛИЗ;3.2. хидрохлорна киселина/Hydrochloric acid ЧИСТ ЗА АНАЛИЗ, р/d/:1,1 (прибл. 6 N);3.3. азотна киселина ЧИСТ ЗА АНАЛИЗ, р: 1,045;3.4. азотна киселина ЧИСТ ЗА АНАЛИЗ, р: 1,38 до 1,42;3.5. сярна киселина ЧИСТ ЗА АНАЛИЗ, р: 1,84;3.6. молибдено-ванадиев реактив:

смесват се 200 ml разтвор на амониев молибден (ammonium heptamolybdate solution) (3.6.1), 200 ml разтворна амониев молибдат (ammonium monovanadate solution) (3.6.2) и 134 ml азотна киселина (3.4) в една еднолитроваградуирана колба; обемът се допълва с вода;

3.6.1. разтвор на амониев молибдат/Ammonium heptamolybdate solution:в топла вода се разтварят 100 g амониев амолибдат - чист за анализ (NH4) 6Mo7O24.4H2O. добавят се 10

ml амоняк (р:0,91) и се допълва до 1 l с вода;3.6.2. амониев монованадан - разтвор/Ammonium monovanadate solution:2,735 g амониев монованадат (ammonium monovanadate) ЧИСТ ЗА АНАЛИЗ NH4VO3 се разтварят в 400 ml

гореща вода. Разбърква се постоянно, бавно се добавят 20 ml разредена азотна киселина (7 ml от HNO3 (3.4) + 13 mlна H2O и се допълва до 1 l с вода.

3.7. Стандартен разтвор на 1 mg фосфор на ml:Разтварят се 4,387 g oт калиев дихидрогенен фосфат (potassium dihydrogen phosphate) чист за анализ K2PO4

във вода. Допълва се до 1 l с вода.4. Апаратура:4.1. силициеви (кварцови) или порцеланови съдове за пепел /Silica or porcelain ashing crucibles;4.2. електрическа муфелна пещ с термостат, установен на 550°C (Electric muffle-furnace with thermostat);4.3. 250 ml Kjeldahl колба;4.4. градуирани колби и прецизни пипети;4.5. спектрофотометър / Spectrophotometer;4.6. епруветки от около 16 mm в диаметър, със запушалки, градуирани до диаметър от 14,5 mm; с обем : 25

до 30 ml.5. Процедура5.1. Приготвяне на разтвора

В съответствие с естеството на пробата се приготвя разтвор, както е посочено в т.5.1.1 или т. 5.1.2.5.1.1. Обикновена процедура1g или повече от пробата се претеглят с точност до 1 mg. Пробата се поставя за теста в една Киедалова

(Kjeldahl) колба, добавят се 20 ml сярна киселина acid (3.5), разклаща се, за да се намокри веществото изцяло скиселина и за да се предпази от залепване по стените на колбата, нагрява се и се оставя при точка на кипене за 10min. Оставя се да изстине леко, добавят се 2 ml азотна киселина (3.4), нагрява се умерено, оставя се да изстине леко,добавя се още малко азотна киселина (3.4) и се връща до точката на кипене.Тази процедура се повтаря, докато сеполучи безцветен разтвор. Охлажда се, добавя се малко вода, течността се прелива в една 500 ml градуирана колба,изплаквайки Kjeldahl колбата с гореща вода. Оставя се да изстине, допълва се до обема с вода, хомогенизира се и сефилтрира.

5.1.2. Проби, съдържащи органични вещества без съдържание на калциев и магнезиев дихидрогененфосфат /magnesium dihydrogen phosphates.

Претеглят се около 2,5 g от пробата с точност до 1 mg в шахтна пещ. Пробата за теста се бърка, докатонапълно се смеси с 1 g калциев карбонат (3.1). Изпепелява се в пещта при 550°C ± 5°C, докато бъде получена бялаили сива пепел (малко дървени въглища не са от значение). Пепелта се прехвърля в една 250 ml мензура (Beaker).Добавят се 20 ml вода и хидрохлорна киселина /hydrochloric acid/ (3.2), докато бурното кипене престане. Прибавят седопълнително 10 ml хидрохлорна киселина (3.2). Мензурата се поставя на пясъчна баня и се изпарява до сухо, за дасе направи силициевият двуокис (кварцът) неразтворим. Утайката се разтваря отново в 10 ml азотна киселина (3.3) исе кипва на пясъчната баня за 5 минути без изпаряване до изсушаване. Течността се пресипва в една 500 mlградуирана колба, изплаквайки мензурата няколко пъти с гореща вода. Оставя се да изстине, допълва се до обема свода, хомогенизира се и се филтрира.

5.2. Изменение в цвета и измерване на оптическата плътностКратна част oт получения филтрат се разрежда, както е посочено в т. 5.1.1 и т. 5.1.2, за да се получи

фосфорна концентрация от не повече от 40 mg/ml. Поставят се 10 ml oт този разтвор в една епруветка (4.6) и седобавят 10 ml oт молибдено-ванадатиев реактив (мolybdovanadate) (3.6). Хомогенизира се и се оставя за най-малко10 min при 20°C. Измерва се оптическата плътност в спектрофотометър при 430 nm срещу разтвор, получен чрездобавянето на 10 ml oт молибдено-ванадатиевия реактив (3.6) към 10 ml вода.

5.3. Крива на калибриранеОт стандартния разтвор (3.7) се приготвят разтвори, съдържащи съответно 5,10, 20, 30 и 40 mg фосфор на

ml. Вземат се 10 ml oт всеки от тези разтвори и се добавя към тях 10 ml oт молибдено-ванадатиев реактив (3.6).Хомогенизира се и се оставя да стои за най-малко 10 min при 20°C. Оптическата плътност се измерва, както епосочено в 5.2.

Кривата на калибриране се проследява чрез нанасяне на оптическите плътности/гъстоти срещусъответстващите количества фосфор. За концентрации между 0 и 40 mg/ml кривата ще бъде линейна (linear).

6. Калкулиране на резултатите

Количеството на фосфора в пробата за тест се определя чрез използване кривата на калибриране.Резултатът се изразява като процент от пробата.ПовторяемостРазликата между резултатите от две паралелни измервания, извършени върху една и съща проба, не би

трябвало да надвишава 3 % в относителна стойност - при фосфорно съдържание, по-малко от 5 %;0,15 %, в абсолютна стойност - при фосфорно съдържание от 5 % или повече.

ХVIII. Метод за определяне на сурови масла и мазнини

1. Задача и обхватТова е метод за определяне на съдържанието на сурови масла и мазнини в животинските храни. Той не

обхваща анализа на семена и плодове за добиване на масла.Използването на описаните процедури, зависи от характера и състава на животинските храни и повода за

извършване на анализа.1.1. Процедура А - сурови масла и мазнини, които могат да се извлекат пряко - този метод е приложим за

хранителни материали от растителен произход, с изключение на включените в обхвата на процедура Б.1.2. Процедура Б - общо съдържание на сурови масла и мазнини - този метод е приложим за хранителни

материали от животински произход и за всички комбинирани храни. Използва се за всички материали, от коитомаслата и мазнините не могат да бъдат напълно извлечени без предварителна хидролиза (напр. глутени, дрожди,картофени белтъчини и продукти, предмет на процеси, като екструдиране, настъргване на люспи и нагряване).

1.3. Интерпретиране на резултатите - във всички случаи, при които по-висок резултат се получава приизползване на процедура Б, отколкото се получава при процедура А, полученият по процедура Б резултат се приемакато вярна стойност.

2. Принцип2.1. Процедура А - пробата се извлича с петролев етер. Разтворителят се дестилира, а остатъкът се

изсушава и измерва.2.2. Процедура Б - пробата се обработва термично със солна киселина. Сместа се охлажда и филтрира.

След като бъде промит и изсушен, остатъкът се подлага на определяне съгласно процедура А.3. Реактиви3.1. петролев етер, диапазон на кипене : от 40 до 60°C. Индексът на брома трябва да бъде по-малък от 1, а

остатъкът след изпарението - по-малък от 2 mg/100 ml;3.2. натриев сулфат, безводен;3.3. солна киселина, 3 N;3.4. филтрираща добавка, например инфузорна пръст, Hyflo-supercel.3.5. вълероден тетрахлорид A.R.4. Апаратура4.1. Екстрактор. Ако апаратът има сифон (Сокслетов апарат), дебитът на нагряването с обратен хладник

трябва да бъде такъв, че да се получават най-малко десет цикъла в час. Ако апаратът е без сифон, дебитът наобратния хладник трябва да бъде около 10 ml в min.

4.2. Екстракционни патрони без разтворими в петролев етер вещества и чиято порьозност съответства наизискванията на т. 4.1.

4.3. Сушилня или вакуумсушилня, настроена при 75°C ±3°C, или въздушна пещ, настроена при 100°C±3°C.

5. Процедура5.1. Процедура А (виж т. 8.1)Претеглят се 5 g от пробата с точност 1 mg, прехвърлят се в екстракционен патрон (4.2) и се покрива с

памучен обезмаслен тампон.Патронът се поставя в екстрактор (4.1) и в продължение на 6 h се извлича с петролен етер (3.1). Екстрактът

се събира в суха претеглена колба, в която има няколко късчета пемза - (Късчетата пемза се заменят със стъклениперли, когато маслата или мазнините подлежат на по-нататъшни качествени изследвания.).

Чрез дестилация се отстранява разтворителят. Остатъкът се изсушава, като в продължение на 1,5 h колбатасе поставя в сушилнята (4.3). Оставя се да се охлади в сушилен шкаф и се претегля. Изсушава се отново впродължение на 30 min, за да се осигури теглото на маслата и мазнините да остане постоянно (загубата на тегломежду две последователни претегляния трябва да бъде по-малка от 1 mg).

5.2. Процедура БПретеглят се 2,5 g от пробата с точност 1 mg (вж. т. 7.2), поставят се в бехерова чаша 400 ml или

ерленмайерова колба 300 ml и се добавят 100 ml солна киселина (3.3) и няколко късчета пемза. Бехеровата чаша сепокрива с наблюдателно стъкло или към коничната колба се свързва обратен хладник. Сместа се нагрява до слабокипене на слаб пламък или на котлон и така се държи в течение на 1 h. Следи се продуктът да не залепне по стените

на контейнера.Охлажда се и се добавя достатъчно количество от филтрационната добавка (3.4), за да се предотврати

всякаква загуба на мазнини при филтрирането. Филтрира се през навлажнена обезмаслена двойно филтриращахартия. Остатъкът се промива в студена вода до получаване на неутрален филтрат. Филтратът се проверява засъдържание на масла и мазнини. Тяхното наличие показва, че пробата трябва да се извлече с петролен етер, като сеизползва процедура А, преди хидролизата.

Двойната филтрираща хартия, съдържаща сухия остатък, се поставя върху наблюдателно стъкло и се сушиедин час и половина във въздушната пещ (4.3) 100°C ±3°C.

Двойната филтрираща хартия се поставя в екстракционен патрон (4.2), който се покрива с памученобезмаслен тампон. Патронът се поставя в екстрактора (4.1) и се продължава, както е посочено във втори и третиабзац на 5.1.

6. Изразяване на резултатитеТеглото на остатъка се изразява като процент от пробата.ПовторяемостРазликата между две паралелни определяния, извършени на същата проба от един и същ лаборант, не

трябва да превишава:- 2 % в абсолютна стойност - за съдържание на сурови масла и мазнини, по-ниско от 5 %;- 4 % в абсолютна стойност спрямо най-високия резултат - за съдържание от 5 до 10 %;- 0,4 % в абсолютна стойност - за съдържание над 10 %.7. Забележки7.1. При продукти с високо съдържание на масла и мазнини, които е трудно да се строшат или са

неподходящи за изтегляне на хомогенна редуцирана проба за изпитване, се процедира, както следва:Претеглят се 20 g от пробата с точност 1 mg и се смесват с 10 g или повече безводен натриев сулфат (3.2).С

петролев етер (3.1) се извлича, както е посочено в т. 5.1. Полученият екстракт се долива до 500 ml с въглеродентетрахлорид (3.5) и се хомогенизира. Вземат се 50 ml от разтвора и се поставят в малка суха претеглена колба, коятосъдържа парчета пемза - (Късчетата пемза се заменят със стъклени перли, когато маслата или мазнините подлежат напо-нататъшни качествени изследвания.). Разтворителят се отстранява чрез дестилиране, изсушава се и сепродължава, както е посочено в последния абзац на т. 5.1.

Разтворителят се отстранява от остатъка от екстракцията, останал в патрона, остатъкът се строшава доедрина на частиците 1 mm, връща се в екстракционния патрон (без да се добавя натриев сулфат) и се продължава,както е посочено в 1.2 и 1.3.

Съдържанието на масла и мазнини се изчислява като процент от пробата, като се използва следнатаформула:

(10 а + b).5,

където:а е масата на остатъка след първата екстракция (аликватна част на екстракта), в g;

b - масата на остатъка след втората екстракция, в g.7.2.При продукти с ниско съдържание на масла и мазнини пробата за изпитване може да бъде увеличена до

5 g.7.3. Храните за домашни любимци, които имат високо съдържание на вода, може да е нужно да бъдат

смесени с безводен натриев сулфат преди хидролизата и екстракцията, както при процедура Б.7.4. В т. 5.2 може да е по-ефективно да се използва гореща вода вместо студена вода за измиване на

остатъка след филтрирането.7.5.Времето за сушене 1,5 h може да е нужно да се удължи при някои животински храни. Трябва да се

избягва излишното сушене, тъй като може да доведе до лоши резултати. Може да се използва също такамикровълнова печка.

7.6.Предварителната екстракция при процедура А преди хидролизата и повторната екстракция припроцедура Б се препоръчват, ако съдържанието на сурови масла / мазнини е по-голямо от 15 %. В известна степентова зависи от характера на животинската храна и характера на маслата/мазнините в животинската храна.

ХIХ. Метод за определяне на аминокиселини

1. Цел и област на приложениеНастоящият метод е за определяне на свободните (синтетични и естествени) аминокиселини и общите

(пептидно свързани и свободни) аминокиселини в животински храни, като се използва анализатор на

аминокиселини. Методът е приложим за следните аминокиселини: цист(е)ин, метионин, лизин, треонин, аланин,аргинин, аспартитова киселина, глутаминова киселина, глицин, хистидин, изолеуцин, леуцин, фенилаланин, пролин,серин, тирозин и валин.

Методът не разграничава солите на аминокиселините и не може да диференцира D и L формите нааминокиселините. Той не е валиден за определяне на триптофан или на хидрокси аналози на аминокиселини.

2. Принцип2.1. Свободни аминокиселиниСвободните аминокиселини се извличат с разредена солна киселина. Извлечените заедно с тях азотни

макромолекули се утаяват със сулфосалицилова киселина и се отстраняват чрез филтриране. Филтрираният разтворсе коригира на рН 2,20. Аминокиселините се отделят чрез йоннообменна хроматография и се определят чрез реакцияс нинхидрин и фотометрична детекция при 570 nm.

2.2. Общо съдържание на аминокиселиниИзбраният метод зависи от изследваните аминокиселини. Цистеинът и метионинът се окисляват до

цистеинова киселина и метионин сулфон съответно преди хидролиза. Тирозинът се определя в хидролизати нанеокислени проби. Всички останали аминокиселини, изброени в абзац 1, могат да бъдат определени в окисленапроба или в неокислена проба.

Окисляването се извършва при 0°C със смес на пероксимравчена киселина и фенол. Излишъкът отокислителния реактив се разлага с натриев сулфид. Окислената или неокислена проба се хидролизира със солнакиселина (с = 6 mol/l) в продължение на 23 часа. Хидролизатът се коригира до рН 2,20. Аминокиселините се отделятчрез йоннообменна хроматография и се определят чрез реакция с нинхидрин, като се използва фотометричнадетекция при 570 nm (440 nm за пролина).

3. РеактивиИзползва се бидестилирана вода или вода с еквивалентно качество (проводимост < 10 µS).3.1. водороден прекис, 30 % (m/m);3.2. мравчена киселина, 98 - 100 % (m/m);3.3. фенол;3.4. натриев дисулфид;3.5. натриев хидроокис;3.6. дихидрат на 5-сулфосалицилова киселина;3.7. солна киселина, плътност 1,18 g/ml;3.8. 3-натриев цитратен дихидрат;3.9. 2,2'-тиодиетанол (тиодигликол);3.10. натриев хлорид;3.11. нинхидрин;3.12. петролеев етер, обхват на кипене 40 - 60°C;3.13. норлеуцин или други съединения, които могат да се използват като вътрешни еталони;3.14. газообразен азот (< 10 ppm кислород);3.15. 1-октанол;3.16. аминокиселини:3.16.1. Еталонни субстанции. Чисти съединения, несъдържащи вода от кристализация. Изсушава се под

вакуум над Р2O5 или H2SO4 една седмица преди употреба;3.16.2. Цистеинова киселина;3.16.3. метионин сулфон.3.17. Разтвор на натриев хидроокис, с = 7,5 mol/l:

Разтварят се 300 g NaOH (3.5) във вода и се долива до 1 l.3.18. Разтвор на натриев хидроксид, с = 1 mol/l:Разтварят се 40 g NaOH (3.5) във вода и се долива до 1 l.3.19. Разтвор на мравчена киселина-фенол:Смесват се 889 g мравчена киселина (3.2) с 111 g вода и се добавят 4,73 g фенол (3.3).3.20. Хидролизна смес, с = 6 mol НСl / l, съдържаща 1 g фенол/l:Добавя се 1 g фенол (3.3) към 492 ml HCl (3.7) и се допълва до 1 l с вода.3.21. Екстракционна смес с 0,1 mol HCl / l, съдържаща 2 % тиодигликол:Вземат се 8,2 mg HCl (3.7), разреждат се с приблизително 900 ml вода, добавят се 20 ml тиодигликол (3.9) и

се долива до 1 l с вода (не се смесват 3.7 и 3.9 пряко).3.22. 5-сулфосалицилова киселина, с = 6 %:Разтварят се 60 g 5-сулфосалицилова киселина (3.6) във вода и се долива до 1 l с вода.3.23. Окислителна смес (пероксимравчена киселина-фенол):Смесват се 0,5 ml водороден прекис (3.1) с 4,5 ml разтвор на мравчена киселина-фенол (3.19) в малка

бехерова чаша. Инкубира се (термостатира се) при 20 - 30°C в продължение на 1 h, за да се образувапероксимравчена киселина, след това се охлажда в ледена баня (15 min) преди добавянето към пробата.

Внимание! Да се избягва контакт с кожата и да се носи защитно облекло.3.24. Цитратен буфер, с = 0,2 mol Na+/l, рН 2,20:Разтварят се 19,61 g натриев цитрат (3.8), 5 ml тиодигликол (3.9), 1 g фенол (3.3) и 16,50 ml HCl (3.7) в

приблизително 800 ml вода. Коригира се рН на 2,20. Долива се до 1 l с вода.3.25. Отмиващи буфери, приготвени съгласно условията на използвания анализатор (4.9).3.26. Нинхидрин реагент, приготвени съгласно условията на използвания анализатор (4.9).3.27. Еталонни разтвори на аминокиселини. Тези разтвори се съхраняват при температури под 5°C.3.27.1. Изходен еталонен разтвор на аминокиселини (3.16.1) - с = 2,5 µmol/ml за всяка в солна киселина.3.27.2. Изходен еталонен разтвор на цистеинова киселина и метионин сулфон - с = 1,25 µmol/ml.Разтварят се 0,2115 g цистеинова киселина (3.16.2) и 0,2265 g метионин сулфон (3.16.3) в цитратен буфер

(3.24) в мерителна обемна колба 1 l и се допълва до отметката с цитратен буфер. Съхранява се под 5°C не по-дългоот 12 месеца. Този разтвор не се използва, ако стандартният изходен разтвор (3.27.1) съдържа цистеинова киселина иметионин сулфон.

3.27.3. Изходен еталонен разтвор на вътрешен еталон, например норлеуцин - с = 20 µmol/ml.Разтварят се 0,6560 g норлеуцин (3.13) в цитратен буфер (3.24) в мерителна обемна колба и се доливат до

250 ml с цитратен буфер. Съхранява се под 5°C не по-дълго от 6 месеца.3.27.4. Калибриращ разтвор на еталонни аминокиселини за използване с хидролизати - с = 5 nmol/50 µl на

цистеинова киселина и метионин сулфон и с = 10 nmol/50 µl на другите аминокиселини.Разтварят се 2,2 g натриев хлорид (3.10) в бехерова чаша 100 ml с 30 ml буферен цитратен разтвор (3.24).

Добавят се 4,00 ml изходен еталонен разтвор на аминокиселини (3.27.1), 4,00 ml изходен еталонен разтвор нацистеинова киселина и метионин сулфон (3.27.2) и ако се използва, 0,50 ml изходен еталонен разтвор с вътрешенстандарт (3.27.3). Коригира се рН до 2,20 с натриев хидроокис (3.18).

Количествено се прехвърля в мерителна обемна колба 50 ml и се долива до отметката с цитратен буфер(3.24) и се смесва.

Съхранява се при температура под 5°C не по-дълго от 3 месеца.Виж също наблюдения 9.1.3.27.5. Калибриран разтвор на еталонни аминокиселини за използване с хидролизати, приготвени съгласно

5.3.3.1 и за използване с екстракти (5.2). Калибрираният разтвор се приготвя съгласно 3.27.4, като се пропусканатриевият хлорид.

Съхранява се при температура под 5°C не по-дълго от 3 месеца.4. Апаратура4.1. Колба с кръгло дъно 100 или 250 ml с обратен хладник.4.2. Флакон от боросиликатно стъкло 100 ml с винтова тапа с гумен/тефлонов уплътнител (напр. Duran,

Schott) за използване в пещ.4.3. Пещ с изкуствена вентилация и регулатор на температурата с точност над ± 2°C.4.4. рН-метър (с градуиране на три знака след десетичната запетая).4.5. Мембранен филтър (диаметър на отворите 0,2 µm).

4.6. Центрофуга.4.7. Ротационен вакуумен изпарител.4.8. Механичен вибратор или магнитна бъркалка.4.9. Анализатор на аминокиселини или HPLC оборудване за HPLC с йоннообменна колона, уред за

нинхидрин, дериватизация след колоната и фотометричен детектор. Колоната се пълни със сулфоновиполистиролови смоли, които могат да разделят аминокиселини една от друга, и от други материали, реагиращиположително на нинхидрина. Потокът в линиите на буферния разтвор и нинхидрина се осигурява от помпи съсстабилност на дебита приблизително 0,5 % в периода, който обхваща еталонното калибриране и анализа на пробата.При някои анализатори на аминокиселини могат да се използват хидролизни методи, при които хидролизатът е сконцентрация на натрий с= 0,8 mol/l и съдържа цялата остатъчна мравчена киселина от етапа на окисляването. Другине дават задоволителна сепарация на някои аминокиселини, ако хидролизатът съдържа в излишък мравченакиселина и / или високи концентрации на натриеви йони. В този случай обемът на киселината се намалява чрезизпаряване до приблизително 5 ml след хидролизата и преди коригирането на рН. Изпаряването трябва да сеизвърши под вакуум при максимум 40°C.

5. Процедура5.1. Приготвяне на пробатаПробата се смила, за да се постигне гранулометрия 0,5 mm. Пробите с голямо съдържание на влага трябва

да се изсушат с въздух при температура, която не превишава 50°C, или чрез лиофилизация преди смилане. Пробите свисоко съдържание на мазнини трябва да бъдат извлечени с петролев етер (3.12) преди стриването.

5.2. Определяне на свободните аминокиселини в животински храни и предварително приготвени смесиПретеглят се с точност до 0,2 mg подходящо количество (1 - 5 g) от приготвената проба (5.1) в

ерленмайерова колба и се прибавят 100 ml от извлечената смес (3.21). Сместа се разтръсква в продължение на 60 minс помощта на механичен вибратор или магнитна бъркалка (4.8). Седиментът се оставя да се утаява и се пипетира 10ml от плаващия отгоре слой на разтвора в бехерова чаша от 100 ml.

Добавят се 5 ml разтвор на сулфосалицилова киселина (3.22) с бъркане, като се продължава бъркането спомощта на магнитна бъркалка в продължение на 5 min. Филтрира се и се центрофугира плаващият отгоре слой, зада се отстранят всички твърди фази. Поставят се 10 ml от получения разтвор в бехерова чаша 100 ml и рН секоригира на 2,20, като се използва разтвор на натриев хидроксид (3.18), прехвърля се в мерителна обемна колба сподходящ обем, като се използва цитратен буфер (3.24) и се долива до отметката с буферен разтвор (3.24).

Ако се използва вътрешен еталон, се добавят 1 ml вътрешен еталон (2.27.3) за всеки 100 ml краен разтвор исе долива до отметката с буферен разтвор (3.24).

Преминава се към етапа на хроматографията съгласно 5.4.Ако екстрактите не се изпитват същия ден, те трябва да се съхраняват при температури под 5°C.5.3. Определяне на общото съдържание на аминокиселини5.3.1. ОкисляванеПретеглят се с точност 0,2 mg от 0,1 до 1 g от приготвената проба (5.1) във:- облодънна колба 100 ml (4.1) за хидролиза на открито (5.3.23), или- облодънна колба 250 ml (4.1), ако се изисква ниска концентрация на натрий (5.3.3.1), или- флакон 100 ml, снабден с винтова капачка (4.2) (за затворена хидролиза 5.3.2.4).Претеглената част от пробата трябва да има съдържание на натрий около 10 mg и съдържание на влага,

което не превишава 100 mg.Колбата/флаконът се поставя в ледена водна вана и се охлажда до 0°C, добавят се 5 ml окисляваща смес

(3.23) и се смесват, като се използва стъклена шпатула с извит накрайник. Колбата / флаконът се запечатват сшпатулата вътре с непропускащ въздух тънък слой, поставя се ледената водна вана, в която се намира запечатаниятконтейнер, в хладилник при 0°C и се оставя в продължение на 16 h. След 16 h се маха от хладилника и излишниятокисляващ реагент се разлага с добавяне на 0,84 g натриев дисулфит (3.4).

Преминава се към 5.3.2.1.5.3.2. Хидролиза5.3.2.1. Хидролиза на окислени пробиКъм окислените проби, приготвени съгласно 5.3.1, се прибавят 25 ml хидролизна смес (3.20), като

внимателно се измиват всички утайки на пробата, прилепнали по стените на съда и шпатулата. В зависимост отпроцедурата на хидролизата, която се използва, се преминава към 5.3.2.3 или 5.3.2.4 съответно.

5.3.2.3. Хидролиза на неокислена пробаВ облодънна колба се претеглят 100 ml или 250 ml (4.1) или флакон 100 ml, снабден с винтова капачка

(4.2), с точност 0,2 mg, от 0,1 до 1 g от приготвената проба (5.1). Частта на претеглената проба трябва да съдържанатрий около 10 mg. Внимателно се добавят 25 ml хидролизна смес (3.20) и се смесва с пробата. По-нататък сепродължава съгласно 5.3.2.3 или 5.3.2.4.

5.3.2.3. Открита хидролизаДобавят се 3 стъклени перли към сместа в колбата (приготвена в съответствие с 5.3.2.1 или 5.3.2.2) и се

вари при непрекъснато кипене с нагряване с обратен хладник в продължение на 23 h. След завършване нахидролизата кондензаторът се отмива с 5 ml цитратен буфер (3.24). Колбата се откачва и се охлажда в ледена вана.Продължава се съгласно 5.3.3.

5.3.2.4. Закрита хидролизаФлаконът, съдържащ сместа, приготвена в съответствие с 5.3.2.1 или 5.3.2.2 в пещ (4.3), се поставя при

110°C. По време на първия час, за да се предотврати повишаването на налягането (поради отделяне на газообразнисубстанции) и да се избегне експлозия, се поставя винтовата капачка над върха на съда. Съдът не се затваря скапачката. След един час съдът се запушва с капачката и се оставя в пещта (4.3) в продължение на 23 h. Следприключване на хидролизата флаконът се маха от пещта, внимателно се отвива капачката на флакона, който сепоставя в ледена водна вана. Оставя се да се охлади.

В зависимост от процедурата за коригиране на рН (5.3.3) количествено съдържанието на флакона сепрехвърля в бехерова чаша от 250 ml или облодънна колба от 250 ml, като се използва цитратен буфер (5.24).

Продължава се съгласно 5.3.3.5.3.3. Коригиране на рНВ зависимост от натриевия толеранс на анализатора на аминокиселини (4.9) продължава се съгласно 5.3.3.1

или 5.3.3.2, за да се коригира рН.5.3.3.1. За хроматографски системи (4.9), изискващи ниска концентрация на натрий:Препоръчително е да се използва вътрешен изходен еталонен разтвор (3.27.3), когато се използват

анализатори на аминокиселини, изискващи ниско съдържание на натрий (когато трябва да се намали обемът накиселината).

В този случай се прибавят 2 ml вътрешен изходен еталонен разтвор (3.27.3) към хидролизата предиизпаряването.

Прибавят се 2 капки 1-октанол (3.15) към хидролизата, получен съгласно 5.3.2.3 или 5.3.2.4.Като се използва ротационен изпарител (4.7), намалява се обемът до 5 - 10 ml под вакуум при 40°C. Ако

случайно обемът спадне под 5 ml, хидролизатът трябва да се изхвърли и анализът да се започне отново.Коригира се рН на 2,20 с разтвор на натриев хидроокис (3.18) и се преминава към 5.3.4.5.3.3.2. За всички други анализатори на аминокиселини (4.9)Хидролизатите се вземат, получени съгласно 5.3.2.3 или 5.3.2.4, и се неутрализират частично, като

внимателно се добавят при непрекъснато разбъркване на 17 ml разтвор на натриев хидроокис (3.17), като сеосигурява температурата да се поддържа под 40°C. рН се коригира на 2,20 при стайна температура, като се използваразтвор на натриев хидроокис (3.17) и накрая разтвор на натриев хидроокис (3.18) и се преминава към 5.3.4.

5.3.4. Разтвор на пробата за хроматографияКоличествено се прехвърля хидролизатът с коригирана рН (5.3.3.1 или 5.3.3.2) с цитратен буфер (3.24) в

мерителна обемна колба 200 ml и се долива до отметката с буфера (3.24).Ако вътрешният еталон още не е бил използван, се прибавят 2 ml от вътрешния еталон (3.27.3) и се долива

до отметката цитратен буфер (3.24). Разбърква се старателно.Преминава се към етап хроматография (5.4).Ако разтворите на пробите не се изследват същия ден, те се съхраняват при температура под 5°C.5.4. ХроматографияПреди хроматографията екстрактът (5.2) или хидролизата (5.3.4) се привежда до стайна температура.

Сместа се разбърква и подходяща част от нея се филтрира през мембранен филтър 0,2 mm (4.5). Полученият бистърразтвор се подлага на йоннообменна хроматография, като се използва анализатор на аминокиселини (4.9).

Инжектирането може да се извърши ръчно или автоматично. Важно е едно и също количество разтвор (±0,5 %) да се добавя в колоната за анализ на еталоните и пробите, освен когато се използва вътрешен еталон, и когатоотношенията натрий / аминокиселина в разтворите на еталоните и пробите са практически подобни.

По принцип честотата на калибриране зависи от стабилността на нинхидриновия реактив и системата заанализ. Еталонът или пробата се разреждат с цитратен буфер (3.24), за да се получи пикова повърхност на еталона от30 - 200 % от пиковата площ на пробата аминокиселина.

Хроматографията на аминокиселините варира в малки граници според вида на използвания анализатор наизползваната смола. Избраната система трябва да може да разделя аминокиселините една от друга и от веществата,реагиращи положително на нинхидрина. В обхвата на работа хроматографската система трябва да даде линейнареакция на промените в количествата аминокиселини, прибавени в колоната.

По време на хроматографията, когато се анализира еквимоларен разтвор (на аминокиселините, които сеопределят), се прилагат съотношения между основата и върха на пиковете, описани по-долу. Този еквимоларенразтвор трябва да съдържа най-малко 30 % от максималното съдържание на всяка аминокиселина, което може дабъде точно измерено с анализатора на аминокиселини (4.9).

При отделянето на треонин-серин съотношение между основата и върха на пиковете на двете застъпващисе аминокиселини на хроматограмата не трябва да превишава 2:10 (ако се определят само цистеин, метионин,треонин и лизин, недостатъчната сепарация на съседни пикове ще има неблагоприятен ефект върху определянето).За всички останали аминокиселини сепарацията трябва да бъде по-добра от 1:10.

Системата трябва да осигурява отделянето на лизина от "структурите на лизина" и на орнитина.6. Изчисляване на резултатитеПлощта на пиковете на пробата и еталона се измерва за всяка отделна аминокиселина и се изчислява

количеството в g аминокиселина на kg проба.

A.E.MW.F

= g

B.W.1000

аминокиселина на kg мостра.

Ако се използва вътрешен еталон, се умножава с D/C.А е пиковата площ, хидролизат или екстракт;В - пиковата площ, калибриращ еталонен разтвор;С - пиковата площ, вътрешен еталон хидролизат или екстракт;D - пиковата площ, вътрешен еталон, калибриращ еталонен разтвор;

MW - молекулното тегло на определяната аминокиселина;Е - концентрацията на еталона в µmol/ml;W - теглото на пробата g (коригирано до оригиналното тегло, ако е сушено или са отстранени мазнините);F е ml общото съдържание на хидролизат (5.3.4) или ml изчислен общ обем на разтваряне на екстракта

(6.1).Цистинът и цистеинът се определят като цистеинова киселина в хидролизатите на окислената проба, но се

изчисляват като цистин (C6H12N2O4S2 молекулно тегло 240,30 чрез използване молекулно тегло 120,15 (= 0,5 x240,30).

Метионинът се определя като метионин сулфон в хидролизати на окислени проби, но се изчислява катометионин, като се използва молекулното тегло на метионина 149,21.

Добавеният свободен метионин се определя след извличането като метионин, като за изчислението сеизползва същото молекулно тегло.

6.3. Общият разтворен обем екстракти (F) за определянето на свободни аминокиселини (5.2) се изчислява,както следва:

(10 ml + 5 ml) V ml

F = 100 ml . + ,

10 ml 10 ml

където V е обемът на крайния екстракт.

7. Оценка на методаМетодът е тестван чрез сравняване на резултатите на международно ниво през 1990 г., като са използвани

четири различни животински храни (смесена храна за прасета, компаунд за бройлери, белтъчен концентрат,предварително приготвени смеси). Резултатите, след елиминиране на стойностите, рязко отличаващи се отнормалните, на средноаритметичното и стандартното отклонение са дадени в таблицата:

Средни аритметични стойности в g/kg

Аминокиселина

Референтен материал Треонин Цистеин Метионин Лизин

Смесена храна за свине 6,94 3,01 3,27 9,55n = 15 n = 17 n = 17 n = 13

Компаунд за бройлери 9,31 3,92 5,08 13,93n = 16 n = 18 n = 18 n = 16

Белтъчен концентрат 22,32 5,06 12,01 47,74n = 16 n = 17 n = 17 n = 15

Предварително 59,42 - 90,21 98,03приготвена смеска n = 16 n = 16 n = 16

n = брой участващи лаборатории.

7.1. ПовторяемостПовторяемостта, изразена като "вътрешно лабораторно стандартно отклонение" на посоченото сравнение

между различни лаборатории, е дадена в следните таблици:

Вътрешно лабораторно стандартно отклонение (St) в g/kg








Коефициент на вариация ( %) за вътрешно лабораторно стандартно отклонение (St)








7.2. ВъзпроизводимостРезултатите за стандартните отклонения между лаборатории за посоченото сравнение са дадени в

таблицата:Стандартно отклонение между лабораториите (St) в g/kg








Коефициент на вариация ( %) за стандартно отклонение между лабораториите (St)





Белтъчен концентрат 3,8 12,3 13,0 3,0

n = 16 n = 17 n = 17 n = 15



8. Използване на референтните материалиПравилното прилагане на метода се проверява чрез извършване на повтарящи измервания на

сертифицирани референтни материали, когато има такива на разположение. Препоръчва се калибриране съссертифицирани калибрирани разтвори на аминокиселини.

9. Забележки9.1. Поради различия между анализаторите на аминокиселини крайните концентрации на калибрираните

разтвори на еталонни аминокиселини (вж. 3.27.4 и 3.27.5) и на хидролизатите (вж. 5.3.4) трябва да се вземат катонасока.

Обхватът на линейна реакция на апарата трябва да се провери за всички аминокиселини.Еталонният разтвор се разрежда с цитратен буфер, за да даде пикова площ в средата на обхвата.9.2. Когато за анализ на хидролизатите се използва висококачествено течно хроматографско оборудване,

експерименталните условия трябва да се оптимизират в съответствие с препоръките на производителя.9.3. При прилагането на метода за животински храни, които съдържат повече от 1 % хлорид (концентрат,

минерални храни, допълнителни храни), може да се случи подценяване на метионина и трябва да се извършиспециална обработка.

ХХ. Определяне на олахиндокс

(2-[N-2'-(хидроксиетил(карбамоил]-3-метилхиноксалин-N1qN4-диоксид)1. Цел и обхватТова е метод за определяне на олахиндокс в животински храни. Долната граница на определяне е 5 mg/kg.2. ПринципПробата се извлича със смес вода-метанол. Съдържанието на олахиндокс се определя с висококачествен

течен хроматограф обратна фаза (HPLC), като се използва УВ детектор.3. Реактиви:3.1. метанол;3.2. метанол с качество HPLC;3.3. вода с качество HPLC;3.4. мобилна фаза за HPLC;смес вода (3.3) - метанол (3.2), 900 + 100 (V+V).3.5. Еталонна субстанция: чист олахиндокс(2-[N-2'-(хидроксиетил(карбамоил]-3-метилхиноксалин-N1qN4-диоксид), E 851;3.5.1. изходен еталонен разтвор на олахиндокс, 250 mg/ml.Претеглят се 50 mg олахиндокс (3.5) с точност 0,1 mg в мерителна обемна колба 200 ml и се прибавят

около 190 ml вода. След това колбата се поставя за 20 min в ултразвукова вана (4.1). След ултразвуковата обработкаразтворът се довежда до стайна температура, съдържанието се допълва до отметката с вода и се разбърква. Колбатасе обвива с алуминиево фолио и се съхранява в хладилник. Всеки месец разтворите се заменят със свежи.

3.5.2. Междинен еталонен разтвор на олахиндокс, 25 µg/ml10 ml от изходния еталонен разтвор (3.5.1) се прехвърлят в мерителна обемна колба 100 ml, допълват се до

отметката с мобилна фаза (3.4) и се разбъркват. Колбата се обвива с алуминиево фолио и се съхранява в хладилник.Този разтвор се приготвя всеки ден.

3.5.3. Калибриращи разтвори:В няколко градуирани колби 50 ml се прехвърлят 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 15,0 и 20,0 ml междинен еталонен

разтвор (3.5.2). Допълват се до отметката с мобилна фаза (3.4) и се размесват. Колбите се обвиват с алуминиевофолио. Тези разтвори отговарят съответно на 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 7,5 и 10,0 µg олахиндокс на ml. Разтворите трябва дасе приготвят всеки ден.

4. Апаратура:4.1. ултразвукова вана;4.2. механична бъркалка;4.3. оборудване HPLC с УВ детектор с променлива дължина на вълната или диоден детектор;4.3.1. хроматографска колона 250 mm x 4 mm С18, частици 10 µmm или еквивалентна;4.4. мембранен филтър 0,45 µm.5. Процедура

Забележка. олахиндоксът e чувствителен към светлината. Всички операции се извършват при разсеянасветлина или се използват тъмнокафяви стъкленици.

5.1. Общи положения5.1.1. Трябва да се анализира празна проба храна, за да се провери отсъствието на олахиндокс и на

субстанции, които оказват влияние.5.1.2. Извършва се тест за възстановяване чрез анализиране на празна проба храна, към който е било

добавено количество олахиндокс, подобно на наличното в пробата. За да се получи концентрация 50 mg/kg, 10 ml отизходния еталонен разтвор (3.5.1) се прехвърлят в ерленмайерова колба от 250 ml и разтворът се концентрира чрезизпаряване до около 0,5 ml. Прибавят се 50 g от празната проба храна, разбърква се добре и оставя за 10 min, катоотново се разбърква няколко пъти, преди да се пристъпи към екстракцията (5.2).

Забележка. За целите на този метод празната проба храна трябва да бъде подобна на тази на пробата и внея не трябва да се открива олахиндокс.

5.2. ЕкстракцияС точност до 0,01 g се претеглят около 50 g от пробата. Прехвърлят се в ерленмайерова колба от 1000 ml,

прибавят се 100 ml метанол (3.1) и колбата се поставя за 5 min в ултразвукова вана (4.1). Прибавят се 410 ml вода исе оставя да престои в ултразвуковата вана още 15 min. Колбата се изважда от ултразвуковата вана, разбърква се сбъркалката в продължение на 30 min и се филтрира през нагънат филтър. 10 ml от филтрата се прехвърлят вмерителна обемна колба от 20 ml, допълва се с вода до отметката и се разбърква. Аликвотната част се филтрира презмембранен филтър (4.4) (вж. т. 9 наблюдение). Продължава се с определяне с помощта на HPLC (5.3).

5.3. Определяне с HPLC5.3.1. Параметри:

Аналитична колона (4.3.1)

Мобилна фаза (3.4) смес вода (3.3) - метанол(3.2), 900 + 100 (V+V)

Дебит 1,5 - 2 ml/min

Дължина на вълна 380 nmна откриване

Инжекционен обем 20 µl - 100 µl

Проверява се стабилността на хроматографската система, като се инжектира няколко пъти калибриращиятразтвор (3.5.3), съдържащ 2,5 µg/ml, докато се постигнат постоянни височини на пиковете и време на забавяне.

5.3.2. Калибрираща графикаИнжектира се няколко пъти калибриращ разтвор (3.5.3) и се определят средноаритметичните височини

(площи) на пиковете за всяка концентрация. Начертава се калибриращата графика, като се използватсредноаритметичните височини (площ) на пиковете на калибриращите разтвори за ординати и съответнитеконцентрации в µg/ml за абсциси.

5.3.3. Разтвор на пробатаИнжектира се екстракт от пробата (5.2) няколко пъти, като се използва същият обем като приетия за

калибриращите разтвори и се определят средноаритметичните височини (площи) на пиковете на олахиндокс.6. Изчисляване на резултатитеОт средноаритметичните височини (площи) на пиковете на олахиндокс на разтвора се определя

концентрацията на разтвора на пробата в µg/ml чрез сравняване с калибриращата графика (5.3.2). Съдържанието наолахиндокс в пробата се определя със следната формула:

c.1000

w = ,

m

в която:w е съдържанието в mg/kg;с - концентрацията на олахиндокс в екстракта на пробата (5.2) в µg/ml;m - масата на изпитваната част в g (5.2).7. Установяване на достоверността на резултатите7.1. ИдентичностИдентичността на аналита може да се потвърди чрез ко-хроматография или използване на диоден полеви

детектор, чрез които се сравняват спектрите на екстракта на пробата (5.2) и на калибриращия разтвор, съдържащ 5,0µg/ml.

Само височината на пика на олахиндокс трябва да се увеличи, след като се вземат предвид кактодобавеното количество, така и разреждането на екстракта. Широчината на пика по средата на неговата височинатрябва да бъде в рамките на ± 10 % от оригиналната широчина на пика на олахиндокс на неподсилен екстракт наразтвора.

Диодна полева детекцияРезултатите се оценяват съгласно следните критерии:(а) дължината на вълната на максимална оптична плътност на пробата и на еталонните спектри, записани

при връхната точка на пика на хроматограмата, трябва да бъдат в рамките на допустимата граница, определена отразрешаващата способност на системата за детекция. За диодната детекция тя типично е в рамките на ± 2 nm.

(б) между 220 и 400 nm спектрите на пробата и на еталона, регистрирани във връхната точка на пика нахроматограмата, не трябва да се различават за частите на спектъра, разположени между 10 и 100 % от относителнатаоптична плътност; този критерий е изпълнен, когато са налице едни и същи максимални стойности и когато никъденаблюдаваното отклонение между спектрите не превишава 15 % от оптичната плътност на спектъра на еталоннияаналит;

(в) между 220 и 400 nm спектрите на възходящия наклон, връхната точка и низходящия наклон на пика,произведени от екстракта на пробата, не трябва да се различават един от друг за частите на спектъра, разположенимежду 10 и 100 % на относителна оптична плътност; този критерий е изпълнен, когато са налице едни и същимаксимални стойности и когато във всички наблюдавани точки отклонението между спектрите не превишава 15 %от оптичната плътност на спектъра във връхната точка на пика.

Ако един от тези критерии не е удовлетворен, наличието на аналит не се потвърждава.7.2. ПовторяемостРазликата между резултатите на две паралелни определения, извършени върху една и съща мостра, не

трябва да превишава 15 % от най-високия резултат за съдържание на олахиндокс между 10 и 200 mg/kg.7.3. ВъзстановяванеЗа една подсилена празна проба възстановяването трябва да бъде най-малко 90 %.8. Резултати от съвместното изследванеПри провеждане на съвместно изследване, при което 4 мостри на храни за прасенца, включително една

празна проба, са анализирани в 13 лаборатории, се получават резултатите, дадени в таблицата:

Мостра 1 Мостра 2 Мостра 3 Мостра 4

L 13 10 11 11

n 40 40 44 44

Средноаритметична - 14,6 48,0 95,4стойност (mg/kg)

St (mg/kg) - 0,82 2,05 6,36

SR (mg/kg) - 1,62 4,28 8,42

CVt ( %) - 5,6 4,3 6,7

CVR ( %) - 11,1 8,9 8,8

Номинално съдържание - 15 50 100(mg/kg)

Възстановяване ( %) 97,3 96,0 95,4

L - брой на лабораториите;n - брой на индивидуалните стойности;SR - стандартно отклонение на възпроизводимост;St - стандартно отклонение на повторяемостта;CVt - коефициент на вариации на възпроизводимост;CVR - коефициент на вариации на повторяемост.9. ЗабележкаВъпреки че методът не е утвърден за храни, съдържащи повече от 100 mg/kg олахиндокс, могат да бъдат

получени задоволителни резултати, като се използва по-малка проба за анализ и/или като се разреди екстрактът(5.2), така че да се постигне концентрация в рамките на калибриращата графика (5.3.2).

ХХI. Методи за определяне на нишесте

ПОЛАРИМЕТРИЧЕН МЕТОД1. Цел и обхватЧрез този метод може да се определи нивото на нишестето и високомолекулните продукти от неговото

разграждане в продуктите за изхранване на животни, с изключение на онези от тях, които съдържат цвекловирезанки, цвеклова пулпа, изсушена горна част на цвеклото и листата, картофена пулпа, сушени дрожди, продукти,богати на инулин (например резенки и брашно от земна ябълка).

2. ПринципМетодът включва две определяния. В първото пробата се обработва докато е гореща с разредена солна

киселина. След избистряне и филтруване се определя въртенето на поляризираната светлина от разтвора чрезполяриметрия.

Във второто пробата се екстрахира с 40 % етанол. След подкисляване със солна киселина, избистряне ифилтруване въртенето на поляризираната светлина се измерва както в първoто определяне.

Разликата между двете измервания, умножено по известен коефициент, дава количеството на нишестето впробата.

3. Реактиви:3.1. 25 % (о/о) солна киселина, плътност 1,126;3.2. 1,128 % (т/о) солна киселина.Концентрацията трябва да бъде проверена чрез титруване с 0,1 N разтвор на натриева основа в присъствие

на 0,1 % (т/о) метилрот в 94 %-ен (о/о) етанол. 10 ml солна киселина са еквивалентни на 30,94 ml 0,1 N натриеваоснова.

3.3. Разтвор I на Carrez - разтварят се 21,9 g цинков ацетат Zn(CH3COO) 2.2H2O и 3 g ледена оцетнакиселина във вода. Долива се до 100 ml с вода.

3.4. Разтвор II на Carrez - разтварят се 10,6 g калиев фероцианид K4(Fe(CN) 6).3H2O във вода. Долива се до100 ml с вода.

3.5. 40 % (о/о) етанол, плътност: 0,948 при 20°C.4. Апаратура:4.1. ерленмайерова колба от 250 ml със стандартна шлифова запушалка и с обратен хладник;4.2. поляриметър или захарометър.5. Процедура5.1. Подготовка на пробатаПробата се раздробява докато стане достатъчно дребна, за да премине през сито с кръгли отвори 0,5 mm.5.2. Определяне на общото въртене на поляризираната светлина (P или S) (виж наблюдение 7.1).Претеглят се 2.5 g от раздробената проба с точност до милиграм и се поставят в мерителна колба от 100 ml.

Прибавят се 25 ml солна киселина (3.2), разклаща се до получаване на хомогенно разпределение на изследванатапроба и се прибавят още 25 ml солна киселина (3.2). Колбата се поставя в кипяща водна баня при енергично ипостоянно разклащане през първите 3 min, за да се предотврати образуването на агломерати. Количеството на водатавъв водната баня трябва да бъде достатъчно, така че тя да не престане да кипи при потапяне на колбата в нея.Колбата не трябва да се изважда от водната баня при разклащането. След точно 15 min колбата се изважда отводната баня, добавят се 30 ml студена вода и се охлажда незабавно до 20°C.

Добавят се 5 ml разтвор I на Carrez (3.3) и се разклаща в продължение на една минута. След това се добавят5 ml разтвор II на Carrez (3.4) и се разклаща отново в продължение на 1 min. Обемът се допълва с вода, хомогенизирасе и се филтрува. Ако филтратът не е съвършено прозрачен (което е рядкост), определянето се повтаря, като сеизползват по-големи количества от разтворите I и II на Carrez, например 10 ml.

С поляриметър или захарометър се измерва въртенето на поляризираната светлина на разтвора в кювета сдължина 200 mm.

5.3. Определяне въртенето на поляризираната светлина (P' или S') на субстанции, разтворими в 40 %-енетанол.

Претеглят се 5 g от пробата с точност до 1 mg, пренасят се в мерителна колба от 100 ml и се добавят около80 ml етанол (3.5) (виж наблюдение 7.2). Колбата се оставя за един час при стайна температура, като през това времешесткратно се разклаща енергично, така че пробата напълно да се смеси с етанола. Обемът се допълва с етанол (3.5),хомогенизира се и се филтрува.

50 ml от филтрата (равняващи се на 2,5 g от пробата) се пипетират в ерленмайерова колба от 250 ml,добавят се 2,1 ml солна киселина (3.1) и се разклаща енергично. Обратният хладник се прикрепва къмерленмайеровата колба и тя се потапя в кипяща водна баня. Точно след 15 min ерленмайеровата колба се изважда отводната баня, съдържанието й се прехвърля в мерителна колба от 100 ml, като се изплаква с малки количествастудена вода и се охлажда до 20°C.

Пробата се избистря с разтворите I (3.3) и II (3.4) на Carrez, обемът се допълва с вода, хомогенизира се,филтрува се и се измерва въртенето на поляризираната светлина, както е указано във втория и третия абзац на т. 5.2.

6. Пресмятане на резултатитеСъдържанието на нишесте в проценти се изчислява по следната формула:6.1. Съдържание, определено с поляриметър:

където:Р е общата оптична ротация в градуси;РI - общата оптична ротация в градуси на разтвор от 40 % етанол ;

- специфичната оптична ротация на чисто нишесте; общоприетите стойности са:

+ 185,9° - оризово нишесте,+ 195,4° - картофено нишесте,+ 184,6° - царевично нишесте,+ 182,7° - пшенично нишесте,+ 181,5° - ечемичено нишесте,+ 181,3° - овесено нишесте,+ 184,0° - други типове нишесте и други смеси, съдържащи нишесте в комбинираните фуражи.6.2. Съдържание, определено със захариметър:

където:S е общата оптична ротация в захарни градуси;SI - общата оптична ротация в захарни градуси на разтвор от 40 % етанол;N - теглото на захарозата в g в 100 ml вода, даващо оптична ротация от 100 захарометрични градуса в 200

mm тръба. Теглото варира в съответствие от използването на различни видове захарометри:16,29 g - за френски захарометри;26,00 g - за немски захарометри;20,00 g - за други захарометри;

- специфичната оптична ротация на чисто нишесте (виж 6.1).6.3. ПовторяемостРазликата между резултатите от две паралелни определяния, отнасяща се за една и съща проба, не трябва

да надвишава 0,4, измерено в абсолютна стойност при съдържание на нишесте под 40 % и 1 % относителна стойностза съдържащи нишесте над 40 %.

7. Наблюдения7.1. Ако пробата съдържа повече от 6 % карбонати, пресметнати като калциев карбонат, преди определяне

на общото въртене на поляризираната светлина те трябва да бъдат разградени чрез обработка с точно определеноколичество сярна киселина.

7.2. В случай на продукти с високо съдържание на лактоза, такива като пулверизирана сушена суроваткаили обезмаслено мляко на прах, след прибавянето на 80 ml етанол (3.5) се процедира, както следва: прикрепва сеобратният хладник към колбата и тя се потапя във водна баня при 50°C за 30 min. Оставя се да изстине и анализътпродължава, както е указано в 5.3.

ХХII. Определяне на общото количество суров белтък

1. Цел и обхват - методът дава възможност да се определи общото количество суров белтък в хранителнитевещества на базата на азотно съдържание, определяно по метода на Kjeldahl.

2. Принцип - пробата се изварява със сярна киселина в присъствие на катализатор. Серният раpтвор сеалкализира с разтвор на натриев хидроксид. Амонякът се дестилира и събира в мерно количество сярна киселина,излишъкът от която се титрува със стандартен разтвор на натриев хидроксид.

3. Реагенти:3.1. калиев сулфат;3.2. катализатор - меден оксид (II) или меден сулфат пентахидрат, CuSO4.5Н2О;3.3. гранулиран цинк;3.4. сярна киселина, r20 = 1,84 g/ml;3.5. сярна киселина (H2SO4) = 0,5 mol/l;3.6. сярна киселина (H2SO4) = 0,1 mol/l;3.7. метил червен индикатор - разтваря се 300 mg червен метил в 100 ml етанол, s = 95 - 96 % (v/v);3.8. разтвор на натриев хидроксид (трябва да се използва техническо качество) V = 40 g / 100 ml (т/V:40 %);3.9. разтвор на натриев хидроксид с = 0,25 ml/l;3.10. разтвор на натриев хидроксид с=0,1 mol/l;

3.11. гранулиран камък пемза, измит в солна киселина и запален;3.12. ацетанилид (т.р.=114°C, N=10,36 %);3.13. захароза (без азот).4. Апарат - подходящ за кипене, дeстилация и титрация, по процедурата на Кйелдал.5. Процедура5.1. Кипене - отмерва се 1 g от пробата с точност 0,001 g и пробата се прехвърля в колбата на апарата за

кипене. Прибавят се 15 g натриев сулфат (3.1), подходящо количество катализатор (3.2) (от 0,3 до 0,4 g меден оксид(II) или от 0,9 до 1,2 g меден сулфат пентахидрат (II), 25 ml сярна киселина (3,4) и няколко гранули пемзен камък(3.11) и се разбърква. Колбата се нагрява първоначално бавно, като от време на време се бърка, докато масата секарбонизира и изчезне пяната; след това се нагрява по-интензивно, докато течността изцяло закипи. Нагряването еподходящо, ако врящата киселина се кондензира по стените на колбата. Следва да се внимава стените да не прегреяти органични частички да не прилепват към тях. Когато разтворът се избистри и стане бледозелен, се продължава дасе вари още 2 h, след което се оставя, за да се охлади.

5.2. Дестилация - внимателно се добавя достатъчно вода, за да се осигури пълно разтваряне на сулфатите,охлажда се и след това се прибавят няколко гранули цинк (3.3). В събирателната колба на апарата за дестилация сепоставя точно измерено количество от 25 ml сярна киселина (3.5) или (3.6) в зависимост от предполагаемотосъдържание на азот. Добавят се няколко капки червен метилов индикатор (3.7). Колбата за кипене се свързва къмкондензатора на дестилационния апарат и краят на кондензатора се потапя в течността от събирателната колба надълбочина поне 1 cm (виж наблюдение 8.3). Бавно се изсипват 100 ml разтвор от натриев хидроксид (3.8) в колбатаза кипене, без загуба на амоняк (виж наблюдение 8.1). Колбата се нагрява, докато амонякът се дестилира.

5.3. Титрация - излишното количество сярна киселина в събирателната колба се титрира с разтвор отнатриев хидроксид (3.9) или (3.10) в зависимост от концентрацията на използваната сярна киселина, докато седостигне крайната точка.

5.4. Контролен тестВ потвърждение на това, че реагентите не съдържат азот, се извършва контролен тест (кипене, дестилация,

титрация) с 1 g захароза (3.13) вместо пробата.6. Калкулиране на резултатитеСъдържанието на общото количество белтък се извършва по следната формула:(V0.V1).с.0,014.100.6,25.t, където:V0 е обемът (ml) на NаОН (3.9 или 3.10), използван в теста с контролната проба;V1 - обемът (ml) на NаОН (3.9 или 3.10), използван в титрацията на пробата;с - концентрацията (mol/l) на натриев хидроксид (3.9 или 3.10);t - масата [g] на пробата.7. Сверяване, поверка на метода7.1. ПовторяемостРазликата между резултатите от двете паралелни определяния, извършвани с една и съща проба, не трябва

да превишават:• 0,2 % в абсолютна стойност - за съдържанието на общ белтък по-малко от 20 %;• 1,0 % отнесен към по-високато стойност - за съдържанието на общ белтък от 20 % до 40 %;• 0,4 % в абсолютна стойност - за съдържанието на общ белтък повече от 40 %.

7.2. ТочностАнализът (кипине, дестилация, титрация) се извършва с от 1,5 до 2,0 g ацетанилид (3.12) в присъствието на

1 g захароза (3.13); 1 g ацеталинид консумира 14,80 ml сярна киселина (3.5). Възвращаемостта (оползотворяването)трябва да бъде поне 99 %.

8. Наблюдение8.1. Апарътът следва да бъде от ръчен, полуавтоматичен или автоматичен тип. Ако апаратът изисква

прехвърляне между стъпките на кипенето и дестилацията, трансферът се извършва без загуба. Ако колбата надестилационния апарат не е снабдена с капкомерна фунийка, се добавя натриев хидроксид веднага предисвързването на колбата с кондензатора, като течността се изсипва бавно по стените.

8.2. Ако кипящото вещество се втвърди, отново се започва определянето с по-големи количества сярнакиселина (3.4), отколкото е указано.

8.3. За продукти с ниско съдържание на азот обемът на сярната киселина (3.6), който се поставя всъбирателната колба, може да се намали, ако е необходимо, до 10 или 15 ml и да се добави до 25 ml с вода.

ХХIII. Определяне на суров протеин чрез хидролизиране с пепсин и солна киселина

1. Цел и обхватТози метод дава възможност да се определи фракцията на суровия протеин чрез хидролизиране с пепсин и

солна киселина при определени условия. Той е приложим при всички продукти за изхранване на животни.2. ПринципПробата се нагрява в продължение на 48 h при 40°C в разтвор на пепсин хидрохлорид. Суспенсията се

филтрува и съдържанието на азот във филтрата се определя по метода за определяне на суров протеин.3. Реактиви:3.1. солна киселина, плътност 1,125;3.2. 0,075 N солна киселина;3.3. 2 единици / mg пепсин; активността на пепсина се определя по метод, описан в част 4 на това

приложение, и трябва да бъде установена в съответствие с този метод;3.4. около 0,2 % (т/о) свежо приготвен разтвор на пепсин в солна киселина (3.2); активност 400 единици/l;3.5. емулсия за гасене на пяна (например силикон);3.6. всички реактиви, изброени в т. 3. на метода за определяне на суров протеин.4. Апаратура:4.1. водна баня или термостат, регулиран на 40°C ± 1°C;4.2. апарат за разлагане и дестилация по Kjeldahl.5. Процедура5.1. Приготвяне на разтвор (виж наблюдение 7.2.)Претеглят се 2 g от пробата с точност до mg и се пренасят в мерителна колба от 500 ml. Добавят се 450 ml

разтвор на пепсин хидрохлорид (3.4), предварително нагрят до 40°C, и се разклаща, за да се предотвратиобразуването на агломерати. Проверява се рН на суспенсията да е по-малко от 1,7. Колбата се поставя във воднабаня или в термостат (4.1) и се оставя там за 48 h. Разклаща се след 8, 24 и 32 h. След 48 h се прибавят 15 ml солнакиселина (3.1), охлажда се до 20°C, обемът се допълва с вода и се филтрува.

5.2. Хидролизиране250 ml от филтрата се пренасят в колбата на дестилационния апарат (4.2). Добавят се реагентите,

необходими за хидролизата, указани във второто изречение на т. 5.1 от метода за определяне на суров протеин.Хомогенизира се и се довежда до кипене. Ако се образува пяна, се добавят няколко капки емулсия за гасене на пяна(3.5). Кипенето продължава енергично докато водата се изпари почти напълно. Намалява се нагряването ипоследните следи от вода внимателно се отстраняват.

Когато разтворът се избистри и обезцвети (или цветът стане светлозелен, ако е използван катализатор,съдържащ мед), кипенето продължава още 1 h. Оставя се да изстине.

5.3. Дестилация и титруване.Процедира се, както е указано в т. 5.2 и 5.3 от метода за определяне на суров протеин.5.4. Празна пробаПразната проба се прави, като се прилага същата процедура с пропускане на пробата, която трябва да бъде

анализирана.6. Пресмятане на резултатитеОбемът на сярната киселина, използвана при празната проба, се изважда от обема, използван при

изследваната проба. 1 ml 0,1 N сярна киселина съответства на 1,4 mg азот.Количеството на азота се умножава по коефициент 6,25. Резултатът се изразява като процент от пробата.ПовторяемостРазликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени с една и съща проба, не трябва да

надвишават:• 0,4 като абсолютна стойност, при съдържание по-малко от 20 %;• 2,0 % като относителна стойност, при съдържание не по-малко от 20 % и не повече от 40 %;• 0,8 като абсолютна стойност, при съдържание повече от 40 %.7. Наблюдения

7.1. Стойностите, получени чрез този метод нямат непосредствена пряка връзка със смилаемостта in vivo.7.2. Продукти, съдържащи повече от 10 % масла или мазнини, трябва първо да бъдат обезмаслени чрез

екстрахиране с петролев етер (точка на кипене 40 - 60°C).

ХХIV. Определяне активността на пепсин

1. Цел и обхватТози метод дава възможност да се определи активността на пепсина, който се използва при определяне на

суровия протеин чрез хидролизиране с пепсин и солна киселина.2. ПринципХемоглобинът се обработва при определени условия с пепсин в среда, съдържаща солна киселина.

Нехидролизираната фракция на протеина се преципитира с трихлороцетна киселина. Към филтрата се прибавятнатриева основа и реактив на Folin-Ciocalteu. Оптичната плътност на разтвора се измерва при 750 nm и количествотона тирозина се определя по калибровъчна крива.

Определение - за единица пепсин се приема това количество от този ензим, което в условията на методаосвобождава за 1 min такова количество хидроксиарилни групи, които, оцветени с реактива на Folin-Ciocalteu, иматоптична плътност, съответстваща на оптичната плътност на 1 mmol тирозин, оцветен по същия начин.

3. Реактиви:3.1. 0,2 N солна киселина.3.2. 0,06 N солна киселина.3.3. 0,025 N солна киселина.3.4. 5 % разтвор (т/о) на трихлороцетна киселина.3.5. 0,5 N разтвор на натриева основа.3.6. Реактив на Folin-Ciocalteu. В облодънна колба от 2 l със стандартно шлифовано гърло се поставят 100 g

натриев волфрамат (Na2WO4.2H2O), 25 g натриев молибдат (Na2MoO4.2H2O) и 700 ml вода. Прибавят се 50 mlфосфорна киселина (плътност 1.71) и 100 ml концентрирана солна киселина (плътност 1.19), колбата се свързва собратен хладник, нагрява се до завиране и в продължение на 10 h се поддържа слабо кипене. Оставя се да изстине,демонтира се хладникът и се добавят 175 g литиев сулфат (Li2SO4.2H2O), 50 ml вода и 1 ml бром. Вари се 15 min, зада се отстрани излишъкът от бром.

Разтворът се оставя да изстине, пренася се в мерителна колба от 1 l, обемът се допълва с вода, разбърква сеи се филтрува. Не трябва да остава зеленикаво оцветяване. Преди употреба реактивът се разрежда с вода всъотношение 1:2.

3.7. Разтвор на хемоглобин. Претегля се количество хемоглобин (около 2 g белтъчен субстрат, определенпо Anson), съответстващо на 354 mg азот (1) и се пренася в колба от 200 ml със стандартно шлифово гърло. Прибавятсе няколко ml солна киселина (3.2), колбата се свързва с вакуумпомпа и се разклаща, докато хемоглобинът серазтвори напълно. Вакуумът се освобождава и обемът се допълва до 100 ml със солна киселина при разклащане.Приготвя се непосредствено преди употреба.

3.8. Стандартен разтвор на тирозин - 181,2 mg тирозин се разтварят в солна киселина (3.1) и обемът седопълва до 1 l със същата киселина (резервен разтвор). 20 ml от този разтвор се разреждат до 100 ml със солнакиселина (3.1). 1 ml от този разтвор съдържа 0,2 µmol тирозин.

4. Апаратура:4.1. водна баня с температура 25,0 ± 0,1°C, контролирана от ултратермостат;4.2. спектрофотометър;4.3. хронометър с точност 1 sec;4.4. рН-метър.5. Процедура5.1. Приготвяне на разтвора (виж наблюдение 7.1)150 mg пепсин се разтварят в 100 ml солна киселина (3.2). 2 ml от този разтвор се пренасят с пипета в

мерителна колба от 50 ml и обемът се допълва със солна киселина (3.3). рН на разтвора, проверен с рН-метър, трябвада бъде 1,6 ± 0,1. Колбата се потапя във водната баня (4.1).

5.2. Хидролизиране5 ml от разтвора на хемоглобин (3.7) се пренасят с пипета в епруветка, нагряват се до 25°C във водната

баня (4.1), прибавя се 1 ml разтвор на пепсин, получен както е описано в т. 5.1, и се разбърква със стъклена пръчка с

удебелен край, като се правят около 10 движения напред - назад. Епруветката се инкубира във водната баня при25°C в продължение на точно 10 min, считано от момента на прибавянето на пепсиновия разтвор(продължителността и температурата трябва стриктно да се съблюдават). Прибавят се 10 ml разтвор натрихлороцетна киселина (3.4), предварително темперирана на 25°C, разбърква се и се филтрува през сух филтър.

5.3. Развитие на цветната реакция и измерване на оптическата плътност5 ml от филтрата се пренасят с пипета в ерленмайерова колба от 50 ml, добавят се 10 ml разтвор на

натриева основа (3.5) и при постоянно разклащане се добавят 3 ml разреден реактив на Folin-Ciocalteu (3.6).Оптическата плътност на разтвора се определя след 5 до 10 min със спектрофотометър при дължина на вълната 750nm и кювета с дебелина 1 сm срещу вода.

5.4. Празна пробаПри всяко определяне се прави празна проба, както следва:5 ml от разтвора на хемоглобин (3.7) се пренасят с пипета в епруветка, нагряват се до 25°C във водната

баня (4.1), прибавят се 10 ml разтвор на трихлороцетна киселина (3.4), предварително темперирана на 25°C,разбърква се, прибавя се 1 ml разтвор на пепсин, получен както е описано в т. 5.1. Разбърква се със стъклена пръчкаи епруветката се оставя във водната баня (4.1) при 25°C точно за 10 min. Разбърква се и се филтрува през сух филтър.Процедурата продължава, както е описано в т. 5.3.

5.5. Калибровъчна криваВ ерленмайерови колби от 50 ml се пренасят аликвоти от 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 ml от стандартния разтвор

на тирозин (3.8), отговарящи съответно на 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1,0 µmol тирозин. Серията се допълва със разтвор,несъдържащ тирозин. Обемите се довеждат до 5 ml със солна киселина (3.1). Добавят се 10 ml разтвор на натриеваоснова (3.5) и при постоянно разбъркване се добавят 3 ml разреден разтвор на реактива на Folin-Ciocalteu (3.6).Оптическата плътност се измерва както е указано в последното изречение на т. 5.3. Калибровъчната крива сеначертава, като стойностите за оптичната плътност се нанасят срещу стойностите, съответстващи на количествата натирозина.

6. Пресмятане на резултатитеОт калибриращата крива се отчита количеството на тирозин в mol, съответстващо на оптическата гъстота

на цветния разтвор, коригиран на основа на празната проба.Активността на пепсина в mol на тирозина при 25°C на mg за min се изчислява при следната формула:Свързване в mg ( U/mg) = 0,32а/p ,

където:

a е количеството тирозин в mol, отчетено на калибриращата крива;р - теглото в mg на количеството пепсин, посочено в 5.2.7. Наблюдения7.1. Количеството на разтворения пепсин трябва да бъде такова, че при фотометричните измервания в края

и началото на серията оптичната плътност да бъде в границите между 0,035 и 0,35.7.2. Две единици / mg, получени по този метод, отговарят на: 3,64 милиединици / mg по Anson (µmol

тирозин / mg / min при 35,5°C) или 36 400 търговски единици / g ( µmol тирозин / g /10 min при 35,5°C).

ХХV. Определяне на свободен и общ госипол

1. Цел и обхватТози метод дава възможност да се определят нивото на свободния госипол, общият госипол и химически

сродните субстанции в памучно семе, брашно от памучно семе, в кюспе от памучно семе и в комбинирани продуктиза изхранване на животни, съдържащи тези субстанции, когато концентрацията надвишава 20 ppm.

2. ПринципСвободният госипол се определя чрез екстракция в присъствие на 3-аминопропан-1-ол или със смес от

пропан-2-ол и хексан. Общият госипол се определя чрез екстракция с диметилформамид. Чрез анилин госиполът сепревръща в госипол-дианилин, чиято оптическа плътност се измерва при 440 nm.

3. Реактиви:3.1. смес от пропан-2-ол и хексан: 60 обемни части пропан-2-ол ч.з.а. се смесват с 40 обемни части

n-хексан;3.2. разтворител А - в еднолитрова мерителна колба се смесват около 500 ml от сместа пропан-2-ол и

хексан (3.1) 2 ml 3-аминопропан-1-ол, 8 ml ледена оцетна киселина и 50 ml вода. Обемът се допълва със смес отпропан-2-ол и хексан (3.1). Този реактив е стабилен в продължение на една седмица.

3.3. Разтворител Б - в мерителна колба от 100 ml се пренасят с пипета 2 ml 3-аминопропан-1-ол и 10 mlледена оцетна киселина. Охлаждат се до стайна температура и обемът се допълва с N, N-диметилформамид. Тозиреактив е стабилен в продължение на една седмица.

3.4. Анилин, ч.з.а. - ако оптическата плътност на празната проба надвишава 0,022, анилинът се дестилиранад цинков прах, като се отстраняват първите и последните 10 % от дестилата. Охлажда се и се съхранява в кафявабутилка с шлифова запушалка. Този реактив се съхранява няколко месеца.

3.5. Стандартен разтвор А на госипол - в мерителна колба от 250 ml се пренасят 27,9 mg госипол ацетат.Разтваря се и обемът се допълва с разтворител А (3.2). 50 ml от този разтвор се пренасят в мерителна колба от 250 mlи обемът се допълва с разтворител А. Концентрацията на госипола в този разтвор е 0,02 mg/ml. Преди употреба сеоставя в продължение на един час при стайна температура.

3.6. Стандартен разтвор Б на госипол - в мерителна колба от 50 ml се пренасят 27,9 mg госипол ацетат.Разтваря се и обемът се допълва с разтворител Б (3.3). Концентрацията на госипола в този разтвор е 0,5 mg/ml.

Стандартните разтвори A и Б на госипол са стабилни в продължение на 24 h, ако се съхраняват на тъмно.4. Апаратура:4.1. клатачен апарат: около 35 оборота в min;4.2. спектрофотометър.5. Процедура5.1. Изпитвана пробаКоличеството на пробата зависи от предполагаемото съдържание на госипола в нея. За предпочитане е да

се работи с малка проба и относително голяма аликвота от филтрата, така че да се получи количество госиполдостатъчно за прецизно спектрофотометрично измерване. За определяне на свободния госипол в памучно семе,брашно от памучно семе и в кюспе от памучно семе изследваната проба не трябва да надвишава 1 g. При определянев смесени продукти за изхранване на животни пробата може да бъде 5 g. В повечето случаи е достатъчна аликвота от10 ml от филтрата. Тя трябва да съдържа от 50 до 100 µg госипол. При определяне на общия госипол пробата трябвада бъде от 0,5 до 5 g, така че аликвота от 2 ml от филтрата да съдържа от 200 до 400 µg госипол.

Анализът се провежда при стайна температура около 20°C.5.2. Определяне на свободен госиполПробата се пренася в колба от 250 ml с шлифовано гърло, като дъното на колбата трябва да е покрито с

трошено стъкло. 50 ml от разтвор А (3.2) се добавят с пипета, колбата се запушва и се разбърква в продължение на 1h на клатачния апарат. Филтрува се през сух филтър и филтратът се събира в малка колба с шлифовано гърло. Повреме на филтруването фунията се покрива с часовниково стъкло. Равни аликвоти от филтрата, съдържащ от 50 до100 mg госипол, се пренасят в две мерителни колби (А и Б) от по 25 ml. Ако е необходимо, обемът се допълва до 10ml с разтворител А (3.2). Обемът в колба А се допълва със сместа пропан-2-ол - хексан (3.1). Този разтвор сеизползва като стандартен и срещу него се измерват разтворите на пробата.

В две други мерителни колби от 25 ml (В и Г) се пренасят с пипета по 10 ml от разтворител А (3.2). Обемътв колба В се допълва със сместа пропан-2-ол - хексан (3.1). Този разтвор се използва като стандартен и срещу него сеизмерва празната проба.

Във всяка от колбите Г и Б се добавят по 2 ml анилин (3.4). Нагрява се в продължение на 30 min надкипяща водна баня, за да се развие оцветяването. Охлажда се до стайна температура, обемът се допълва със сместапропан-2-ол - хексан (3.1), хомогенизира се и се оставя да престои 1 h.

Оптическата плътност на празната проба Г се определя чрез сравняване със стандартния разтвор В.Оптическата плътност на пробата Б се определя чрез сравняване със стандартния разтвор А. Измерването сепровежда на спектрофотометър при 440 nm, като се използва кювета с дебелина 1 cm.

Оптическата плътност на празната проба се изважда от тази на изследваната проба (коригирана оптическаплътност). От тази стойност се пресмята количеството на свободния госипол, както е описано в т. 6.

5.3. Определяне на общия госиполПробата, съдържаща от 1 до 5 mg госипол, се пренася в мерителна колба от 50 ml и се добавят 10 ml от

разтворител Б (3.3). Едновремено с това се приготвя и празната проба като 10 ml от разтворител Б (3.3) се пренасят вдруга мерителна колба от 50 ml. Двете колби се нагряват в продължение на 30 min над кипяща водна баня. Охлаждасе до стайна температура, обемът на всяка от колбите се допълва със сместа пропан-2-ол - хексан (3.1).Хомогенизира се и се оставя да се утаи в продължение на 10 - 15 min, след което се филтрува и филтратите сесъбират в колби с шлифови запушалки.

В две мерителни колби от 25 ml се пренасят по 2 ml от пробата. В други две мерителни колби от 25 ml сепренасят по 2 ml от празната проба. Обемът на колбите от всяка серия се довежда до 25 ml със сместа пропан-2-ол -хексан (3.1). Тези разтвори се използват като стандартни разтвори.

В други две колби се пренасят по 2 ml анилин (3.4.) Нагрява се в продължение на 30 min над кипяща воднабаня, за да се развие оцветяването. Охлажда се до стайна температура, обемът се допълва със сместа пропан-2-ол -хексан (3.1), хомогенизира се и се оставя да престои в продължение на 1 h.

Оптическата плътност се определя, както е описано в т. 5.2 за свободния госипол. От тази стойност сепресмята количеството на общия госипол, както е описано в т. 6.

6. Пресмятане на резултатитеРезултатите могат да се изчислят или на база специфичната оптическа плътност (6.1), или на

калибрираната крива (6.2).6.1 На база специфичната оптическа плътностСпецифичните оптически плътности при описаните условия ще бъдат:

1 %

свободен госипол - E = 625,

1 cm

1 %

общ госипол - E = 600.

1 cm

Съдържанието на свободен или общ госипол на пробата се изчислява по формулата:

1250 E

% госипол = ,

1 %E _____ PA

1 cm

където:

Е е коригираната оптическа плътност, определна съгласно 5.2;Р - пробата за тест в g;А - аликвотната част от филтрата в ml.6.2. На база на калибрираната криваПодготвят се 2 серии от пет 25 ml-ови градуирани колби. Капват се съответно 2, 4, 6, 8 и 10 ml-ови части от

стандартния разтвор на госипол А (3.5) във всяка серия от колби. Обемът се допълва до 10 ml с разтвор А (3.2).Комплектова се всяка серия с 25 ml-ова колба, съдържаща само 10 ml от разтвора А(3.2) (празен тест).

Обемът на колбите на първата серия (вкл. колбата с празния тест) се допълва със смес от пропан-2-ол ихексан (3.1) до 25 ml (референтна серия).

Прибавя се 2 ml анилин (3.4) във вторите серии (вкл. колбите за празния тест). Загрява се за 30 min наводна баня до получаване на цвета. Охлажда се до стайна температура и се определят стойностите на пропан-2-ол ихексановата смес (3.1). Хомогенизира се и се оставя да престои 1 h (стандартна серия). Определя се включената в 5.2оптическа плътност (гъстота) на разтворите в стандартните серии в сравнение с кореспондиращите разтвори вспоменатите серии. Установява се калибриращата крива (линия) чрез милиметроването на оптическата плътност къмколичествата на госипола (в mg).

ХХVI. Определяне на тилозин чрез дифузия в агар

1. Цел и обхватТози метод дава възможност за определяне съдържанието на тилозина в продукти за изхранване на

животни, концентрати и премикси, когато количеството му е повече от 2 ppm.2. ПринципПробата се обработва с разтвор на фосфатен буфер рН 8, след което се екстрахира с метанол. След

центрофугиране екстрактът се разрежда и неговата антибиотична активност се определя чрез измерване дифузиятана тилозина в агарова среда, засята със Sarcina lutea. Дифузията става видима по образуването на зони на инхибиранев присъствието на микроорганизма. Диаметърът на тези зони е право пропорционален на логаритъма наконцентрацията на антибиотика.

3. Микроорганизъм - Sarcina lutea, ATCC № 93413.1. Поддържане на родителския щамИнокулира се със Sarcina lutea епруветка скосен агар с хранителна среда (4.1), рН се довежда до 7,0.

Инкубира се в течение на 24 h при около 35°C. Културата се съхранява в хладилник и с нея всеки месец сереинокулира скосен агар.

3.2. Приготвяне на бактериална суспенсияБактериите се събират в 2 до 3 ml физиологичен разтвор (4.4) от епруветка със скосен агар (3.1). С тази

суспенсия се инокулира колба на Roux, съдържаща 250 ml хранителна среда (4.1), коригирана до рН 7,0. Култивирасе в продължение на 24 h при температура 35°C, след което бактериите се събират в 25 ml физиологичен разтвор(4.4). Суспенсията се хомогенизира и се разрежда така, че да се получи пропускливост на светлината 75 % при 650nm.

Тази суспенсия се съхранява в хладилник и може да се използва една седмица.За различните концентрации на тилозин, които се използват, предварително се определя количеството на

инокулума, който дава възможно най-големите и ясни зони на инхибиране. Това се извършва върху стъклени плочис основната среда за определянето (4.1). Хранителната среда се инокулира при температура от 48 до 50°C.

4. Хранителна среда и реактиви4.1. Основна среда за определянето:глюкоза - 1 g;трипсинов пептон - 10 g;месен екстракт - 1,5 g;дрождев екстракт - 3 g;агар в зависимост от качеството - от 10 до 20 g;дестилирана вода - до 1000 ml.

За поддържане на родителския щам и за приготвяне на бактериалната суспенсия рН се коригира до 7,0непосредствено преди употреба, а за определянето рН се довежда до 8,0.

4.2. Разтвор на фосфатен буфер с рН 8:монокалиев фосфат, KH2PO4, ч.з.а. - 0,523 g;

дикалиев фосфат, K2HPO4.2H2O, ч.з.а. - 16,730 g;дестилирана вода - до 1000 ml.4.3. Разтвор на фосфатен буфер с рН 7:монокалиев фосфат, KH2PO4, ч.з.а. - 5,5 g;дикалиев фосфат, K2HPO4.2H2O, ч.з.а. - 13,6 g;дестилирана вода - до 1000 ml.4.4. Стерилен физиологичен разтвор.4.5. Чист метанол.4.6. 40 %-ен (о/о) метанол.4.7. Смес от разтвор на фосфатен буфер (4.2) и чист метанол в съотношение 60/40 по обем.4.8. Стандартна субстанция: тилозин с известна активност.5. Стандартни разтвориСтандартната субстанция (4.8) се суши в продължение на 3 h при 60°C във вакуумна сушилня (5 mm Hg

стълб). Претеглят се от 10 до 50 mg в мерителна колба, разтварят в 5 ml метанол (4.5) и се разрежда с разтвора нафосфатния буфер, рН 7 (4.3), така че да се получи основна концентрация на тилозина 1000 µg/ml.

От този резервен разтвор чрез разреждане със сместа (4.7) се приготвя стандартен работен разтвор S8,съдържащ 2 µg/ml тилозин - основа.

Като се използва сместа (4.7), чрез серийни разреждания (1+1) се приготвят следните концентрации:S4 - 1 µg/ml;S2 - 0,5 µg/ml;S1 - 0,25 µg/ml.6. ЕкстракцияЗа концентратите се взема проба от 10 g; за премиксите и за продуктите за изхранване на животни - 20 g.

Добавят се 60 ml разтвор на фосфатен буфер рН 8 (4.2), предварително нагрят до 80°C, и се хомогенизира впродължение на 2 min (домашен миксер, Ultra-turrax и др.).

Оставя се в продължение на 10 min, добавят се 40 ml метанол и се хомогенизира в продължение на 5 min.Екстрактът се центрофугира, аликвотна част се разрежда със сместа (4.7), за да се получи предполагаема

концентрация на тилозина 2 µg/ml (= U8). След това чрез серийни разреждания (1+1), като се използва сместа (4.7),се приготвят концентрациите U4, U2 и U1.

При съдържание по-малко от 10 ppm екстрактът се изпарява до сухо на ротационен изпарител при 35°C иостатъкът се разтваря в 40 %-ен метанол (4.6).

7. Метод за определяне7.1. Инокулиране на хранителната средаОсновната среда за определянето (4.1), коригирана до рН 8, се инокулира с бактериалната суспенсия (3.2.)

при температура от 48 до 50°C.7.2. Подготовка на паничкитеДифузията в агар се провежда в панички, като се използват четири концентрации на стандартния разтвор

(S8, S4, S2, S1) и четири концентрации на екстракта (U8, U4, U2, U1). Във всяка паничка трябва да бъдатразположени четирите концентрации на стандартния разтвор и на екстракта.

За тази цел се избират достатъчно големи панички, така че в агаровата среда да могат да бъдат направенинай-малко 8 кладенчета с диаметър от 10 до 13 mm. Пресмята се количеството на инокулираната хранителна среда(7.1) да бъде такова, че да осигури равномерен слой с дебелина 2 mm. За предпочитане е изследването да сепровежда в съдчета, състоящи се от стъклена плочка със съвършено пасващ пластмасов или алуминиев пръстен сдиаметър 200 mm и височина 20 mm.

В зависимост от диаметъра на кладенчетата в тях се нанася с пипета точно премерено количество (между0,10 и 0,15 ml) от разтвора на антибиотика.

За всяка проба разрежданията се повтарят най-малко 4 пъти с всяка концентрация, така че всякоопределяне да включва оценяването на 32 зони на инхибиране.

7.3. ИнкубиранеПаничките се инкубират в продължение на 24 h при 35 до 37°C.8. ОценяванеЗа предпочитане е диаметърът на зоните на инхибиране да се измери чрез прожектиране. Измерванията се

нанасят върху полулогаритмична хартия, като се нанасят стойностите на логаритъма на концентрациите срещустойностите за диаметъра на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на стандартния разтвор и на екстракта.При условие, че няма странични ефекти, двете линии трябва да бъдат успоредни.

Логаритъмът на относителната активност се пресмята, като се използва следната формула:

(U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8) 0,602

U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2

Реалната активност е равна на предполагаемата активност, умножена по относителната активност.9. ПовторяемостРазликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени с една и съща проба, не трябва да

надвишават 10 % като относителна стойност.

ХХVII. Определяне на виржиниамицин чрез дифузия в агар

1. Цел и обхватТози метод дава възможност за определяне съдържанието на виржиниамицин в продукти за изхранване на

животни, концентрати и премикси, когато количеството му е повече от 2 ppm.2. ПринципПробата се екстрахира с Tween80 - метанолов разтвор. След центрофугиране и филтруване екстрактът се

разрежда и неговата антибиотична активност се определя чрез измерване дифузията на виржиниамицина в агаровасреда, засята със Sarcina lutea. Дифузията става видима по образуването на зони на инхибиране в присъствието намикроорганизма. Диаметърът на тези зони е право пропорционален на логаритъма на концентрацията наантибиотика.

3. Микроорганизъм - Sarcina lutea, ATCC № 93413.1. Поддържане на родителския щамИнокулира се със Sarcina lutea епруветка скосен агар с хранителна среда (4.1). Инкубира се в течение на 24

h при около 35°C. Културата се съхранява в хладилник и с нея всеки 14 дни се реинокулира скосен агар.3.2. Приготвяне на бактериална суспенсияБактериите се събират от наскоро приготвена епруветка скосен агар (3.1) в 2 до 3 ml физиологичен разтвор

(4.3). С тази суспенсия се инокулира колба на Roux, съдържаща 250 ml хранителна среда (4.1). Култивира се впродължение на 24 h при температура 35°C, след което бактериите се събират в 25 ml физиологичен разтвор (4.3).Суспенсията се хомогенизира и се разрежда така, че да се получи пропускливост на светлината 75 % при 650 nm.Тази суспенсия се съхранява в хладилник и може да се използва една седмица.

За различните концентрации на виржиниамицин, които се използват, предварително се определяколичеството на инокулума, който дава възможно най-големите и ясни зони на инхибиране. Това се извършва върхустъклени плочи с основната среда за определянето (4.1). Хранителната среда се инокулира при температура от 48 до50°C.

4. Хранителна среда и реактиви4.1. Основна среда за определянето:глюкоза - 1 g;трипсинов пептон - 10 g;

месен екстракт - 1,5 g;дрождев екстракт - 3 g;агар, в зависимост от качеството - от 10 до 20 g;дестилирана вода - до 1000 ml;рН се коригира до стойност 6,5 преди употреба.4.2. Разтвор на фосфатен буфер с рН 6:монокалиев фосфат, KH2PO4, ч.з.а. - 8,0 g;дикалиев фосфат, K2HPO4.2H2O, ч.з.а. - 2,0 g;дестилирана вода - до 1000 ml.4.3. Стерилен физиологичен разтвор.4.4. Чист метанол.4.5. Смес от разтвор на фосфатен буфер (4.2) и чист метанол в съотношение 80/20 по обем.4.6. 0,5 %-ен (т/о) разтвор на Tween80 в метанол.4.7. Стандартна субстанция: виржиниамицин с известна активност.5. Стандартни разтвориПриготвя се метанолов разтвор на стандартната субстанция (4.7), съдържащ 800 mg/ml виржиниамицин.

От този резервен разтвор чрез разреждане със сместа (4.5) се приготвя стандартен работен разтвор S8, съдържащ 1µg/ml виржиниамицин. Като се използва сместа (4.5), чрез серийни разреждания (1 + 1) се приготвят следнитеконцентрации:

S4 - 0,5 µg/ml;S2 - 0,25 µg/ml;S1 - 0,125 µg/ml.6. Екстракция6.1. Продукти със съдържание на виржиниамицин 50 ppm или по-малкоВзема се проба от 10 до 20 g, добавят се 100 ml от разтвора (4.6) и се разклащат в продължение на 30 min

на клатачния апарат. Центрофугира се или се филтрува, вземат се 20 ml от чистия разтвор и се изпаряват до сухо наротационен изпарител. Утайката се разтваря в 20 ml или повече от сместа (4.5), за да се получи предполагаемаконцентрация на виржиниамицин 1 µg/ml (= U8). След това чрез серийни разреждания (1 + 1), като се използвасместа (4.5), се приготвят концентрациите U4, U2 и U1.

6.2. Продукти със съдържание на виржиниамицин повече от 50 ppmВзема се проба от 1 до 10 g, добавят се 100 ml от разтвора (4.6) и се разклащат в продължение на 30 min на

клатачния апарат. Центрофугира се или се филтрува, филтратът се разрежда със сместа (4.5), за да се получипредполагаема концентрация на виржиниамицин 1 µg/ml (= U8). След това се приготвят концентрациите U4, U2 иU1, както е указано в т. 6.1.

7. Метод за определяне7.1. Инокулиране на хранителната средаОсновната среда за определянето (4.1) се инокулира с бактериалната суспензия (3.2) при температура от 48

до 50°C.7.2. Подготовка на паничкитеДифузията в агар се провежда в панички, като се използват четири концентрации на стандартния разтвор

(S8, S4, S2, S1) и четири концентрации на екстракта (U8, U4, U2, U1). Във всяка паничка трябва да бъдатразположени четирите концентрации на стандартния разтвор и на екстракта.

За тази цел се избират достатъчно големи панички, така че в агаровата среда да могат да бъдат направенинай-малко 8 кладенчета с диаметър от 10 до 13 mm. Пресмята се количеството на инокулираната хранителна среда(7.1) да бъде такова, че да осигури равномерен слой с дебелина 2 mm. За предпочитане е изследването да сепровежда в съдчета, състоящи се от стъклена плочка със съвършено пасващ пластмасов или алуминиев пръстен сдиаметър 200 mm и височина 20 mm.

В зависимост от диаметъра на кладенчетата в тях се нанася с пипета точно премерено количество (между0,10 и 0,15 ml) от разтвора на антибиотика.

За всяка проба разрежданията се повтарят най-малко 4 пъти с всяка концентрация, така че всякоопределяне да включва оценяването на 32 зони на инхибиране.

7.3. ИнкубиранеПаничките се инкубират в продължение на 18 h при 28 до 30°C.8. ОценяванеЗа предпочитане е диаметърът на зоните на инхибиране да се измери чрез прожектиране. Измерванията се

нанасят върху полу-логаритмична хартия като се нанасят стойностите на логаритъма на концентрациите срещустойностите за диаметъра на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на стандартния разтвор и на екстракта.При условие, че няма странични ефекти, двете линии трябва да бъдат успоредни.

Логаритъмът на относителната активност се пресмята, като се използва следната формула:

(U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8) 0,602

U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2

Реалната активност е равна на предполагаемата активност, умножена по относителната активност.9. ПовторяемостРазликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени с една и съща проба, не трябва да

надвишава 10 % като относителна стойност.9.1. Може да бъде използвана всяка друга търговска хранителна среда, която има подобен състав и дава

подобни резултати.9.2. Амидошварц се използва, за да направи видими зоните на инхибиране на стандартните разтвори (син

пръстен).9.3. Този щам, изолиран от LUFA в Кил, расте по-бързо, отколкото S. aureus ATCC 6538 P.9.4. Щам, изолиран от LUFA в Кил.

ХХVIII. Определяне на влага в животински и растителни мазнини и масла

1. Цел и обхватТози метод дава възможност да се определят водата и летливите субстанции, съдъжащи се в животински и

растителни мазнини и масла.2. ПринципПробата се изсушава до постоянно тегло при 103°C. Загубата на маса се определя чрез претегляне.

3. Апаратура:3.1. плоскодънно блюдо от корозионноустойчив материал с диаметър от 8 до 9 cm и приблизителна

височина 3 сm;3.2. живачен термометър с усилен резервоар и разширение в горната част на капиляра, градуиран от около

80°C до най-малко 110°C и дълъг приблизително 10 cm;3.3. пясъчна баня или електрически котлон;3.4. ексикатор, съдържащ ефикасен сушител;3.5. аналитични везни.4. ПроцедураВ сухото тарирано блюдо (3.1), в което е поставен термометърът (3.2), се претеглят с точност до 1 mg

около 20 g от хомогенизираната проба. Нагрява се върху пясъчната баня или котлона (3.3), като се разбъркванепрекъснато с термометъра така, че да се достигне температура 90°C за около 7 min.

Нагряването се намалява, като се наблюдава честотата, с която се появяват мехурчета от дъното наблюдото. Температурата не трябва да надвишава 105°C. Като се продължава разбъркването, се изстъргва дъното наблюдото, докато престанат да се образуват мехури.

За да се осигури напълно отстраняване на влагата нагряването се повтаря няколко пъти до 103 ± 2°C сохлаждане до 93°C между нагряванията. След това се оставя да се охлади до стайна температура в ексикатора (3.4) исе претегля. Тази операция се повтаря, докато загубата на маса между две последователни претегляния не надвишава2 mg.

Забележка: Увеличаването на масата на пробата след повторно нагряване е индикация за окисляване намазнината. В този случай резултатът се пресмята от претеглянето, проведено непосредствено преди масата дазапочне да нараства.

5. Пресмятане на резултата

Съдържанието на влага като процент от пробата се дава от следната формула:

(М1 - М2)100,

M0

където:M0 е масата на изследваната проба, в g;М1 - масата на тегловното стъкло със съдържанието в него, преди сушене, в g;М2 - масата на тегловното стъкло със съдържанието в него, след сушене, в g.Резултати, по-ниски от 0,05 %, трябва да се записват като "по-ниско от 0,05 %".

ПовторяемостРазликата във влажността между резултатите в две паралелни определяния, проведени на една и съща

проба, не трябва да надвишава 0,05 % като абсолютна стойност.

ХХIХ. Определяне на магнезий чрез атомно абсорбционна спектрофотометрия

1. Цел и обхватТози метод дава възможност да се определи количеството на магнезий в продукти за изхранване на

животни. В частност той е подходящ за определяне съдържания на магнезий, по-ниски от 5 %.2. ПринципПробата се опепелява и се разтваря в разредена солна киселина. Ако пробата не съдържа органични

субстанции, тя се разтваря директно в разредена солна киселина. Разтворът се разрежда и съдържанието на магнезийсе определя чрез атомно абсорбционна спектрофотометрия с дължина на вълната 285,2 nm при сравняване съсстандартни разтвори.

3. Реактиви:3.1. солна киселина, ч.з.а., плътност 1,16;3.2. концентрирана солна киселина, ч.з.а., плътност 1,16;3.3. магнезиева лента или жица, или магнезиев сулфат хептахидрат, изсушен при стайна температура;3.4. разтвор на стронциева сол (хлорид или нитрат), отговарящ на 2,5 % (т/о) стронций (= 76,08 g

SrC12.6H2O, ч.з.а., или 60,38 g Sr(NO3)2, ч.з.а.);3.5. стандартен разтвор на магнезий:претегля се с точност до 1 mg 1 g магнезий (3.3), от чиято повърхност предварително внимателно са

отстранени окисите, или съответно количество (10,143 g) магнезиев сулфат хептахидрат (3.3); пренася се вмерителна колба от 1000 ml, добавят се 80 ml солна киселина (3.1), оставя се да се разтвори и обемът се долива до1000 ml с вода; 1 ml от този разтвор съдържа 1 mg магнезий.

4. Апаратура:4.1. тигли от платина, кварц или порцелан;4.2. термостатируема електрическа муфелна пещ;4.3. атомно абсорбционен спектрофотометър.5. Процедура5.1. Приготвяне на разтвор от пробата5.1.1. Продукти за изхранване на животни, съставени изключително от неорганични субстанцииВ мерителна колба от 500 ml с 250 до 300 ml вода се претеглят с точност до 1 mg 5 g от пробата. Добавят се

40 ml солна киселина (3.1), довежда се до кипене и течността се оставя да кипи леко в продължение на 30 min.Оставя се да изстине, обемът се допълва с вода, размесва се и се филтрува в суха бехерова чаша през сух нагънатфилтър. Първите 30 ml от филтрата се отстраняват. В присъствие на силикати проба от 5 g се обработва с достатъчноколичество (15 - 30 ml) солна киселина (3.2), изпарява се до сухо на водна баня и се пренася в пещ с температура105°C за 1 h. По-нататък се процедира, както е указано в третото изречение на т. 5.1.2.

5.1.2. Продукти за изхранване на животни, съставени предимно от минерални субстанцииВ тигел се претеглят 5 g от пробата с точност до 1 mg и се опепеляват в муфелна пещ при 550°C, докато се

получи пепел, свободна от въглени частици, и се оставя да изстине. За да се отстранят силикатите, към пепелта седобавя достатъчно количество (15 - 30 ml) солна киселина (3.2), изпарява се до сухо на водна баня и се пренася всушилня при 105°C за 1 h. Остатъкът се обработва с 10 ml солна киселина (3.1) и с топла вода се пренася в мерителнаколба от 500 ml. Оставя се да се охлади и обемът се допълва с вода. Размесва се и се филтрува в суха бехерова чашапрез сух нагънат филтър. Първите 30 ml от филтрата се отстраняват.

5.1.3. Продукти за изхранване на животни, съставени предимно от органични субстанцииВ тигел се претеглят 5 g от пробата с точност до 1 mg и се опепеляват в муфелна пещ при 550°C, докато се

получи пепел, свободна от въглени частици. Пробата се обработва с 5 ml солна киселина (3.2), изпарява се до сухо наводна баня и след това се суши за един час в сушилня при 105°C, за да се стопят неразтворимите силикати. Пепелтасе обработва с 5 ml солна киселина (3.1), пренася се с топла вода в мерителна колба от 250 ml, довежда се до кипене,оставя се да изстине и обемът се допълва с вода. Размесва се и се филтрува в суха бехерова чаша през сух нагънатфилтър. Първите 30 ml от филтрата се отстраняват.

5.2. Измерване чрез атомна абсорбцияЧрез разреждане на стандартния разтвор (3.5) с вода се приготвят най-малко пет сравнителни разтвора с

нарастващи концентрации, отговарящи на оптималния измервателен диапазон на спектрофотометъра. Във всекиразтвор се добавят 10 ml от разтвора на стронциева сол (3.4) и обемът им се довежда до 100 ml с вода. Еднааликвотна част от филтрата, получен по т. 5.1.1, 5.1.2 или 5.1.3 се разреждат с вода така, че да се получиконцентрация на магнезий, която е в границите на концентрацията на сравнителните разтвори. Концентрацията насолна киселина в този разтвор не трябва да надвишава 0,4 N. Добавят се 10 ml разтвор на стронциева сол (3.4) и

обемът се допълва до 100 ml с вода. Абсорбцията на определяемия разтвор и на сравнителните разтвори се измервапри дължина на вълната 285,2 nm.

6. Пресмятане на резултатитеКоличеството на магнезия в пробата се пресмята по отношение на сравнителните разтвори. Резултатът се

изразява като процент от пробата.ПовторяемостРазликата между резултатите в две паралелни определяния, проведени на една и съща проба, не трябва да

надвишава 5 % в относителна стойност.

ХХХ. Определяне на сурови влакнини

1. Цел и обхватТози метод дава възможност за определяне в продукти за изхранване на животни количеството на

органичните субстанции, които не съдържат мазнини и са неразтворими в кисели и алкални среди. Обикновено те сеозначават като сурови влакнини.

2. ПринципПробата, обезмаслена, когато е необходимо, се обработва последователно с кипящи разтвори на сярна

киселина и калиева основа с определени концентрации. Остатъкът се отделя чрез филтруване в присъствие на азбест,измива се, изсушава се, претегля се и се опепелява при 900°C. Загубата на тегло в резултат на опепеляванетоотговаря на грубото влакно, присъстващо в изследваната проба.

3. Реактиви:3.1. сярна киселина 0,26 N;3.2. обработен азбест:Към азбест от същия тип, който се използва за тигел на Gooch, се добавя разредена солна киселина (1 обем

солна киселина с плътност 1,19 + 3 обема вода) в обем пет пъти по-голям от обема на азбеста. Сместа се кипи заоколо 45 min, оставя се да изстине и се филтрува през фуния на Buechner. Остатъкът се мие първо с вода, докатоизчезне солната киселина, и след това с ацетон (3.6). Азбестът се изсушава в сушилен шкаф и след това се накаляваза 2 h при 900°C. Оставя се да изстине и се съхранява в шише с шлифова запушалка. Азбестът, обработен по тозиначин, може да се използва няколко пъти. Той трябва да отговаря на изискванията за празна проба, дадени в т. 5.

3.3. емулсия за пеногасене (напр. силикон);3.4. разтвор на калиева основа 0,23 N;3.5. солна киселина 0,5 N;3.6. ацетон;3.7. диетилов етер.4. Апаратура:4.1. бехерови чаши с обем най-малко 600 ml, с градуировка на нивото на 200 ml;4.2. порцеланови дискове с диаметър около 80 mm и дебелина около 4 mm, перфорирани с приблизително

32 дупки, всяка от които с диаметър около 4 mm;4.3. смукателно шише за гумена запушалка с капацитет около 2 l, с градуировка на нивото на 800 ml,

комплектувано със стъклени фунии с диаметър 120 mm;4.4. филтрувални дискове с диаметър 40 mm и дебелина около 4 mm, със скосен ръб, който да пасва на

конуса на фунията (4.3), перфорирани с около 16 отвора, всеки от които с диаметър около 4 mm и покрити с мрежа сразмер на отворите около 1 mm; както дисковете, така и мрежата трябва да бъдат устойчиви на киселини и основи;

4.5. тигли за изгаряне от платина или кварц;4.6. термостатируема електрическа муфелна пещ;4.7. ексикатор;4.8. азбестов филтър:Суспендират се 2 g азбест (3.2) в 100 ml вода. Филтрува се под вакуум през филтрувален диск, покрит с

метална мрежа (4.4), поставен във фунията на смукателното шише (4.3). Филтратът се събира и се филтрува ощеведнъж през същия филтър. Филтратът се отстранява.

5. ПроцедураВ бехерова чаша (4.1) се претеглят с точност до 1 mg 3 g от пробата и 2 g обработен азбест (3.2), добавят се

200 ml сярна киселина (3.1) и няколко капки емулсия за гасене на пяна (3.3). Нагрява се бавно до завиране и сеоставя да се вари точно 30 min. За да се запази постоянен обемът, бехеровата чаша се покрива с приспособление заохлаждане, като например облодънна колба от 500 ml, в която циркулира студена вода. Кипенето се прекратява чрездобавяне на около 50 ml студена вода и незабавно се филтрува под вакуум през азбестов филтър, подготвенпредварително, както е указано в т. 4.8.

Остатъкът се промива с пет порции от по приблизително 100 ml много гореща вода така, че да се получикраен обем на филтрата 800 ml. Остатъкът се пренася количествено в бехеровата чаша (4.1), в която предварително е

бил поставен порцелановият диск за регулиране на кипенето (4.2). Добавят се 200 ml разтвор на калиева основа (3.4).Нагрява се до кипене и се оставя да се вари точно 30 min. Добавят се приблизително 50 ml студена вода и незабавносе филтрува под вакуум през свеж азбестов филтър, подготвен предварително, както е указано в т. 4.8. Остатъкът семие с много гореща вода, докато промивната вода стане неутрална (изпитва се с лакмусова хартия), и след това трипъти с ацетон (3.6) (общо около 100 ml ацетон).

Остатъкът се пренася количествено в тигел за изгаряне (4.5), като, ако е необходимо, се натрошава, и сесуши до постоянно тегло в сушилния шкаф при 130°C.

Оставя се да се охлади в ексикатора (4.7) и бързо се претегля.Тигелът се поставя в муфелната пещ (4.6) и се накалява за 30 min при 900°C. Оставя се да се охлади в

ексикатора (4.7) и бързо се претегля.Празната проба се провежда, като се приложи същата процедура към обработения азбест (3.2), но без

пробата. Загубата на тегло в резултат от накаляването на 6 g азбест не трябва да надвишава 10 mg.6. Пресмятане на резултатитеСъдържанието на грубо влакно като процент от пробата се дава от отношението:

(a - b) 100,

3

където:

а е загубата на тегло след накаляване на пробата;b - загубата на тегло след накаляване на празната проба.ПовторяемостРазликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени на една и съща проба, не трябва да

надвишават:0,3 като абсолютна стойност, за съдържание на грубо влакно по-малко от 10 %;

3 % като относителна стойност, за съдържание на грубо влакно, равно или по-голямо от 10 %.7. Наблюдения7.1. Продуктите за изхранване на животните, съдържащи повече от 10 % масла или мазнини, трябва да

бъдат обезмаслени с диетилов етер (3.7) преди анализа. За да се направи това, пробата (3 g, претеглена с точност до 1mg) се поставя върху азбестов филтър (4.8). Залива се трикратно с около 50 ml диетилов етер и всеки път сефилтрува внимателно под вакуум. Обезмаслената проба и азбестът се пренасят количествено в бехерова чаша (4.1) ианализът продължава, както е показано в (5).

7.2. Продуктите за изхранване на животните, съдържащи масла и мазнини, които не могат директно дабъдат екстрахирани, трябва да бъдат обезмаслени, както е указано в 7.1, и допълнително обезмаслявани всеки пътслед измиване на киселината от остатъка при киселинната обработка.

За да се направи това, киселината се измива от остатъка трикратно с ацетон (3.6) (общо 100 ml), след товатрикратно с 50 ml диетилов етер (3.7). След това остатъкът се пренася количествено в бехерова чаша (4.1) и анализътсе продължава, както е указано във втория абзац на т. 5 - обработка с разтвор на калиева основа).

7.3. Ако продуктите за изхранване на животни са богати на калций (повече от 2 % калций), пробата заизследване (3 g, претеглени с точност до 1 mg) се поставя в бехерова чаша (4.1) със 100 ml 0,5 N солна киселина (3.5)и се оставя на хладно за 5 min. Филтрува се незабавно и се промива със студена вода. Като спомагателно средство зафилтруване се използват 2 g от азбеста, указан за варенето със сярна киселина. Ако филтруването се окаже трудно,суспенсията се разрежда с ацетон (3.6). След това се процедира, както е указано в (5).

ХХХI. Определяне на нишесте чрез панкреатичен метод

1. Цел и област на приложениеМетодът дава възможност за определяне съдържанието на нишесте и на високомолекулните продукти от

разграждане на нишестето в продуктите за изхранване на животни, съдържащи цвеклови резанки, цвеклова пулпа,изрезки от сушена горна част на цвеклото или листа, картофена пулпа, сушени дрожди, продукти, богати на инулин(напр. резанки и брашно от земна ябълка), и продукти, съдържащи пръжки. Определянията се провеждат само когатомикроскопското изследване покаже, че в пробата има значителни количества нишесте.

2. ПринципЗахарите, присъстващи в пробата, се екстрахират с етанол. Нишестето в екстрахирания остатък се

разгражда до захар с панкреатин. Образуваните захари се хидролизират със солна киселина и получената глюкоза се

определя по метода на Luff-Schoorl. Така полученото количество глюкоза, умножено по постоянен коефициент, давасъдържанието на нишесте в пробата.

3. Реактиви:3.1. етанол, неутрален по фенолфталеин, 90 % (о/о);3.2. пентан-1-ол (амилов алкохол), ч.з.а;3.3. толуол;3.4. буферен разтвор:разтварят се във вода 9,078 g калиев дихидроген фосфат KH2PO4 и 11,876 g динатриев фосфат

Na2HPO4.2H2O; обемът се долива до 1 l с вода;3.5. разтвор на натриев хлорид, 0,2 N;3.6. разтвор I на Carrez:разтварят се във вода 21,9 g цинков ацетат Zn(CH3COO) 2.2H2O и 3 g ледена оцетна киселина; обемът се

довежда до 100 ml с вода;3.6. разтвор II на Carrez:разтварят се във вода 10,6 g калиев фероцианид K4(Fe(CN6)).3H2O; обемът се довежда до 100 ml с вода;3.8. солна киселина, N;3.9. солна киселина, ч.з.а, около 8 N, плътност 1,125;3.10. разтвор на натриева основа, ч.з.а, около 10 N, плътност 1,33;3.11. индикаторен разтвор на метилоранж, 0,1 % (т/о);3.12. панкреатин пулверизиран, както в указанията в т. 8; съхранява се в затворени бутилки, защитени от

светлина и влага;3.13. реактив на Luff-Schoorl.Разтворът на лимонена киселина (3.13.2) се налива в разтвора на натриев карбонат (3.13.3), като

внимателно се разбърква по време на добавянето. След това се добавя разтворът на меден сулфат (3.13.1) и обемът седовежда до 1 l с вода. Оставя се да престои една нощ и се филтрува. Проверява се нормалността на така полученияреагент (Cu 0,1 N; Na2CO32N). рН на разтвора трябва да бъде около 9,4.

3.13.1. разтвор на меден сулфат:разтварят се 25 g меден сулфат, ч.з.а, CuSO4.5H2O в 100 ml вода;3.13.2. разтвор на лимонена киселина:разтварят се 50 g лимонена киселина, ч.з.а, C6H8O7.H2O в 50 ml вода;3.13.3. разтвор на натриев карбонат:разтварят се 353,8 g безводен натриев карбонат, ч.з.а, в около 300 ml гореща вода; оставя се да се охлади.3.14. гранули пемза, пречистена чрез изваряване в солна киселина, промивани с вода и изсушавани;3.15. разтвор на калиев йодид, ч.з.а, 30 % (т/о);3.16. сярна киселина, около 6 N, плътност 1,18;3.17. разтвор на натриев тиосулфат, 0,1 N;3.18. разтвор на нишесте:Смес от 30 ml вода и 5 g разтворимо нишесте се прибавят към 1 l кипяща вода. Вари се 3 min и се оставя да

се охлади. Този разтвор трябва да бъде свежо приготвен.4. Апаратура:4.1. екстрактор (виж фигурата на стр.12), състоящ се от:4.1.1. широкогърлена конична колба от 500 ml;4.1.2. обратен хладник, комплектуван с кран към коничната колба;4.1.3. подвижно вретено в центъра на обратния хладник с кука в долния край; щипка за закрепване на

вретеното;4.1.4. метален съд, който се закачва за куката на вретеното (4.1.3) и държи филтрационния тигел (4.1.5);4.1.5. филтрационен тигел за бързо филтруване с максимален размер на порите от 90 до 100 µ (напр.

порьозност 1), с капацитет около 30 ml;4.1.6. филтърни хартии, подходящи по размер за филтрационния тигел;4.2. термостат, регулиран на 38°C;4.3. мерителни колби от 200 ml със стандартен шлиф и обратен хладник;4.4. мерителни колби от 100 ml със стандартен шлиф и обратен хладник.5. Процедура5.1. Приготвяне на пробатаПробата се раздробява така, че цялата да мине през сито 0,5 mm (отговаря на сито ISO R 565).5.2. ЕкстракцияПретегля се 2 g проба с точност до 1 mg и се пренася във филтрационния тигел (4.1.5), дъното на който е

било предварително покрито с филтърна хартия (4.1.6), напоена с етанол (3.1). В коничната колба (4.1.1) се поставят55 mm етанол (3.1) и няколко гранули пемза (3.14). Филтрационният тигел се поставя в металния съд (4.1.4) и

последният се окачва на куката на вретеното (4.1.3). Обратният хладник се поставя на коничната колба и вретенотосе спуска надолу така, че дъното на тигела да докосва точно повърхността на етанола. Вретеното се фиксира здравона това ниво. Етанолът се довежда до кипене и се вари 3 h. След това се оставя да се охлади и вретеното (4.1.3) сеиздърпва така, че да повдигне тигела колкото е възможно по-високо в коничната колба. Коничната колба се отварявнимателно и по стената на колбата се добавят 45 ml вода. Обратният хладник се поставя обратно наерленмайеровата колба и филтрационният тигел се фиксира на 10 cm над повърхността на течността. Течността седовежда до кипене и се вари 3 h. След това колбата се охлажда, отваря се и тигелът се изважда от съда.

5.3. Озахаряване и хидролизаТигелът се поставя на смукателно шише и се изсушава при изсмукване. Остатъкът от екстракцията се

пренася в хаван и се стрива фино. Прахът се пренася количествено с около 60 ml вода в мерителна колба от 200 ml,снабдена със стандартен шлиф, и се добавят няколко капки амилов алкохол (3.2). Колбата се свързва с обратенхладник. Нагрява се до кипене и се вари 1 h, след което се оставя да се охлади и обратният хладник се сваля. Добавятсе 25 ml буферен разтвор (3.4), 250 mg панкреатин (3.12), 2,5 ml разтвор на натриев хлорид (3.5) и 10 капки толуол(3.3). Разклаща се 2 min, колбата се поставя в термостата (4.2) и се държи там 21 h, като от време на време серазклаща. След това се оставя да се охлади до стайна температура.

Добавят се 5 ml разтвор I на Carrez (3.6) и се разклаща 1 min. След това се добавят 5 ml разтвор II на Carrez(3.7) и отново се разклаща за 1 min. Обемът се допълва с вода, смесва се и се филтрува. 50 ml от филтрата сепренасят с пипета в мерителна колба от 100 ml (може да се работи също със 100 ml филтрат и мерителна колба от200 ml). Добавят се няколко капки от индикатора (3.11) и се подкислява с 8 N солна киселина (3.9), докатоиндикаторът се оцвети червено. След това се добавят допълнително 6,25 ml 8 N солна киселина (3.9) (или 12,50 ml,ако се работи със 100 ml филтрат). Съединява се обратният хладник към колбата, разтворът се довежда до кипене исе вари 1 h. Оставя се да се охлади, неутрализира се с 10 N разтвор на натриева основа (3.10), докато индикаторът сеоцвети в жълто. След това се подкислява леко чрез добавяне на малко солна киселина, N (3.8). Обемът се допълва свода и се смесва. Съдържанието на глюкоза се определя съгласно метода на Luff-Schoorl, както е указано в т. 5.4.

5.4. Титруване по Luff-Schoorl.В ерленмайерова колба от 300 ml се пренасят с пипета 25 ml от реактива на Luff-Schoorl и точно премерени

25 ml от разтвора, получен в т. 5.3, който не би трябвало да съдържа повече от 60 mg глюкоза. Добавят се 2 гранулипемза (3.14). При разклащане на ръка се нагрява над среден пламък и течността се довежда до кипене за около 2 min.Коничната колба незабавно се поставя върху телена мрежа с азбестово покритие, която има отвор с диаметър около6 cm. Пламъкът под телената мрежа е запален и регулиран предварително така, че да се нагрява само дъното наконичната колба. След това се свързва обратният хладник към коничната колба. Веднага щом това е направено, севари точно 10 min. Охлажда се незабавно в студена вода и след около 5 min се титрува, както следва:

добавят се 10 ml разтвор на калиев йодид (3.15) и незабавно след него, но внимателно (поради опасност отсилно запенване) 25 ml 6 N сярна киселина (3.16). След това се титрува с разтвор на 0,1 N натриев тиосулфат (3.17),докато се появи убито жълто оцветяване, добавят се няколко капки разтвор на нишестен индикатор (3.18) ититруването се довършва.

Същото титруване се провежда и на точно измерена смес от 25 ml на реагента на Luff-Schoorl (3.13) и 25ml вода след добавяне към нея на 10 ml разтвор на калиев йодид и 25 ml 6 N сярна киселина (3.16), но без да се кипи.

5.5. Празна пробаПразната проба се провежда, като се прилага процедурата, описана в т. 5.3 и 5.4, но без проба за

анализиране.6. Пресмятане на резултатитеКато се използва таблицата в приложението, се определя количеството глюкоза в mg, отговарящо на

разликите в резултатите от двете титрувания (изразени като ml 0,1 N натриев тиосулфат) и отнасящи се както допробата за анализ, така и до празната проба.

Съдържанието на нишесте, като процент от пробата, се дава от формулата:0,72 (А - В), където:А е глюкозата, отнасяща се до пробата за анализ, в mg;В - глюкозата, отнасяща се до празната проба (виж наблюдение 7.2),в mg.7. Наблюдения7.1. Когато в пробата присъстват едновременно лактоза и частично или напълно разградено до декстрин

нишесте, резултатът може да бъде завишен с 0,5 до 3 %. В такива случаи действителното съдържание на нишесте сеполучава, както следва:

а) определя се съдържанието на редуциращи захари в етаноловия екстракт, получен в т. 5.2 и резултатът сеизразява като процент глюкоза;

б) определя се съдържанието на водоразтворими редуциращи захари в пробата и резултатът се изразявакато процент глюкоза;

в) резултатът, получен в (а), се изважда от този, получен в (б), и разликата се умножава по 0,9;

г) стойността, получена във (в), се изважда от съдържанието на нишесте, получено чрез прилагане наметода и пресмятането по т. 6.

7.2. Количеството глюкоза, отнасящо се до празната проба, нормално е 0,25 mg. То не може да бъдепо-голямо от 0,50 mg.

8. Указания, отнасящи се за панкреатина:външен вид;жълтеникавобял аморфен прах;съдържание на глюкоза - количеството на глюкоза в празната проба (виж 5.5) нормално е 0,25 mg.

Резултат, по-голям от 0,50 mg, показва, че панкреатинът не може повече да бъде използван.Проверка за свързване на йод:Суспендират се 62,5 mg панкреатин в около 50 ml вода, нагрята до около 25 - 30°C. Добавя се 1 ml 0,1 N

разтвор на йод. Разбърква се 2 min. Титрува се с 0,1 N разтвор на натриев тиосулфат в присъствие на нишестениндикатор. Свързването на йодния разтвор от панкреатина не трябва да надвишава 0,5 ml.

Проверка за амилолитична активност.Смесват се 100 ml разтвор на нишесте (3.18), 5 ml буферен разтвор (3.4), 0,5 ml разтвор на натриев хлорид

(3.5) и 62,5 mg панкреатин. Сместа се нагрява до 25 - 30°C и се разбърква за 2 min. Добавя се 1 ml 0,1 N разтвор найод. Синьото оцветяване от добавянето на разтвора на йод трябва да изчезне в продължение на не повече от 15 min.

Таблица на значенията за 25 ml реактив на Luff-Schoorl ml 0,1 N Na2S2O, нагряване 2 min, кипене 10 min



C6H12O6


Ml mg разлика mg разлика Мг разлика Ml1 2,4 3,6 3,9 1

2,4 3,7 3,92 4,8 7,3 7,8 2

2,4 3,7 3,93 7,2 11,0 11,7 3

2,5 3,7 3,94 9,7 14,7 15,6 4

2,5 3,7 4,05 12,2 18,4 19,6 5

2,5 3,7 3,96 14,7 22,1 23,5 6

2,5 3,7 4,07 17,2 25,8 27,5 7

2,6 3,7 4,08 19,8 29,5 31,5 8

2,6 3,7 4,09 22,4 33,2 35,5 9

2,6 3,8 4,010 25,0 37,0 39,5 10

2,6 3,8 4,011 27,6 40,8 43,5 11

2,7 3,8 4,012 30,3 44,6 47,5 12

2,7 3,8 4,113 33,0 48,4 51,6 13

2,7 3,8 4,114 35,7 52,2 55,7 14

2,8 3,8 4,115 38,5 56,0 59,8 15

2,8 3,9 4,116 41,3 59,9 63,9 16

2,9 3,9 4,117 44,2 63,8 68,0 17

2,9 3,9 4,218 47,1 67,7 72,2 18

2,9 4,0 4,319 50,0 71,7 76,5 19

3,0 4,0 4,420 53,0 75,7 80,9 20

3,0 4,1 4,521 56,0 79,8 85,4 21

3,1 4,1 4,622 59,1 83,9 90,0 22

3,1 4,1 4,623 62,2 80,0 94,6 23

ХХХII. Определяне на ампролиум

1-[(4-амино-2-пропилпиримидин-5-ил)метил]-2-метил-пиридиниум хлорид хидрохлорид1. Цел и обхватТова е метод за определяне на ампролиум в животински храни и предварително приготвени смеси.

Границата на откриване 1 mg/kg, границата на определяне 25 mg/kg.2. ПринципПробата се извлича със смес метанол - вода. След разтваряне с мобилната фаза и мембранна филтрация,

съдържанието на ампролиум се определя с помощта на висококачествена течна хроматография катионен обмен(HPLC), използваща УВ детектор.

3. Реагенти:3.1. метанол;3.2. ацетонитрил, клас HPLC;3.3. вода, клас HPLC;3.4. разтвор на натриев двуводороден фосфат, с = 0,1 mol/l - разтварят се 13,80 g монохидрат на натриев

двуводороден фосфат във вода (3.3) в мерителна колба 1000 ml, долива се до отметката вода (3.3) и се смесва;3.5. разтвор на натриев перхлорат, с = 1,6 mol/l - разтварят се 224,74 g монохидрат на натриев перхлорат

във вода (3) в мерителна колба 1000 ml и се долива до отметката вода (3) и се смесва;3.6. мобилна фаза за HPLC (виж забележка 9.1) - смес на ацетонитрил (3.2), разтвор на натриев

двуводороден фосфат (3.4) и разтвор на натриев перхлорат (3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v), преди употреба сефилтрира през мембранен филтър 0,22 mm (4.3) и се дегазира разтворът (напр. в ултразвукова вана (4.4) най-малко15 min);

3.7. еталонен разтвор: чист ампролиум, 1-[(4-амино-2-пропилпиримидин-5-ил)метил]-2-метил-пиридиниумхлорид хидрохлорид, Е 750 (виж 9.2);

3.7.1. изходен еталонен разтвор на ампролиум 500 µg/ml - претеглят се с точност 0,1 mg 50 mg ампролиум(3.7) в мерителна колба 100 ml, разтварят се в 80 ml метанол (3.1) и колбата се поставя за 10 min в ултразвукова вана(4.4); след ултразвуковата обработка разтворът се довежда до стайна температура, долива се вода до отметката и сесмесва; при температура под 4°C разтворът е стабилен в продължение на един месец;

3.7.2. междинен еталонен разтвор на ампролиум, 50 µg/ml - 5 ml от изходния еталонен разтвор (3.7.1) сепипетират в мерителна колба 50 ml, допълва се до отметката с екстракционния разтворител (3.8) и се смесва. Притемпература под 4°C разтворът е стабилен в продължение на един месец;

3.7.3. калибриращи разтвори - прехвърлят се 0,5; 1 и 2 ml от междинния еталонен разтвор (3.7.2) в няколкомерителни колби 50 ml. Допълват се до отметката с мобилна фаза (3.6) и се смесва. Тези разтвори съответстват 0,5; 1и 2 mg ампролиум на ml. Те се приготвят непосредствено преди употреба;

3.8. екстракционен разтворител - смес метанол (3.1)-вода 2 + 1 (v + v).4. Апарати:4.1. оборудване HPLC с инжекционна система, подходяща за инжектиране на обеми от 100 µl;4.1.1. течна хроматографска колона 125 mm x 4 mm, катионен обмен, пълнеж Nucleosil 10 SA, 10 µm или

еквивалентен;4.1.2. УВ детектор с регулиране дължината на вълната или диоден полеви детектор;4.2. мембранен филтър, материал PTFE, 0,45 µm;

4.3. мембранен филтър, 0,22 µm;4.4. ултразвукова вана;4.5. механичен вибратор или магнитна бъркалка.5. Процедура5.1. Общи положения5.1.1. Празна проба хранаЗа осъществяване на теста на възстановяване (5.1.2) трябва да се анализира празна проба храна, за да се

провери отсъствието на ампролиум и на субстанции, които оказват влияние. Празната проба храна трябва да бъдеподобна по вид на пробата и ампролиум или субстанциите, които оказват въздействие.

5.1.2. Тест за възстановяванеТрябва да се извърши тест за възстановяване чрез анализиране на празна проба храна, към който е било

добавено количество ампролиум, подобно на наличното в пробата. За да се получи концентрация 100 mg/kg, 10 ml отизходния еталонен разтвор (3.7.1) се прехвърлят в ерленмайерова колба 250 ml и разтворът се изпарява до около 0,5ml. Прибавят се 50 g от празната проба храна, разбърква се добре и се оставя за 10 min, като отново се разбъркваняколко пъти, преди да се пристъпи към екстракцията (5.2).

Алтернативно, ако няма на разположение празна проба храна, подобна на пробата (вж. 5.1.1), тестът навъзстановяване може да се извърши чрез метода добавяне на еталон. В този случай пробата, която трябва да сеанализира, се подсилва с количество ампролиум, подобно на това, което вече се съдържа в пробата. Тази проба сеанализира заедно с неподсилената проба и възстановяването се изчислява чрез изваждане.

5.2. Екстракция5.2.1. Предварително приготвени смеси (съдържание < 1 % ампролиум) и животински храниС точност до 0,01 g се претеглят 5 до 50 g от пробата в зависимост от съдържанието на ампролиум в

ерленмайерова колба 500 ml, прибавят се 200 ml екстракционен разтвор (3.8). Колбата се поставя за 15 min вултразвукова вана (4.4). Колбата се изважда от ултразвуковата вана, разбърква се с вибратора или бъркалката (4.5) впродължение на 1 h. Аликватът на екстракта се разрежда с мобилната фаза (3.6) до съдържание на ампролиум от 0,5до 2 µg/ml и се смесва (виж забележка 9.3) 5 до 10 ml от този разреден разтвор се филтрират през мембранен филтър(4.2). Продължава се с определяне с помощта на HPLC (5.3).

5.2.2. Предварително приготвени смеси (съдържание і 1 % ампролиум)С точност до 0,001 g се претеглят 1 до 4 g от предварително приготвената смес в зависимост от

съдържанието на ампролиум в ерленмайерова колба 500 ml, прибавят се 200 ml екстракционен разтвор (3.8). Колбатасе поставя за 15 min в ултразвукова вана (4.4). Колбата се изважда от ултразвуковата вана, разбърква се с вибратораили бъркалката (4.5) в продължение на 1 h. Аликватът на екстракта се разрежда с мобилната фаза (3.6) досъдържание на ампролиум от 0,5 до 2 µg/ml и се смесва (виж забележка 9.3). 5 до 10 ml от този разреден разтвор сефилтрират през мембранен филтър (4.2). Продължава се с определяне с помощта на HPLC (5.3).

5.3. Определяне с HPLC5.3.1. Параметри - следните условия се предлагат като насоки. Могат да се използват други условия, ако те

дават еквивалентни резултати.

Течно-хроматографска 125 mm x 4 mm катионно -колона(4.1.1): обменен пълнеж SA, 10 µmNucleosil 10 или еквивалентенПодвижна фаза смес от ацетонитрил, нат-

риев дихидроген фосфатенразтвор (3.4) и разтворот натриев перхлорат(3.5),450 + 450 + 100(v+v+v)

скорост на изтичане 0,7 за 1ml/minдължина на вълната: 264 nmинжекционен обем 100 µl

Необходимо е да се провери стабилността на хроматографската система, като се инжектира няколко пътикалибриращият разтвор (3.7.3), съдържащ 1,0 µg/ml, докато се постигнат постоянни височини на пиковете и време назабавяне.

5.3.2. Калибрираща графикаНяколко пъти се инжектира калибриращ разтвор (3.7.3) и се определят средноаритметичните височини

(площ) на пиковете за всяка концентрация. Начертават се калибриращата графика, като се използват средноаритметичните височини (площ) на пиковете на калибриращите разтвори за ординати и съответните концентрации вµg/ml за абсциси.

5.3.3. Разтвор на пробата

Екстракт от пробата се инжектира (5.2) няколко пъти, като се използва същият обем като приетия закалибриращите разтвори и се определят средноаритметичните височини (площ) на пиковете на ампролиум.

6. Изчисляване на резултатитеОт средноаритметичните височини (площ) на пиковете на ампролиум на разтвора се определя

концентрацията на разтвора на пробата в µg/ml чрез сравняване с калибриращата графика (5.3.2). Съдържанието наампролиум w в mg/kg в пробата се дава със следната формула:

V.b.f

w = [mg/kg],

m

където:V е обемът на екстракционния разтворител (3.8) в ml в съответствие с т. 5.2 (т.е. 200 ml);b - концентрацията на ампролиум в екстракта на пробата (5.2) в mg/ml;f - коефициент на разреждане съгласно т. 5.2;m - масата на изпитваната част в g (5.2).7. Установяване на достоверността на резултатите7.1. ИдентичностИдентичността на аналита може да се потвърди чрез ко-хроматография или използване на диоден полеви

детектор, чрез които се сравняват спектрите на екстракта на пробата (5.2) и на калибриращия разтвор (3.7.3),съдържащ 2,0 µg/ml.

7.1.1. Ко-хроматографияЕкстракт на пробата се подсилва чрез добавяне на подходящо количество калибриращ разтвор (3.7.3).

Количеството на добавения ампролиум трябва да бъде подобно на количеството ампролиум, открито в екстракта напробата.

Само височината на пика на ампролиум трябва да се увеличи, след като се вземат предвид кактодобавеното количество, така и разреждането на екстракта. Широчината на пика, по средата на неговата височина,трябва да бъде в рамките на ± 10 % от оригиналната широчина на пика на ампролиум на неподсилен екстракт наразтвора.

7.1.2. Диодна полева детекцияРезултатите се оценяват съгласно следните критерии:(а) дължината на вълната на максимална абсорбция на пробата и на еталонните спектри, записани при

връхната точка на пика на хроматограмата, трябва да бъдат в рамките на допустимата граница, определена отразрешаващата способност на системата за детекция. За диодната детекция типично тя е в рамките на ± 2 nm;

(б) между 210 и 320 nm спектрите на пробата и на еталона, регистрирани във връхната точка на пика нахроматограмата, не трябва да се различават за частите на спектъра, разположени между 10 и 100 %, от относителнатаабсорбция; този критерий е изпълнен, когато са налице едни и същи максимални стойности и когато никъденаблюдаваното отклонение между спектрите не превишава 15 % от абсорбцията на спектъра на еталонния аналит;

(в) между 210 и 320 nm спектрите на възходящия наклон, връхната точка и низходящия наклон на пика,произведени от екстракта на пробата, не трябва да се различават един от друг за частите на спектъра, разположенимежду 10 и 100 % на относителната абсорбция; този критерий е изпълнен, когато са налице едни и същи максималнистойности и когато във всички наблюдавани точки отклонението между спектрите не превишава 15 % отабсорбцията на спектъра във връхната точка на пика.


трябва да превишава:15 % от най-високия резултат - за съдържание на ампролиум между 25 mg/kg и 500 mg/kg;75 mg/kg съдържание на ампролиум между 500 mg/kg и 500 mg/kg;7,5 % от най-високия резултат - за съдържание на ампролиум над 1000 mg/kg.7.3. ВъзстановяванеЗа една подсилена празна проба възстановяването трябва да бъде най-малко 90 %.8. Резултати от съвместното изследванеПри провеждане на изследване и анализиране на три мостри храни за птици (проби 1 - 3), една минерална

храна (проба 4) и предварително приготвена смес (проба 5) се постигат следните резултати:

Проба1 Проба2 Проба3 Проба4 Проба5

L 14 14 14 14 15

n 56 56 56 56 60

Mean - 45=5 188 5129 25 140[mg/kg]

SR - 2,26 3,57 178 550

CVR[ %] - 4,95 1,90 3,46 2,20

sr: - 2,95 11,8 266 760

CVr[ %]: - 6,47 6,27 5,19 3,00

Номинално - 50 200 5000 25 000съдържание[mg/kg]

L - брой на лабораториите;n - брой на индивидуалните стойности;SR - стандартно отклонение на повторяемостта;CVR - коефициент на вариации на повторяемост;sr: - стандартно отклонение на възпроизводимост;CVr: - коефициент на вариации на възпроизводимост.9. Забележки9.1. Ако пробата съдържа тиамин, пикът на тиамина на хроматограмата се появява малко преди пика на

ампролиум. Като се следва този метод, ампролиумът и тиаминът трябва да се разделят. Ако тиаминът иампролиумът не се разделят с помощта на колона (4.1.1), използвана при този метод, до 50 % от ацетонитрилнатачаст на мобилната фаза се заменя (3.6) с метанол.

9.2. Съгласно британската фармакопея спектър на разтвор на ампролиум (с = 0,02 mol/l) показвамаксимуми при 246 nm и 262 nm. Абсорбцията ще възлезе на 0,84 при 246 nm и 0,80 при 262 nm.

9.3. Екстрактът трябва винаги да бъде разреден с мобилна фаза, защото иначе времето на забавяне на пикана ампролиума може значително да се премести поради промени в йонната сила.

ХХХIII. Определяне на етопабат

(метил-4-ацетамидо-2-етоксибензоат)1. Цел и обхватТози метод дава възможност за определяне количеството на етопабат в продукти за изхранване на

животни, концентрати и премикси. Долната граница на определянето е 2 ppm.2. ПринципПробата се екстрахира с разреден метанол. Разтворът се подкислява и екстрахира с хлороформ.

Хлороформният екстракт се промива първо с алкален разтвор и след това с вода. Пречистеният екстракт секонцентрира, етопабатът се хидролизира с разредена солна киселина. Образуваното по този начин аминопроизводносе диазотира и куплира с 2-аминоетил-1-нафтиламин. Цветният комплекс се екстрахира с бутанол и оптическатаплътност на разтвора се измерва при 555 nm.

3. Реактиви:3.1. метанол, ч.з.а;3.2. метанол, 50 % (о/о) - смесват се еднакви обеми метанол (3.1) и вода;3.3. солна киселина, ч.з.а, плътност 1,19;3.4. солна киселина, разредена 1 : 10 - 10,0 ml солна киселина (3.3) се разрежда с вода до 100 ml;3.5. солна киселина, около 0,3 N - разреждат се 25 ml солна киселина (3.3) до 1000 ml с вода;3.6. хлороформ, ч.з.а;3.7. разтвор на натриев карбонат, 4 % (т/о) - разтварят се 40 g безводен натриев карбонат, ч.з.а, във вода и

разтворът се довежда до 1000 ml с вода;3.8. разтвор на натриев нитрит, 0,2 % (т/о) - разтварят се във вода 100 mg натриев нитрит, ч.з.а., и обемът се

довежда до 50 ml с вода в мерителна колба; приготвя се непосредствено преди употреба;3.9. разтвор на амониев сулфамат, 1,0 % (т/о) - разтварят се във вода 500 mg амониев сулфамат, ч.з.а., и

обемът се довежда до 50 ml с вода в мерителна колба; приготвя се непосредствено преди употреба;3.10. разтвор на 2-аминоетил-1-нафтиламин, 0,2 % (т/о) - разтварят се във вода 100 mg

2-аминоетил-1-нафтиламин, ч.з.а., и обемът се довежда до 50 ml с вода в мерителна колба; приготвя се

непосредствено преди употреба;3.11. безводен натриев хлорид, ч.з.а;3.12. n-бутанол, ч.з.а;3.13. стандартна субстанция - чист етопабат;3.14. стандартни разтвори:3.14.1. разтвор на етопабат 0,040 mg/ml - претеглят се с точност 0,1 mg 40 mg от стандартната субстанция

(3.13); разтварят се в метанол (3.2) в мерителна колба от 100 ml, обемът се допълва със същия разтворител и сесмесва; разреждат се с метанол (3.2) 10,0 ml от този разтвор до 100 ml в мерителна колба; полученият разтвор естабилен в течение на един месец;

3.14.2. разтвор на етопабат 0,016 mg в 20 ml - в мерителна колба от 250 ml се разреждат с метанол (3.2) 5 mlот разтвора (3.14.1) и се смесват добре; приготвя се преди употреба.

4. Апаратура:4.1. конични колби от 250 ml с шлифови запушалки;4.2. делителни фунии от 100 ml с шлифови запушалки;4.3. клатачна машина;4.4. ротационен вакуум изпарител с колби от 250 ml;4.5. водна баня;4.6. центрофуга с епруветки от 50 и 15 ml с шлифови запушалки;4.7. въздушен хладник с шлифова свръзка;4.8. спектрофотометър с кювети от 10 mm.5. Процедура5.1. ЕкстракцияКоличество от фино раздробена и хомогенизирана проба, съдържаща около 80 mg етопабат, се претегля с

точност до 1 mg. Изследваната порция се пренася в конична колба от 250 ml (4.1) и се добавят 100,0 ml разреденметанол (3.2). Колбите се запушват и се разклащат един час на клатачката (4.3). Декантира се, филтрува се и първитемилилитри от филтрата се отстраняват.

5.2. ПречистванеЗабележка: Всички операции по тази точка трябва да бъдат проведени бързо.Пренасят се 20 ml от бистрия екстракт в делителна фуния от 100 ml (4.2), добавят се 5 ml от разредената

1:10 солна киселина (3.4) и 20 ml хлороформ (3.6). Отначало се разклаща внимателно, а после енергично за 3 min.Оставя се, докато се разделят зоните и фазата на хлороформа се събира във втора делителна фуния от 100 ml (4.2).

Киселата фаза се екстрахира още два пъти с по 20 ml хлороформ (3.6). Хлороформените екстракти сесъбират във втората делителна фуния, а киселата фаза се изхвърля. Към комбинирания хлороформен разтвор седобавят 10 ml разтвор на натриев карбонат (3.7), разклаща се 3 min и се оставя фазите да се разделят. Фазата нахлороформа се събира в трета делителна фуния (4.2), а водната фаза се изхвърля. Към хлороформения разтвор седобавят 10 ml разтвор на натриев карбонат (3.7), разклаща се 3min и се оставя фазите да се разделят.

Фазата на хлороформа се събира в четвърта делителна фуния от 100 ml (4.2), промива се двукратно с по 25ml вода, водните фази се отделят, а хлороформеният екстракт се събира количествено в колба от 250 ml (4.4).Водните фази се събират в една от делителните фунии; всяка делителна фуния се промива с няколко милилитрахлороформ, водната фаза се екстрахира със същите милилитри хлороформ, оставя се фазите да се разделят и фазатана хлороформа се добавя към хлороформения екстракт в колбата.

5.3. ХидролизаС помощта на ротационния вакуум изпарител (4.4) хлороформеният екстракт се изпарява до около 2 ml на

водна баня при температура 50°C. Остатъкът се разтваря в 2 - 3 ml метанол (3.1) и разтворът се пренася количественов центрофужна епруветка от 50 ml с помощта на две порции от по 10 ml и една порция от 5 ml 0,3 N солна киселина(3.5). Съединява се въздушният хладник (4.7), добавят се няколко парченца стъкло, разклаща се добре, епруветкатасе потопява в кипяща водна баня и се държи там 45 min. След това се охлажда на струя студена течаща вода.

5.4. Развитие на цветната реакция и измерване на оптическата плътностДобавя се 1,0 ml разтвор на натриев нитрит (3.8), разбърква се и се оставя да престои 2 min. Добавя се 1,0

ml разтвор на натриев сулфамат (3.9), разклаща се и се оставя да престои 2 min. Добавя се 1,0 ml разтвор на2-аминоетил-1-нафтиламин (3.10), разклаща се и се оставя да престои 10 минути. Добавят се 0,5 g натриев хлорид(3.11) и 10.0 ml n-бутанол (3.12), разклаща се енергично, докато натриевият хлорид се разтвори напълно.

Супернатантният бутанолов разтвор се изтегля с пипета, пренася се в центрофужна епруветка от 15 ml(4.6) и се центрофугира. Оптическата плътност (ЕА) се измерва на спектрофотометър при 555 nm срещу n-бутанол(3.12).

5.5. Контролен тестКонтролният тест се провежда с 20 ml метанол (3.2) по същата процедура, като се започне от т. 5.2.

Оптическата плътност (ЕB) се измерва при 555 nm срещу n-бутанол (3.12).5.6. Стандартен тест

Стандартният тест се провежда с 20 ml стандартен разтвор (3.14.2) по същата процедура, като се започнеот т. 5.2. Оптическата плътност (ЕС) се измерва при 555 nm срещу n-бутанол (3.12).

6. Пресмятане на резултатиСъдържанието на етопабат в mg на килограм проба се дава от формулата:(ЕА - ЕВ) / (ЕС - ЕВ) . 80/W,където:ЕА е оптическата плътност на разтвора от пробата;ЕВ - оптическа плътност на разтвора от контролния тест;ЕС - оптическа плътност на разтвора от стандартния тест;W - теглото на порцията за изследване в грамове.7. ПовторяемостРазликите между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не

трябва да надвишават:• 20 %, като относителна стойност - за съдържание на етопабат под 7,5 ppm;• 1,5 ppm, като абсолютна стойност, за съдържание между 7,7 и 10 ppm;• 15 %, като относителна стойност, за съдържание над 10 ppm.

ХХХIV. Определяне на динитолмид (ДОТ)

(3,5-динитро-о-толуамид)1. Цел и обхватТози метод дава възможност за определяне количеството на динитолмид (ДОТ) в продукти за изхранване

на животни, концентрати и премикси. Нитрофуранови производни могат да пречат. Долната граница наопределянето е 40 ppm.

2. ПринципПробата се екстрахира с ацетонитрил. Екстрактът се пречиства върху алуминиев окис и се филтрува.

Аликвота от филтрата се изпарява до сухо. Остатъкът се разтваря в диметилформамид и се обработва сетилендиамин, с който образува пурпурен комплекс. Динитолмидът се определя спектрофотометрично при 560 nm.

3. Реактиви:3.1. Ацетонитрил, 85 % (о/о) - смесват се 850 ml чист ацетонитрил и 150 ml вода. Сместа се дестилира

преди употреба, като се събира фракцията, която кипи между 75 и 77°C.3.2. Алуминиев окис за колонна хроматография - накалява се при 750°C най-малко два часа, охлажда се в

ексикатор и се съхранява в бутилка от кафяво стъкло с шлифова запушалка. Преди употреба се навлажнява, кактоследва: в бутилка от кафяво стъкло се поставят 10 g алуминиев окис и 0,7 ml вода, бутилката се запушва, нагрява се5 min на кипяща водна баня, като енергично се разклаща, оставя се да се охлади, като разклащането се продължава;активността се проверява, като се подлага на анализ, започвайки от т. 5.1, определено количество от стандартнияразтвор (3.6). Добивът от динитолмид трябва да бъде 100±2 %.

3.3. N, N-диметилформамид, 95 % (о/о) - смесват се 95 ml N, N-диметилформамид, ч.з.а., и 5,0 ml вода;3.4. Диаминоетан, ч.з.а., с максимално водно съдържание 2 %.3.5. Стандартна субстанция - чист 3,5-динитро-о-толуамид, отговарящ на следната характеристика:точка на топене: 177°C;молекулярен екстинкционен коефициент при 248 nm в ацетонитрил - 13,1 при 10,3;молекулярен екстинкционен коефициент при 266 nm в N, N-диметилформамид - 10,1 при 10,3.3.6. Стандартен разтвор - претеглят се с точност до 0,1 mg 40 mg от стандартната субстанция (3.5) и се

разтварят с ацетонитрил (3.1) в мерителна колба от 200 ml. Обемът се допълва със същия разтворител и се смесва. 20ml се разреждат до 100 ml с ацетонитрил (3.1) в мерителна колба и се смесват. 1 ml от този разтвор съдържа 40 mgдинитолмид.

4. Апаратура:4.1. конична колба от 250 ml с шлифова запушалка;4.2. обратен хладник с шлифова свръзка;4.3. шот-филтър G3 с диаметър 60 mm;4.4. вакуумфилтър (такъв като апарат на Witt);4.5. водна баня, регулирана на 50°C;4.6. спектрофотометър с кювети от 10 mm.5. Процедура5.1. Екстракция и пречистване10 g фино раздробена и хомогенизирана проба се претеглят с точност до 1 mg. За концентрати и премикси

се претегля 1 g с точност 1 mg. Порцията за изследване се поставя в конична колба от 250 ml (4.1) и се добавят 65 mlацетонитрил (3.1). Смесва се, монтира се обратният хладник (4.2) към колбата и се нагрява на водна баня (4.5) за 30

min, като непрекъснато се разклаща. Охлажда се под струя студена вода. Добавят се 20 g алуминиев окис (3.2),охлажда се 3 min и се оставя да се утаи.

Мерителна колба от 100 ml се поставя във филтрувалния апарат (4.4), закрепва се шотфилтърът (4.3) иразтворът се филтрува при изсмукване. Неразтворените остатъци в колбата се пренасят във филтъра с няколко mlацетонитрил (3.1) и се изсмуква до сухо. Вакуумът се освобождава. Остатъкът върху филтъра се ресуспендира вняколко ml ацетонитрил (3.1) и се филтрува отново. Тази операция се повтаря, докато обемът на филтрата достигнедо около 95 ml. Долива се до 100 ml с ацетонитрил (3.1) и се смесва. Ако е необходимо, аликвотът се разрежда сацетонитрил (3.1) така, че да се получи разтвор, съдържащ от 5 до 15 mg динитолмид на 1 ml.

5.2. Развитие на цветната реакция и измерване на оптическата плътностВ три бехерови чаши от 50 ml, съответно А, Б и В, се пипетират по 4 ml от разтвора, получен в т. 5.1. Само

в чаша В се добавя 1 ml от стандартния разтвор (3.6). Трите чаши се поставят на водна баня (4.5) в камина с добравентилация и се изпаряват до сухо в поток на сух въздух. Трите чаши се охлаждат при стайна температура.

В чаша А се добавят 10 ml N, N-диметилформамид (3.3) и по 2 ml в чашите Б и В. Оставят се за няколкоминути, като се разбъркват по малко, докато остатъкът се разтвори напълно. След това в чашите Б и В се добавя по 8ml диаминоетан (3.4) и се разбърква. Точно 5 min след добавянето на диаминоетана оптическата плътност на тритеразтвора се измерва на спектрофотометър (4.6) при 560 nm срещу N, N-диметилформамид (3.3).

6. Пресмятане на резултатитеСъдържанието на динитолмид в mg/kg проба се получава по формулата:(ЕВ - ЕА) / (ЕС - ЕВ) * F / W * 1000 ,където:ЕА е оптическата плътност на разтвор А (празна проба);ЕВ - оптическата плътност на разтвор В (проба за анализиране);ЕС - оптическата плътност на разтвор С (вътрешен стандарт);W - теглото на порцията за изследване в грамове;F - коефициент на разреждане (възможно направено в т. 5.1).7. ПовторяемостРазликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени на една и съща проба, не трябва да

надвишават:• 10 ppm, като абсолютна стойност - за съдържание на динитолмид под 100 ppm;• 10 %, като относителна стойност - за съдържание между 100 и 5000 ppm;• 500 ppm, като абсолютна стойност - за съдържание между 5000 и 10 000 ppm;• 5 %, като относителна стойност - за съдържание над 10 000 ppm.

ХХХV. Определяне на никарбазин

(еквимолекулярна смес от 4,4'-динитрокарбанилид и 2-хидрокси-4,6-диметилпиримидин)1. Цел и обхватТози метод дава възможност за определяне количеството на никарбазин в продукти за изхранване на

животни, концентрати и премикси, съдържащи не повече от 5 % тревно брашно. Нитрофуранови производни,ацетиленхептин и карбадокс могат да пречат. Долната граница на определянето е 20 ppm.

2. ПринципПробата се екстрахира с N, N-диметилформамид. Екстрактът се пречиства чрез хроматография на колона с

алуминиев окис; никарбазинът се елюира с етанол. Елюатът се обработва с разтвор на натриева основа в етанол, прикоето се развива жълто оцветяване. Никарбазинът се определя спектрофотометрично при 430 nm.

3. Реактиви:3.1. N, N-диметилформамид, ч.з.а.;3.2. алуминиев окис за колонна хроматография - накалява се при 750°C най-малко за 2 h, охлажда се в

ексикатор и се съхранява в бутилка от кафяво стъкло с шлифова запушалка; преди използване активността сепроверява, като се подлага на анализ, започвайки се от т. 5.2, определено количество от стандартния разтвор (3.8.3);добивът от никарбазин трябва да бъде 100 ± 2 %.

3.3. етанол, ч.з.а., 95 % (о/о);3.4. етанол, ч.з.а., 80 % (о/о);3.5. разтвор на натриева основа, ч.з.а., 50 % (т/о);3.6. разтвор на натриева основа в етанол, 1 % (т/о) - в мерителна колба от 50 ml се поставят 1 ml от

разтвора на натриева основа (3.5) и обемът се допълва с 80 %-ен етанол (3.4). Приготвя се по време на употреба.3.7. стандартна субстанция:чист никарбазин;молекулярен екстинкционен коефициент при 362 nm N, N-диметилформамид: 37,8 при 10,3;3.8. стандартни разтвори:

3.8.1. разтвор на никарбазин, 1,25 mg/ml - претеглят се с точност до 0,1 mg 125 mg от стандартнатасубстанция (3.7); разтварят се в 75 ml в N, N-диметилформамид (3.1) в мерителна колба от 100 ml, подгрява се леко,оставя се да се охлади, обемът се допълва със същия разтворител и се смесва; пази се далеч от светлина.

3.8.2. разтвор на никарбазин, 0,125 mg/ml - 10 ml от разтвор (3.8.1) се разреждат с N, N-диметилформамид(3.1) до 100 ml в мерителна колба и се смесва;

3.8.3. разтвор на никарбазин, 0,025 mg/ml - 20 ml от разтвор (3.8.2) се разреждат с N, N-диметилформамид(3.1) до 100 ml в мерителна колба и се смесва.

4. Апаратура:4.1. конична колба от 250 ml с шлифова запушалка;4.2. обратен хладник с шлифова свръзка;4.3. кипяща водна баня;4.4. центрофуга с епруветки от 120 ml;4.5. стъклена колона за хроматография (вътрешен диаметър 25 mm, дължина 300 mm);4.6. спектрофотометър с кювети от 10 mm;4.7. бюрета, градуирана на 1/10 ml.5. Процедура5.1. Екстракция10 g фино раздробена и хомогенизирана проба се претеглят с точност до 1 mg. За концентрати и премикси

се претегля 1 g с точност 1 mg. Порцията за изследване се поставя в конична колба от 250 ml (4.1) и се добавят точно100 ml N, N-диметилформамид (3.1). Смесва се, монтира се обратният хладник (4.2) към колбата и се нагрява наводна баня (4.3) за 15 min, като се разклаща от време на време. Охлажда се под струя студена вода. След това вцентрофужна епруветка (4.4) се излива супернатантният слой и се центрофугира около 3 min. Ако е необходимо, 25ml от супернатантния слой се разреждат с N, N-диметилформамид (3.1), за да се получи разтвор, съдържащ от 2 до10 mg никарбазин.

5.2. ХроматографияВ колоната за хроматографиране (4.5) се налива суспенсия от 30 g алуминиев окис (3.2) в N,

N-диметилформамид (3.1). Нивото на течността се оставя да спадне до 1 cm над алуминиевия окис, след което вколоната се наливат 25 ml от екстракта, получен в т. 5.1. Течността се оставя да изтича и, като не се позволява наколоната да изсъхне, тя се промива с три порции от по 10 ml N, N-диметилформамид (3.1). След това се елюира със70 ml 95 %-ен етанол (3.3). Първите 10 ml от елюата се елиминират, а остатъкът се разделя, както следва:

една порция от 5 ml (а);една порция от 50 ml в мерителна колба (б);

една порция от 5 ml (в).Проверява се дали порциите (а) и (в) не се оцветяват жълто, когато се добави етанолов разтвор на натриева

основа (3.6). Операциите продължават с порция (б), както е указано в т. 5.3.5.3. Развитие на цветната реакция и измерване на оптическата плътностВ две отделни мерителни колбички от 25 ml, А и Б, се пипетират по 20 ml от порция (в) на елюата. В колба

А се добавят 5 ml от етаноловия разтвор на натриева основа (3.6), а в колба Б - 5 ml 95 %-ен етанол (3.3). Смесва седобре.

Оптическата плътност на двата разтвора се измерва в следващите 5 min при 430 nm срещу смес от 20 ml 95%-ен етанол (3.3) и 5,0 ml етанолов разтвор на натриева основа (3.6).

Изважда се стойността на оптическата плътност на разтвор Б от тази на разтвор А. От тази стойност сеопределя количеството никарбазин чрез сравняване с калибровъчна крива 5.4.

5.4. Калибровка25 ml от стандартния разтвор (3.8.3) се подлагат на хроматографиране, както е указано в т. 5.2. Порция (б)

на елюата се налива в градуирана бюрета (4.7) и разпределя в мерителни колби от 25 ml в обеми, както следва: 2; 4;6; 8 и 10 ml (отговарящи съответно на 0,025; 0,050; 0,075; 0,100 и 0,125 mg никарбазин). Във всяка колба се добавят 5ml етанолов разтвор на натриева основа (3.6), обемите се допълват с 95 %-ен етанол (3.3) и се смесват добре.

Оптическата плътност на разтворите се измерва в следващите 5 min при 430 nm срещу смес от 20 ml 95%-ен етанол (3.3) и 5 ml етанолов разтвор на натриева основа (3.6).

Калибровъчната крива се построява, като се нанасят значенията за оптическата плътност по ординатата, асъответните количества никарбазин в mg - по абсцисата.

6. Пресмятане на резултатиСъдържанието на никарбазин в mg на килограм проба се дава от формулата:

A/W*F*10 000,

където:

А е количеството никарбазин в mg, както е определено при фотометричното измерване;W - теглото на порцията за изследване в грамове;F - коефициент на разреждане (възможно направено в т. 5.1).7. ПовторяемостРазликите между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не

трябва да надвишават:• 10 ppm, като абсолютна стойност - за съдържание на никарбазин по-малко от 100 ppm;• 10 % като относителна стойност - за съдържание между 100 и 5000 ppm;• 500 ppm като абсолютна стойност - за съдържание между 5000 и 10 000 ppm;• 5 % като относителна стойност - за съдържание над 10 000 ppm.

ХХХVI. Определяне на менадион (витамин K3)

1. Цел и обхватТози метод дава възможност за определяне количеството на менадион (витамин К3) в продукти за

изхранване на животни, концентрати и премикси. Долната граница на определянето е 1 ppm.2. ПринципПробата се екстрахира с разреден етанол. Сместа се избистря с разтвор на танин и се центрофугира.

Екстрактът се обаботва с разтвор на натриев карбонат; освободеният менадион се екстрахира с 1,2-дихлоретан. Взависимост от съдържанието на менадион дихлоретановият екстракт се обработва или директно, или следизпаряване. Обработването се извършва с 2,4-динитрофенилхидразин в етанол, подкислен със солна киселина.Полученият хидразон, обработен с излишък от амоняк, образува синьозелено оцветен комплекс, чиято оптическаплътност се измерва при 635 nm.

3. Реактиви:3.1. етанол, 96 % (о/о);3.2. етанол (3.1), разреден до 40 % с вода;3.3. разтвор на танин, 10 % (т/о) - приготвя се от пречистен, пулверизиран танин;3.4. 1,2-дихлоретан, ч.з.а.;3.5. разтвор на безводен натриев карбонат, ч.з.а., 10 %, (т/о);3.6. солна киселина, 37 % (т/о), плътност 1,19;3.7. абсолютен алкохол, ч.з.а.;3.8. реактив с 2,4-динитрофенилхидразин - 40 mg 2,4-динитрофенилхидразин, ч.з.а., се разтварят при

кипене в около 40 ml абсолютен алкохол (3.7); оставя се да се охлади и се пренася в мерителна колба от 50 ml;добавя се 1 ml солна киселина (3.6.) и обемът се допълва с абсолютен алкохол (3.7.); приготвя се непосредственопреди употреба;

3.9. амоняк, 25 % (т/о), плътност 0,91;3.10. смес на амоняк с етанол - смесва се 1 обем етанол (3.7) с 1 обем амоняк (3.9).3.11. стандартни разтвори на менадион - разтварят се 20 mg менадион (витамин К3) в 1,2-дихлоретан (3.4)

и обемът се довежда до 200 ml. Аликвоти от този резервен разтвор се разреждат с 1,2-дихлоретан (3.4) така, че да сеполучи серия от разтвори, с концентрации между 2 и 10 mg/ml; тези разтвори трябва да бъдат свежо приготвени.

4. Апаратура:4.1. механична клатачка;4.2. центрофуга (3000 - 5000 min-1);4.3. делителни фунии от 100 и 250 ml с шлифови запушалки;4.4. ротационен вакуумизпарител с колби от 250 ml;4.5. водна баня;4.6. спектрофотометър с кювети от 10 mm.5. ПроцедураЗабележка: Всички операции трябва да бъдат проведени далеч от пряка светлина, с използване на

оборудване от тъмно стъкло, където е необходимо.5.1. Проба за изследванеОт фино раздробената проба се взема проба за изследване, в зависимост от предполагаемото съдържание

на менадион, напр.:от 0,1 до 5 g, за концентрати и премикси;от 20 до 30 g, за продукти за изхранване на животни.Пробата се пренася незабавно в колба от 250 ml с шлифована запушалка.5.2. ЕкстракцияКъм пробата се прибавят точно 96 ml разреден етанол (3.2) и механично се разклаща 15 min при стайна

температура. След това се прибавят 4 ml разтвор на танин (3.3), смесва се, екстрактът се пренася в центрофужнаепруветка, центрофугира се при 3000 до 5000 min-1 и се декантира.

Точно премерени 20 до 40 ml от екстракта се пренасят в делителна фуния от 250 ml, добавят се с пипета 50ml 1,2-дихлоретан (3.4), смесва се и се добавят с пипета 20 ml разтвор на натриев карбонат (3.5). Разклаща сеенергично 30 sec, след което фазата на дихлоретана се събира в делителна фуния от 100 ml. Добавят се 20 ml вода,разклаща се отново за 15 sec и фазата на дихлоретана се събира, като се отделят следите от вода с лентичкифилтърна хартия.

При концентрати и премикси се взема аликвота от екстракта и се разрежда с 1,2-дихлоретан (3.4) така, чеда се получи концентрация на менадион от 2 до 10 mg/ml. При продукти за изхранване на животните аликвота отекстракта се изпарява до сухо под намалено налягане в азотна атмосфера на водна баня при 40°C. Остатъкът сеобработва бързо с 1,2-дихлоретан (3.4) така, че да се получи концентрация на менадион от 2 до 10 mg/ml.

5.3. Образуване на хидразон2 ml от дихлоретановия екстракт, получен в т. 5.2, се пренасят в мерителна колба от 10 ml и се добавят 3 ml

от реактива с 2,4-динитрофенилхидразин. Колбата се затваря здраво със запушалка от корк или тефлон, за да сеизбегне изпаряването, и се нагрява два часа при 70°C на водна баня. Оставя се да се охлади, добавят се 3 ml смес наамоняк и етанол (3.10), смесва се, допълва се обемът с абсолютен етанол и отново се смесва.

5.4. Измерване на оптическата плътностОптическата плътност на синьозелено оцветения комплекс се измерва на спектрофотометър при 635 nm

срещу проба на реагента, получена чрез обработване на 2,0 ml 1,2-дихлоретан (3.4), както е посочено в т. 5.3.Количеството на менадиона се определя по калибровъчна крива, построена за всяка серия анализи.5.5. Калибровъчна крива2 ml от стандартните разтвори на менадион (3.11) се обработват, както е описано в т. 5.3. Оптическата

плътност се измерва, както е посочено в т. 5.4. Калибровъчната крива се построява, като значенията на оптическатаплътност се нанасят по ординатата, а съответните количества менадион в mg - по абсцисата.

6. Пресмятане на резултатитеКоличеството на менадион в пробата се пресмята, като се вземат предвид теглото на пробата и

разрежданията, направени в хода на анализа.Резултатите се изразяват в mg менадион на kg.7. ПовторяемостРазликите между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не

трябва да надвишават:• 20 %, като относителна стойност - за съдържание на менадион по-малко от 10 ppm;• 2 ppm, като абсолютна стойност - за съдържание между 10 и 14 ppm;• 15 %, като относителна стойност - за съдържание между 14 и 100 ppm;• 15 ppm, като абсолютна стойност - за съдържание между 100 и 150 ppm;• 10 %, като относителна стойност - за съдържание по-голямо от 150 ppm.

ХХХVII. Определяне на Афлатоксин В1

А. МЕТОД НА ЕДНОДИМЕНСИОНАЛНА ТЪНКОСЛОЙНА ХРОМАТОГРАФИЯ1. Цел и обхватТози метод позволява определяне на количеството Афлатоксин В1 в следните храни за животни: фъстъци,

копра, ленено семе, соя, сусам, кюспе от бабасу, палмово и царевично масло, готови тестени храни и зърненипродукти, грахово брашно, картофен пулп и нишесте. Долната граница на определение е 0,01 mg/kg (10 ppb).

В присъствието на пречещи субстанции, които затрудняват определението, е необходимо да се започнеанализът отново, като се използва метод Б (двудименсионална тънкослойна хроматография).

2. ПринципПробата се подлага на екстрахиране с хлороформ. Екстрактът се филтрува, взима се аликвотна част и се

пречиства чрез колонна хроматография върху силикагел. Извлекът се изпарява и остатъкът се разтваря повторно вопределен обем хлороформ или смес от бензол и ацетонитрил. Аликвотна част от този разтвор се под-лага натънкослойна хроматография (ТСХ). Количеството Афлатоксин В1 се определя с ултравиолетово облъчване нахроматограмата или визуално, или чрез флуороденситометрия, чрез сравняване с познати количества стандартенАфлатоксин В1. Идентичността на екстрахирания от храната Афлатоксин В1 трябва да бъде потвърдена попосочената процедура.

3. Реактиви:Забележка: Всички реактиви трябва да са с чистота за анализ A.R., освен когато е посочено друго.3.1. ацетон;3.2. хлороформ, стабилизиран с 0,5 до 1,0 % 96 % етанол (v/v);3.3. нормален хексан;

3.4. метанол;3.5. безводен диетилов етер, свободен от прекиси;3.6. смес на бензол и ацетонитрил: 98/2 (v/v);3.7. смес на хлороформ (3.2) и метанол (3.4): 97/3 (v/v);3.8. силикагел, за колонна хроматография с размер на частиците 0,05 до 0,20 mm;3.9. абсорбент памучна вата, предварително обезмаслена с хлороформ, или стъклена вълна;3.10. натриев сулфат, безводен, на гранули;3.11. инертен газ, напр. азот;3.12. 1 N солна киселина;3.13. 50 % (v/v) сярна киселина;3.14. кизелгур (hyflosupercel), промит в киселина;3.15. силикагел G-HR или равностоен на него, за ТСХ;3.16. стандартен разтвор с около 0,1 µg Афлатоксин В1 на милилитър в хлороформ (3.2) или смес

бензин/ацетонитрил (3.6), приготвен и проверен, както е посочено в раздел 7;3.17. стандартен разтвор за качествен анализ, съдържащ около 0,1 µg Афлатоксин В1 и В2 на ml в

хлороформ (3.2) или смес бензол/ацетонитрил (3.6). Тези концентрации са дадени като насока. Те трябва да сеуточнят така, че да се получи еднакъв интензитет на флуоресценция и за двата афлатоксина;

3.18. разтворители за проявяване:3.18.1. хлороформ (3.2) /ацетон (3.1): 9/1 (V/V), ненаситена вана;3.18.2. диетилов етер (3.5) /метанол (3.4) /вода: 96/3/1 (V/V/V), ненаситена вана;3.18.3. диетилов етер (3.5) /метанол (3.4) /вода: 94/4 5/15 (V/V/V), наситена вана;3.18.4. хлороформ (3.2) /метанол (3.4): 94/6 (V/V), наситена вана;3.18.5. хлороформ (3.2) /метанол (3.4): 97/3 (V/V), наситена вана.4. Апаратура:4.1. мелница-миксер;4.2. апарат за бълникане (шейкър) или магнитна бъркалка;4.3. нагъната филтърна хартия, Schlieicher and Schuell N588, или равностойна, диаметър: 24 cm;4.4. стъклена тръба за хроматография (вътрешен диаметър: 22 mm, дължина: 300 mm) с кран и 250 ml

резервоар;4.5. ротационен вакуум-изпарител, с 500 ml облодънна колба;4.6. 500 ml конусни колби със стъклени запушалки с шлиф;4.7. апарат за ТСХ;4.8. стъклени блюда за ТСЛ, 200 x 200 mm, приготвени както следва (посочените количества са достатъчни

за пет блюда). Поставят се 30 g силикагел G-HR (3.15) в конусна колба. Добавят се 60 ml вода, запушва се и серазклаща 1 min. Суспензията се разстила върху блюдата така, че да се получи равномерен слой с дебелина 0,25 mm.Оставя се да изсъхне на въздух и след това в ексикатор със силикагел. В момента на ползване блюдата се активират,като се държат в сушилня при 110°C в продължение на 1 h.

Готови за ползване блюда са подходящи, ако дават резултати, сходни с тези, които се получават приизползването на блюдата, приготвени по описания начин.

4.9. ултравиолетова лампа с голяма дължина на вълната (360 nm); интензитетът на облъчване трябва дапозволява петно 1 ng Афлатоксин В1 да може ясно да се разграничава върху ТСХ блюдото на разстояние 10 cm отлампата;

4.10. 10 ml градуирани епруветки с полиетиленови запушалки;4.11. ултравиолетов спектрофотометър;4.12. флуороденситометър (по избор).5. Процедура5.1. Приготвяне на пробата (виж. при "Наблюдения", част В, т. 1)Пробата се смила така, че цялата да преминава през сито 1mm (съгласно препоръка ISO R 565).5.2. ЕкстрахиранеПоставят се 50 g смляна, хомогенизирана проба в 500 ml конусна колба (4.6). Добавят се 25 g кизелгур

(3.14), 25 ml вода и 250 ml хлороформ (3.2). Колбата се запушва, разклаща се или се бърка 30 min с апарата (4.2) и сефилтрува през нагъната филтърна хартия (4.3). Първите 10 ml от филтрата се изхвърлят и после се събират 50 ml.

5.3. Колонно очистванеВ долния край на хроматографската тръба (4.4) се вкарват запушалка от памучна вата или стъклена вълна

(3.9), напълват се две трети от тръбата с хлороформ (3.2) и се добавят 5g натриев сулфат (3.10).Проверява се горната повърхност на пласта от натриев сулфат да е равна, след това се добавя 10 g

силикагел (3.8) на малки порции. Разбърква се добре след всяко прибавяне, като се избягва образуване на мехурчета.Изчаква се да престои 15 min и след това внимателно се добавят 15 g натриев сулфат (3.10). Оставя се течността даспадне точно до над горната повърхност на слоя натриев сулфат.

Смесват се 50 ml екстракт, събран в (5.2) със 100 ml нормален хексан (3.3), и количествено сместа сепрехвърля в колоната. Изчаква се течността да спадне точно до над горната повърхност на слоя натриев сулфат.Изхвърлят се промивните води. След това се добавят 100 ml диетилов етер (3.5) и отново се изчаква да спадне до надгорната повърхност на слоя натриев сулфат. При тези операции се следи дебитът да е 8 до 12 ml в min и колоната дане изсъхва. Изхвърля се течността, която изтича. След това се елюира със 150 ml смес хлороформ/метанол (3.7) и сесъбира целият елюат.

Изпарява се последният почти до сухо при температура, не по-висока от 50°C и в поток инертен газ (3.11) сротационния изпарител (4.5). Количествено се прехвърля остатъкът, като се използва хлороформ (3.2) или смесбензол/ацето-нитрил (3.6) в 10 ml градуирана епруветка (4.10). Концентрира се разтворът в поток от инертен газ(3.11) и след това се наглася обемът до 2 ml с хлороформ (3.2) или смес бензол/ацетонитрил (3.6).

5.4. Тънкослойна хроматографияВърху ТСХ блюдото (4.8) на 2 сm от долния ръб и на разстояния от 2 сm се капват обемите стандартен

разтвор и екстракт, посочени по-долу:- 10, 15, 20, 30 и 40 µl от стандартния разтвор на Афлатоксин В1 (3.17);- 10 ml от екстракта, получен в 5.3, и на същото място отгоре 20 µl от стандартния разтвор (3.16);- 10 и 20 µl от екстракта, получен в 5.3.Хроматограмата се проявява на тъмно с един от проявителите разтвори (3.18). Изборът на разтворител

трябва да е направен предварително чрез нанасяне на 25 µl от качествения стандартен разтвор (3.17) върху блюдотои след проявяване - проверка дали Афлатоксин В1 и В2 са напълно разделени един от друг.

Разтворителите се оставят да се изпарят на тъмно и след това се облъчват с ултравиолетова светлина, катоблюдото се поставя на 10 сm от лампата (4.9). Петната Афлатоксин В1 дават синя флуоресценция.

5.5. Количествени определенияОпределя се или визуално, или чрез флуороденситометрия.5.5.1. Визуални измерванияОпределя се количеството Афлатоксин В1 в екстракта, като се сравнява интензитетът на флуоресценция на

петната с екстракт с този на петната със стандартен разтвор, и се намира на кое съответства. Интерполира се, ако сеналага. Флуоресценцията, получена чрез наслагване на екстракта върху стандартния разтвор, трябва да епо-интензивна от тази на 10 µl от екстракта и да има не повече от едно видимо петно. Ако интензитетът нафлуоресценция на 20 µl от екстракта е по-голям от този на 40 µl от стандартния разтвор, екстрактът се разрежда 10или 100 пъти с хлороформ (3.2) или смес бензол / ацетонитрил (3.6), преди да се подложи отново на тънкослойнахроматография.

5.5.2. Измерване чрез флуороденситометрияИзмерва се интензитета на флуоресценция на петната Афлатоксин В1 с флуороденситометъра (4.12) при

дължина на вълната на възбуждане 365 nm и дължина на вълната на излъчване 443 nm. Определя се количествотоАфлатоксин В1 в петната екстракт чрез сравняване на интензитета на флуоресценцията им с този на петнатастандартен Афлатоксин В1.

5.6. Потвърждаване идентичността на Афлатоксин В1Потвърждава се идентичността на Афлатоксин В1 в екстракта, както е посочено по-долу.5.6.1. Обработка със сярна киселинаНапръсква се (спрей) сярна киселина (3.13) върху хроматограмата, получена в 5.4. Флуоресценцията на

петната Афлатоксин В1 при ултравиолетово облъчване трябва да се превърне от синя в жълта.5.6.2. Двудименсионална хроматография, свързана с образуване на Афлатоксин В1-полуацетал

(Афлатоксин В2А)Забележка: описаните по-долу операции трябва да се извършват, като се спазва точно схемата на фигура 1.

Фиг. 15.6.2.1. Нанасяне на разтворитеНеобходимо е да се маскират две прави линии върху блюдото (4.8), успоредни на две съседни страни (на 6

сm от всяка страна), за да се ограничи миграцията на фронтовете разтворител. Върху блюдото с капилярни пипетиили микроспринцовки се капват следните разтвори:

- върху точка А - обем от пречистен екстракт от пробата, получен в 5.3, съдържащ около 2,5 nmАфлатоксин В1;

- върху точки В и С: 25 µl от стандартния разтвор (3.16).5.6.2.2. ПроявяванеПроявява се хроматограмата в направление I на тъмно, като се използва проявителят разтворител (3.18.1)

(1 сm слой в ненаситена вана), докато фронтът на разтворителя стигне до ограничителната за разтворителя линия.Блюдото се изважда от ваната и се оставя да изсъхне на тъмно при стайна температура в продължение на 5

min. След това се напръсква със сярна киселина (3.12) по дължината на ивица 2,5 cm височина, покривайки точки Аи В (показани със защрихованата площ на фиг. 1) докато потъмнее, като останалата част от блюдото се защити съсстъкло. Оставя се да взаимодейства 10 min на тъмно и се изсушава във въздушен поток при стайна температура.

След това се проявява хроматограмата в направление II на тъмно, като се използва проявителят разтвор(3.18.1) (1 сm слой в ненаситена вана), докато фронтът на разтворителя достигне ограничителната линияразтворител. Блюдото се изважда от ваната и се оставя да изсъхне при стайна температура.

5.6.2.3. Интерпретация на хроматограмитеХроматограмата се изследва под ултравиолетова светлина (4.9) и се проверява за следните характеристики:А) поява на синьо флуоресцентно петно от Афлатоксин В1, с източник стандартния разтвор, нанесен в С

(миграция в направление I);Б) поява на синьо флуоресцентно петно на нереагирал (със солната киселина) Афлатоксин В1 и

по-интензивно синьо флуоресцентно петно на Афлатоксин В1-полуацетал, като и двете са с източник стандартнияразтвор, нанесен в В (миграция в направление II);

В) поява на петна, отговарящи на тези, описани в Б, с източник екстракта от пробата, нанесен в А.Положението на тези петна се определя първо чрез миграционното отстояние на Афлатоксин В1 от точка А внаправление I (същото, като изминатото от стандарта, нанесен в С) и след това чрез миграционните отстояния от тамв направление II на Афлатоксин В1-полуацетала (същите като тези, изминати от стандарта, нанесен в В).Интензитетите на флуоресценция на петната полуацетал с източник екстракта и от стандарта, нанесен във В, трябвада съвпадат.

6. Изчисляване на резултатите6.1. От визуалните измерванияСъдържанието Афлатоксин В1 в µg на kg проба (PPB) се определя по формулата

S.Y.V,

W.X

където Y и X са съответно обемите в µl на стандартен разтвор на Афлатоксин В1 (3.16) и екстрат, имащподобен интензитет на флуоресценция;

S е концентрацията в µg Афлатоксин В1 в стандартен разтвор;V - крайният обем на екстракта в µl, според необходимото разреждане;W - теглото на пробата в g според обема на екстракта, нанесен на колоната за пречистване6.2. От флуороденситометричните измервания съдържанието Афлатоксин В1 в µg на kg проба (PPB) се

определя по формулата:

S.V,

W.Y

където:

Y е обемът в µl от екстракта;S - количеството в ng Афлатоксин В1 в екстракта (пропорционално на количеството Y), получено при

измерването;V - краен обем в µl, според необходимото разреждане;W - теглото на пробата в g според обема на екстракта, нанесен на колоната за пречистване.7. Приготвяне и анализ на стандартен разтвор (3.16)7.1. Определяне на концентрацията Афлатоксин В1Приготвя се стандартен разтвор на Афлатоксин В1 в хлороформ (3.2) или в смес бензол / ацетонитрил(3.6)

с концентрация 8 до 10 µg/ml.Определя се абсорбционният спектър между 330 и 370 nm с помощта на спектрофотометър (4.11).Измерва се оптичната плътност (A) при 363 nm за хлороформен разтвор, или при 348 nm за разтвора

бензол/ацетонитрил.Изчислява се концентрацията в mg Афлатоксин В1 на 1 µl разтвор по следната формула:

312.A.1000

- за хлороформения разтвор;

20 600312.A.1000

- за разтвора от смес на бензол/

19 800 ацетонитрит.

Разрежда се според необходимостта, далеч от дневна светлина, за да се получи работен стандартен разтворс концентрация Афлатоксин В1 приблизително 0,1 µg/ml. Когато се държи в хладилник при 4°C, този разтвор естабилен две седмици.

7.2. Проверка на хроматографската честотаВърху блюдо (4.8) се капва 5 µl от стандартния разтвор Афлатоксин В1, съдържащ от 8 до 10 µg/ml (7.1).

Хроматограмата се проявява, както е посочено в 5.4. В ултравиолетова светлина хроматограмата трябва да показвасамо едно петно и в първоначалната зона на нанасяне не трябва да се забелязва никаква флуоресценция.

8. ПовторяемостРазликата между резултатите на две паралелни определения, извършени с една и съща проба от един и същ

аналитик, не трябва да бъде повече от:- 25 % по отношение най-високия резултат за съдържания Афлатоксин В1 от 10 и до 20 µg/kg;- 5 µg, в абсолютна стойност, за съдържания по-големи от 20 и до 50 µg /kgl;- 10 % по отношение най-високата стойност за съдържания над 50 µg /kgl.9. ВъзпроизводимостВиж под "Наблюдения", част С, т. 2.

Б. ДВУДИМЕНСИОНАЛНА ТЪНКОСЛОЙНА ХРОМАТОГРАФИЯ1. Цел и обхватТози метод позволява определяне количеството Афлатоксин В1 в храни за животни, непопадащи в обхвата

на метод А. Долната граница на определение е 0,01 mg/kg (10 ppb). Методът е неприложим към храни, съдържащипулп от цитрусови плодове.

2. ПринципПробата се подлага на екстрахиране с хлороформ. Екстрактът се филтрува, взима се аликвотна част и се

пречиства чрез колонна хроматография върху силикагел. Извлекът се изпарява и остатъкът повторно се разтваря вопределен обем хлороформ, или смес от бензол и ацетонитрил. Аликвотна част от този разтвор се подлага натънкослойна хроматография (ТСХ). Количеството Афлатоксин В1 се определя с ултравиолетово облъчване нахроматограмата или визуално, или чрез флуороденситометрия, чрез сравняване с познати количества стандартенАфлатоксин В1. Идентичността на екстрахирания от храната Афлатоксин В1 трябва да бъде потвърдена попосочената процедура.

3. Реактиви:Забележка. Всички реактиви трябва да са с чистота за анализ A.R., освен когато е посочено друго.3.1. ацетон;3.2. хлороформ, стабилизиран с 0,5 до 1,0 % 96 % етанол (v/v);3.3. нормален хексан;3.4. метанол;3.5. безводен диетилов етер, свободен от прекиси;3.6. смес на бензол и ацетонитрил: 98/2 (v/v);3.7. смес на хлороформ (3.2) и метанол (3.4): 97/3 (v/v);3.8. силикагел, за колонна хроматография с размер на частиците 0,05 до 0,20 mm;3.9. абсорбент памучна вата, предварително обезмаслена с хлороформ, или стъклена вълна;3.10. натриев сулфат, безводен, на гранули;3.11. инертен газ, напр. азот;3.12. 1 N солна киселина;3.13. кизелгур (Hyflosupercel), промит в киселина;3.14. силикагел G-HR или равностоен на него, за ТСХ;3.15. проявители разтворители:3.15.1. диетилов етер (3.5) / метанол (3.4)/ вода: 94/4.5/1.5 (v/v/v), наситена вана;3.15.2. хлороформ (3.2)/ ацетон (3.1): 9/1 (v/v), ненаситена вана;3.16. стандартен разтвор с около 0,1 mg Афлатоксин В1 на ml в хлороформ (3.2) или смес

бензин/ацетонитрил (3.6), приготвен и проверен, както е посочено в т. 7 на метод А.4. Апаратуравиж в точка 4 на метод А.5. Процедура5.1. Приготвяне на пробата - виж т. 5.1, 5.2 и 5.3 на метод А5.2. Екстрахиране5.3. Колонно очистване5.4. Двудименсионална ТСХ5.4.1. Нанасяне на разтворите (спазва се схемата на фиг.1)Маркират се две прави линии върху едно блюдо (4.8), успоредни на две съседни страни (на 5 и 6 сm от

всяка страна съответно), за да се ограничи миграцията на фронтовете на разтворителя. Капват се следните разтворивърху блюдото, като се използват капилярни пипети или микроспринцовки:

- върху точка А, 20 µl от пречистения екстракт от пробата, получен в 5.3;- върху точка B, 20 µl от стандартния разтвор (3.16);- върху точка В, 10 µl от стандартния разтвор (3.16);- върху точка C, 20 µl от стандартния разтвор (3.16);- върху точка D, 40 µl от стандартния разтвор (3.16).Изсушава се в бавен въздушен поток или инертен газ (3.11). Получените петна трябва да са с диаметър

около 5mm.

Фиг. 25.4.2. Проявяване (спазва се схемата от фиг. 2)Хроматограмата се проявява в направление I на тъмно, като се използва проявителят разтворител (3.15.1)

(1 сm слой в наситена вана), докато фронтът на разтворителя достигне до ограничителната за разтворителя линия.Блюдото се изважда от ваната и се оставя да изсъхне на тъмно при стайна температура за 15 min.

След това хроматограмата се проявява в направление II на тъмно, като се използва проявителятразтворител (3.15.2) (1 сm слой в ненаситена вана), докато фронтът на разтворителя достигне ограничителната заразтворителя линия. Блюдото се изважда от ваната и се оставя да изсъхне на тъмно при стайна температура.

Фиг. 35.4.3. Интерпретация на хроматограмите (спазва се схемата на фиг. 3)

Хроматограмата се облъчва с ултравиолетова светлина, като блюдото се поставя на 10 сm от (4.9).Локализира се положението на сините флуоресцентни петна В, C и D и Е на Афлатоксин В1 от стандартния разтвор.Прокарват се две въображаеми линии през тези петна и под прав ъгъл към направленията на проявяване.Пресечницата Р на тези линии е мястото, където се очаква да се открие петното Афла-токсин В1 с източникекстракта на пробата, нанесен в А (фиг. 2). Действителното местоположение на петното Афлатоксин В обаче можеда бъде в точка Q в пресечницата на две въображаеми прави линии, образуващи ъгъл, приблизително 100°C междутях, и преминаващи през петната В и С съответно. Определя се количеството Афлатоксин В1 в екстракта от пробата,както е посочено в 5.5.

5.4.4. Допълнителна хроматографияМаркират се две прави линии върху едно ново блюдо (4.8), успоредни на две съседни страни, както е

посочено на схемата на фиг. 2, и върху точка А се нанася 20 ml от пречистения екстрат от пробата, получен в 5.3, ивърху тях - 20 µl от стандартния разтвор (3.16). Проявява се, както е посочено в 5.4.2. Хроматограмата се облъчва султравиолетова светлина (4.9) и се проверява дали:

- петната Афлатоксин В1 от екстракта и от стандартния разтвор са насложени едно върху другo;- флуоресценцията на това петно е по-интензивна от тази на петното Афлатоксин В1, проявено в точка Q

върху първото блюдо.5.5. Качествено определениеОпределят се или визуално, или чрез флуороденситометрия.5.5.1. Визуални измерванияОпределя се количеството Афлатоксин В1 в екстракта, като се сравни интензитетът на флуоресценция на

петната с екстракт с този на петната C, D и Е от стандартния разтвор. Интерполира се, ако се налага. Акоинтензитетът на флуоресценция на 20 µl от екстракта е по-голям от този на 40 µl от стандартния разтвор, екстрактътсе разрежда 10 или 100 пъти с хлороформ (3.2) или смес бензол/ацетонитрил (3.6), преди да се подложи отново натънкослойна хроматография.

5.5.2. Измерване чрез флуороденситометрияИзмерва се интензитетът на флуоресценция на петната Афлатоксин В1 с флуороденситометъра (4.12) при

дължина на вълната на възбуждане 365 nm и дължина на вълната на излъчване 443 nm.Определя се количеството Афлатоксин В1 в петното екстракт, като се сравнява неговият интензитет на

флуоресценция с този на петна С, D и E от стандартния разтвор.5.6. Потвърждаване идентичността на Афлатоксин В1виж т. 5.6 от метод А6. Изчисляване на резултатитевиж т. 6 от метод А7. Повторяемоствиж т. 8 от метод А8. Възпроизводимоствиж "Наблюдения", част В, т. 2В. Наблюдения по отношение методи А и Б1. ОбезмасляванеПроби, съдържащи повече от 5 % мазнини, трябва да бъдат обезмаслени с петролев етер (т.к. 40 до 60°C)

след приготвянето им по 5.1.В такива случаи резултатите от анализа трябва да се изразят чрез теглото на необезмаслената проба.2. Възпроизводимост на резултатитеВъзпроизводимостта на резултатите, т.е. разликите в резултатите, получени от две или повече лаборатории

с една и съща проба, се изчислява, както следва:± 50 % от средната стойност - за средни стойности Афлатоксин В1 от 10 и до 20 µg/kg;± 10 mg/kg върху средната стойност - за средни стойности, по-високи от 20 и до 50 µg/kg;± 20 % средната стойност - за средни стойности над 50 µg/kg.

ХХХVIII. Определяне на авопарцин чрез дифузия в среда на агар

1. Цел и обхватМетодът се използва за определянето на авопарцин в храните за животните и в предварителните смеси.

Долната граница за определянето е 2 mg/kg (2 части на хиляда). Присъствието на полиетерни антибиотици може даокаже влияние при определянето.

2. ПринципПробата се извлича със смес от ацетон/вода/солна киселина. Антибиотичната активност на екстракта се

определя посредством измерване на дифузията на авопарцина в среда от агар с бацилус субтилис. Дифузията сепоказва чрез формирането на зони за инхибиране на микроорганизмите. За диаметъра на тези зони се приема, че е в

директно съотношение спрямо логаритъма на антибиотичната концентрация, в рамките на спектъра от използванитеантибиотични концентрации.

3. Микроорганизъм - бацилус субтилис АТСС 6633 (NCIB 8054)3.1. Поддържане на щамова култураПрави се посявка в тръбички, съдържащи полегати плоскости от културна среда (4.1), с бацилус субтилис

и се оставя да пренощува при температура 30°C. Културата се съхранява в хладилник при температура около 4°C.Ежемесечно се правят нови посевки.3.2. Подготовка на суспензията от спори (1)Обира се добивът от неотдавна подготвената полегата плоскост от агар (3.1) посредством 2 до 3 ml

стерилна вода. Тази суспензия се използва, за да се направи посявка върху 300 ml от културната среда (4.1),съдържаща се в колба на Рукс, и се оставя да престои 3 до 5 дни при температура 30°C. Добивът се обира в 15 mlетанол (4.2), след като се провери под микроскоп формирането на малки спори, и се смесва добре. Тази суспензияможе да се запази в продължение на най-малко 5 месеца при температура около 4°C.

4. Културни среди и реагенти4.1. Културна среда:

Пептон 6,0Триптофан 4,0Екстракт от дрожди 3,0Глюкоза 1,5Агар 1,0Вода 1000 mlpH 6,5 (след стерилизация).

4.2. Етанол 20 % (обем/обем) - 200 ml етанол се разреждат с 800 ml вода.4.3. Солна киселина, отн. т. разреждане 1 - 18 до 1 - 19;(1) могат да се използват и други методи, при условие че се установи, че дават аналогични суспензии от

спори;(2) може да се използва всяка продавана на пазара среда с аналогичен състав, която дава същите резултати.4.4. Натриева основа, разтвор 2 М разтвор.4.5. Фосфатен буфер, 0,1М - калиев дихидроген фосфат, KH2PO4 - 13,6 g. Вода до 1000 ml. Стойността на

рН се регулира на 4,5.4.6. Смес на ацетон/вода/солна киселина (4.3) - 65/32,5/2,5 (v/v/v).4.7. Стандартна субстанция - авопарцинов сулфат с позната активност.5. Стандартни решенияТочно претеглено количество от приблизително 10 mg от стандартната субстанция (4.7) се разтваря във

фосфатен буфер (4.5) и се разрежда с този буфер, така че да се получи основен разтвор, съдържащ 100 µg авопарцинна 1 ml. Съхранен в затапена колба при температура 4°C, този разтвор остава стабилен в продължение на до 7 дни.

5.1. За предварителни смесиОт този основен разтвор посредством последователно разреждане с буфера (4.5) се подготвят следните

разтвори:

S8 4 mg/lS4 2 mg/lS2 1 mg/lS1 0,5mg/l

5.2. За храни за животниОт този основен разтвор посредством последователно разреждане с буфера (4.5) се подготвят следните

разтвори:

S8 2 mg/lS4 1 mg/lS2 0,5 mg/lS1 0,25mg/l

6. Подготвяне на ектракта и разтворите за анализ6.1. Предварителни смесиПретегля се възможно най-близко до 10 mg достатъчно количество проба, която да съдържа 10 до 100 mg

авопарцин. Прехвърля се в градуирана колба от 100 ml с 60 ml от сместа (4.6) и се разклаща в продължение на 15 minна механичен шейкър. Проверява се киселинността и рН се довежда до стойност 2, ако е необходимо, се използвасолна киселина (4.3). Приготвя се обем със сместа (4.6) и се смесва добре. Една част се филтрира през подходящафилтърна хартия (напр. Уотман № 1), като се изхвърлят първите 5 ml от филтрата. Взима се една аликвотна част ирН се регулира до стойност 4,75 с разтвор на солна киселина (4.4). Този разтвор се разрежда с буфер (4.5), така че дасе получи очакваната концентрация на авопарцин от 4 µg/ml (= U8).

От този разтвор се приготвят разтвори U4 (очаквано съдържание: 2 mg/l), U2 (очаквано съдържание: 1mg/l) и U1 (очаквано съдържание: 0,5 mg/l) посредством последователно разреждане (1 + 1) с буфер (4.5).

6.2. Храни за животниПретеглят се 50 g от пробата и 100 ml от сместа (4.6) и се разклащат в продължение на 30 min на

механичен шейкър. Екстрактът се избистря посредством центрофугиране (като се използват затапени центрофужнитръби), взима се аликвотна част от избистрения екстракт (виж таблицата) и се регулира киселинността на рН 4,5 сразтвор на натриев хидроксид (4.4). Тази аликвотна част се разрежда с буфер (4.5), така че да се получи U8 (вижтаблицата).

От този разтвор се приготвят разтвори U4 (очаквано съдържание: 1mg/l), U2 (очаквано съдържание: 0,5mg/l) и U1 (очаквано съдържание: 0,25 mg/l), посредством последователно разреждане (1 + 1) с буфер (4.5).

Ниво на авопарцина в 5 7,5 10 15 20 40(mg/kg)

Тегло на пробата 50 50 50 50 50 50(g(± 0,1g))

Количество на разтвора 100 100 100 100 100 100(4.6)( ml)

Обем на чистия екстракт 20 15 20 15 20 10

Краен обем 25 25 50 50 100 100

Очаквана концентрация 2 Прибл. 2 2 Прибл.2 2 2(mg/ml)

7. Процедура на анализиране на пробата7.1. Посявка върху средата на пробатаПриготвя се посявка на пробната среда (4.1) със съдържащата спори суспензия (3.2) при температура 50 до

60°C. Посредством предварителни опити върху панички с пробна среда (4.1) се определя количеството суспензиясъс спори, което е необходимо за получаването на максимално големи и чисти зони на инхибиране, при различнитеконцентрации на авопарцин.

7.2. Подготвяне на паничкитеДифузията през агара се осъществява в панички с четирите концентрации на стандартния разтвор (S8, S4,

S2, S1) и четирите концентрации на пробния разтвор (U8, U4, U2, U1). Тези четири концентрации на екстракта истандарта е необходимо да се поставят във всяка паничка. За тази цел се избират достатъчно големи панички, коитода позволят да бъдат направени поне осем отвора с диаметър 10 до 13 mm при разстояние не по-малко от 30 mmмежду центровете в средата от агар. Опитът се извършва върху панички, състоящи се от лист стъкло с покриталуминий или пластмасов пръстен, поставен отгоре, с диаметър 200 mm и височина 20 mm.

В паничките се налива количество от средата (4.1), върху което е било направена посявка в съответствие ст. 7.1, така че да се получи слой с дебелина около 2 mm (60 mm за паничка с дебелина 200 mm). Оставя се така, че дазастане в равна позиция, пробиват се отворите и в тях се поставят точно измерени обеми от пробата и стандартнитеразтвори (между 0,710 и 0,715 ml на отвор, в зависимост от диаметъра). Всяка концентрация се прилага поне четирипъти, така че всяко определяне да бъде обект на оценяването на 32 зони на инхибиране.

7.3. Инкубация (престояване)Паничките се оставят да престоят в продължение на 16 до 18 h при температура 30°C.8. ОценкаИзмерва се диаметърът на зоните на инхибиране до най-близките 0,71 mm. Записват се средните

измервания за всяка концентрация върху хартия за полулогаритмична графика (милиметрова), която показвалогаритъма на концентрациите в съотношение с диаметрите на зоните на инхибиране. Изчертават се линиите на"най-добро напасване" както на стандартния разтвор, така и на екстракта.

Пунктът на "най-добро напасване" за стандартното най-ниско ниво (SL) се определя по формулата:

7S1 + 4S2 + S4 - 2S8

SL = (1)

10

Пунктът на "най-добро напасване" за стандартното най-високо ниво (SН) се определя по формулата:

7S8 + 4S4 + S2 - 2S1

SH = (2)

10

Аналогично се изчисляват точките на "най-добро напасване" за най-ниското ниво на екстракта (UL) и занай-високото ниво на екстракта (UH), като се заместят U1, U2, U4 и U8 с S1, S2, S4 и S8 в посочените формули.

Изчислените стойности на SL и SH се заместват върху млиметрова хартия и се свързват така, че да сеполучи линията на "най-добро напасване" за стандартния разтвор. Аналогично се записват стойностите на UL и UHи се свързват така, че да се получи линията на "най-добро напасване" за екстракта.

В случай че липсва каквото и да е смущение, линиите трябва да са успоредни. За целите на практикаталиниите могат да се приемат за успоредни при положение, че стойностите (SH-SL) и (UH-UL) не се различават сповече от 10 % от техните средни стойности.

Ако се установи, че линиите не са успоредни, то или U1 и S1, или U8 и S8 могат да се отхвърлят и да сеизчислят SL, SH, UL и UH, като се използват алтернативните формули, така че да се получат линии на "най-добронапасване":

5S1 + 2S2 - S4 5S2 + 2S4 - S8

SL = или (3)

6 6

5S4 + 2S2 - S1 5S8 + 2S4 - S2

SH = или (4)

6 6

и аналогично за UL и UH. Алтернативните линии на "най-добро напасване" се проверяват за успоредност,така както е показано тук, по-горе. В крайния отчет се отбелязва фактът, че резултатът е бил изчислен на база тритенива.

Ако се приеме, че линиите са успоредни, тогава се изчислява логаритъмът на относителната активност(логаритъм А) посредством една от следните формули:

За четири нива -

(U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8) . 0,602

Log A = (5)

U4 +U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2

За три нива -

(U1 + U2 + U4 - S1 - S2 - S4) . 0,401

Log A = (6)

U4 + S4 - U1 - S1

или

(U2 + U4 + U8 - S2 - S4 - S8) . 0,401

Log A = (7)

U8 + S8 - U2 - S2

Действителната активност е равна на допусканата активност и е по-голяма от относителната активност.Ако бъде установено, че относителната активност е извън обхвата от 0,5 до 2, опитът се повтаря, като се

извършват целесъобразни напасвания към концентрациите на екстракта или ако това не е възможно, къмстандартните разтвори. Когато относителната активност не може да бъде ограничена в рамките на необходимияобхват, то всеки получен резултат трябва да се счита за приблизителен и това трябва да се отбележи в крайния отчет.

Ако се приеме, че линиите не са успоредни, определянето се повтаря. Ако все още не може да се постигнеуспоредност на линиите, определянето се счита за незадоволително.

9. ПовторяемостРазликата между резултатите на двете определяния, които се извършват на базата на една и съща проба и

от един и същ аналитик, не трябва да надвишава:- 2 mg/kg в абсолютна стойност за съдържания на авопарцин от 2 и нагоре до 10 mg/kg;- 20 % спрямо най-високата стойност - за съдържания от 10 до 25 mg/kg;- 5 mg/kg в абсолютна стойност - за съдържания от 25 до 50 mg/kg;- 10 % спрямо най-високата стойност - за съдържания над 50 mg/kg.

ХХХIХ. Определяне на монензин натрии посредством дифузия в среда на агар

1. Цел и обхватМетодът се използва за определянето на монензин натрии в храните за животните и в предварителните

смеси. Долната граница за определянето е 10 mg/kg (10 части на хиляда).2. ПринципПробата се извлича посредством 90 % метанол. Екстрактът се подлага на съответни процедури, в

съответствие със съдържанието на монензин натрии в пробата. Антибиотичната активност се определя, като сеизмери дифузията на монензин натрии в среда от агар, върху която има посявка на бацилус субтилис. Дифузията сепоказва чрез формирането на зони за инхибиране на микроорганизмите. За диаметъра на тези зони се приема, че е вдиректно съотношение спрямо логаритъма на антибиотичната концентрация, в целия спектър на използванитеантибиотични концентрации. Чувствителността на тази система на пробата за анализи се намалява в присъствието нанатриеви йони.

3. Микроорганизъм - бацилус субтилис АТСС 6633 (N CIB 8054)3.1. Поддържане на щамова култураПрави се посявка в тръбички, съдържащи полегати плоскости от културна среда (4.1), с бацилус субтилис

и се оставя да пренощува при температура 30°C. Културата се съхранява в хладилник при температура около 4°C.Нови посевки се правят ежемесечно.3.2. Подготовка на суспензията от спори (2)Събира се добивът от наскоро приготвената полегата плоскост от агар (3.1) посредством 2 до 3 ml стерилна

вода. Тази суспензия се използва, за да се направи посявка върху 300 ml от културната среда (4.1), съдържаща се вколба на Рукс, и се оставя да престои 3 до 5 дни при температура 30°C. Добивът се събира в 15 ml 20 % етанол (4.3),след като се проверява под микроскоп формирането на малки спори, и се смесва добре. Тази суспензия може да сезапази в продължение на най-малко 5 месеца при температура около 4°C.

4. Културни среди и реагенти4.1. Културна среда

Триптофан 10 gЕкстракт от дрожди 3 gМесо-костен екстракт 1,5 gГлюкоза 1 gАгар (по качество) 10 - 20 gВода 1000 mlpH 6,5 (след стерилизация).4.2. Среда на пробата за анализиГлюкоза 10 gЕкстракт от мая 2,5 gДикалиев хидроген фосфат K2HPO4 0,69 gКалиев дихидроген фосфат KH2PO4 0,45 gАгар (според качеството) 10 до 20 gВода 1000 mlpH 6 (след стерилизация).

Един mg натриев монензин е еквивалентен на 1,000 единици UK.Могат да се използват и други методи, при условие че се установи получаването на аналогични суспензии

от спори.Може да се използва всяка продавана на пазара среда с аналогичен състав, която дава същите резултати.4.3. Етанол 20 % (обем/обем) - разреждат се 200 ml етанол с 800 ml вода.4.4. Метанол дехидратен.4.5. Метанол 90 % (обем/обем) - разреждат се 900 ml метанол (4.4) със 100 ml вода.4.6. Метанол 50 % (обем/обем) - разреждат се 500 ml метанол (4.4) с 500 ml вода.4.7. Алуминиев окис, гранулиран (алкоа F, мрежа с 20 дупки; активиран алуминий UG1: фирма "Ланкастър

и Ко." или еквивалент).4.8. Стандартни субстанции: натриев монензин с позната активност (напр. от Международната

лаборатория за биологични стандарти. Централна ветеринарна лаборатория, Уейбридж, Обединено кралство - СърейКТ 15 3NB).

5. Апаратура5.1. ротационен вакуумен изпарител с 250 ml колба с кръгло дъно;5.2. стъклена тръбичка за хроматографски анализ с вътрешен диаметър: 25 mm с дължина 400 mm, с един

отворен край с диаметър 2 mm;5.3. стъклена тръбичка за хроматографски анализ с вътрешен диаметър: 11 mm с дължина приблизително

300 mm, с един отворен край с диаметър 2 mm.6. Стандартни решенияРазтваря се точно претеглено количество от стандартната субстанция (4.8) в метанол (4.4), така че да се

получи основен разтвор, съдържащ 800 mg натриев монензин на 1 ml. Съхранен в затапена колба при температура4°C, този разтвор остава стабилен в продължение на до две седмици.

От този фондов разтвор се подготвят посредством последователно разреждане с 50 % метанол (4.6)следните разтвори:

S8 8 mg/lS4 4 mg/lS2 2 mg/lS1 1 mg/l

7. Подготвяне на екстракта7.1. Екстрахиране7.1.1. Предварителни смесиПретегля се количество от пробата с тегло 2 g, добавят се 100 ml 90 % метанол (4.5), хомогенизира се и се

центрофугира в продължение на няколко min. Изплувалият отгоре разтвор се разрежда с 50 % метанол (4.6), така чеда се получи очакваното съдържание на натриев монензин от 8 µg/ml (= U8).

7.1.2. Храни за животни с ниво на натриевия монензин не по-малко от 50 частици на хилядаПретегля се количество от пробата с тегло от 10 до 20 g, добавят се 100 ml 90 % метанол (4.5),

хомогенизира се в продължение на няколко min и разтворът се оставя да се утаи.Вкарва се запушалка от стъклен памук в тесния край на една стъклена тръбичка (5.2) и се добавя

алуминиев окис (4.7), като леко се почуква, докато колоната достигне височина 75 до 80 mm.Екстрактът се прелива върху колона от алуминиевия окис и филтратът се събира. Разреждат се 30 ml от

филтрата до 50 ml с вода. След това се разрежда с 50 % метанол (4.6), така че да се получи очакваното съдържаниена натриев монензин от 8 µg/ml (= U8).

7.1.3. Храни за животни с ниво на натриевия монензин, по-малко от 50 частици на хиляда (до една границаот 10 части на хиляда)

Претегля се проба с тегло от 10 до 20 g, добавят се 100 ml 90 % метанол (4.5) и се хомогенизира впродължение на 15 min. Центрофугира се, докато разтворът стане прозрачен.

За една проба, съдържаща 20 частици на хиляда (ppm) монензин натрии, се взимат 40 ml от изплувалата наповърхността течност. За проба, съдържаща 10 ppm, се взимат 80 ml и се изпаряват до изсъхване под вакуум върхуротационен изпарител (5.1) при температура не повече от 40°C. Остатъкът се разтваря в 10 ml 90 % метанол (4.5).

Вкарва се запушалка от стъклен памук в тесния край на една стъклена тръбичка (5.3) и се добавяалуминиев окис (4.7), като леко се почуква, докато стълбът достигне височина 75 до 80 mm.

Прелива се метаноловият разтвор на остатъка върху стълба от алуминиевия окис и се събира филтратът.Стълбът се измива с 10 ml 90 % метанол (4.5) и измитите разтвори се комбинират с филтрата.

Разтворът се изпарява до изсъхване под вакуум върху ротационен изпарител (5.1) при температура неповече от 40°C. Разтваря се остатъкът в 10 ml дехидриран метанол (4.4) и се добавя вода, докато се получи 20 ml.Разтворът се центрофугира при честота на въртене не по-малко от 4000 оборота/min в продължение на поне 5 min.След това се прави разреждане с 50 % метанол (4.6), така че да се получи очакваното съдържание на натриевмонензин 8 µg/ml (= U8).

7.2. Разтвори на пробите за анализиОт разтвор U8 се подготвят разтвори U4 (очаквано съдържание: 4 µg/ml), U2 (очаквано съдържание: 2

µ/ml) и U1 (очаквано съдържание: 1 µg/ml) посредством последователно разреждане (1 + 1) с 50 % разтвор наметанол (4.6).

8. Процедура за анализиране на пробата8.1. Посявка върху средата на пробатаПрави се посявка върху пробната среда (4.2) със съдържащата спори суспензия (3.2) при температура 50 до

60°C. Посредством предварителни опити върху панички с пробна среда (4.2) се определя количеството суспензиясъс спори, което ще е необходимо за получаването на максимално големи и чисти зони на инхибиране приразличните концентрации на натриев монензин.

8.2. Подготвяне на паничкитеОсъществява се дифузия през агара върху панички с четирите концентрации на стандартния разтвор (S8,

S4, S2, S1) и четирите концентрации на пробния разтвор (U8, U4, U2, U1). Четирите концентрации на екстракта истандарта е необходимо да се поставят във всяка паничка. За тази цел се избират достатъчно големи панички, коитопозволяват да бъдат направени поне осем отвора с диаметър 10 до 13 mm с разстояние не по-малко от 30 mm междуцентровете в средата от агар. Опитът се провежда върху панички, състоящи се от лист стъкло с покрит алуминий илипластмасов пръстен, поставен отгоре, с диаметър 200 mm и височина 20 mm.

В паничките се налива количество от средата (4.2), върху което е било направена посявка в съответствие ст. 8.1, така че да се получи слой с дебелина около 2 mm (60 mm за паничка с дебелина 200 mm). Оставя се така, че дазастане в равна позиция, правят се отворите и в тях се поставят точно измерени обеми от пробата за анализи истандартните разтвори (между 0,710 и 0,715 ml за всеки отвор, в зависимост от диаметъра). Всяка концентрация сеприлага поне четири пъти, така че всяко определяне да бъде обект на оценката на 32 зони на инхибиране.

8.3. Инкубация (престой)Паничките се оставят да престоят в продължение на приблизително18 h при температура 35 до 37°C.9. ОценкаИзмерва се диаметърът на зоните на инхибиране до най-близките 0,71 mm. Записват се средните

измервания за всяка концентрация върху милиметрова хартия, която показва логаритъма на концентрациите всъотношение с диаметрите на зоните на инхибиране. Изчертават се линиите на "най-добро напасване" както настандартния разтвор, така и на екстракта, както е показано например тук по-долу.

Пунктът на "най-добро напасване" за стандартното най-ниско ниво (SL) се определя по формулата:

7S1 + 4S2 + S4 - 2S8

SL = (1)

10

Определя се пунктът на "най-добро напасване" за стандартното най-високо ниво (SН), като се използваформулата:

7S8 + 4S4 + S2 - 2S1

SH = (2)

10

Аналогично се изчисляват точките на "най-добро напасване" за най-ниското ниво на екстракта (UL) и занай-високото ниво на екстракта (UH), като се заместват U1, U2, U4 и U8 с S1, S2, S4 и S8 в посочените формули.

Изчислените стойности на SL и SH се записват върху същата хартия за чертане на диаграми (милиметрова)и се обединяват така, че да се получи линията на "най-добро напасване" за стандартния разтвор. Аналогично сезаписват стойностите на UL и UH и се обединяват така, че да се получи линията на "най-добро напасване" заекстракта.

В случай че липсва каквото и да е смущение, линиите са успоредни. За целите на практиката линиитемогат да се приемат за успоредни, при положение че стойностите (SH-SL) и (UH-UL) не се различават с повече от 10% от техните средни стойности.

Ако се установи, че линиите не са успоредни, то или U1 и S1, или U8 и S8 могат да се отхвърлят и да сеизчислят SL, SH, UL и UH, като се използват алтернативните формули, така че да се получат линии на "най-добронапасване":

5S1 + 2S2 - S4 5S2 + 2S4 - S8

SL = или (3)

6 6

5S4 + 2S2 - S1 5S8 + 2S4 - S2

SH = или (4)

6 6

и аналогично за UL и UH. Алтернативните линии на "най-добро напасване" се проверят за успоредност,както е показано по-горе. В крайния отчет се отбелязва фактът, че резултатът е бил изчислен на база трите нива.

Ако се приеме, че линиите са успоредни, се изчислява логаритъмът на относителната активност(логаритъм А) посредством една от следните формули:


(U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8) . 0,602

Log A = (5)

U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2


(U1 + U2 + U4 - S1 - S2 - S4) . 0,401

Log A = (6)

U4 + S4 - U1 - S1

или

(U2 + U4 + U8 - S2 - S4 - S8) . 0,401

Log A = (7)

U8 + S8 - U2 - S2

Действителната активност е равна на допусканата активност и е по-голяма от относителната активност.Ако се установи, че относителната активност е извън обхвата от 0,75 до 2,70, опитът се повтаря, като се

извършват целесъобразни напасвания към концентрациите на екстракта, а ако това не е възможно - към стандартнитеразтвори. Когато относителната активност не може да бъде ограничена в рамките на необходимия обхват, всекиполучен резултат се счита за приблизителен и това се отбелязва в крайния отчет.

Ако се приеме, че линиите не са успоредни, определянето се повтаря. Ако все още не може да се постигнеуспоредност на линиите, определянето се счита за незадоволително.

10. ПовторяемостРазликата между резултатите от двете определяния, които се извършват на базата на една и съща проба и

от един и същ аналитик, не трябва да надвишава:- 20 % спрямо най-високата стойност - за съдържания на монензин натрии от 10 до 25 mg/kg;- 5 mg/kg в абсолютна стойност - за съдържания от 25 до 50 mg/kg;- 10 % спрямо най-високата стойност - за съдържания над 50 mg/kg.

ХL. Определяне на халофугинон

DL-транс-7-бромо-6-хлоро-3-[3-(3-хидрокси-2-пиперидил)ацетонил]-квиназолин-4-(3Н)-на хидробромид1. Цел и обхватМетодът се използва за определянето на халофугинон в храните за животните. Долната граница за

определянето е 1 mg/kg.2. ПринципСлед третиране с гореща вода халофугинонът се екстрахира като свободна основа в етилов ацетат и след

това се разделя като хидрохлорид във воден киселинен разтвор. Екстрактът се очиства посредством хроматография сйонен обмен. Съдържанието на халофугинона се определя посредством високочестотна хроматография със запазенафаза (HPLC), като се използва детектор на ултравиолетови лъчи.

3. Реагенти:3.1. ацетонитрил, клас HPLC;3.2. амберлит XAD-2 смола;

3.3. амониев ацетат;3.4. етилов ацетат;3.5. оцетна киселина, глациална (във формата на лед);3.6. халофугинон - стандартна субстанцияDL-транс-7-бромо-6-хлоро-3-[3-(3-хидрокси-2-пиперидил)ацетонил]-квиназолин-4-(3Н)-на хидробромид,

Е 764);3.6.1. фондов стандартен разтвор на халофугинон, 100 mg/ml - претеглят се с точност до 0,1 mg 50 mg

халофугинон (3.6) в градуирана колба с вместимост 500 ml, разтварят се в буферен разтвор на амониев ацетат (3.18),допълва се до маркировката с буферен разтвор и се смесва. Този разтвор остава стабилен в продължение на 3седмици при температура 5°C, при положение че се съхранява на тъмно;

3.6.2. разтвори за калиброване - в една редица от градуирани колби с вместимост 100 ml се прехвърлят 1, 2,3, 4 и 6,0 ml от основния стандартен разтвор на халофугинон (3.6.1). Допълва се до маркировката с подвижна фаза(3.21) и се смесва. Разтворите ще имат съответно концентрации на халофугинон 1, 2, 3, 4 и 6,0 ml. Преди употребатези разтвори трябва да са прясно приготвени;

3.7. хидрохлорна (солна) киселина (r 20 - в концентрация приблизително 1,16 g/ml);3.8. метанол;3.9. сребърен нитрат;3.10. натриев аскорбат;3.11. натриев карбонат;3.12. натриев хлорид;3.13. EDTA (етилен-диамин-тетра-оцетна киселина, двунатриева сол);3.14. вода, клас HPLC;3.15. разтвор на натриев карбонат, обем, равен на 10 g/100 ml;3.16. натриев хлорид - наситен разтвор на натриев карбонат, обем, равен на 5 g/100 ml;50 g натриев карбонат се разтварят (3.11) във вода, разрежда се до 1 l и се добавя натриев хлорид (3.12),

докато се получи наситен разтвор;3.17. солна киселина, приблизително 0,1 mol/l;10 ml солна киселина се разтварят (3.7) във вода, докато се получи 1 l;3.18. буферен разтвор на амониев ацетат, приблизително 0,25 - разтварят се 19,3 g амониев ацетат (3.3) и

30 ml оцетна киселина (3.5) във вода (3.14) и се разреждат до 1 l;3.19. подготвяне на амберлит XAD-2 смола - измива се подходящо количество амберлит (3.2) с вода,

докато бъдат отстранени всички хлоридни йони, като това се индицира посредством теста със сребърен нитрат(3.20), който се изпълнява в изхвърлената течна фаза. След това смолата се измива с 50 ml метанол (3.8), изхвърля семетанолът и се съхранява смолата под свеж метанол;

3.20. разтвор на сребърен нитрат, приблизително 0,1 mol/l - 0,17 g сребърен нитрат се разтварят (3.9) в 10ml вода;

3.21. подвижна фаза HPLC - смесват се 500 ml ацетонитрил (3.1) с 300 ml буферен разтвор на амониевацетат (3.3) и 1,200 ml вода (3.14). Киселинността се регулира на рН = 4,3, като се използва оцетна киселина (3.5).Филтрира се през филтър 0,22 mm (4.8) и разтворът се дегазира (напр. посредством почистване с ултразвук впродължение на 10 min). Този разтвор остава стабилен в продължение на един месец, при положение че се съхранявана тъмно място в затворен съд.

4. Апаратура:4.1. ултразвукова баня;4.2. ротационен филмов (тънкослоен) изпарител;4.3. центрофуга;4.4. оборудване HPLC, което има детектор на ултравиолетови лъчи с променлива дължина на вълната или

детектор с диодна решетка;4.4.1. течна хроматографска колона, 300 mm > 4 mm, С 18,10 mm опаковка, или еквивалентна колона;4.5. стъклена колона (300 mm > 10 mm), снабдена с филтър от синтеровано стъкло и спирачно кранче;4.6. филтри от стъкловлакно, с диаметър 150 mm;4.7. мембранни филтри - 0,45 mm;4.8. мембранни филтри - 0,22 mm.5. ПроцедураЗабележка. Халофугинонът като свободна основа е нестабилен в разтвори на алкалин и на етилов ацетат,

ако не остане в етиловия ацетат в продължение на повече от 30 min.5.1. Общи положения5.1.1. Анализира се храна без добавки (чиста храна), за да се провери и удостовери това, че не присъстват

нито халофугинон, нито други включени субстанции.5.1.2. Провежда се тест за възстановяване, като се анализира храната без хранителни добавки, която е била

подсилена посредством добавянето на известно количество халофугинон, аналогично на това, което присъства впробата.

За да се подсили на ниво 3 mg/kg, се добавят 300 ml от фондовия стандартен разтвор (3.6.1), докато сеполучи 1 l от чистата храна, смесва се и се изчаква 10 min, преди да се продължи с екстрахирането (5.2).

Забележка. За целите на този метод чистата храна трябва да е аналогична по вид на тази от пробата и прианализа да не се открие халофугинон.

5.2. ЕкстрахиранеПретеглят се с точност до 0,1 mg 10 mg от подготвената проба в центрофужна тръбичка с вместимост 200

ml, добавят се 0,5 g натриев аскорбат (3.10), 0,5 g EDTA (етилен-диамин-тетра-оцетна киселина, двунатриева сол)(3.13) и 20 ml вода и се смесва. Тръбичката се поставя за 5 min във водна баня (80°C). След охлаждане до стайнатемпература се добавят 20 ml разтвор на натриев карбонат (3.15) и се смесва. Незабавно се добавят 100 ml етиловацетат (3.4) и се разклаща силно с ръка в продължение на 15 s. След това тръбичката се поставя за 3 min вултразвукова баня (4.1) и се разхлабва запушалката. Центрофугира се в продължение на 2 min и се прелива фазата наетиловия ацетат през филтър от стъкловлакно (4.6) в разделителна фуния с вместимост 500 ml. Екстрахирането напробата се повтаря с втора част от 100 ml етилов ацетат. Комбинираните екстракти се измиват в продължение на 1min с 50 ml разтвор на натриев хлорид - наситен натриев карбонат (3.16) и се изхвърля водният слой.

Екстрахира се органичният слой в продължение на 1 min с 50 ml солна киселина (3.17). Оставя се долниятслой на киселината да изтече в разделителна фуния с вместимост 250 ml. Повторно се екстрахира органичният слойв продължение на една минута и половина с нови 50 ml разтвор на натриев хлорид и се комбинира с първияекстракт. Измиват се комбинираните киселинни екстракти посредством завъртане в продължение на приблизително10 s с 10 ml етилов ацетат (3.4).

Водният слой се прехвърля количествено в 250 ml колба с кръгло дъно и се изхвърля органичната фаза.Изпарява се целият останал етилов ацетат от киселинния разтвор, като се използва ротационен филмов (тънкослоен)изпарител (2.4). Температурата на водната баня не трябва да превишава 40°C. Под вакуум от приблизително 25 mbarцелият остатъчен етилов ацетат ще бъде отстранен в рамките на 5 min при температура 38°C.

5.3. Почистване5.3.1. Подготвяне на колоната с амберлитЗа всеки екстракт на пробата се подготвя по една колона XAD-2. 10 g от подготвения амберлит се

прехвърлят (3.19) в стъклена колона (4.5) с метанол (3.8). Добавя се една малка запушалка от стъклен памук вгорната част на коритото от смола. Оставя се метанолът да изтече от колоната и смолата се измива със 100 ml вода,като потокът се спира веднага, щом течността достигне горната част на коритото от смола. Оставя се колоната да сеуравновеси за 10 min преди употреба. Не се допуска колоната да изтече напълно до сухо.

5.3.2. Почистване на пробатаЕкстрактът се прехвърля (5.2) количествено към горната част на подготвената колона от амберлит (5.3.1) и

се отмива, като се изхвърля елюатът (отмитият разтвор). Скоростта на отмиване не трябва да превишава 20 ml/min.Колбата с кръгло дъно се изплаква с 20 ml солна киселина (3.17), която се използва и за да се измие колоната отсмола. Евентуално останалият киселинен разтвор се продухва с въздушен поток. Изхвърлят се отмитите разтвори.Добавят се 100 ml метанол (3.8) към колоната и се оставя 5 до 10 min да изтече, като отмитият разтвор се събира в250 ml колба с кръгло дъно. Оставя се останалият метанол за 10 min, за да влезе в равновесие със смолата, и сепродължава отмиването със скорост 20 ml/min, като отмитият разтвор се събира в същата 250 ml колба с кръглодъно. Изпарява се метанолът върху ротационния тънкослоен изпарител (4.2), като температурата на водната баня нетрябва да превишава 40°C. Остатъкът се прехвърля количествено в 10 ml калибрована колба, като се използваподвижната фаза (3.21). Долива се до маркировката с мобилната фаза и се смесва. Една аликвотна (кратна) част сефилтрува през мембранен филтър (4.7). Този разтвор се запазва за определяне посредством високочестотнахроматография със запазена фаза HPLC (5.4).

5.4. Определяне посредством HPLC5.4.1. ПараметриСледните условия се предлагат като ръководство, могат да се използват и други условия, при условие че с

тях се получават еквивалентни резултати:течна хроматографска колона (4.4.1);мобилна фаза на HPLC (3.21);скорост на потока: 1,5 до 2 ml/min;дължина на вълната за откриване: 243 nm;обем за инжектиране: 40 до 100 ml;проверява се стабилността на хроматографската система, като се инжектира калибриращият разтвор

(3.6.2), съдържащ 3 mg/ml, няколко пъти, докато се постигне постоянна височина на пиковете (или участъците) ивреме на задържане.

5.4.2. Графика на калибриранеВсеки калибриращ разтвор се инжектира (3.6.2) няколко пъти и се измерват височините на пиковете (или

участъците) за всяка концентрация. Начертава се графиката на калибриране, като се използват средните височини напиковете (участъците) на калибриращите разтвори като ординати, а съответните концентрации в mg/ml - катоабсциси.

5.4.3. Разтвор на пробатаОт пробата се инжектира (5.3.2) няколко пъти, като се използва същият обем, който е взет за

калибриращите разтвори, и се определя средната височина на пиковете (участъкът) за халофугинона.6. Изчисляване на резултатитеКонцентрацията на разтвора на пробата в mg/ml се определя от средната височина (участък) на пиковете за

халофугинона, като се използват препратки към графиката на калибрирането (5.4.2).Съдържанието на халофугинона в тегловни проценти w (mg/kg) в пробата се дава със следната формула:

c.10m

w = ,

m

където:

c е концентрацията на халофугинона в разтвора на пробата в mg/ml;m - масата на изпробваната част в грамове.7. Валидизиране на резултатите7.1. ИдентичностИдентичността на анализираната субстанция може да се потвърди посредством успоредна хроматография

или като се използва детектор с диодна решетка, с който се сравняват спектрите на екстракта на пробата и накалибриращия разтвор (3.6.2), съдържащ 6,0 mg/ml.

7.1.1. Успоредна хроматографияЕкстракт на пробата се подсилва посредством добавянето на едно целесъобразно количество калибриращ

разтвор (3.6.2). Количеството на добавения халофугинон трябва да е аналогично на приблизителното количество нахалофугинона, намерен в екстракта на пробата.

Само височината на пика на халофугинона следва да се увеличи, след като се вземе под внимание кактодобавеното количество, така и разреждането на екстракта. Широчината на пика, на половината от нейнатамаксимална височина, трябва да бъде в рамките на ± 10 % от първоначалната широчина.

7.1.2. Откриване с диодна решеткаРезултатите се оценяват съобразно следните критерии:(а) дължината на вълната за максималната абсорбция на пробата и на стандартните спектри, записана при

пиковия връх върху хроматограмата, трябва да е една и съща в рамките на едно поле, определено от разрешителната(разделителната) способност на системата за откриване, за откриване с диодна решетка, тази дължина на вълната еобикновено в рамките на ± 2 nm;

(б) между 225 и 300 nm пробата и стандартните спектри, записани при пиковия връх на хроматограмата, нетрябва да са различни за тези части на спектъра в рамките на обхвата от 10 до 100 % от относителната абсорбция,този критерий се счита за спазен, когато присъстват едни и същи максимуми и в никой от наблюдаваните пунктовеотклонението между двата спектъра превишава 15 % от абсорбцията на стандартната анализирана субстанция;

(в) между 225 и 300 nm спектрите на горния склон върхът и долният склон на пика, които се произвеждатот екстракта на пробата, не трябва да се различават помежду си за тези части от спектъра в рамките на обхвата от 10до 100 % от относителната абсорбция; този критерий се счита за спазен, когато присъстват едни и същи максимумии когато при всички наблюдавани пунктове отклонението между спектрите не превишава 15 % от абсорбцията наспектъра на върха.

Ако някой от тези критерии не бъде спазен, присъствието на анализираната субстанция не може да сесчита за потвърдено.

7.2. ПовторяемостРазликата между резултатите от две паралелни определяния, които се провеждат върху една и съща проба

(мостра), не трябва да превишават 0,5 mg/kg за съдържание на халофугинон до 3 mg/kg.7.3. ВъзстановяванеЗа подсилената чиста проба възстановяването е минимум 80 %.8. Резултати от съвместно изпитванеРезултатите от съвместно изпитване, при което три проби са подложени на анализ от осем лаборатории, са

представени в таблицата.

Резултати

Празна А Проба B Проба B Проба C Проба Cпри (брашно) (брашно) (гранули) (гранули)получа- при след при следване получа- два получа- два

ване месеца ване месеца

Средна (1) n.d. 2.80 2.42 2.89 2.45SR - 0,45 0.43 0.40 0.42CVR - 16 18 14 17Възстано- - 86 74 88 75вяване

(1) - единици в mg/kgn.d. - не е откритоSR - стандартно отклонение на повтoряемостCVR - коефицент на вариация на повторяемосттаВъзстановяване (%)

XLI. Метод за определяне на робенидин

1. Определяне на robenidine1.3-bis[(4-chlorobenzylidene)amino] guanidine-hydrochloride1. Цели и обсегТози метод се използва за определяне съдържанието на robenidine във фуражите, като долната граница на

определяне е 5 mg/kg.2. ПринципПробата се екстрахира с помощта на кисел метанол. Екстрактът се изсушава, след което аликвотна част от

него се подлага на изчистване в колона с алуминиев окис. Robenidine се елуира от колоната с метанол. След като секонцентрира, към него се добавя ново количество, за да се постигне подходящият за мобилната фаза обем.Съдържанието на robenidine се определя чрез обратнофазова течна хроматография (HPLC) с много високи работнихарактеристики на базата на утравиолетов детектор.

3. Реактиви3.1. метанол;3.2. кисел метанол - слагат се 4 ml солна киселина (Р20с 1,18 g/ml) в 500 ml градуирана колба. Напълва се с

метанол до определената черта (3.1) и се разбърква. Разтворът се приготвя непосредствено преди употреба;3.3. ацетонитрил, HPLC степен;3.4. молекулярно сито - тип 3А с 8 до12 мрежести отвора (1,6-2,5 mm отвори, кристален алумино силикат,

диаметър на порите 0,3 mm);3.5 алуминиев окис - I степен на киселинна реакция за колонна хроматография - 100 g алуминиев окис се

прехвърлят в подходящ съд и се прибавят 2,0 ml вода. Запушва се и се разклаща за приблизително 20 min. Такаполученият разтвор се съхранява в добре запушен съд;

3.6. разтвор на калиев дихидрогенен фосфат, с = 0.025 mol/l - 3,40 g калиев дихидрогенен фосфат серазтварят във вода (HPLC степен) в 1000 ml градуирана колба. Допълва се до определената черта и се разбърква;

3.7. разтвор на двунатриев хидрогенен фосфат, с = 0.025 mol/l - 3,55 g безводен двунатриев хидрогененфосфат (или 4,45 g дихидрат или 8,95 g от додекахидрат) се разтварят във вода (HPLC степен) в 1000-милиметроваколба. Допълва се до определената черта и се разбърква;

3.8. HPLC подвижна/мобилна фаза - смесват се следните реактиви:650 ml ацетонитрил (3.3),250 ml вода (HPLC степен),50 ml разтвор на калиев дихидрогенен фосфат (3.6),50 ml разтвор на двунатриев хидрогенен фосфат (3.7).През 0,22 mm филтър се прецежда (4.6) и се дегазира разтворът (напр. чрез утрасонификация за 10 min);3.9. стандартна субстанция - чист robenidine - 1.3-bis[(4-chlorobenzylidene)amino] guanidine hydrochloride, E

750;3.9.1. изходен стандартен разтвор на robenidine - 300 µmg/ml - отмерват се 30 g от стандартния

робенидинов разтвор (3.9) до най-близките 0,1 mg на колбата. Разтваря се в кисел метанол (3.2) в 100 ml градуиранаколба. Допълва се до определената черта със същия разтворител и се разбърква. Колбата се увива в алуминиевофолио и се поставя на тъмно място;

3.9.2. междинен стандартен разтвор на robenidine - 12 µmg/ml - 10,0 ml от изходния стандартен разтвор сеслагат (3.9.1) в 250 ml градуирана колба. Допълва се до количеството, необходимо за подвижната фаза, и серазбърква. Колбата се увива с алуминиево фолио и се съхранява на тъмно място;

3.9.3. калибрацинни разтвори - 5, 10, 15 и 20 ml от междиния стандартен разтвор се прехвърлят (3.9.2) вняколко 50 ml калибрирани колби. Допълват се до количеството, необходимо за подвижната фаза (3.8) и серазбъркват. Разтворите отговарят съответно на 1,2; 2,4; 3,6; 4,8 и 6,0 µg/ml робенидин. Разтворите се приготвятнепосредствено преди употреба.

4. Апаратура4.1. стъклена колона - направена е от тъмно кехлибарено стъкло, снабдено със запорен кран. Резервоарът е

приблизително с обем 150 ml, вътрешен диаметър от 10 до 15 mm и дължина 250 mm;4.2. лабораторен механичен шейкър;4.3. вакуумен ротационен изпарител на филма;4.4. HPLC апарат с утравиолетов детектор с променлива дължина на вълните или диодно-клетъчен

детектор, който работи в обхват 250 - 400 mm;4.4.1.течна хроматографска колона - 300 mm x 4 mm, С18, 10 mm опаковка или еквивалент;4.5. филтрова хартия със стъклени нишки (Whatman GF/A или еквивалент);4.6. мембранни филтри, 0,22 µm;4.7. мембранни филтри, 0,45 µm.5. ПроцедураЗабележка. Робенидинът е чувствителен към светлина. Да се използват тъмнокехлибарени стъкленици във

всички операции.5.1. Общи положения5.1.1. Анализира се празна проба с цел да се провери наличието на робенидин или интерфериращи

вещества.5.1.2. Провежда се възстановителен тест, като се анализира празната проба (5.1.1), която е била усилена от

допълнително количество робенидин, сходно с това в пробата. Пробата може да бъде усилена до ниво 60 mg/kg, катосе прехвърлят 3,0 ml от изходния стандартен разтвор в отделна 250 ml конична колба. Разтворът се изпарява до 0,5ml под азотна струя. Прибавят се 15 g от празната проба, смесва се добре и се изчаква 10 min, преди да се продължис етапа на екстракция.

Забележка. За целите на метода празната фуражна проба трябва да бъде сходна по вид с образеца и прианализ не трябва да се открие наличието на робенидин в нея.

5.2. ЕкстракцияОтмерват се приблизително 15 g от приготвения образец до най-близките 0,01 g. Прехвърлят се в 250 ml

колба и се добавят 100 ml кисел метанол (3.2), съдът се запушва добре и се бърка в шейкър в продължение на 1 h(4.2). Разтворът се прецежда през филтрова хартия със стъклени нишки (4.5) и целият филтрат се събира в 150 mlконична колба. Прибавят се 7,5 g от молекулярно сито (3.4), съдът се запушва добре и се разбива в продължение на 5min. Незабавно се прецежда през филтрова хартия със стъклени нишки. Разтворът се запазва за етапа напурификация (5.3).

5.3. Пурификация5.3.1. Подготовка на колоната с алуминиев окисДолният край на стъклената колона се запушва (4.1) с тапа от стъклен памук и се уплътнява, като тапата се

набутва навътре с помощта на стъклена пръчка. Отмерват се 11 g от приготвения алуминиев окис (3.5) и сепрехвърлят в колоната. По време на опита влиянието на околната среда трябва да се сведе до минимум. Колоната сепочуква леко в долния й край, за да се избистри окисът.

5.3.2. Пурификация на пробата/образецаПрехвърлят се 5 ml от пробния екстрат, приготвен в (5.2), в колоната с помощта на пипета. Краят на

пипетата се поставя близо до колонната стена и се оставя разтворът да се абсорбира от алуминиевия окис.Робенидинът от колоната се елюира, като се използват 100 ml метанол (3.1) при скорост на изтичане 2 до 3 ml/min.Елюираната субстанция се поставя в 250 ml колба с кръгло дъно. Метаноловият разтвор се подлага на изпаряване доизсъхване при намалено налягане от 40°C във вакуумен ротационен филмов изпарител (4.3). Утайката се разтваряотново в 3 до 4 ml субстанция от подвижната фаза (3.8) и се прехвърля в 10 ml колба. Колбата се изплаква наняколко пъти с 1 до 2 ml от подвижната фаза и изплакнатите количества се прехвърлят в градуираната колба.Допълва се до определената черта със същия разтворител и се разбърква. Една аликвотна част от полученотовещество се филтрира през мембранни филтри 0,45 µт (4.7). Разтворът се запазва за определяне на HPLC.

5.4. Определяне на HPLC5.4.1. ПараметриПредлагат се следните условия за провеждане на анализа. Други условия могат да бъдат използвани, ако те

дават равностойни резултати:- течна хроматографична колона (4.4.1),

- HPLC подвижна фаза (3.8),- скорост на изтичане - 1,5 до 2 ml/min,- вълнова дължина на детектора - 317 nm,- обем за инжектиране - 20 до 50 µl.Проверява се стабилността на хроматографичната система, като на няколко пъти се инжектира

калибрационнен разтвор (3.9.1), съдържащ 3,6 µg/ml, докато се постигнат постоянни височини на пика и времена назадържане.

5.4.2. Калибрационна графикаВсеки от калибрационните разтвори, получени в (3.9.1), се инжектира няколко пъти и се измерват

височините (областите на пика) за всяка концентрация. Начертава се калибрационна крива, като се обозначаватсредните пикови височини или области на калибрационните разтвори по ординатите, а съответните концентрации вµg за ml по абсцисите.

5.4.3. Мострен разтворМостреният разтвор се инжектира няколко пъти, като се използва същият обем като този в

калибрационните разтвори и се определя средната пикова височина (област) на робенидиновите пикове.6. Изчисление на резултатитеОт средната височина (област) на робенидиновите пикове се определя концентрацията на мострения

разтвор в µg/ml на базата на калибрационната графика (5.4.2).Съдържанието на робенидин w (mg/kg) в пробата е дадена в следната формула:

200c

W = [mg/kg],

m

където:

с е концентрацията на робенидин в мострения разтвор в µg/ml;m - масата на тестовата позиция в g.7. Потвърждаване на резултатите7.1. Идентичност

Идентичността на аналита може да се потвърди чрез ко-хроматография или използването на диодендетектор, с помощта на който могат да се сравнят спектрите на мострения екстракт и калибрационния разтвор(3.9.3), съдържащ 6 mg/ml.

7.1.1. Ко-хроматографияПробният екстракт се подсилва, като към него се прибави подходящо количество от калибрационния

разтвор (3.9.3). Количеството добавен робенидин трябва да бъде сходно с количество робенидин, изчислено впробния екстракт.

Усилва се единствено височината на робенидиновия пик, като се вземе предвид както добавенотоколичество, така и разтвореният екстракт. Пиковата широчина в половината от максималната му височина трябва дабъде в приблизително 10 % от началната широчина.

7.1.2. Диодно детектиранеРезултатите са оценени съгласно следните критерии:(а) вълновата дължина на максималната абсорбция на пробата и стандартните спектри, регистрирана в

пиковия апекс на хроматограмата, трябва да попадне в същото поле на разделителната сила на детектиращатасистема; що се отнася до диодния детектор, типично за него е да бъде приблизително в обсега на 2 nm;

(б) в обсега между 250 и 400 nm пробата и стандартните спектри, регистрирани в пиковия апекс нахроматограмата, не трябва да се различават от онези части на спектъра, които попадат в обсег 10 до 100 % ототносителната абсорбция; критерият е изпълнен тогава, когато налице са същите максимуми и няма регистриранаточка, в която отклонението между двата спректъра да превишава 15 % от абсорбцията на стандартния аналит;

(в) в обсега между 250 и 400 nm спектрите на възходящия наклон, апекса и низходящия наклон на пика,регистриран от мострения екстракт, не трябва да се различават един от друг за тези части от спектъра, които попадатв обсега на 10 до 100 % от относителната абсорбция; критерият е спазен тогава, когато налице са същите максимумии когато във всички регистрирани точки отклонението между спектрите не надминава 15 % от абсорбцията наспектъра на апекса.

Ако един от критериите не е спазен, наличието на аналита не се потвърждава.7.2. Повторяемост

Разликата между резултатите от двата паралелно проведени опита за определяне на робенидиновотосъдържание в една и съща проба не трябва да превишава 10 % от по-високата стойност за робенидиново съдържание,по-голямо от 15 mg/kg.

7.3. ВъзстановяванеВъзстановяването за подсилена празна фуражна проба трябва да бъде поне 85 %.8. Резултати от съвместно изследванеПри организирано съвместно изследване, проведено от 12 лаборатории, при което предмет на анализ са

четири фуражни проби от храната на домашни птици и зайци във формата на шрот или гранули, като всяка проба сеподлага на двоен анализ, се получават следните резултати, представени в таблицата:

Домашни птици Зайци

шрот гранули шрот гранули

Средна (mg/kg) 27,00 27,99 43,6 40,1S1 (mg/kg) 1,46 1,26 1,44 1,66CV1 (%) 5,4 4,5 3,3 4,1S1 (mg/kg) 4,36 3,36 4,61 3,91CVR (%) 16,1 12,0 10,6 9,7Възстановя- 90,0 93,3 87,2 80,2ване (%)

S1 - стандартно отклонение на повторяемостCV1 - коефицент на вариация на повторяемосттаSR - стандартно отклонение на възпроизводимостCVR - коефицент на вариация на възпроизводимостта

ХLII. Определяне на methyl benzoquate

7-benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-quinolone1. Цели и обхватТози метод се използва за определяне съдържанието на methyl benzoquate във фуражите, като долната

граница на определяне е 1 mg/kg.2. ПринципМетиловият benzoquate се екстрахира от пробата с помощта на метанолова метаносулфонова киселина.

Екстрактът се пречиства с дихлорметан чрез йоннообменна хроматография и после отново с дихлорметан.Съдържанието на метиловия benzoquate се определя чрез обратнофазова течна хроматография (HPLC) с многовисоки работни характеристики на базата на ултравиолетов детектор.

3. Реактиви3.1. дихлорметан;3.2. метанол, HPLC степен;3.3. HPLC подвижна фаза:смесица от метанол (3.2) и вода (HPLC степен) 75 + 25 (v + v).Разтворът се прецежда през филтър 0,22 µmm (4.5) и се дегазира (напр. чрез ултрасонификация в

продължение на 10 min);3.4. разтвор на метаносулфонова киселина, s = 2 % - метаносулфоновата киселина и метанолът се

разреждат в съотношение 20 ml към 1000 ml (3.2);3.5. разтвор на солна киселина, s = 10 % - солната киселина (Р20 с, 1,18 g/ml) се разрежда с вода в

съотношение 100 ml към 1000 ml;3.6. катионнообменна смола Amberlite CG-120 (Na), 100 до 200 мрежа - смолата се подлага на обработка

преди употреба - суспендират се 100 g от смолата и 500 ml разтвор на солна киселина (3.5), нагрява се на горещкотлон до завиране, като непрекъснато се бърка. Оставя се да се охлади и киселината се източва. Прецежда се презфилтрова хартия във вакуум. Смолата първо се измива с 500 ml дози вода два пъти, а след това и с 250 ml метанол.Смолата се изплаква с още 250 ml метанол и се изсушава, като се пуска въздух през филтър-преса. Изсушенатасмола се съхранява в добре запушена бутилка;

3.7. стандартна субстанция - чист methyl benzoquate (7-benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-quinolone);3.7.1. Изходен стандартен разтвор на methyl benzoquate, 50 µg/ml - отмерват се 50 mg от стандартната

субстанция (3.7) с точност до 0,1 mg и се разтварят в разтвор на метаносулфонова киселина (3.4) в 100 ml градуиранаколба. Допълва се до определената черта и се разбърква.

3.7.2. Междинен стандартен разтвор на methyl benzoquate, 500 µg/mlПрехвърлят се 5 ml от изходния стандартен разтвор на methyl benzoquate (3.7.1) в 50 ml градуирана колба.

Допълва се с метанол (3.2) до определената черта и се разбърква.3.7.3. Калибрационни разтвориПрехвърлят се 1, 2, 3, 4 и 5 ml от междинния стандартен разтвор на methyl benzoquate (3.7.2) в няколко 25

ml градуирани колби. Допълва се до определения за подвижната фаза (3.3) обем и се разбърква. Концентрацията наmethyl benzoquate в тези разтвори е съответно 2, 4, 6, 8 и 10 µg/ml. Разтворите се приготвят непосредствено предиупотреба.

4. Апаратура4.1. лабораторен шейкър;4.2. вакуумен ротационен изпарител на филма;4.3. стъклена колона (250 mm х 15 mm), снабдена със запорен кран. Резервоарът е с обем 200 ml

приблизително;4.4. HPLC апарат с ултравиолетов детектор с променлива дължина на вълните или диоден детектор;4.4.1. течна хроматаграфска колона - 300 mm x 4 mm, С18, 10 µm опаковка или еквивалент;4.5. мембранни филтри, 0,22 µm;5. Процедура5.1. Общи положения5.1.1. Анализира се празна фуражна проба с цел да се провери отсъствието както на methyl benzoquate, така

и на интерфириращи вещества.5.1.2. Провежда се възстановителен тест, като се анализира празната проба, която предварително е била

усилена чрез прибавяне на допълнително количество methyl benzoquate, сходно с количеството в пробата. Пробатаможе да бъде усилена до ниво до 15 mg/kg, като се прибавят 600 µl от изходния стандартен разтвор (3.7.1) към 20 gот празната проба. Смесва се и се изчаква 10 min, преди да се продължи с етапа на екстракция (5.2).

Забележка. За целите на метода празната проба трябва да бъде сходна по вид с образеца и при анализ нетрябва да се открие наличието на methyl benzoquate.

5.2. ЕкстракцияОтмерват се приблизително 20 g от приготвената проба до най-близкия 0,01 g и се прехвърлят в 250 ml

конична колба. Прибавят се 100 ml разтвор на метаносулфонова киселина (3.4) и се разбива механично впродължение на 30 min. Филтрира се през филтърна хартия и филтратът се запазва за етапа на разреждане течност -течност (5.3).

5.3. Разреждане течност - течностПрехвърлят се 100 ml солна киселина (3.5) и 250 ml от филтрата, получен в (5.2), в 500 ml делителна

фуния. Прибавят се 100 ml дихлорметан (3.1) във фунията и се разбива за около 1 min. Оставят се пластовете да серазделят и се източва долният пласт (дихлорметан) в 500 ml колба с кръгло дъно. Екстракцията на водната фаза сеповтаря с още две 40 ml дози дихлорметан и се смесва с първия екстракт от колбата с кръглото дъно.Дихлорметановият екстракт се подлага на изпаряване до изсъхване във вакуумния ротационен изпарител, работещпри намалено налягане и при 40°C. Утайката се разтваря в 20 до 25 ml метанол (3.2), колбата се запушва и се запазвацелият екстракт за йоннообменната хроматография (5.4).

5.4. Йоннообменна хроматография5.4.1. Приготвяне на катионнообменната колонаЗапушва се долният край на стъклената колона (4.3) с тапа от стъклен памук. Приготвя се суспензия с 5 g

от катионнообменно обработената смола (3.6) и 50 ml солна киселина (3.5). Тя се излива в стъклената колона исуспензията се оставя да се избистри. Източва се излишното количество киселина до нивото на повърхността насмолата и се промива колоната с вода, докато източеното вещество стане неутрално към лакмуса. Прехвърлят се 50ml метанол (3.2) в колоната и се оставя да се отцеди до нивото на смолистата повърхност.

5.4.2. Колонна хроматографияС помощта на пипета внимателно се прехвърля екстрактът, получен в (5.3), в колоната. Колбата с кръгло

дъно се изплаква с две дози (от 5 до 10 ml) метанол (3.2) и изплакнатите количества се прехвърлят в колоната.Екстрактът се източва до нивото на смолата и колоната се измива с 50 ml метанол, като скоростта на изтичане е непо-голяма от 5 ml на min. Източеното количество се изхвърля. Мethyl benzoquate от колоната се елюира, като сеизползва 150 ml разтвор на метаносулфонова киселина (3.4) и се поставя колонният елюат в 250 ml конична колба.

5.5. Разреждане течност - течностЕлюатът, получен в (5.4.2), се прехвърля в 1 l делителна фуния. Коничната колба се изплаква с 5 до 10 ml

метанол (3.2) и се смесват изплакнатите количества със съдържанието от делителната фуния. Прибавят се 300 mlразтвор на солна киселина и 130 ml дихлорметан (3.1). Разбива се за около 1 min и се оставя фазите да се разделят.Долният слой (дихлорметан) се източва в 500 ml колба с кръгло дъно. Екстракцията на водната фаза се повтаря с ощедве дози по 70 ml дихлорметан и се смесват новополучените екстракти с първия екстракт от колбата с кръгло дъно.

Дихлорметановият екстракт се подлага на изпаряване до изсъхване във вакуумния ротационен изпарител,

работещ при намалено налягане и при 40°C. Утайката се разтваря в колбата с приблизително 5 ml метанол (3.2) иколичествено разтворът се прехвърля в 10 ml градуирана колба. Колбата с кръгло дъно се изплаква с още две дозиметанол (1 до 2 ml) и съдържанието се прехвърля в градуираната колба. Допълва се с метанол до определената чертаи се разбърква. Една аликвотна част се филтрира през мембранен филтър (4.6). Разтворът се запазва за определяне наHPLC (5.6).

5.6. Определяне на HPLC5.6.1. ПараметриПредлагат се следните условия за провеждане на анализа:- течна хроматографична колона (4.4.1);- HPLC подвижна фаза - метанолово-водна смес (3.3);- скорост на изтичане - 1 до 1,5 ml/min;- вълнова дължина на детектора - 265 nm;- обем за инжектиране - 20 до 50 µl.Други условия могат да бъдат използвани, ако те дават равностойни резултати.Проверява се стабилността на хроматографичната система, като на няколко пъти се инжектира

калибрационният разтвор (3.7.3), съдържащ 4 µg/ml, докато се постигнат постоянни височини на пика и времена назадържане.

5.6.2. Калибрационна графикаВсеки от калибрационните разтвори, получени в (3.7.3), се инжектира няколко пъти и се измерват

височините (областите) на пика за всяка концентрация. Начертава се калибрационна крива, като средните пиковивисочини или области на калибрационните разтвори се обозначават по ординатите, а съответните концентрации в mgза ml - по абсцисите.

5.6.3. Мострен разтворМостреният разтвор (5.5) се инжектира няколко пъти, като се използва същият обем като този в

калибрационните разтвори и се определя средната пикова височина (област) на methyl benzoquate пикове.6. Изчисление на резултатитеОт средната височина (област) на пиковете на methyl benzoquate се определя концентрацията на мострения

разтвор в µg/ml, като се използва калибрационната графика (5.6.2).Съдържанието на methyl benzoquate w (mg/kg) в пробата е дадена в следната формула:

200cW = _____,

m

където:с е концентрацията на methyl benzoquate в мострения разтвор в µg/ml;m - масата на тестовата позиция в g.7. Потвърждаване на резултатите7.1. ИдентичностИдентичността на аналита може да се потвърди чрез ко-хроматография или чрез използване на диоден

детектор, с помощта на който могат да се сравнят спектрите на мострения екстракт и калибрационния разтвор(3.7.3), съдържащ 10 µg/ml.

7.1.1. Ко-хроматографияПробният екстрат се подсилва, като към него се прибави подходящо количество от междинния стандартен

разтвор (3.7.2). Количеството добавен methyl benzoquate трябва да бъде сходно с количество methyl benzoquate,изчислено в пробния екстракт.

Усилва се единствено височината на methyl benzoquate пик, като се вземат предвид както добавенотоколичество, така и разтвореният екстракт. Пиковата широчина в половината от максималната му височина трябва дабъде в приблизително 10 % от началната широчина.

7.1.2. Диодно детектиранеРезултатите са оценени според следните критерии:(а) вълновата дължина на максималната абсорбция на пробата и стандартните спектри, регистрирана в

пиковия апекс на хроматограмата, трябва да попадне в същото поле на разделителната сила на детектиращатасистема; типично за диодния детектор е да бъде приблизително в обсега на 2 nm;

(б) в обсега между 250 и 400 nm пробата и стандартните спектри, регистрирани в пиковия апекс нахроматограмата, не трябва да се различават от онези части на спектъра, които попадат в обсег 10 до 100 % ототносителната абсорбция; критерият е изпълнен тогава, когато налице са същите максимуми и няма регистриранаточка, в която отклонението между двата спектъра да превишава 15 % от абсорбцията на стандартния аналит;

(в) в обсега между 250 и 400 nm спектрите на възходящия наклон, апекса и низходящия наклон на пика,

регистриран от мострения екстрат, не трябва да се различават един от друг за тези части от спектъра, които попадатв обсега на 10 до 100 % относителна абсорбция; критерият е спазен тогава, когато налице са същите максимуми икогато във всички регистрирани точки отклонението между спектрите не надминава 15 % от абсорбцията наспектъра на апекса.

Ако един от критериите не е спазен, наличието на аналита не се потвърждава.7.2. ПовторяемостРазликата между резултатите от двата паралелно проведени опита за определяне на methyl benzoquate

съдържание в една и съща проба не трябва да превишава: 10 % спрямо по-високата стойност на съдържание наmethyl benzoquate, между 4 и 20 mg/kg.

7.3. ВъзстановяванеВъзстановяването за подсилена празна фуражна проба трябва да бъде поне 90 %.8. Резултати от съвместно изследванеПет проби се подлагат на анализ от 10 лаборатории. За всяка една проба са проведени двойни анализи.

Резултатите са представени в таблицата:

Празна Шрот 1 Гранули 1 Шрот 2 Гранули 2проба

Средна (mg/kg) n.d. 4.50 4.50 8.90 8,70S1 (mg/kg) n.d. 0,30 0,20 0,60 0,50CV1 (%) n.d. 6,70 4,40 6,70 5,70S1 (mg/kg) n.d. 0,40 0,50 0,90 5,70CVR (%) n.d. 8,90 11,00 10,10 11,00Възстановя- n.d. 92,00 93,00 92,00 89,00ване (%)

n.d. - не е откритоS1 - стандартно отклонение на повторяемостCV1 - коефицент на вариация на повторяемосттаSR - стандартно отклонение на възпроизводимостCVR - коефицент на вариация на възпроизводимостта

ХLIII. Определяне на спирамицин чрез дифузия в хранителна среда агар-агар

1. Цел и обхватМетодът е за определяне на спирамицин в животински храни и предварително приготвени смеси. Долната

граница на определяне е 1 mg/kg (1ррm)(1).2. ПринципПробата се извлича със смес на метанол/фосфат-бикарбонатен буфер при рН 8. Извлекът се декантира или

центрофугира и разрежда. Нейната антибиотична активност се определя чрез измерване на дифузията наспирамицин в агар-агар среда, изкуствено заразена в Microccus luteus. Дифузията се показва чрез формиране на зонина инхибиране на микроорганизмите. Приема се, че диаметърът на тези зони е право пропорционален на логаритъмана антибиотичната концентрация в обхвата на използваните антибиотични концентрации.

3. Микроорганизъм - Microccus luteus АТСС 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)3.1. Поддържане на изходна култураВ тръби, съдържащи културална хранителна среда (4.1), се посява Microccus luteus и се слага в инкубатор

за 24 h при 30°C. Културата се съхранява в хладилник при около 4°C. Слага се отново в инкубатор на всеки 2седмици.

3.2. Приготвяне на бактериалната суспензияВзема се продуктът на свежа хранителна среда агар-агар (3.1) с 2 до 3 ml разтвор на натриев хлорид (4.3).

Тази суспензия се използва, за да се посее в 250 ml културална среда (4.1), съдържаща се в Roux колба и се поставя винкубатор за 18 - 20 h при 30°C. Полученото се слага в 25 ml разтвор на натриев хлорид (4.3) и се разбърква.Суспензията се разрежда до 1/10 с разтвор на натриев хлорид (4.3). Прозрачността на суспензията трябва да бъдеоколо 75 %, измерена при 650 nm в клетка 1 cm спрямо разтвор на натриев хлорид (4.3). Тази суспензия може да сесъхранява една седмица при около 4°C.

4. Културална среда и реактиви

4.1. Културална среда

Месен пептон 6 gТриптон 4 gЕкстракт от дрожди 3 gМесен екстракт 1,5 gГликоза 1 gАгар-агар 10 до 20 gВода 1000 mlрН 6,5 до 6,6 (след стерилизация).

4.2. Хранителна среда за извършване на анализа

Триптон 5 gЕкстракт от дрожди 4 gМесен екстракт 3 gАгар-агар 10 до 20 gВода 1000 mlрН 8,0 (след стерилизация).

4.3. Разтвор на натриев хлорид 0,8 % (об.т.)Разтварят се 8 g натриев хлорид във вода и се разрежда до 1000 ml и се стерилизира.

4.4. Фосфатно-бикарбонатен буфер, рН 8,0

Двукалиев водороден фосфат К2НРО4 16,7 gКалиев двуводороден фосфат КН2РО4 0,5 gНатриев водороден карбонат NaHCO3 20 gВода до 1000 ml

4.5. Смес на метанолов фосфатно-бикарбонатен буфер (4.4)50/50 об. тегло4.6. Стандартна субстанцияСпирамицин с известна активност (в IU).5. Стандартни разтвориРазтваря се точно претеглено количество стандартна субстанция (4.6) в сместа (4.5) и се разтваря със

същата смес, за да се получи изходен разтвор, съдържащ 1000 IU спирамицин на 1 ml. Съхраняван в запушена колбапри 4°C, този разтвор е стабилен до 5 дни.

От този изходен разтвор се приготвят чрез последователно разреждане със сместа (4.5) следните разтвори:S8 - 1 IU/mlS4 - 0,5 IU/mlS2 - 0,25 IU/ml6. Приготвяне на екстракта и разтворите за извършване на анализ6.1. ИзвличанеПретегля се проба от 20 g при животински храни и от 1 до 20 g при предварително приготвени смеси.

Добавят се 100 ml от сместа (4.5) и се разтръсква в продължение на 30 min. Центрофугира се или се декантира иплаващият по повърхността слой се разрежда с разтвора (4.5), за да се получи очаквано съдържание на спирамицинот 1 IU/ml (= U8).

За очаквани нива на спирамицин, по-ниски от 2,5 mg/kg животинска храна, извличането се извършва, кактоследва: претеглят се 20 g проба; добавят се 100 ml от сместа (4.5) и се разтръсква в продължение на 30 min;центрофугира се в продължение на няколко min, вземат се 50 ml от плаващия на повърхността разтвор и се изпаряватдо около 4 ml при намалено налягане в ротационен изпарител при температура, непревишаваща 40°C. Остатъкът серазрежда със сместа (4.5), за да се очаква съдържание на спирамицин от 1 IU/ml (= U8).

6.2. Разтвори за извършване на анализОт разтвор U8 се приготвят разтвори U4 (очаквано съдържание: 0,5 IU/ml), U2 (очаквано съдържание: 0,25

IU/ml) и U1 (очаквано съдържание: 0,125 IU/ml) чрез последователно разреждане (1 + 1) със сместа (4.5).7. Процедура на извършване на анализа7.1. Посяване в средата за изпитванеВ средата за изпитване (4.2) се посява бактериалната суспензия (3.2) при около 50°C. Чрез предварителни

опити в петрита със среда за изпитване (4.2) се определя количеството на бактериалната суспензия, необходимо да

се получат най-големите и най-ясни зони на инхибиране с различна концентрация на спирамицин.7.2. Подготовка на петритатаДифузията през агар-агар се извършва в петрита с четирите концентрации на стандартния разтвор (S8, S4,

S2 и S1) и четирите концентрации на анализирания разтвор (U8, U4, U2 и U1). Тези четири концентрации наесктракта и стандарта трябва задължително да се поставят във всяко петри. В тази връзка се избират петрита,достатъчно големи, за да позволят в средата агар-агар да се направят поне 8 отвора с диаметър от 10 до 13 mm и непо-малко от 30 mm между центровете. Тестът трябва да се извърши в петрита, състоящи се от лист стъкло, покрит салуминиев или пластмасов пръстен, поставен отгоре, с вътрешен диаметър 200 mm и височина 20 mm.

В петритата се излива част от средата (4.2), посята както в 7.1, за да се получи слой, дебел около 2 mm (60ml за петри с диаметър 200 mm). Оставя се да се изравни, пробиват се дупките и в тях се обозначават точнопремерени обеми от разтворите за анализиране и стандартните разтвори (между 0,10 и 0,15 ml на дупка в зависимостот диаметъра). Всяка концентрация се полага поне 4 пъти, така че на всяко определяне да подлежат на оценка 32зони на инхибиране.

7.3. Поставяне в инкубаторПетритата се поставят за 16 - 18 h при 30 ± 2°C.8. ОценяванеИзмерва се диаметърът на зоните на инхибиране с точност 0,1 mm. Отбелязват се средноаритметичните

стойности на измерванията за всяка концентрация върху милиметрова хартия, показваща логаритъма наконцентрациите във връзка с диаметрите на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на най-добро съответствиена стандартния разтвор и екстракта.

Определя се "най-точно съответстващата" точка за стандартното най-ниско ниво (SL), като се използваформулата:

7S1 + 4S2 + S4 - S8SL = _____________________ (1)

10

Определя се "най-точно съответстващата" точка за стандартното най-високо ниво (SH), като се използваформулата:

7S8 + 4S4 + S2 - S1SH = _____________________ (2)

10

По подобен начин се изчисляват и "най-точно съответстващите" точки за най-ниските нива на екстракта(UL) и най-високите нива на екстракта (UH) като във формулите се заменят S1, S2 и S8 с U1, U4 и U8.

Изчислените стойности на SL и SH се нанасят на същата милиметрова хартия и се свързват, за да сеполучи линията на "най-точно съответствие" за стандартния разтвор. По подобен начин се нанасят UL и UH и сесвързват, за да се получи линията на "най-точно съответствие" за екстракта.

При отсъствие на интерференции линиите трябва да са паралелни. За практически цели линиите могат дасе считат паралелни, ако стойностите (SH - SL) и (UH - UL) не се различават с повече от 10 % от тяхната среднааритметична стойност.

Ако се окаже, че линиите не са паралелни u1 и s1 или u8 и s8 могат да се изключат и SL, SH, UL и UH да сеизчислят, като се използват алтернативните формули, за да се получат линиите на "най-точно съответствие"

5S1 + 2S2 - S4 5S2 + 2S4 - S8SL = _______________ или _________________ (3)

6 65S4 + 2S2 - S1 5S8 + 2S4 - S2

SH = _________________ или _____________________ (4)6 6

и по-подобен начин за UL и UH. Трябва да бъде удовлетворен същият критерий за успоредност. Фактът, черезултатът е изчислен от три нива, трябва да бъде отбелязан в крайния отчет.

Малките букви "s" и "u" се отнасят за диаметрите на зоните на инхибиране.Когато линиите се считат за успоредни, се изчислява логаритъмът на относителна активност (log A)

посредством една от следните формули в зависимост от това, дали са използвани три или четири нива за оценка науспоредността.


(U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8) . 0,602

Log A = (5)

U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2


(U1 + U2 + U4 - S1 - S2 - S4) . 0,401

Log A = (6)

U4 + S4 - U1 - S1

или

(U2 + U4 + U8 - S2 - S4 - S8) . 0,401

Log A = (7)

U8 + S8 - U2 - S2

Активността на пробвания екстракт е равна на активността на релевантния стандарт, умножена по А:

(U8=S8 x A)

Ако относителната активност се окаже извън обхвата от 0,5 до 2, анализът се повтаря, като се правятподходящи корекции на концентрациите на екстракта или ако това не е възможно - на стандартните разтвори. Когатоотносителната активност не може да се доведе в изисквания обхват, всеки получен резултат се счита заприблизителен и това се отбелязва в крайния отчет.

Когато линиите не могат да се считат за успоредни, определянето се повтaря. Ако пак не може да сеполучи успоредност, определянето се счита за незадоволително.

Резултатите се изразяват в mg спирамицинова база на kg животинска храна.9. ПовторяемостРазликата между резултатите на две успоредни определяния, направени на същата проба от същия

лаборант, не трябва да превишава:- 2 mg/kg в абсолютна стойност - за съдържание на спирамицинова база до 10 g/kg;- 20 % от най-високата стойност - за съдържания от 10 до 25 mg/kg;- 5 mg/kg в абсолютна стойност - за съдържание от 25 до 50 mg/kg;- 10 % от най-високата стойност - за съдържания над 50 mg/kg.

ХLIV. Определяне на диклазурил

(+) - 4-хлорфенил [2,6-дихлоро-4-(2,3,4,5-тетрахидро-3,5-диоксо-1,2,4-триазин-2-ил)фенил] ацетонитрил1. Цели и обхватТова е метод за определяне на диклазурил в животински храни и предварително приготвени смеси.

Границата на откриване е 0,1 mg/kg. Границата на определяне е 0,5 mg/кg2. ПринципСлед добавяне на вътрешен еталон пробата се извлича с подкиселен метанол. При животински храни

аликватната част на екстракта се пречиства в екстракционен патрон С18 твърда фаза. Диклазурилът се отмива отпатрона със смес от подкиселен метанол и вода. След изпаряване остатъкът се разтваря в DMF/вода. Припредварително приготвени смеси екстрактът се изпарява и остатъкът се разтваря в DMF/вода. Съдържанието надиклазурил се определя чрез течна хроматография троичен градиент обратна фаза (HPLC) с използване на УВдетектор.

3. Реагенти3.1. вода, клас HPLC;3.2. амониев ацетат;3.3. тетрабутиламониев водороден сулфат (TBHS);3.4. ацетонитрил, клас HPLC;

3.5. метанол, клас HPLC;3.6. N, N-диметилформамид (DMF);3.7. солна киселина r20 = 1,19 g/ml;3.8. еталонна субстанция: ампролиум II-24 - (+) - 4-хлорфенил

[2,6-дихлоро-4-(2,3,4,5-тетрахидро-3,5-диоксо-1,2,4-триазин-2-ил)фенил] ацетонитрил с гарантирана чистота, Е 771.3.8.1. Изходен еталонен разтвор на диклазурил, 500 µg/mlПретеглят се с точност 0,1 mg 25 mg от еталонната субстанция на диклазурил (3.8) в мерителна колба от 50

ml, разтварят се в DMF (3.6), допълва се до отметката с DMF (3.6) и се смесва. Колбата се обвива с алуминиевофолио или се използва колба от тъмно стъкло и се съхранява в хладилник. При температура под 4°C разтворът естабилен в продължение на един месец.

3.8.2. Еталонен разтвор на диклазурил, 50 µg/ml5 ml от изходния еталонен разтвор (3.8.1) се прехвърлят в мерителна колба 50 ml, долива се с DMF до

отметката (3.6) и се смесва. Колбата се обвива с алуминиево фолио или се използва колба от тъмно стъкло и сесъхранява в хладилник. При температура под 4°C разтворът е стабилен в продължение на 1 месец.

3.9. Вътрешна еталонна субстанция: 2,6-дихлоро-a-(4-хлорфенил)-4-(4,4 дихидро3,5диоксо-1,2,4-триазин-2(3Н)-yl) a-метилбензин-ацетонитрил.

3.9.1. Вътрешен изходен еталонен разтвор, 500 µg/mlПретеглят се с точност 0,1 mg 25 mg от вътрешната еталонна субстанция (3.9) в мерителна колба 50 ml.

Разтваря се в DMF (3.6), долива се до отметката с DMF (3.6) и се смесва. Колбата се обвива с алуминиево фолио илисе използва колба от тъмно стъкло и се съхранява в хладилник. При температура под 4°C разтворът е стабилен впродължение на един месец.

3.9.2. Вътрешен еталонен разтвор, 50 µg/ml5,00 ml от вътрешния изходен еталонен разтвор се прехвърлят (3.9.1) в мерителна колба 50 ml, долива се до

отметката с DMF (3.6) и се смесва. Колбата се обвива с алуминиево фолио или се използва колба от тъмно стъкло исе съхранява в хладилник. При температура под 4°C разтворът е стабилен в продължение на един месец.

3.9.3. Претеглят се с точност 0,1 mg р/210 mg от вътрешната еталонна субстанция в мерителна колба 100ml, разтваря се в DMF (3.6) в ултразвукова вана (4.6), долива се до отметката с DMF и се смесва. Колбата се обвива салуминиево фолио или се използва колба от тъмно стъкло и се съхранява в хладилник. При температура под 4°Cразтворът е стабилен в продължение на един месец.

3.10. Калибриращ разтвор, 2 µg/mlОтпипетирват се 2 ml еталонен разтвор на диклазурил (3.8.2) и 2,00 ml вътрешен еталонен разтвор (3.9.2) в

мерителна колба от 50 ml. Добавят се 16 ml DMF (3.6), долива се до отметката с вода и се смесва. Този разтвор сеприготвя непосредствено преди използване.

3.11. Екстракционен патрон С18 твърда фаза, напр. Bond Elut, размер 1 сс, маса на сорбента 100 mg3.12. Екстракционен разтворител - подкиселен метанолОтпипетирват се 5 mg солна киселина (3.7) в 1000 mg метанол (3.5) и се смесват.3.13. Мобилна фаза за HPLCОтмиващ агент А - амониев ацетат - разтвор на тетрабутиламониев водороден сулфат.3.13.1. 5 g амониев ацетат (3.2) и 3,4 g TBSH се разтварят (3.3) в 1000 ml вода (3.1) и се смесват.3.13.2. Отмиващ агент Б - ацетонитрил (3.4).3.13.3. Отмиващ агент В - метанол (3.5).4. Апарати4.1. механичен вибратор;4.2. оборудване за HPLC троичен градиент;4.2.1. течна хроматографска колона, Hypersil ODS, пълнеж 3 mm, 100 mm x 4,6 mm или еквивалентна;4.2.2. УВ детектор с регулиране на дължината на вълната или диоден полеви детектор;4.3. вакуумен ротационен изпарител;4.4. мембранен филтър, 0,45 µm;4.5. вакуумен колектор;4.6. ултразвукова вана.5. Процедура5.1. Общи положения5.1.1. Празна проба хранаAнализира се празна проба храна, за да се провери отсъствието на диклазурил и на субстанции, които

оказват влияние. Празната проба храна трябва e подобна по вид на пробата и/или субстанциите, които оказватвъздействие.

5.1.2. Тест за възстановяванеИзвършва се тест за възстановяване чрез анализиране на празна проба храна, към който е било добавено

количество диклазурил, подобно на наличното в пробата. За да се получи концентрация 1 mg/kg, 0,1 ml от изходния

еталонен разтвор (3.8.1) се добавят към 50 g празна проба храна, смесва се добре и се оставя за 10 min, като отново серазбърква няколко пъти, преди да се пристъпи към екстракцията (5.2).

Алтернативно, ако няма на разположение празна проба храна, подобна на пробата (вж. 5.1.1), тестът навъзстановяване може да се извърши чрез метода добавяне на еталон. В този случай пробата, която трябва да сеанализира, се подсилва с количество диклазурил подобно на това, което вече се съдържа в пробата. Тази проба сеанализира заедно с неподсилената проба и възстановяването се изчислява чрез изваждане.

5.2. Екстракция5.2.1. Животински храниС точност до 0,01 g се претеглят приблизително 50 g от пробата. Прехвърлят се в ерленмайерова колба от

500 ml, прибавят се 1 ml вътрешен еталонен разтвор (3.9.2), 200 ml екстракционен разтворител (3.12) и колбата сезапушва. Сместа се разтръсква на вибратора (4.1) цяла нощ. Оставят се да се утаи 10 min. 20 ml от аликвотната частна слоя, плаващ отгоре, се прехвърлят в подходящ стъклен контейнер и се разреждат с 20 ml вода. Този разтвор сепрехвърля в екстракционен патрон (3.11) и минава през него чрез прилагане на вакуум (4.5). Патронът се измива с 25ml смес на екстракционния разтворител (3.12) и вода, 65 + 65 (V +V). Отстраняват се събраните фракции исъединенията се отмиват с 25 ml смес на екстракционния разтворител (3.12) и вода, 80 + 20 (V + V). Тези фракции сеизпаряват точно до постигане на сухост с помощта на ротационен изпарител (4.3) при температура 60°C. Остатъкътсе разрежда в 1 ml DMF (3.6), добавят се 1,5 ml вода и се смесват. Филтрира се през мембранен филтър (4.4).Продължава се с определяне с помощта на HPCL (5.3).

5.2.2. Предварително приготвени смесиС точност до 0,001 g се претегля приблизително 1 g от пробата. Прехвърля се в ерленмайерова колба от

500 ml, прибавят се 1,00 ml вътрешен еталонен разтвор (3.9.2), 200 ml екстракционен разтворител (3.12) и колбата сезапушва. Сместа се разтръсква на вибратора (4.1) цяла нощ. Оставя се да се утаи 10 min. Аликвотна част 10.000/р ml(р е номиналното съдържание на диклазурил в предварително приготвената смес в mg/kg) на плаващия отгоре слой воблодънна колба с подходящ размер. Изпарява се точно до постигане на сухост с помощта на ротационен изпарител(4.3) под редуцирано налягане при температура 60°C. Остатъкът се разрежда отново в 10 ml DMF (3.6), добавят се 15ml вода и се смесват. Продължава се с определяне с помощта на HPLC (5.3).

5.3. Определяне с HPLC5.3.1. ПараметриСледните условия се предлагат като насоки. Могат да се използват други условия, ако те дават

еквивалентни резултати.

Течна хромато- 100 mm x 4,6, Hypersil ODS, 3 mmграфична колона опакован или еквивалент(4.2.1)

Подвижна фаза Eluent A (3.13.1): воден разтворот амониев ацетати тетрабутил -амониев хидрогенсулфат

Eluent A (3.13.2): ацетонитрил

Eluent A (3.13.3): метанол

Състояние на Линеен градиентелюация

Първоначални условия: A + B + C =60 + 20 + 20 (v + v + v)

След 10 min градиентна елюацияза 30 min до: A + B + C = 45 + 20 + 35(v + v + v)Промиване с B 10 min

Скорост на 1,5 - 2 ml/min.изтичане

Обем на вливане 20 µl

Дължина на 280 hmвълната

Стабилността на хроматографската система се проверява, като се инжектира няколко пъти калибриращиятразтвор (3.10), съдържащ 1,0 µg/ml, докато се постигнат постоянни височини на пиковете и време на забавяне.

5.3.2. Калибрираща графика20 µl калибриращ разтвор се инжектират (3.7.3) няколко пъти и се определя средноаритметичната

височина (площ) на пиковете на диклазурил и на пиковете на вътрешните еталони.5.3.3. Разтвор на пробата20 µl разтвор на пробата се инжектира (5.2.1 или 5.2.2) няколко пъти и се определят средноаритметичните

височини (площи) на пиковете и на пиковете на вътрешните еталони.6. Изчисляване на резултатите6.1. ХраниСъдържанието на диклазурил w (mg/kg) в пробата се дава със следната формула:

където:hd,s е височината (площта) на пика на диклазурил в разтвора на пробата (5.2.1);hi,s - височината (площта) на пика на вътрешния еталон в разтвора на пробата (5.2.1);hd,c - височината (площта) на пика на диклазурил в калибриращия разтвор (3.10);hi,c - височината (площта) на пика на вътрешния еталон в калибриращия разтвор (3.10);bd,c - концентрацията на диклазурил в калибриращия разтвор в µg/ml;m - масата на изпитваната част в [g];V - обемът на екстракта пробата съгласно 5.2.1 (т.е. 2,5 ml).6.2. Предварително приготвени смесиСъдържанието на диклазурил w (mg/kg) в пробата се определя със следната формула:

където:hd,s е височината (площта) на пика на диклазурил в разтвора на пробата (5.2.2);hi,s - височината (площта) на пика на вътрешния еталон в разтвора на пробата (5.2.1);hd,c - височината (площта) на пика на диклазурил в калибриращия разтвор (3.10);hi,c - височината (площта) на пика на вътрешния еталон в калибриращия разтвор (3.10);bd,c - концентрация на диклазурил в калибриращия разтвор в µg/ml;m - масата на изпитваната част в [g];V - обемът на екстракта пробата съгласно 5.2.2 (т.е. 2,5 ml).7. Установяване на достоверността на резултатите7.1. ИдентичностИдентичността на аналита може да се потвърди чрез ко-хроматография или използване на диоден полеви

детектор, чрез които се сравняват спектрите на екстракта на пробата (5.2.1 или 5.2.2) и на калибриращия разтвор(3.10).

7.1.1. Ко-хроматографияЕкстракт на пробата (5.2.1 или 5.2.2) се подсилва чрез добавяне на подходящо количество калибриращ

разтвор (3.10). Количеството на добавения диклазурил трябва да бъде подобно на количеството диклазурил, откритов екстракта на пробата.

Само височината на пика на диклазурил трябва да се увеличи, след като се вземат предвид добавенотоколичество и разреждането на екстракта. Широчината на пика по средата на неговата височина трябва да бъде врамките на ± 10 % от оригиналната широчина на пика на диклазурил на неподсилен екстракт на разтвора.

7.1.2. Диодна полева детекция

Резултатите се оценяват съгласно следните критерии:(а) дължината на вълната на максимална абсорбция на пробата и на еталонните спектри, записани при

връхната точка на пика на хроматограмата, трябва да бъдат в рамките на допустимата граница, определена отразрешаващата способност на системата за детекция; за диодната детекция тя типично е в рамките на ± 2 nm;

(б) между 230 и 320 nm спектрите на пробата и на еталона, регистрирани във връхната точка на пика нахроматограмата, не трябва да се различават за частите на спектъра, разположени в обхвата 10 - 100 %, ототносителната абсорбция; този критерий е изпълнен, когато са налице едни и същи максимални стойности и когатоникъде наблюдаваното отклонение между спектрите не превишава 15 % от абсорбцията на спектъра на еталоннияаналит;

(в) между 230 и 320 nm спектрите на възходящия наклон, връхната точка и низходящия наклон на пика,произведени от екстракта на пробата, не трябва да се различават един от друг за частите на спектъра, разположенимежду 10 и 100 % на относителната абсорбция; този критерий е изпълнен, когато са налице едни и същи максималнистойности и когато във всички наблюдавани точки отклонението между спектрите не превишава 15 % отабсорбцията на спектъра във връхната точка на пика.


трябва да превишава:- 30 % от най-високия резултат - за съдържание на диклазурил между 0,5 mg/kg и 2,5 mg/kg;- 0,75 mg/kg - за съдържание на диклазурил между 2,5 mg/kg и 5 mg/kg;- 15 % от най-високия резултат - за съдържание на диклазурил над 5 mg/kg.7.3. ВъзстановяванеЗа една подсилена (празна) проба възстановяването трябва да бъде най-малко 80 %.8. Резултати от съвместното изследванеПри анализa на пет мостри (тези проби включват 2 предварително приготвени смеси - едната, смесена с

органична матрица (О 100), а другата - с неорганична матрица (А 100). Теоретичното съдържание е 100 mgдиклазурил на kg. Двете смесени храни за птици са произведени от 3 различни производители (NL) (L1/Z1/K1).Теоретичното съдържание е 1 mg диклазурил на kg. Лабораториите са инструктирани да анализират всяка пробаедин или два пъти.) от 11 лаборатории се получават следните резултати, дадени в долната таблица:

Пример 1 Пример 2 Пример 3 Пример 4 Пример 5А 100 О 100 L 100 Z 1 K 1

L 11 11 11 11 6

n 19 18 19 19 12

mean 100,8 103,5 0,89 1,15 0,89

Sr (mg/kg) 5,88 7,64 0,15 0,02 0,03

CVr (%) 5,83 7,38 17,32 1,92 3,34

SR (mg/kg) 7,59 7,64 0,17 0,11 0,12

CVR (%) 7,53 7,38 18,61 9,67 13,65

Номинално 100 100 1 1 1съдържание

L - брой на лабораториите;n - брой на индивидуалните стойности;SR - стандартно отклонение на повторяемостта;CVR - коефициент на вариации на повторяемост;Sr - стандартно отклонение на възпроизводимост;CVr - коефициент на вариации на възпроизводимост.9. Забележкa. Трябва предварително да бъде показано, че реакцията на диклазурил в обхвата на

концентрациите е линейна.

ХLV. Определяне на карбадокс

Метил 3-(2-хиноксалинилметилен)карбазат N1, N4-диоксид

1. Цели и обхватТова е метод за определяне на карбадокс в животински храни и предварително приготвени смеси.

Границата на откриване е 1 mg/kg; границата на определяне е 10 mg/kg.2. ПринципПробата се уравновесява с вода и се извлича с метанол-ацетонитрил. При животинските храни аликватна

част на филтрирания екстракт се подлага на почистване в алуминиева оксидна колона. При предварителноприготвените смеси и препарати аликватна част от филтрирания екстракт се разрежда до подходяща концентрация свода, метанол и ацетонитрил. Съдържанието на карбадокс се определя с помощта на висококачествена течнахроматография обратна фаза, като се използва УВ детектор.

3. Реагенти3.1. метанол;3.2. ацетонитрил, HPLC клас;3.3. оцетна киселина, w = 100 %;3.4. алуминиев оксид: неутрален, клас активност = I.;3.5. метанол-ацетонитрил (1 + 1) (v + v) - смесват се 500 ml метанол (3.1) с 500 ml ацетонитрил (3.2);3.6. оцетна киселина, s= 10 % - разреждат се 10 ml оцетна киселина (3.3) до 100 ml с вода;3.7. натриев ацетат, CH3COONа;3.8. вода, клас HPLC;3.9. ацетатен буферен разтвор, с = 0,01 mol/l, рН = 6,0 - 0,82 g натриев ацетат се разтварят (3.7) в 700 ml

вода (3.8) и се коригира стойността на рН до 6 с оцетна киселина (6.3). Прехвърля се в мерителна колба от 1000 ml,долива се до отметката вода (3.6) и се смесва.

3.10. Мобилна фаза за HPLC.Смесват се 825 ml разтвор на ацетатен буфер (3.9) със 175 ml ацетонитрил (3.2). Филтрира се през филтър

0,22 µm (4.5) и разтворът се дегазира (напр. чрез ултразвукова обработка в продължение на 10 min).3.11. Еталонна субстанцияЧист карбадокс - метил 3-(2-хиноксалинилметилен)карбазат N1, N4-диоксид, Е 850.3.11.1. Изходен еталонен разтвор на карбадокс, 100 mg/ml (вж. т. 5 Процедура)С точност до 0,1 mg се претеглят 25 mg еталонна субстанция карбадокс (3.11) в мерителна колба от 250 ml.

Разтваря се в метанол-ацетонитрил (3.5) в ултразвукова вана (4.7). След ултразвуковото третиране разтворът седовежда до стайна температура, долива се до отметката с метанол-ацетонитрил (3.5) и се смесва. Колбата се обвива салуминиево фолио или се използва колба от тъмно стъкло и се съхранява в хладилник. При температура под 4°Cразтворът е стабилен в продължение на един месец.

3.11.2. Калибриращи разтвори2, 5, 10 и 20 ml от изходния еталонен разтвор се прехвърлят (3.11.1) в няколко калибрирани колби от 100

ml. Добавят се 30 ml вода, добавя се до отметката метанол-ацетонитрил (3.5) и се смесва. Колбата се обвива салуминиево фолио. Тези разтвори отговарят съответно на 2, 5, 10 и 20 mg/ml карбадокс. Калибриращите разтвори сеприготвят непосредствено преди употреба.

Забележка. За определяне на карбадокс в животински храни, съдържащи по-малко от 10 mg/kg, сеприготвят калибриращи разтвори с концентрация под 2,0 mg/ml.

3.12. Смес вода-[метанол-ацетонитрил] (3.5), 300 + 700 (v + v)Смесват се 300 ml вода със 700 ml смес на метанол-ацетонитрил (3.5).4. Апарати4.1. лабораторен вибратор или магнитна бъркалка;4.2. стъклено влакнеста филтърна хартия (Whatman GF/A или еквивалентен);4.3. стъклена колона (дължина 300 до 400 mm, вътрешен диаметър приблизително 10 mm) със синтерована

стъклена фрита и отвеждащ клапан.Забележка. Могат да бъдат използвани също стъклена колона със спирателен кран или стъклена колона с

конусен край. В този случай в долния край се слага тапа от стъклена вата и се уплътнява с помощта на стъкленапречка.

4.4. HPLC оборудване с инжекционна система, подходяща за инжектиране на обеми от 20 µl;4.4.1 течна хроматографска колона: 300 mm x 4 mm, С18,10 µm пълнеж или еквивалентна;4.4.2. УВ детектор с регулиране на дължината на вълната или диоден полеви детектор, работещи в обхвата

225 - 400 nm;4.4. мембранен филтър, 0,22 µm;4.5. мембранен филтър, 0,45 µm;4.6. ултразвукова вана.5. ПроцедураЗабележка. Карбадоксът е чувствителен на светлина. Всички процедури се извършват при намалена

светлина или се използват тъмни стъкленици или стъкленици, увити в алуминиево фолио.

5.1. Общи положения5.1.1. Празна проба хранаЗа осъществяване на теста на възстановяване (5.1.2) се анализира празна проба храна, за да се провери

отсъствието на карбадокс и на субстанции, които оказват влияние. Празната проба храна трябва да бъде подобна повид на пробата и при анализа не трябва да се открият карбадокс или субстанции, които оказват въздействие.

5.1.2. Тест за възстановяванеИзвършва се тест за възстановяване чрез анализиране на празна проба храна, която е била подсилена чрез

добавяне на количество карбадокс, подобно на наличното в пробата. За да се получи концентрация 50 mg/kg, 15 mlот изходния еталонен разтвор (3.11.1) се прехвърлят в ерленмайерова колба от 200 ml и разтворът се изпарява вазотен поток до около 0,5 ml. Прибавят се 10 g от празната проба храна, разбърква се добре и се оставя за 10 min,като отново се разбърква няколко пъти, преди да се пристъпи към екстракцията (5.2).

Алтернативно, ако няма на разположение празна проба храна, подобна на пробата (вж. 5.1.1), тестът навъзстановяване може да се извърши чрез метода добавяне на еталон. В този случай пробата, която трябва да сеанализира, се подсилва с количество карбадокс, подобно на това, което вече се съдържа в пробата. Тази проба сеанализира заедно с неподсилената проба и възстановяването се изчислява чрез изваждане.

5.2. Екстракция5.2.1. Животински храниС точност до 0,01 g се претеглят приблизително 10 g от пробата и се прехвърлят в ерленмайерова колба от

200 ml. Добавят се 15 ml вода, смесва се и се уравновесява за 5 min. Добавят се 35 ml метанол-ацетонитрил (3.5),слага се запушалка и се разтръсква в продължение на 30 min на вибратора или се разбърква с магнитната бъркалка(4.1). Разтворът се филтрира през стъклено влакнеста филтърна хартия (4.2). Този разтвор се запазва за етапа напречистване (5.3).

5.2.2. Предварително приготвени смеси (0,1 до 2 % ампролиум) и животински храниС точност до 0,01 g се претегля приблизително 1 g от несмляната проба и се прехвърля в ерленмайерова

колба от 200 ml. Добавят се 15 ml вода, смесва се и се уравновесява за 5 min. Добавят се 35 ml метанол-ацетонитрил(3.5), слага се запушалка и се разтръсква в продължение на 30 min на вибратора или се разбърка с магнитнатабъркалка (4.1). Разтворът се филтрира през стъклено влакнеста филтърна хартия (4.2). Отпипетирва се аликвотначаст на филтрата в калибрирана колба от 50 ml. Добавят се 15 ml вода, долива се до отметката метанол-ацетонитрил(3.5) и се смесва. Концентрацията на карбадокс в крайния разтвор трябва да бъде приблизително 10 µg/ml.Аликвотът се филтрира през филтър 0,45 µm (4.6). (4.2). Продължава се с определяне с помощта на HPLC (5.4).

5.2.3. Препарати (> 2 %)С точност до 0,001 g се претеглят приблизително 0,2 g от несмляната проба и се прехвърлят в

ерленмайерова колба от 250 ml. Добавят се 45 ml вода, смесва се и се уравновесява за 5 min. Добавят се 105 mlметанол-ацетонитрил (3.5), поставя се запушалка и се хомогенизира. Пробата се поставя в ултразвукова вана (4.7) за15 min, след което се разтръсква или разбърква (4.1) в продължение на 15 min. Разтворът се филтрира през стъкленовлакнеста филтърна хартия (4.2). Аликвотът на филтрата се разрежда със смес вода-метанол-ацетонитрил (3.12) доконцентрация на карбадокс в крайния разтвор 10 - 15 µg/ml (за препарат 10 % коефициентът на разреждане е 10).Аликвoтът се филтрира през филтър 0,45 µm (4.6). Продължава се с определяне с помощта на HPLC (5.4).

5.3. Пречистване5.3.1. Подготовка на алуминиевата оксидна колонаПретеглят се 4 g алуминиев оксид (3.4) и се прехвърлят в стъклената колона (4.3).5.3.2. Пречистване на пробата15 ml филтриран екстракт се подават (5.2.1) в алуминиевата оксидна колона и се отстраняват първите 2 ml

от отмиващия агент. Следващите 5 ml се събират и аликвотът се филтрира през филтър 0,45 µm (4.6). Преминава секъм определяне с помощта на HPLC (5.4)

5.4. Определяне с HPLC5.4.1. ПараметриСледните условия се предлагат като насоки. Могат да се използват други условия, ако дават еквивалентни

резултати.Течна хроматографична колона (4.1.1) - 300 mm x 4 mm, С18,10 µm опаковка или еквивалент.Подвижна фаза (3.10) - смес от ацетатен буферен разтвор (3.9) и ацетонитрил (3.2.), 825 + 175 (v + v).Скорост на изтичане - 1,5 - 2 ml/minДължина на вълната - 365 nmОбем за инжектиране - 20 µl.Стабилността на хроматографската система се проверява, като калибриращият разтвор (3.11.3), съдържащ

5 µg/ml, се инжектира няколко пъти, докато се постигнат постоянни височини на пиковете и време на забавяне.5.4.2. Калибрираща графикаНяколко пъти се инжектира калибриращ разтвор (3.11.3) и се определят средноаритметичните височини

(площ) на пиковете за всяка концентрация. Начертава се калибриращата графика, като се използват

средноаритметичните височини (площ) на пиковете на калибриращите разтвори за ординати и съответнитеконцентрации в µg/ml за абсциси.

5.4.3. Разтвор на пробатаЕкстракт от пробата [(5.3.2) за животински храни, (5.2.2) за предварително приготвени смеси, (5.2.3) за

препарати] се инжектира няколко пъти и се определят средноаритметичните височини (площи) на пиковете накарбадокс.

6. Изчисляване на резултатитеОт средноаритметичните височини (площи) на пиковете на карбадокс на разтвора на пробата се определя

концентрацията на разтвора на пробата в µg/ml чрез сравняване с калибриращата графика (5.4.2).6.1. Животински храниСъдържанието на карбадокс w в mg/kg в пробата се дава със следната формула:

b.V1

w = [mg/kg],

m

където:b е концентрацията на карбадокс в екстракта от пробата (5.3.2) в µg/ml;V1 - обемът на екстракта в ml (т.е. 50 ml);m - теглото на изследваната част в [g].6.2. Предварително приготвени смеси и препаратиСъдържанието на карбадокс w в mg/kg в пробата се дава със следната формула:

b.V2.f

w = [mg/kg],

m

където:b e концентрацията на карбадокс в екстракта от пробата (5.2.2 или 5.2.3) в µg/ml;V2 - обемът на екстракта в ml (т.е. 50 за предварително приготвени смеси и 150 - за препарати);f - коефициент на разреждане съгласно 5.2.2 (предварително приготвени смеси) или 5.2.3 (препарати);m - теглото на изследваната част в g.7. Установяване на достоверността на резултатите7.1. Идентичност

Идентичността на аналита може да се потвърди чрез ко-хроматография или използване на диоден полевидетектор, чрез които се сравняват спектрите на екстракта на пробата и на калибриращия разтвор (3.11.3), съдържащ10 µg/ml.

7.1.1. Ко-хроматографияЕкстракт на пробата се подсилва чрез добавяне на подходящо количество калибриращ разтвор (3.11.3).

Количеството на добавения карбадокс трябва да бъде подобно на количеството карбадокс, открито в екстракта напробата.

Само височината на пика на карбадокс трябва да се увеличи, след като се вземат предвид добавенотоколичество и разреждането на екстракта. Широчината на пика по средата на неговата височина трябва да бъдеприблизително 10 % от оригиналната широчина на пика на карбадокс на неподсилен екстракт на разтвора.

7.1.2. Диодна полева детекцияРезултатите се оценяват съгласно следните критерии:(а) дължината на вълната на максимална абсорбция на пробата и на еталонните спектри, записани при

връхната точка на пика на хроматограмата, трябва да бъдат в рамките на допустимата граница, определена отразрешаващата способност на системата за детекция; за диодната детекция тя типично е в рамките на ± 2 nm;

(б) между 225 и 400 nm спектрите на пробата и на еталона, регистрирани във връхната точка на пика нахроматограмата, не трябва да се различават за частите на спектъра, разположени между 10 и 100 %, от относителнатаабсорбция; този критерий е изпълнен, когато са налице едни и същи максимални стойности и когато никъденаблюдаваното отклонение между спектрите не превишава 15 % от оптична плътност на спектъра на еталоннияаналит;

(в) между 225 и 400 nm спектрите на възходящия наклон, връхната точка и низходящия наклон на пика,произведени от екстракта на пробата, не трябва да се различават един от друг за частите на спектъра, разположенимежду 10 и 100 % на относителната абсорбция; този критерий е изпълнен, когато са налице едни и същи максимални

стойности и когато във всички наблюдавани точки отклонението между спектрите не превишава 15 % отабсорбцията на спектъра във връхната точка на пика.

Ако един от тези критерии не е удовлетворен, наличието на аналит не се потвърждава.7.2. ПовторяемостЗа съдържания 10 mg/kg или по-високи разликата между резултатите на две паралелни определения,

извършени върху една и съща мостра, не трябва да превишава 15 % спрямо най-високия резултат.7.3. ВъзстановяванеЗа една подсилена (празна) проба възстановяването трябва да бъде най-малко 90 %.8. Резултати от съвместното изследванеПри анализиране на шест животински храни, четири предварително приготвени смеси и три препарата (на

всяка проба бяха извършени дублирани анализи) от 8 лаборатории се получават резултатитe (с изключение наразличаващите се от нормалните стойности), дадени в следната таблица :

Таблица 1. Резултати от съвместното изследване на животински храни

Проба 1 Проба 2 Проба 3 Проба 4 Проба 5 Проба 6

L 8 8 8 8 8 8

N 15 14 15 15 15 15

Средна 50,0 47,6 48,2 49,7 46,9 49,7(mg/kg)

Sr (mg/kg) 2,90 2,69 1,38 1,55 1,52 2,12

CVr (%) 5,8 5,6 2,9 3,1 3,2 4,3

SR (mg/kg) 3,92 4,13 2,23 2,58 2,26 2,44

CVR (%) 7,8 8,7 4,6 5,2 4,8 4,9

Номинално 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0съдържание(g/kg)

Таблица 2. Резултати от съвместното изследване на предварително приготвени смеси и препарати

Предварително Препаратиприготвени смеси

A B C D A B C

L 7 7 7 7 8 8 8

N 14 14 14 14 16 16 16

Средна (g/kg) 8,89 9,29 9,21 8,76 94,6 98,1 104

Sr (g/kg) 0,37 0,28 0,28 0,44 4,1 5,1 7,7

CVr (%) 4,2 3,0 3,0 5,0 4,3 5,2 7,4

SR (g/kg) 0,37 0,28 0,40 0,55 5,4 6,4 7,7

CVR (%) 4,2 3,0 4,3 6,3 5,7 6,5 7,4

Номинално 10,0 10,0 10,0 10,0 100 100 100съдържание(g/kg)

L - брой на лабораториите;n - брой на индивидуалните стойности;SR - стандартно отклонение на повторяемостта;CVR - коефициент на вариации на повторяемост;Sr - стандартно отклонение на възпроизводимост;CVr - коефициент на вариации на възпроизводимост.

ХLVI. Определяне на витамин А

1. Цел и обхватТова е метод за определяне на витамин А (ретинол) в животински храни и предварително приготвени

смеси. Витамин А включва всички транс-ретинил алкохоли и техните цис-изомери, които се определят по тозиметод. Съдържанието на витамин А се изразява в международни единици (IU) на kg. Една IU отговаря наактивността на 0,300 µg от всички транс-витамин А алкохоли или на 0,344 µg от всички транс-витамин А ацетатиили 0,550 µg от всички транс-витамин А палмитати. Границата на определяне е 2000 IU витамин А/кg.

2. ПринципПробата се хидролизира с разтвор на етанов калиев хидроксид и витамин А се извлича в петролен етер.

Разтворителят се отстранява чрез изпаряване и остатъкът се разтваря в метанол и ако е необходимо, се разрежда доизискваната концентрация. Съдържанието на витамин А се определя чрез висококачествена течна хроматографияобратна фаза (RP-HPLC), като се използва УВ детектор или флуоресцентен детектор. Хроматографските параметрисе избират, така че да няма разделяне между всичките транс-ретинил алкохоли и техните цис-изомери.

3. Реагенти3.1. етанол, s = 96 %;3.2. лек петролен етер, обхват на кипене 40° до 60°C;3.3. метанол;3.4. разтвор на калиев хидроксид, µ/100 ml;3.5. разтвор на натриев аскорбат, b = 10 g/100 ml (вж. 7.7 забележки);3.6. натриев сулфид, Na2S.xH2О (х = 7 - 9);3.6.1. разтвор на натриев сулфид, с = 0,5 mol/l в глицерол, b = 120 g/l (за х = 9) (вж. 7.8 забележки);3.7. фенолфталеинов разтвор, b = 2g/100 ml в етанол (3.1);3.8. 2-пропанол;3.9. мобилна фаза за HPLC: смес на метанол (3.3) и вода, напр. 980 +20 (V + V). Точното съотношение се

определя от характеристиките на използваната колона;3.10. азот, без съдържание на кислород;3.11. всички транс-витамин А ацетати, свръхчисти, със сертифицирана активност, напр. 2,80 х 106 IU/g;3.11.1. Изходен разтвор на всички транс-витамин А ацетати: с точност до 0,1 mg се претеглят 50 mg ацетат

на витамин А (3.11) в мерителна колба 100 ml. Разтварят се в 2-пропанол (3.8) и със същия разтворител се долива домарката. Номиналната концентрация на този разтвор е 1400 IU витамин А на ml. Точното съдържание трябва да сеопредели съгласно 5.6.3.1;

3.12. всички транс-витамин А палмитати, свръхчисти, със сертифицирана активност, напр. 1,80 х 106 IU/g;3.12.1. изходен разтвор на всички транс-витамин А палмитати: с точност до 0,1 mg се претеглят 80 mg

палмитат на витамин А (3.12) в мерителна колба 100 ml. Разтварят се в 2-пропанол (3.8) и се долива до отметката съссъщия разтворител. Номиналната концентрация на този разтвор е 1400 IU витамин А на ml. Точното съдържаниетрябва да се определи съгласно 5.6.3.2.

3.13. 2,6-ди-терт-бутил-4метилфенол (ВНТ) (вж. 7.5 забележки)4. Апаратура4.1. вакуумен ротационен изпарител;4.2. стъклария от тъмно стъкло;4.2.1. плоскодънни или ерленмайерови колби, 500 ml, със загладен разширен край;4.2.2. мерителни колби с плоски запушалки, тясно гърло, 10, 25, 100 и 500 ml;4.2.3. разделящи фунии, конични, 1000 ml, със загладени стъклени запушалки;4.2.4. крушовидни колби, 250 ml, със загладени стъклени запушалки;4.3. хладник на Allihn, дължина на ризата 300 mm, със загладен свързващ елемент, с адаптер за подаващата

газ тръба;4.4. нагъната филтърна хартия за разделяне на фазите, диаметър 185 mm (напр. Schleicher & Schuell 597 HY

1/2);4.5. HPLC оборудване с инжекционна система;4.5.1. течна хроматографска колона, 250 mm х 4 mm, С18, 5 или 10 µm пълнеж или еквивалентна

(изискване към качеството на работа: само единичен пик за всички изомери на ретинола при условията на HPLC);4.5.2. УВ или флуоресцентен детектор, с регулиране дължината на вълната;4.6. спектрофотометър с кварцови клетки 10 mm;4.7. водна вана с магнитна бъркалка;

Фиг. 1. Екстракционен апарат (4.8)4.8. екстракционен апарат (вж. фигурата), състоящ се от:4.8.1. стъклен цилиндър с обем 1 l, снабден със загладено стъклено гърло и запушалка;4.8.2. загладена стъклена вложка със странично рамо и регулируема тръба, минаваща през центъра.

Регулируемата тръба трябва да има долен край с U-форма и дюза на противоположния край, така че горният теченслой в цилиндъра да може да се прехвърля в разделяща фуния.

5. ПроцедураЗабележка. Витамин А е чувствителен на (УВ) светлина и окисляване. Всички операции се осъществяват в

отсъствието на светлина (като се използват стъкленици от тъмно стъкло или стъкленици, защитени с алуминиевофолио) и кислород (продухване с азот). По време на извличането въздухът над течността се заменя с азот (избягва сеизлишно налягане, като се разхлабва запушалката от време на време).

5.1. Приготвяне на пробатаПробата се смила така, че да минава през мрежесто сито с отвори 1 mm, като се внимава да се избягва

генерирането на топлина. Смилането се извършва непосредствено преди претеглянето и осапуняването. В противен

случай може да има загуби на витамин А.5.2. ОсапуняванеВ зависимост от съдържанието на витамин А с точност до 0,01 g се претеглят от 2 до 25 g от пробата в

плоскодънна или ерленмайерова колба 500 ml (4. 2.1). Последователно със завихряне се добавят 130 ml етанол (3.1),приблизително 100 mg ВНТ (3.13), 2 ml разтвор на натриев аскорбат (3.5) и 2 ml разтвор на натриев сулфид (3.6).Хладникът се свързва (4.3) към колбата и тя се потапя във водна вана с магнитна бъркалка (4.7). Загрява се до кипенеи се оставя да се нагрее с обратен хладник за 5 min. След това се добавят 25 ml разтвор на калиев хидроксид (3.4)през хладника (4.3) и се оставя да се нагрее с обратен хладник за още 25 min, като се разбърква под азотна струя.След това хладникът се измива с приблизително 20 ml вода и съдържанието на колбата се охлажда до стайнатемпература.

5.3. ИзвличанеОсапуняващият разтвор се прехвърля количествено чрез декантиране с измиване с общ обем от 250 ml

вода в 1000 ml разделяща фуния (4.2.3) или в екстракционния апарат (4.8). Осапунисващата колба се измивапоследователно с 25 ml етанол (3.1) и 100 ml петролен етер (3.2) и отмитото се прехвърля в разделящата фуния или векстракционния апарат. Пропорцията на водата и етанола в комбинираните разтвори трябва да бъде около 2:1.Разтръсква се енергично 2 min се оставя да се утаи 2 min.

5.3.1. Екстракция с използване на разделителна фуния (4.2.3)Когато слоевете са се разделили (вж. забележка 7.3) слоят на петролевият етер се прехвърля в друга

разделителна фуния (4.2.3). Тази екстракция се повтаря 2 пъти със 100 ml петролев етер (3.2) и два пъти с 50 mlпетролев етер (3.2).

Комбинираните екстракти в разделящите фунии се измиват два пъти чрез внимателно завихряне (за да сеизбегне образуването на емулсии) със 100 ml вода и след това чрез повторно разтръскване с нови 100 ml вода, докатоводата остане безцветна при добавяне на разтвор на фенолфталеин (3.7) (измиването четири пъти обикновено едостатъчно). Измитият екстракт се филтрира през сух нагънат филтър за фазово разделяне (4.4), за да се отстранисуспендирана вода, в мерителна колба от 500 ml (4.2.2). Разделителната фуния и филтърът се измиват с 50 mlпетролев етер (3.2), долива се до отметката с петролев етер (3.2) и се смесва добре.

5.3.2. Екстракция с използване на екстракционен апарат (4.8)Когато слоевете са се разделили (вж. забележка 7.3), запушалката на стъкления цилиндър се заменя (4.8.1)

със загладена стъклена вложка (4.8.2) и долният край с U-форма на регулируемата тръба се разполага така, че тя да еточно над нивото на интерфейса. Чрез прилагане на налягане от азотна линия на страничното рамо горният слойпетролев етер се прехвърля в разделителна фуния от 1000 ml (4.2.3). Добавят се 100 ml петролев етер (3.2) встъкления цилиндър, запушва се и се разтръсква добре. Слоевете се оставят да се разделят и горният слой сепрехвърля в разделителната фуния както преди. Екстракционната процедура се повтаря с допълнителни 100 mlпетролев етер (3.2), след това два пъти с 50 ml части петролев етер (3.2) и слоевете петролев етер се добавят вразделителната фуния.

Комбинираните екстракти на петролев етер се измиват, както е описано в 5.3.1, и се продължава, както еописано там.

5.4. Приготвяне на разтвор на образеца за HPLCОтпипетирва се аликвотна част на разтвора на петролевия етер (от 5.3.1 или 5.3.2) в крушовидна колба от

250 ml (4.2.4). Разтворителят се изпарява почти до сухо на ротационния изпарител (4.1) с намалено налягане притемпература на ваната непревишаваща 40°C. Атмосферното налягане се възстановява чрез допускане на азот (3.10) иколбата се маха от ротационния изпарител. Останалият разтворител се отстранява с поток на азот (3.10) и остатъкътнезабавно се разтваря в известен обем (10-100 ml) метанол (3.3) (концентрацията на витамин А трябва да бъде вобхвата от 5 до 30 IU/ml).

5.5 Определяне с HPLCВитамин А се отделя в С18 колона обърната фаза (4.5.1) и концентрацията се измерва посредством УВ

детектор (325 nm) или флуоресцентен детектор (възбуждане: 325 nm, емисия 475 nm) (4.5.2).Аликвoтна част 20 µl метанолов разтвор, получен в 5.4, се инжектира и се разрежда с мобилната фаза (3.9).

Изчисляват се средноаритметичната височина (площ) на пика на няколко инжектирания на разтвор на същата пробаи средноаритметичната височина (площ) на пика на няколко инжектирания на разтвор на калиброващи разтвори(5.6.2).

HPLC условияСледните условия се предлагат като насока. Могат да се използват други условия при условие, че дават

еквивалентни резултати.Течна хроматографска колона (4.5.1) - 250 mm х 4 mm, С18, 5 или 10 пълнеж µm или еквивалентенПодвижна фаза - смес от метанол (3.3) и вода, е.g. 980+20 ( v+v)скорост на изтичане - 1-2 ml/minдедектор(4.5.2.) - УВ детектор (325 nm) или флуоресцентен, с регулиране дължината на вълната 325 nm,

475 nm.

5.6. Калибриране5.6.1. Приготвяне на работни еталонни разтвориОтпипетирват се 20 ml изходен разтвор на ацетат на витамин А (3.11.1) или 20 ml изходен разтвор на

палмитат на витамин А (3.12.1) в плоскодънна и ерленмайерова колба от 500 ml (4.2.1) и се хидролизират, както еописано в 5.2, но без добавяне на ВНТ. След това се извлича с петролев етер (3.2) съгласно 5.3 и се долива до 500 mlпетролев етер (3.2). 100 ml от този екстракт се изпаряват на ротационен изпарител (вж. 5.4) почти до сухо,останалият разтворител се отстранява с азотна струя (3.10) и остатъкът се разтваря отново в 10 ml метанол (3.3).Номиналната концентрация на този разтвор е 560 IU витамин А на ml. Точното съдържание се определя съгласно5.6.3.3. Работният еталонен разтвор се приготвя непосредствено преди използване.

Отпипетирват се 2 ml от този работен еталонен разтвор в мерителна колба 20 ml, долива се метанол (3.3)до отметката и се смесва. Номиналната концентрация на този разреден работен еталонен разтвор е 56 IU витамин Ана ml.

5.6.2. Приготвяне на калибриращи разтвори и калибрираща графика1, 2, 5 и 10 ml от разредения работен еталонен разтвор се прехвърлят в няколко мерителни колби от 20 ml,

долива се метанол (3.3) до отметката и се смесва. Номиналните концентрации на тези разтвори са 2,8; 5,6; 14 и 28 IUвитамин А на ml.

20 µl от всеки калибриращ разтвор се инжектират няколко пъти и се определят средноаритметичнитевисочини (площи) на пика. Като се използват средноаритметичните височини (площи) на пика и като се взематпредвид резултатите от УВ контрола, се начертава калибриращата графика.

5.6.3. УВ стандартизация на еталонни разтвори5.6.3.1. Изходен разтвор на ацетат на витамин АОтпипетирват се 2 ml изходен разтвор на ацетат на витамин А (3.11.1) в мерителна колба от 50 ml (4.2.2) и

с 2-пропанол (3.8) се долива до отметката. Номиналната концентрация на този разтвор е 56 IU витамин А на ml.Отипетирват се 3,0 ml от този разреден разтвор на ацетат на витамин А в мерителна колба от 25 ml и с 2-пропанол(3.8) се долива до отметката. Номиналната концентрация на този разтвор е 6,72 IU витамин А на ml. Измерва се УВспектърът на разтвора спрямо 2-пропанол (3.8) в спектрофотометъра (4.6) в обхвата между 300 nm и 400 nm.Максимумът на екстинкцията трябва да бъде между 325 nm и 327 nm.

Изчисление на съдържанието на витамин А:IU витамин А на ml =Е126 х 19.0E (1%/1cm) от витамин А палмитат = 957 и 326 nm в 2-пропанол.5.6.3.2. Работен еталонен разтвор на витамин АОтпипетирват се 3 ml неразреден работен еталонен разтвор на витамин А, приготвен съгласно 5.6.1, в

мерителна колба от 50 ml (4.2.2) и с 2-пропанол (3.8) се долива до отметката. Отпипетирват се 5 ml от този разтвор вмерителна колба от 25 ml и с 2-пропанол (3.8) се долива до отметката. Номиналната концентрация на този разтвор е6,72 IU витамин А на 1 ml. УВ спектърът на разтвора се измерва спрямо 2-пропанол (3.8) в спектрофотометъра (4.6)в обхвата между 300 nm и 400 nm. Максимумът на екстинкцията трябва да бъде между 325 nm и 327 nm.

Изчисление на съдържанието на витамин А:IU витамин А на ml =Е325 х 18,3E (1%/1cm) от витамин А алкохол =1821 и 325 nm в 2-пропанол6. Изчисляване на резултатитеОт средноаритметичната височина (площ) на пиковете на витамин А на разтвора на пробата с помощта на

калибриращата графика (5.6.2) се определя концентрацията на разтвора на пробата в IU/ml.Съдържанието на витамин А w в IU/kg на пробата се дава със следната формула:

500.b.V2.1000

w = ,

V1m

където:

b е концентрацията на разтвора на пробата (5.4) в IU/ml;V1 - обемът на разтвора на пробата (5.4) в ml;V2 - обемът на аликвота, взет в (5.4) в ml;m - масата на тествана част в g.7. Забележки7.1. За проби с ниска концентрация на витамин А може да е полезно да се комбинират екстрактите на

петролевия етер на две осапуняващи зареждания (измерено количество: 25 g) в един разтвор на проба за HPLC

определяне.7.2. Теглото на пробата, взета за анализ, не трябва да съдържа повече от 2 g мазнина.7.3. Ако не стане разделяне на фазите, се добавят приблизително 10 ml етанол (3.1), за да се разбие

емулсията.7.4. При масло от дроб на треска и други чисти мазнини времето на осапуняването се удължава на 45 - 60

min.7.5. Вместо ВНТ може да се използва хидрохинон.7.6. Възможно е използването на колона нормална фаза за разделяне на изомерите на ретинола.7.7. Вместо разтвор на натриев аскорбат могат да се използват приблизително 150 mg аскорбинова

киселина.7.8. Вместо разтвор на натриев сулфид могат да се използват приблизително 50 mg EDTA.8. ПовторяемостРазликата между резултатите на две паралелни определения, извършени върху същата проба, не трябва да

превишават 15 % спрямо най-високия резултат.9. Резултати от съвместно междулабораторно изследване

Премикс Премикс Минерален Протеин Pigletфураж концентрат фураж

L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49

Mean 17.02 x 10(6) 1.21 x 10(6) 537 100 151 800 18 070[IU/kg]

Sr[IU/kg] 0.51 x 10(6) 0.039 x 10(6) 22 080 12 280 682

r[IU/kg] 1.43 x 10(6) 0.109 x 10(6) 61 824 34 384 1910

CVr[ %] 3.0 3.5 4.1 8.1 3.8

SR 1.36 x10(6) 0.069 x 10(6) 46 300 23 060 3614

R 3.81 x10(6) 0.193 x 10(6) 129 640 64 568 10 119

CVR[ %] 8.0 6.2 8.6 15 20

L - брой на лабораториите;n - брой на индивидуалните стойности;SR - стандартно отклонение на повторяемостта;CVR - коефициент на вариации на повторяемост;Sr - стандартно отклонение на възпроизводимост;CVr - коефициент на вариации на възпроизводимост.

ХLVII. Определяне на витамин Е

1. Цел и обхватТова е метод за определяне на витамин Е в животински храни и предварително приготвени смеси.

Съдържанието на витамин Е се изразява като mg DL-a-токоферол ацетат на kg. Един милиграм DL-a-токоферолацетат отговаря на 0,91 mg DL-a-токоферол (витамин Е). Границата на определяне е 2 mg витамин Е/kg.

2. ПринципПробата се хидролизира с разтвор на етанов калиев хидроксид и витамин Е се извлича в петролев етер.

Разтворителят се отстранява чрез изпаряване и остатъкът се разтваря в метанол и ако е необходимо, се разрежда доизискваната концентрация. Съдържанието на витамин Е се определя чрез висококачествена течна хроматографияобратна фаза (RP-HPLC), като се използва УВ детектор или флуоресцентен детектор.

3. Реагенти3.1. етанол, s = 96 %;3.2. лек петролев етер, обхват на кипене 40° до 60°C;3.3. метанол;3.4. разтвор на калиев хидроксид, b=50g/100 ml;3.5. разтвор на натриев аскорбат, bg/100 ml (вж. 7.7 забележки);

3.6. натриев сулфид, Na2S.xH2О (х = 7 - 9);3.6.1. разтвор на натриев сулфид, с = 0,5 mol/l в глицерол, b = 120g/l (за х = 9) (вж. 7.8 забележки);3.7. фенолфталеинов разтвор, b = 2 g/100 ml в етанол (3.1);3.8. мобилна фаза за HPLC: смес на метанол (3.3) и вода, напр. 980 + 20 (V + V). Точното съотношение се

определя от характеристиките на използваната колона;3.9. азот, без съдържание на кислород;3.10. DL-a-токоферол ацетат, свръхчист, със сертифицирана активност;3.10.1. изходен разтвор на DL-a-токоферол ацетат - с точност до 0,1 mg се претеглят 100 mg

DL-a-токоферол ацетат (3.10) в мерителна колба от 100 ml. Разтварят се в етанол (3.1) и със същия разтворител седолива до отметката. 1 ml от този разтвор съдържа 1 mg DL-a-токоферол ацетат (УВ контрол, вж. 5.6.1.3;стабилизиране, вж. 7.4 забележки);

3.11. DL-a-токоферол, свръхчист, със сертифицирана активност;3.11.1. с точност до 0,1 mg се претеглят 100 mg DL-a-токоферол (3.10) в мерителна колба от 100 ml.

Разтварят се в етанол (3.1) и същият разтворител се долива до отметката. 1 ml от този разтвор съдържа 1 ml DL-a-токоферол (УВ контрол, вж. 5.6.1.3; стабилизиране, вж. 7.4 забележки);

3.12. 2,6-DI-tert-butil-4-метилфенол (ВНТ) (виж 7.5);4. Апаратура4.1. вакуумен ротационен изпарител;4.2. стъклария от тъмно стъкло;4.2.1. плоскодънни или ерленмайерови колби, 500 ml, със загладен разширен край;4.2.2. мерителни колби с плоски запушалки, тясно гърло, 10, 25, 100 и 500 ml;4.2.3. разделящи фунии, конични, 1000 ml, със загладени стъклени запушалки;4.2.4. крушовидни колби, 250 ml, със загладени стъклени запушалки;4.3. хладник на Allihn, дължина на ризата 300 mm, със загладен свързващ елемент, с адаптер за подаващата

газ тръба;4.4. нагъната филтърна хартия за разделяне на фазите, диаметър 185 mm (напр. Schleicher & Schuell 597 HY

1/2);4.5. HPLC оборудване с инжекционна система;4.5.1. течна хроматографска колона, 250 mm х 4 mm, С18, 5 или 10 µm пълнеж или еквивалентна

(изискване към качеството на работа: само единичен пик за всички изомери на ретинола при условията на HPLC);4.5.2. УВ или флуоресцентен детектор с регулиране дължината на вълната;4.6. спектрофотометър с кварцови клетки 10 mm;4.7. водна вана с магнитна бъркалка;

4.8. екстракционен апарат (вж. фигурата), състоящ се от:4.8.1. стъклен цилиндър с обем 1 l, снабден със загладено стъклено гърло и запушалка;4.8.2. загладена стъклена вложка със странично рамо и регулируема тръба, минаваща през центъра;

регулируемата тръба има долен край с U-форма и дюза на противоположния край, така че горният течен слой вцилиндъра да може да се прехвърля в разделяща фуния.

5. ПроцедураЗабележка. Витамин Е е чувствителен на (УВ) светлина и окисляване. Всички операции се осъществяват в

отсъствието на светлина (като се използват стъкленици от тъмно стъкло или стъкленици, защитени с алуминиевофолио) и кислород (продухване с азот). По време на извличането въздухът над течността се заменя с азот (избягва се

излишно налягане, като се разхлабва запушалката от време на време).5.1. Приготвяне на пробатаПробата се смила така, че да минава през мрежесто сито с отвори 1 mm, като се внимава да се избягва

генериране на топлина. Смилането се извършва непосредствено преди претеглянето и осапуняването. В противенслучай може да има загуби на витамин Е.

5.2. ОсапуняванеВ зависимост от съдържанието на витамин Е с точност до 0,01 g се претеглят от 2 до 25 g от пробата в

плоскодънна или ерленмайерова колба от 500 ml (4.2.1). Добавят се последователно със завихряне 130 ml етанол(3.1), приблизително 100 mg ВНТ (3.13), 2 ml разтвор на натриев аскорбат (3.5) и 2 ml разтвор на натриев сулфид(3.6). Хладникът се свързва (4.3) към колбата и тя се потапя във водна вана с магнитна бъркалка (4.7). Загрява се докипене и се оставя да се нагрее с обратен хладник за 5 min. След това се добавят 25 ml разтвор на калиев хидроксид(3.4) през хладника (4.3) и се оставя да се нагрее с обратен хладник за още 25 min, като се разбърква под азотнаструя. След това хладникът се измива с приблизително 20 ml вода и съдържанието на колбата се охлажда до стайнатемпература.

5.3. ИзвличанеЧрез декантиране осапуняващият разтвор се прехвърля количествено чрез измиване с общ обем от 250 ml

вода в 1000 ml разделяща фуния (4.2.3) или в екстракционния апарат (4.8). Осапунисващата колба се измивапоследователно с 25 ml етанол (3.1) и 100 ml петролев етер (3.2) и отмитото се прехвърля в разделящата фуния или векстракционния апарат. Пропорцията на водата и етанола в комбинираните разтвори трябва да бъде около 2:1.Разтръсква се енергично две минути и се оставя да се утаи 2 min.

5.3.1. Екстракция с използване на разделителна фуния (4.2.3)Когато слоевете са се разделили (вж. забележка 7.3), слоят на петролевия етер се прехвърля в друга

разделителна фуния (4.2.3). Тази екстракция се повтаря два пъти със 100 ml петролев етер (3.2) и два пъти с 50 mlпетролев етер (3.2).

Комбинираните екстракти в разделящите фунии се измиват два пъти чрез внимателно завихряне (за да сеизбегне образуването на емулсии) със 100 ml вода и след това чрез повторно разтръскване с нови 100 ml вода, докатоводата остане безцветна при добавяне на разтвор на фенолфталеин (3.7) (обикновено измиването четири пъти едостатъчно). Измитият екстракт се филтрира през сух нагънат филтър за фазово разделяне (4.4), за да се отстранисуспендирана вода, в мерителна колба от 500 ml (4.2.2). Разделителната фуния и филтърът се измиват с 50 mlпетролев етер (3.2), долива се с петролев етер (3.2) до отметката и се смесва добре.

5.3.2. Екстракция с използване на екстракционен апарат (4.8)Когато слоевете са се разделили (вж. забележка 7.3), запушалката на стъкления цилиндър се заменя (4.8.1)

със загладена стъклена вложка (4.8.2) и долният край с U-форма на регулируемата тръба се разполага така, че тя да еточно над нивото на интерфейса. Чрез прилагане на налягане от азотна линия на страничното рамо горният слойпетролев етер се прехвърля в разделителна фуния от 1000 ml (4.2.3). Добавят се 100 ml петролев етер (3.2) встъкления цилиндър, запушва се и се разтръсква добре. Оставя се слоевете да се разделят и горният слой сепрехвърля в разделителната фуния както преди. Екстракционната процедура се повтаря с допълнителни 100 mlпетролев етер (3.2), след това два пъти с 50 ml части петролев етер (3.2) и се добавят слоевете петролен етер вразделителната фуния.

Комбинираните екстракти на петролен етер се измиват, както е описано в 5.3.1, и се продължава, както еописано там.

5.4. Приготвяне на разтвор на пробата за HPLCОтпипетирва се аликвотна част на разтвора на петролния етер (от 5.3.1 или 5.3.2) в крушовидна колба 250

ml (4.2.4). Разтворителят се изпарява почти до сухо на ротационния изпарител (4.1) с намалено налягане притемпература на ваната непревишаваща 40°C. Атмосферното налягане се възстановява чрез допускане на азот (3.9) иколбата се отстранява от ротационния изпарител. Останалият разтворител се отстранява с поток на азот (3.9) иостатъкът незабавно се разтваря в известен обем (10 - 100 ml) метанол (3.3) (концентрацията на DL-a-токоферолтрябва да бъде в обхвата от 5 µg/ml до 30 µg/ml).

5.5. Определяне с HPLCВитамин Е се отделя в С18 колона обърната фаза (4.5.1) и концентрацията се измерва посредством

флуоресцентен детектор (възбуждане: 295 nm, емисия 330 nm) или УВ детектор (292 nm) (4.5.2).Аликвотна част 20 µl метанолов разтвор, получен в 5.4,се инжектира и се разрежда с мобилната фаза (3.8).

Изчислява се средноаритметичната височина (площ) на пика на няколко инжектирания на разтвор на същата проба исредноаритметичните височини (площи) на пика на няколко инжектирания на разтвор на калиброващи разтвори(5.6.2).

HPLC условияУсловия се предлагат като насока. Могат да се използват други условия при условие, че дават

еквивалентни резултати.Течна хроматографска колона (4.5.1) - 250 mm x 4 mm, С18, 5 или 10 µm пълнеж или еквивалентен

Подвижна фаза - смес от метанол (3.3), и вода,е.g. 980+20 (v+v)скорост на изтичане - 1 - 2 ml/minдедектор(4.5.2) - флуоресцентен дедектор, с регулиране дължината на вълната емисия 295 nm, 330 nm или

UV дедектор (292 nm)5.6. Калибриране (DL-a-токоферол ацетат или DL-a-токоферол.5.6.1. Еталон на DL-a-токоферол ацетат5.6.1.1. Приготвяне на работен еталонен разтворПосредством пипета се прехвърлят 25 ml изходен разтвор на DL-a-токоферол ацетат (3.10.1) в плоскодънна

или ерленмайерова колба от 500 ml (4.2.1) и се хидролизира, както е описано в 5.2. След това се извлича с петролеветер (3.2) съгласно 5.3 и се долива до 500 ml петролев етер (3.2). 25 ml от този екстракт се изпаряват на ротационенизпарител (вж. 5.4) почти до сухо, останалият разтворител се отстранява с азотна струя (3.9) и остатъкът се разтваряотново в 25,0 ml метанол (3.3). Номиналната концентрация на този разтвор е 45,5 µg DL-a-токоферол на 1 ml, което ееквивалентно на 50 µg DL-a-токоферол ацетат на 1 ml. Работният еталонен разтвор се приготвя непосредственопреди употреба.

5.6.1.2. Приготвяне на калибриращи разтвори и калибрираща графика1, 2, 4 и 10 ml от разредения работен еталонен разтвор се прехвърлят в няколко мерителни колби по 20 ml,

долива се с метанол (3.3) до отметката и се смесва. Номиналните концентрации на тези разтвори са 2,5; 5, 10 и 25µg/ml DL-a-токоферол ацетат, т.е. 2,28; 4,55; 9,10 µg/ml и 22,8 m/ml DL-a-токоферол.

20 µl от всеки калибриращ разтвор се инжектират няколко пъти и се определят средноаритметичнитевисочини (площи) на пика. Като се използват средноаритметичните височини (площи) на пика, се начертавакалибриращият граф.

5.6.1.3. УВ стандартизация на изходен разтвор на DL-a-токоферол ацетат (3.10.1)5 ml изходен разтвор на DL-a-токоферол ацетат (3.10.1) се разтварят до 25,0 ml с етанол и се измерва УВ

спектърът на този разтвор спрямо етанол (3.1) в спектрофотометър (4.6) между 250 nm и 320 nm. Максимумът напоглъщане трябва да бъде при 284 nm:

Е(1%/1cm) = 43,6 в 284 nm в етанолПри това разреждане трябва да се получи екстинкционна стойност между 0,84 и 0,88.5.6.2. Еталон на DL-a-токоферол - стандартен5.6.2.1. Приготвяне на работен еталонен разтворПосредством пипета се прехвърлят 2 ml изходен разтвор на DL-a-токоферол (3.11.1) в мерителна колба от

50 ml, разтварят се в метанол (3.3) и с метанол се долива до отметката. Номиналната концентрация на този разтвор е40 µg DL-a-токоферол на 1 ml, което е еквивалентно на 44 µg DL-a-токоферол ацетат на 1 ml. Работният еталоненразтвор се приготвя непосредствено преди употреба.

5.6.2.2. Приготвяне на калибриращи разтвори и калибрираща графика1, 2, 4 и 10 ml от разредения работен еталонен разтвор се прехвърлят в няколко мерителни колби от по 20

ml, долива се до отметката с метанол (3.3) и се смесва. Номиналните концентрации на тези разтвори са 2, 4, 8 и 20µg/ml DL-a-токоферол, т.е. 2,20, 4,40, 8,79 и 22 µg/ml DL-a-токоферол ацетат.

20 µl от всеки калибриращ разтвор се ижектират няколко пъти и се определят средноаритметичнитевисочини (площи) на пика. Като се използват средноаритметичните височини (площи) на пика, се начертавакалибриращият граф.

5.6.2.3. УВ стандартизация на изходен разтвор на DL-a-токоферол (3.11.1)2 ml изходен разтвор на DL-a-токоферол (3.11.1) се разтварят до 25 ml с етанол и се измерва УВ спектърът

на този разтвор спрямо етанол (3.1) в спектрофотометър (4.6) между 250 nm и 320 nm. Максимумът на поглъщанетрябва да бъде при 292 nm:

Е(1%/1cm) = 75,8 в 292 nm в етанолПри това разреждане трябва да се получи екстинкционна стойност 0,6.От средноаритметичната височина (площ) на пиковете на витамин А на разтвора на пробата се определя

концентрацията на разтвора на пробата в IU/ml с помощта на калибриращата графика (5.6.2).6. Изчисляване на резултатитеОт средноаритметичната височина (площ) на пиковете на витамин Е на разтвора на пробата се определя

концентрацията на разтвора на пробата в µg/ml (изчислена като a-токоферол ацетат) с помощта на калибриращатаграфика (5.6.1.2 или 5.6.2.2).

Съдържанието на витамин Е w в mg/kg на пробата се определя със следната формула:

500.b.V2

W = [mg/kg],

V1.m

където:b е концентрацията на витамин Е в разтвора на пробата (5.4) в IU /ml;V1 - обемът на разтвора на пробата (5.4) в ml;V2 - обемът на аликвота, взет в 5.4 в ml;m - масата на тествана част в g.7. Забележки7.1. За проби с ниска концентрация на витамин Е може да е полезно да се комбинират екстрактите на

петролевия етер на две осапуняващи зареждания (измерено количество: 25 g) в един разтвор на проба за HPLCопределяне.

7.2. Теглото на пробата, взета за анализ, не трябва да съдържа повече от 2 g мазнина.7.3. Ако не стане разделяне на фазите, за да се разбие емулсията, се добавят приблизително 10 ml етанол

(3.1).7.4. След спектрофотометричното измерване на разтвора на DL -a-токоферол ацетат съгласно 5.6.1.3 или

5.1.6.2.3 съответно се прибавят приблизително 10 mg ВМТ (3.12) към разтвора (3.10.1 или 3.10.2) и разтворът сесъхранява в хладилник (срок на годност максимум 4 седмици).

7.5. Вместо ВНТ може да се използва хидрохинон.7.6. Възможно е използването на колона нормална фаза за разделяне на изомерите на ретинола.7.7. Вместо разтвор на натриев аскорбат могат да се използват приблизително 150 mg аскорбинова

киселина.7.8. Вместо разтвор на натриев сулфид могат да се използват приблизително 50 mg EDTA.8. ПовторяемостРазликата между резултатите на две паралелни определения, извършени върху една и съща проба, не

трябва да превишават 15 % спрямо най-високия резултат.9. Резултати от съвместно междулабораторно изследване:

Премикс Премикс Минерален Протеин Pigletфураж концентрат фураж

L 12 12 13 12 13

n 48 48 48 48 48

Mean 17380 1187 926 315 61,3[mg/kg]

Sr[mg/kg] 384 45,3 25,2 13,0 2,3

r[mg/kg] 1075 126,8 70,6 36,4 6,4

CVr[%]: 2,2 3,8 2,7 4,1 3,8

SR[mg/kg] 830 65,0 55,5 18,9 7,8

R[mg/kg] 2324 182,0 155,4 52,9 21,8

CVR[%]: 4=8 5,5 6,0 6,0 12,7

L - брой на лабораториите;n - брой на индивидуалните стойности;SR - стандартно отклонение на повторяемостта;CVR - коефициент на вариации на повторяемост;sr - стандартно отклонение на възпроизводимост;CVr - коефициент на вариации на възпроизводимост.

ХLVIII. Определяне на триптофан

1. Цел и обхватТова е метод за определяне на общото съдържание и свободния триптофан в животински храни. Той не

различава D и L формите.2. ПринципЗа да се определи общото съдържание на триптофан, пробата се хидролизира в алкална среда с наситен

разтвор на бариев хидроксид и се нагрява до 110°C в продължение на 20 h. След хидролизата се добавя вътрешенеталон.

За да се определи свободният триптофан, пробата се извлича в слабо кисела среда в присъствието навътрешен еталон.

Триптофанът и вътрешният еталон в хидролизата или екстракта се определят с помощта на HPLC сфлуоресцентна детекция.

3. Реагенти:3.1. използва се двойно дестилирана вода или вода с еквивалентно качество (проводимост < µS/сm);3.2. еталонна субстанция: триптофан (чистота/съдържание і 99 %), изсушена под вакуум над фосфорен

пентоксид;3.3. вътрешна еталонна субстанция: -a-метил-триптофан (чистота/съдържание і 99%), изсушена под вакуум

над фосфорен пентоксид;3.4. бариев хидроксид октахидрат (внимава се да не се излага Ba(OH) 2.8H2O черезмерно на въздух, за да

се избегне формирането на BaCO3, което може да обърка определянето); (вж. забележка 9.3);3.5. натриев хидроксид;3.6. орто-фосфорна киселина, w = 85 %;3.7. солна киселина, r20 = g/ml;3.8. метанол, HPLC клас;3.9. петролев етер, обхват на кипене 40 - 60°C;3.10. разтвор на натриев хидроксид, с = 1 mol/l - 40,0 g NaOH се разтварят (3.5) във вода и се долива до 1 l с

вода (3.1);3.11. солна киселина, с = 6 mol/l - взимат се 492 ml HCl (3.7) и се долива до 1 l с вода;3.12. солна киселина, с = 1 mol/l - взимат се 82 ml HCl (3.7) и се долива с вода до 1 l;3.13. солна киселина, с = 0,1 mol/l - взимат се 8,2 ml HCl (3.7) и се долива с вода до 1 l;3.14. орто-фосфорна киселина, с = 0,5 mol/l - взимат се 34 ml орто-фосфорна киселина (3.6) и се долива

вода (3.1) до 1 l;3.15. концентриран разтвор на триптофан (3.2), с = 2,50 µmol/ml - в мерителна обемна колба се разтварят

0,2553 g триптофан (3.2) в солна киселина (3.13) и до отметката се долива със солна киселина (3.13). Съхранява сепри - 18°C максимум четири седмици;

3.16. концентриран вътрешен еталонен разтвор, с = 2,50 µmol/ml - в мерителна обемна колба се разтварят0,2728 g -a-метил-триптофан (3.3) в солна киселина (3.13) и до отметката се долива със солна киселина (3.13).Съхранява се при -18°C максимум четири седмици;

3.17. калибриращ еталонен разтвор на триптофан и на вътрешен еталон - взимат се 2 ml концентриранразтвор на триптофан (3.15) и 2 ml концентриран разтвор на вътрешен еталон (-a-метил - триптофан) (3.16). Разреждасе с вода (3.1) и метанол (3.8) до приблизително същия обем и до приблизително същата концентрация на метанол(10 - 30 %) като при получения хидролизат.

Този разтвор се приготвя непосредствено преди използване. При приготвянето се защитава от прякаслънчева светлина;

3.18. оцетна киселина;3.19. 1,1,1-трихлоро-2-метил-2 пропанол;3.20. етаноламин > 98 %;3.21. разтвор на 1 g 1,1,1-трихлоро-2-метил-2 пропанол (3.19) в 100 ml метанол (3.8);3.22. мобилна фаза за HPLC - 3,00 g оцетна киселина (3.18) + 900 ml вода (3.1) + 50,0 ml разтвор (3.21) на

1,1,1-трихлоро-2-метил-2 пропанол (3.19) в метанол (3.8) (1 g/100 ml). Стойността на рН се коригира до 5, катоизползвате етаноламин (3.20). Долива се до 1000 ml с вода (3.1).

4. Апарати:4.1. HPLC оборудване със спектрофлуориметричен детектор;4.2. течна хроматографска колона, 125 mm x 4 mm, С18, пълнеж 3 µm или еквивалентна;4.3. рН метър;4.4. полипропиленова колба, обем 125 ml, с широко гърло и винтова запушалка;4.5. мембранен филтър, 0,45 µm;4.6. автоклав, 110 (±2)°C, 1,4 (±0,1) bar;4.7. механичен вибратор или магнитна бъркалка;4.8. вихров смесител.5. Процедура5.1. Приготвяне на пробитеПробата се смила, за да минава през сито с квадратни отвори по 0,5 mm. Пробите с високо съдържание на

влага се изсушават на въздух при температура, непревишаваща 50°C, или лиофизирани преди смилане. Проби свисоко съдържание на мазнини се извличат с петролев етер (3.9) преди смилане.

5.2. Определяне на свободен триптофан (екстракт)С точност до 1 mg се претегля подходящо количество (1 - 5 g) от приготвената проба (5.1) в ерленмайерова

колба. Добавят се 100 ml солна киселина с = 0,1 mol/l (3.13) и 5 ml концентриран вътрешен еталонен разтвор (3.16).Разтръсква се или се смесва за 60 min, като се използва механичен вибратор или магнитна бъркалка (4.7).Седиментът се оставя да се утаи и се отпипетирват 10 ml разтвор от плаващия отгоре слой в бехерова чаша. Добавятсе 5 ml орто-фосфорна киселина, с = 0,6 mol/l (3.14). Стойността на рН се коригира до 3, като се използва натриевхидроксид, с = 1 mol/l ( 3.10). Добавя се достатъчно метанол (3.8), за да се постигне концентрация на метанола вкрайния обем между 10 и 30 %. Прехвърля се в обемна мерителна колба с подходящ обем и се разтворя с вода дообема, необходим за хроматографията (приблизително същия обем като на калибриращия еталонен разтвор (3.17)).

Няколко ml от разтвора се филтруват през мембранен филтър 0,45 µm (4.5) преди инжектиране в HPLCколоната. Преминава се към хроматографията съгласно 5.4.

Необходимо е еталонният разтвор и екстрактите да се защитят от пряка слънчева светлина. Ако не евъзможно да се анализират екстрактите същия ден, екстрактите могат да се съхраняват при 5°C максимум 3 дни.

5.3. Определяне на общото съдържание на триптофан (хидролизат).С точност 0,2 mg се претеглят от 0,1 до 1 g от приготвената проба (5.1) в полипропиленовата колба (4.4).

Претеглената част от пробата трябва да има съдържание на азот около 10 mg. Добавят се 8,4 g бариев хидроксидокта-хидрат (3.4) и 10 ml вода. Смесва се на вихров смесител (4.8) или магнитна бъркалка (4.7). Покритият с тефлонмагнит се оставя в сместа. Стените на съда се измиват с 4 ml вода. Поставя се винтовата запушалка и колбата сезатваря хлабаво. Прехвърля се в автоклав при температура 110 (±2)°C за 20 h.

Преди да се отвори автоклавът, температурата се намалява до точно под 100°C. За да се избегнекристализацията на Ba(OH) 2.8H2О, към топлата смес се добавят 30 ml вода, която е със стайна температура.Разтръсква се или се разбърква нежно. Добавят се 2 ml концентриран вътрешен еталон (-a-метил - триптофан)разтвор (3.16). Съдовете се охлаждат във водна/ледена вана в продължение на 15 min.След това се добавят 5 mlортофосфорна киселина, с = 0,5 mol/l (3.14). Съдът се държи в охлаждащата вана и се неутрализира с HCl, с = 6 mol/l(3.11). Добавя се достатъчно метанол, за да се постигне концентрация на метанола в крайния обем между 10 и 30 %.Прехвърля се в мерителна обемна колба с подходящ обем и се разрежда с вода до определения обем, необходим захроматографията (например 100 ml). Добавянето на метанол не трябва да причинява утаяване.

Няколко ml от разтвора се филтрират през мембранен филтър 0,45 µm (4.5) преди инжектиране в HPLCколоната. Преминава се към хроматографията съгласно 5.4.

Необходимо е еталонният разтвор и екстрактите да се защитят от пряка слънчева светлина. Ако не евъзможно да се анализират екстрактите същия ден, екстрактите могат да се съхраняват при 5°C максимум 3 дни.

5.4. Определяне с помощта на HPLC

Предлагат се следните условия като насоки за изократично елуиране. Могат да се използват други условия,при условие че дават еквивалентни резултати (вж. също забележки 9.1 и 9.2):

Течно-хроматографска колона (4.2) - 125 mm x 4 mm, С18, 3 µm пълнеж или еквивалентенТемпература на колоната - стайна температураПодвижна фаза (3.22) - 3 g оцетна киселина (3.18) + 900 ml вода (3.1) + 50,0 ml разтвор (3.21) от смес от

1,1,1-трихлоро-2-метил-2 пропанол (3.19) в 100 ml метанол (3.8) при pH 5,0 на етаноламид(3.20)Скорост на изтичане - 1000 ml с вода (3.1)Общо време - приблизително 34 minДължина на вълната - excitation & 280 nm, emission 356 nmДопълващ разтвор - 20 ml6. Изчисляване на резултати

A.B.C.D.E.MW

= g триптофан pd 100 g проба,

F.G.H.10 000.W

където:

А е площта на пика на вътрешен еталон, калибриращ еталонен разтвор (3.17);B - площта на пика на триптофан, екстракт (5.2) или хидролизат (5.3);С - обемът в ml (2 ml) на концентрирания разтвор на триптофан (3.15), добавен до калибриращия разтвор

(3.17);D - концентрация в µmol/ml (=2,50) на концентрирания разтвор на триптофан (3.15), добавен до

калибриращия разтвор (3.17);Е - обем в ml на концентрирания вътрешен еталонен разтвор (3.16), прибавен при екстракцията (5.2) (= 5,00

ml) или към хидролизата (5.3) (=2);F - площта на пика на вътрешния еталон, екстракт (5.2) или хидролизат (5.3);

G - площта на пика на триптофан, калибриращ стандартен разтвор (3.17);Н - обемът в ml (=2 ml) на концентрирания вътрешен еталонен разтвор (3.16), прибавен към калибриращия

еталонен разтвор (3.17);W - теглото на пробата в g (коригирано или оригинално тегло, ако е изсушавана или са отнемани мазнини);MW - молекулното тегло на триптофан (=204,23).7. ПовторяемостРазликата между резултатите на две паралелни определения, извършени върху същата проба, не трябва да

превишават 10 % спрямо най-високия резултат.8. Резултати от съвместното изследванеПри организиране на съвместно изследване, в което три проби (на всяка проба се извършват по 5 анализа)

се анализират в 12 лаборатории, за да се сертифицира методът за хидролиза, се получават следните резултати,дадени в таблицата:

Проба 1 Проба 2 Проба 3Фураж за свине Фураж за свине

с L-триптофан

L 12 12 12

n 50 55 50

Mean [g/kg] 2,42 3,40 4,22

Sr[g/kg] 0,05 0,05 0,08

r[g/kg] 0,14 0,14 0,22

CVr[ %]: 1,9 1,6 1,9

SR[g/kg] 0,15 0,20 0,09

R[g/kg] 0,42 0,56 0,25

CVR[ %]: 6,3 6,0 2,2

L - брой на лабораториите;n - брой на индивидуалните стойности;SR - стандартно отклонение на повторяемостта;CVR - коефициент на вариации на повторяемост;sr - стандартно отклонение на възпроизводимост;CVr - коефициент на вариации на възпроизводимост.При друго съвместно изследване, в което две проби (на всяка проба се извършват по 5 анализа) се

анализират в 13 лаборатории, за да се сертифицира методът за извличане на свободния триптофан, се получаватрезултатите, дадени в таблицата:

Проба 4 Проба 5Смес от Смес от пшеница и

пшеница и соя соя = проба 4 стриптофан (0,457 g/kg)

L 12 12

n 55 60

Mean [g/kg] 0,391 0,931

Sr[g/kg] 0,005 0,012

r[g/kg] 0,014 0,034

CVr[ %]: 1,34 1,34

SR[g/kg] 0,018 0,048

R[g/kg] 0,050 0,134

CVR[ %]: 4,71 5,11

L - брой на лабораториите;n - брой на индивидуалните стойности;SR - стандартно отклонение на повторяемостта;CVR - коефициент на вариации на повторяемост;sr - стандартно отклонение на възпроизводимост;CVr - коефициент на вариации на възпроизводимост.При изследване, в което четири проби (на всяка проба бяха извършени по 5 анализа) бяха анализирани в 7

лаборатории, с цел да се сертифицира триптофан за хидролиза се получават резултатите, дадени в таблицата:

Проба 1 Проба 2 Проба 3 Проба 4Фураж за Рибно Соево Обезмас-свине брашно брашно лено мля-

(CRM 117) с ниско (CRM 119) ко на прахсъдържа- (CRM 120)ние намазнини

(CRM 118)

L 7 7 7 7

N 25 25 25 25

Mean [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236

Sr[g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040

r[g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112

CVr[%]: 1,04 1,15 1,30 0,76

SR[g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221

R[g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619

CVR[%]: 1,48 4,69 4,11 4,22

L - брой на лабораториите;n - брой на индивидуалните стойности;SR - стандартно отклонение на повторяемостта;CVR - коефициент на вариации на повторяемост;sr - стандартно отклонение на възпроизводимост;CVr - коефициент на вариации на възпроизводимост.9. Наблюдения9.1. Следните специални хроматографски условия могат да дадат по-добро разделяне между триптофан и

a-метил - триптофанИзократна елюция, последвана от градиент на чистотата на колоната:Течно-хроматографска колона - 125 mm x 4 mm, С18, 5 µm пълнеж или еквивалентенТемпература на колоната - 32 °Подвижна фаза - А - 0,01 mol/l KH2PO4/ метанол, 95+5 ( V + V)

B - метанолСтепенна програма 0 min 100 % А 0 % В

15 min 100 % А 0 % В17 min 60 % А 40 % В19 min 60 % А 40 % В21 min 100 % А 0 % В33 min 100 % А 0 % В

Скорост на изтичане - 1,2 ml/ minОбщо време - приблизително 33 min

9.2. Хроматографията ще варира в зависимост от типа на HPLC и използвания материал за пълнеж на

кулата. Избраната система трябва да бъде в състояние да даде основната сепарация между триптофан и вътрешнияеталон. Нещо повече, важно е продуктите на разлагане да са добре разделени от триптофан и вътрешния еталон.Трябва да се подложат на изпитване хидролизати без вътрешен еталон, за да се провери базовата линия подвътрешния еталон за примеси. Важно е времето за провеждане на изпитанието да бъде достатъчно дълго за елуиранена всички продукти на разлагането. В противен случай късни елуитни пикове могат да окажат въздействие върхупоследващите хроматографски изпитания. В обхвата на работа хроматографската система трябва да дава линейнареакция. Линейната реакция трябва да се измерва с постоянна (нормалната) концентрация на вътрешния еталон ивариращите концентрации на триптофан. Важно е размерът на пиковете на триптофана и вътрешният еталон да са врамките на линейния обхват на HPLC/флуоресцентната система. Ако пика(овете) на триптофан и/или вътрешнияеталон е (са) твърде малки или твърде високи, анализът трябва да се повтори с друг размер проба и/или да сепромени крайният обем.

9.3. Бариев хидроксидС времето става все по-трудно разтварянето на бариевия хидроксид. Това води до не бистър разтвор за

определяне с помощта на HPLC, което може да доведе до ниски резултати за триптофан.

ХLIХ. Определяне на натриев лазалоцид

Натриева сол на полиетерната монокарбоксилна киселина, получена от Streptomyces lasaliensis1. Цел и обхватС този метод се определя съдържанието на натриев лазалоцид в храните за животни и премиксите.

Границата на откриване е 5 mg/kg, а границата на определяне е 30 mg/kg.2. ПринципНатриев лазалоцид се извлича от проба в подкислен метанол и се определя чрез високо-ефективна течна

хроматография (HPLC) с обратна фаза, с помощта на спектрофлуориметричен детектор.3. Реактиви3.1. Калиев дихидрогенфосфат (КН2РО4)3.2. Ортофосфорна киселина, w = 85 %3.3. Разтвор на ортофосфорна киселина,s = 20 %Разредете 23,5 ml ортофосфорна киселина (3.2) до 100 ml с вода.3.4. 6-Метил-2-хептиламин (1,5-диметилхексиламин), w = 99 %3.5. Метанол, клас HPLC3.6. Солна киселина, r20 1,19 g/ml3.7. Буферен разтвор на фосфат, с = 0,01 mol/lРазтворете 1,36 g от КН2РО4 (3.1) в 500 ml вода (3.11), добавете 3,5 ml ортофосфорна киселина (3.2) и 10,0

ml 6-метил-2-хептиламин (3.4). Прибавете разтвор на ортофосфорна киселина (3.3) до получаване на рН 4,0 иразредете до 1000 ml с вода (3.11).

3.8. Подкислен метанолПрехвърлете 5,0 ml солна киселина (3.6) в 1000 милилитрова мерителна колба, допълнете с метанол (3.5)

до маркировката и разбъркайте. Разтворът трябва да бъде прясно приготвен преди употреба.3.9. HPLC мобилна фаза, фосфато буферен метанолен разтвор 5 + 95 (V + V)Смесете 5 ml от фосфатния буферен разтвор (3.7) с 95 ml метанол (3.5).3.10. Стандартна субстанция на натриев лазалоцид с гарантирана чистота, C14H53O8Na (натриева сол на

полиетерната монокарбоксилна киселина, получена от Streptomyces lasaliensis), Е7633.10.1. Основен стандартен разтвор на натриев лазалоцид, 500 µg/mlПретеглете с точност до 0,1 mg и поставете 50 mg натриев лазалоцид (3.10) в мерителна колба от 100 ml,

разтворете в подкислен метанол (3.8), допълнете със същия разтворител до маркировката и разбъркайте. Разтворъттрябва да бъде прясно приготвен преди употреба.

3.10.2. Междинен стандартен разтвор на натриев лазалоцид, 50 µg/mlОтмерете с пипета 10,0 ml от основния стандартен разтвор (3.10.1) в мерителна колба от 100 ml, допълнете

с подкислен метанол (3.8) до маркировката и разбъркайте. Разтворът трябва да бъде прясно приготвен предиупотреба.

3.10.3. Калибрационни разтвориПрехвърлете съответно 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 и 10,0 ml от междинния стандартен разтвор (3.10.2) в серия от

50-милилитрови градуирани колби. Допълнете с подкислен метанол (3.8) до маркировката и разбъркайте. Тезиразтвори отговарят съответно на 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 и 10,0 µg натриев лазалоцид на ml. Разтворите трябва да бъдатпрясно приготвени преди употреба.

3.11. Вода, клас HPLC4. Апаратура

4.1. Ултразвукова вана (или вибрираща водна баня) с регулиране на температурата4.2. Мембранни филтри, 0,45 µm4.3. Оборудване за HPLC с инжекционна система, подходяща за инжектиране на обеми от 20 µl.4.3.1. Колона за течен хроматографски анализ 125 mm x 4 mm, обратна фаза С18, опаковка 5 µm или

еквивалент4.3.2. Спектрофлуориметър с регулиране за промяна на дължините на вълните при възбуждане и емисия5. Процедура5.1. Общо описание5.1.1. Празна проба храна за животниЗа изпълнението на теста за извличане (5.1.2) следва да се анализира проба храна за животни, за да се

провери за наличие на натриев лазалоцид и пречещи субстанции. Храната за животни от пробата трябва да е подобенпо вид на този от изследваната проба и в него не трябва да се открива наличие на натриев лазалоцид или пречещисубстанции.

5.1.2. Тест за извличанеТестът за извличане се извършва, като се анализира пробата храна за животни, обогатена чрез прибавяне

на такова количество натриев лазалоцид, близко до наличното в пробата. За да обогатите при ниво 100 mg/kg,пресипете 10,0 ml от основния стандартен разтвор (3.10.1) в конична колба от 250 ml и изпарете разтвора, докатополучите приблизително 0,5 ml. Добавете 50 g проба храна за животни, смесете добре и оставете да престои 10минути. Разбъркайте отново няколко пъти, преди да преминете към екстракцията (5.2).

Като алтернатива, ако не разполагате с храна за животни за проба, подобен по вид на този от изследванатапроба (виж 5.1.1), тестът за извличане може да се извърши чрез стандартен метод на добавяне. В този случайпробата, която ще се анализира, се обогатява с такова количество натриев лазалоцид, което е близко до наличното впробата. Тази проба се анализира заедно с необогатената проба, като извличането се калкулира чрез изваждане.

5.2. Екстракция5.2.1. Храни за животниПретеглете с точност до 0,01 g и поставете от 5 g до 10 g от пробата в 250-милилитрова конична колба с

тапа. Прибавете с пипета 100,0 ml подкислен метанол (3.8). Запушете леко с тапата и разклатете, за да можесъдържанието да се диспергира. Поставете колбата в ултразвукова вана (4.1) при температура приблизително 40°С за20 минути, след което я отместете и охладете до стайна температура. Оставете да престои около 1 час, докатосуспензията се утаи, след което филтрирайте в подходящ съд една аликвотна част през мембранен филтър 0,45 µm(4.2). Пристъпете към определяне чрез HPLC (5.3).

5.2.2. ПремиксиПретеглете с точност до 0,001 g и поставете около 2 g несмлян премикс в мерителна колба от 250 ml.

Прибавете 100,0 ml подкислен метанол (3.8) и разклатете, за да може съдържанието да се диспергира. Поставетеколбата със съдържанието в нея в ултразвукова вана (4.1) при температура приблизително 40°С за 20 минути, следкоето отместете и охладете до стайна температура. Разредете с подкислен метанол (3.8) до маркировката и смесетедобре. Оставете да престои около 1 час, докато суспензията се утаи, след което филтрирайте една аликвотна частпрез мембранен филтър 0,45 µm (4.2). Разредете подходящ обем от чистия филтрат с подкислен метанол (3.8), за даполучите окончателен разтвор за тестване, който съдържа около 4 µg/ml натриев лазалоцид. Пристъпете къмопределяне чрез HPLC (5.3).

5.3. Определяне чрез HPLC5.3.1. Параметри

Следните условия се посочват като указващи; може да се използват други, при условие че даватравностойни резултати:Колона за течен хро- 125 mm x 4 mm, обрат-матографски анализ на фаза С18, опаковка(4.3.1): 5 µm или еквивалентМобилна фаза (3.9): Смес на фосфатен

буферен разтвор (3.7)и метанол (3.5),5 + 95 (V +V)

Скорост на пропускане: 1,2 ml/minДължина на детекция:- Възбуждане: 310 nm- Емисия: 419 nmИнжекционен обем: 20 µl

Проверете стабилността на хроматографската система, като инжектирате няколко пъти калибрационенразтвор (3.10.3), съдържащ 4,0 µg/ml, докато бъдат постигнати постоянни пикови височини (или площи) и временана задържане.

5.3.2. Калибрираща графикаИнжектирайте от всеки калибрационен разтвор (3.10.3) по няколко пъти и определете средните пикови

височини (площи) за всяка концентрация. Начертайте калибрираща графика, като използвате средните пиковивисочини (площи) за ординати, а съответстващите концентрации - за абсциси

5.3.3. Разтвор на пробатаИнжектирайте няколко пъти получените в 5.2.1 или 5.2.2 екстракти от изследваната проба, като използвате

същия обем, взет при калибрационния разтвор, и определете средните пикови височини (площи) на пиковете нанатриевия лазалоцид.

6. Изчисление на резултатитеОт средната пикова височина (площ), получена чрез инжектиране на разтвора на пробата (5.3.3),

определете концентрацията на натриев лазалоцид (µg/ml) по калибриращата графика.6.1. Храни за животниСъдържанието на натриев лазалоцид,w (mg/kg) в пробата се изразява със следната формула:

b = концентрацията на натриев лазалоцид в разтвора на пробата (5.2.1) в µg/ml;V1 = обем на екстракта от пробата, съгласно 5.2.1 в ml (т.е. 100);m = масата в g на взетата за анализ част.6.2. ПремиксиСъдържанието на натриев лазалоцид w (mg/kg) в пробата се изразява със следната формула:

b = концентрацията на натриев лазалоцид в разтвора на пробата (5.2.2) в µg/ml;V2 = обем на екстракта от пробата, съгласно 5.2.2 в ml (т.е. 250);f = фактор на разреждане, съгласно 5.2.2;m = масата в g на взетата за анализ част.7. Потвърждаване на резултатите7.1. ИдентичностМетодите, които са базирани на спектрофлуориметрията, са в по-малка степен подложени на смущения,

отколкото тези, при които се използва UV детекция. Идентичността на анализа може да се потвърди чрезко-хроматография.

7.1.1. Ко-хроматографияОбогатява се екстракт от пробата (5.2.1 или 5.2.2), като се добави подходящо количество калибрационен

разтвор (3.10.3). Количеството добавен натриев лазалоцид трябва да бъде близко до това, открито в екстракта отпробата. На базата на добавеното количество натриев лазалоцид и разреждането на екстракта следва да се увеличисамо височината на пика на натриевия лазалоцид. Широчината на пика при половин височина трябва да бъде вграниците на ± 10 % от оригиналната широчина на пика, получен при необогатения екстракт от пробата.

7.2. ПовторяемостРазликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени върху същата проба, не трябва да

превишава:- 15 % спрямо по-високата стойност при съдържание на натриев лазалоцид от 30 до 100 mg/kg;- 15 mg/kg при съдържание на натриев лазалоцид от 100 до 200 mg/kg;- 7,5 % спрямо по-високата стойност при съдържание на натриев лазалоцид над 200 mg/kg.7.3. ИзвличанеПри обогатената проба храна за животни извличането трябва да бъде най-малко 80 %. При обогатените

проби премикси извличането трябва да бъде най-малко 90 %.8. Резултати от паралелно изследванеПроведено беше паралелно изследване (Analyst, 1995, 120, 2175-2180.) , при което бяха анализирани 2

премикса (проби 1 и 2) и 5 храна за животни (проби 3 - 7) от 12 лаборатории. Върху всяка проба беше извършендвоен анализ. Резултатите са представени в следната таблица:

Проба 1 Проба 2 Проба 3 Проба 4 Проба 5 Проба 6 Проба 7Пилета Пуйки Пуйки Пилета Пуйки Домашни ДомашниПремикс Премикс Гранулиран Натрошен Храна за птици птици

животни Храна за Храна заживотни А животни В

L 12 12 12 12 12 12 12

N 23 23 23 23 23 23 23

Средно (mg/kg) 5050 16 200 76,5 78,4 92,9 48,3 32,6

Sr (mg/kg) 107 408 1,71 2,23 2,27 1,93 1,75

Cvr (%) 2,12 2,52 2,24 2,84 2,44 4,00 5,37

SR (mg/kg) 286 883 3,85 7,32 5,29 3,47 3,49

CVR (%) 5,66 5,45 5,03 9,34 5,69 7,18 10,70

Номиналносъдържание(mg/kg)

5000* 16 000* 80* 105* 120* 50+ 35+

L = брой лабораторииN = брой на отделните резултатиSr = стандартно отклонение на повторяемосттаSR = стандартно отклонение на възпроизводимосттаCvr = коефициент на изменение на повторяемостта, %CVR = коефициент на изменение на възпроизводимостта, %* съдържание, декларирано от производителя+ храна, приготвена в лабораторията

L. Условия, които се прилагат при откриването, определянето или оценката на съставките от животинскипроизход в храните за животни чрез микроскопски анализ

1. Цели и поле на приложениеНастоящите условия се прилагат при откриването чрез микроскопски анализ на съставки от животински

произход (определени като преработени продукти от трупове или части от бозайници, птици и риби) в храните заживотни в рамките на програмата за координиран контрол в областта на храненето на животните съгласноДиректива 95/53/ЕО на Съвета. Предвижда се, че методите, описани в настоящото приложение, се използват привсички официални изпитвания, може да бъде извършено и второ изпитване по производни или друг вид методи с целусъвършенстване на откриването на някои типове съставки от животински произход или за определяне с по-голяматочност на произхода на съставките. Освен това за анализа на някои специфични съставки от животински произход,като плазмата или костите в салото (вж. също точка 9), може да се използва и различен протокол, при условие четези анализи се провеждат в допълнение на анализите, предвидени в програмата за координирания контрол.

2. ЧувствителностВ зависимост от естеството на съставките от животински произход много малки количества могат да бъдат

откривани в храните за животни (< 0,1 %).3. ПринципЗа определянето се използва представителна проба, взета съгласно разпоредбите, определени в Директива

76/371/ЕИО на Комисията от 1 март 1976 г. относно определянето на методите на Общността за взимане на проби иза официалния контрол върху храните за животни (ОВ L 102, 15.4.1976 г., стр. 1.), пробата е надлежно подготвена зацелта. Съставя се следният протокол за третирането на храни за животни с ниска влажност. Храните за животни свлажност над 14 % се изсушават (кондензират) преди третирането им. Някои храни за животни или някои суровини,предназначени за храни на животни (например мас и масла), изискват специално третиране (вж. точка 9). Съставкитеот животински произход се определят на базата на типични характеристики, които се установяват под микроскоп (аименно мускулни влакна и други части от месо, хрущяли, кости, рога, косми, четина, кръв, пера, черупки от яйца,рибешки кости, люспи). Идентификацията се отнася както за пресятата фракция (6.1), така и за концентриранатаутайка (6.2) на образеца.

4. Реактиви

4.1 Фиксатори4.1.1. Хлоралхидрат (водонаситен до 60 % об. тегло)4.1.2. Основа (2,5 % об. тегло NaOH или 2,5 % об. тегло KOH) за пресетите фракции4.1.3. Парафиново масло или глицерол (вискозитет: 68-81) за микроскопски анализ на утайка4.2. Промиващи средства4.2.1. Спирт, 96 %4.2.2. Ацетон4.3. Концентриращи реактиви4.3.1. Тетрахлоретилен (плътност 1,62)4.4. Оцветяващ реагент4.4.1. Йодиран разтвор/калиев йодид (да се разтворят 2 g калиев йодид в 100 ml вода и да се прибави 1 g

йод, да се разклаща често)4.4.2. Ализариново червено (да се разтворят 2,5 ml солна киселина 1М в 100 ml вода и към този разтвор да

се прибавят 200 g ализариново червено)4.4.3. Цистинов реактив (2 g оловен ацетат, 10 g NaOH на 100 ml Н2О)4.4.4. Йодиран разтвор калиев йодид (етанол 70 % р-р)4.5. Избелващ реагент4.5.1. Готов разтвор на натриев хидрохлорид (9,6 % активен хлор)5. Апаратура и помощни средства5.1. Лабораторна везна (точност от 0,01 g, с изключение на концентрираната утайка: 0,001 g)5.2. Инструмент за стриване (мелничка или хаванче, по-конкретно за животински продукти с мастно

съдържание над 15 % към момента на анализа)5.3. Сито с квадратни отвори с размер на отвора максимум 0,50 mm5.4. Декантационна колба или бехерова чаша с конично дъно5.5. Стереомикроскоп (увеличение най-малко 40 пъти)5.6. Съставен микроскоп (увеличение най-малко 400 пъти) с излъчена или поляризирана светлина.5.7. Стандартна лабораторна стъкларияЦялото оборудване се почиства старателно. Декантационните колби и стъклария трябва да се измият

машинно. Ситата се почистват с помощта на четка с твърд косъм.6. ПроцедураГранулираните храни могат да бъдат предварително пресети, ако двете фракции се анализират като

отделни образци.Третират се най-малко 50 g от пробата (стрити старателно, ако е необходимо, с помощта на подходящ

инструмент за смилане (5.2) с цел да се получи подходяща структура). От смления материал се вземат двепредставителни дози, едната за пресятата фракция (най-малко 5 g) (6.1), другата за концентрираната утайка(най-малко 5 g) (6.2). Оцветяването с реагенти (6.3) може да бъде използвано и за идентификационни цели.

С цел да бъде показан видът на животинските протеини и произходът на частиците може да се използвапомощно решаващо устройство, като например ARIES, както и еталонни проби.

6.1. Определяне на съставки от животински произход в пресетите фракцииНай-малко 5 g от пробата трябва да се пресеят (5.3) в две фракции.Пресятата/тите фракция/и, съдържаща/и едрите частици (или представителна част от фракцията), се

разстила върху съответния носител, така че да образува фин слой и методично се изследва под стереомикроскоп(5.5) при различни увеличения за откриване на съставките от животински произход.

Предметните стъкла с препаратите на пресятата/ите фракция/и, които съдържат фини частици, сеизследват методично под съставен микроскоп (5.6) при различни увеличения за откриване на съставките отживотински произход.

6.2. Определяне на съставки от животински произход в концентрираната утайкаНай-малко 5 g (точност от 0,01 g) от пробата се пресипват в декантационна колба или бехерова чаша с

конично дъно и се обработват с най-малко 50 ml тетрахлоретилен (4.3.1). Сместа се разклаща или разбъркванеколкократно.

- Ако се използва затворена декантационна колба, сместа трябва да се остави да престои достатъчно дълговреме, преди да се утаи (минимум три минути) и да се отдели утайката. Неколкократно се разклаща и се оставяотново да се утаи за минимум три минути, преди да се отдели отново утайката.

- Ако се използва отворена бехерова чаша, сместа трябва да се остави да се утаи минимум 5 минути предида се отдели утайката.

Цялата утайка се изсушава и след това се претегля (точност от 0,001 g). Не се налага теглене, освен ако несе изисква количествена оценка. Ако утайката се състои от много едри частици, може да се пресее (5.3) в двефракции. Изсушената утайка се изследва със стереомикроскоп (5.5) и със съставен микроскоп (5.6) за установяванена съставки от кости.

6.3. Използване на фиксатори и оцветяващ реагент

Идентифицирането чрез микроскоп на съставките от животински произход може да се улесни чрезизползването на специални фиксатори и оцветители.

Хлорал хидрат (4.1.1): Чрез внимателно затопляне клетъчните структури могат да бъдат виждани по-ясно,тъй като зърната нишесте желатинизират и нежеланото клетъчно съдържание се отстранява.

Луга (4.1.2): Както натриевият хлорид, така и калиевият хлорид изчистват изследвания материал, катоподпомагат откриването на мускулни влакна, косми и други кератинови структури.

Парафиново масло и глицерол (4.1.3): Костните съставки могат да бъдат добре идентифицирани в тозизапечатващ агент, тъй като повечето кухини остават запълнени с въздух и се появяват като черни дупки с размериоколо 5 - 15 µm.

Йодин/разтвор от калиев йодид (4.4.1): Използван за откриване на нишесте (синьо-виолетов цвят) ипротеини (жълто-оранжев цвят). Разтворите могат да бъдат разредени, ако е необходимо.

Червен разтвор на ализарин (4.4.2): Червено/розово оцветяване на кости, кости от риба и люспи. Предиизсушаване на утайката (виж раздел 6.2) цялата утайка се прехвърля в стъклена епруветка и се изплаква два пъти сприблизително 5 ml алкохол (4.2.1) (всеки път следва да се използва вортекс миксер, разтворителят се оставя дадейства около една минута и се излива). Преди да се използва този оцветител, утайката се избелва, като се добавянай-малко 1 ml натриев хипохлоритен разтвор (4.5.1). Реакцията се оставя да продължи 10 минути. Епруветката сенапълва с вода, утайката се оставя от две до три минути и водата и частиците, които са в състояние на суспензия, сеизливат. Утайката се изплаква още два пъти с около 10 ml вода (следва да се използва вортекс миксер, оставя се да сеутаи и водата се излива всеки път). Добавят се от 2 до 10 или повече капки (в зависимост от количеството наутайката) червен разтвор на ализарин. Сместа се разклаща и реакцията се осъществява за няколко секунди.Оцветената утайка се изплаква два пъти с приблизително 5 ml алкохол (4.2.1), последвани от едно изплакване сацетон (4.2.2) (всеки път следва да се използва вортекс миксер, разтворът се оставя да се утаи за около една минута итечността се излива). След това утайката е готова за изсушаване.

Реагент за цистин (4.4.3): Чрез внимателно загряване съставките, съдържащи цистин (козина, пера и т. н.),стават черно-кафяви.

6.4. Изследване на храните за животни, които биха могли да съдържат рибни брашнаПод съставен микроскоп се изследва минимум едно предметно стъкло с препарат от пресята фина фракция

и от фина фракция на утайка (виж раздели 6.1 и 6.2).Ако на етикета е посочено наличие на рибни брашна в съставките или ако има съмнение, или бъде открито

наличие на рибни брашна при първоначалния преглед, се изследват най-малко две допълнителни предметни стъкла спрепарати от пресята фина фракция на оригиналната проба и на фракция от общата утайка.

7. Изчисляване и оценкаДържавите членки гарантират спазването на процедурите, описани по-нататък, при всеки официален

анализ, целящ количествена оценка (не само наличие) на съставки от животински произход.Изчислението може да бъде направено само ако съставките от животински произход включват парчета от

кости.Парчетата от кости от сухоземни топлокръвни видове животни (т.е. бозайниците и птиците) се различат от

различните типове рибни кости върху микроскопско предметно стъкло по типичните лакуни (вдлъбнатини).Съотношението на отделните съставки от животински произход в пробата се изчислява, като се отчита:

- разчетното съотношение (теглови проценти) на костите в съставките от животински произход и- пропорцията (теглови проценти) на костите в съставките от животински произход.Оценката трябва да се базира на изследването на най-малко три предметни стъкла (ако е възможно) и на

най-малко пет полета за стъкло. В комбинираните храни за животни концентрираната утайка съдържа не самопарчета от кости на сухоземни животни и рибни кости, но и други частици с високо специфично тегло, напримерминерали, пясък, части от вдървесени растения и др.

7.1. Разчетната стойност на процентното съдържание на парчета от костиПроцентно съдържание на парчета кости от сухоземни видове = (S x c)/WПроцентно съдържание на парчета от рибни кости и люспи = (S x d)/W(S = маса на утайката (mg), с = корекционен коефициент (%) за разглежданата доза кости от сухоземни

животни в утайката, d = корекционен коефициент за разглежданата доза парчета от рибни кости и люспи в утайката,W = тегло на образеца, от който произлиза утайката (mg).

7.2. Разчетната стойност на съставките от животински произходПропорционалното участие на кости в продуктите от животински произход може да варира значително.

(Процентното съдържание на кости е от порядъка на 50 до 60 % за костните брашна и от порядъка на 20 до 30 % замесните брашна; в случаите с рибени брашна съдържанието на кости и люспи варира в зависимост от категорията ипроизхода на рибеното брашно, но е в рамките обикновено на 10 до 20 %.)

Ако се знае съдържанието на този тип брашно в пробата, възможно е да се направят следните оценки:

Разчетно съотношение на производните съставки от продукти на животинска основа от сухоземниживотни (%) = (S x c)/(W x f) x 100

Разчетно съотношение на производните съставки от продукти на рибена основа (%) = (S x d)/(W x f) x 100(S = маса на утайката (mg), с = корективен коефициент (%) за разглежданата доза кости от сухоземни

животни в утайката, d = корективен коефициент за разглежданата доза парчета от рибни кости и люспи в утайката, f= корективен коефициент за съдържанието на кости в съставките от животински произход в разглеждания образец,W = тегло на образеца, от който произлиза утайката (mg).

8. Излагане на резултата от изследванетоОтчетът съдържа най-малко информация относно наличието на съставки, производни от сухоземни

животни и рибени брашна. Отделните случаи се представят по следния начин:8.1. Що се отнася до наличието на съставки, производни от сухоземни животни:- в разглежданата проба не се откриват съставки, производни на сухоземни животни, доколкото могат да

бъдат видени под микроскоп,или:- в разглежданата проба се откриват съставки, производни на сухоземни животни, доколкото могат да

бъдат видени под микроскоп.8.2. Що се отнася до наличието на рибени брашна:- в разглежданата проба не се откриват съставки, производни на риба, доколкото могат да бъдат видени

под микроскоп,или:- в разглежданата проба се откриват съставки, производни на риба, доколкото могат да бъдат видени под

микроскоп.Ако бъдат открити съставки, производни от риба или сухоземни животни, при необходимост отчетът от

изследванията може да дава количествена оценка на откритите съставки (х %, < 0,1 %, между 0,1 и 0,5 %, между 0,5и 5 % или > 5 %) и да уточнява типа сухоземни животни (ако е необходимо) и идентифицираните съставки отживотински произход (мускулни влакна, хрущяли, кости, рога, косми, четина, кръв, пера, яйчни черупки, кости отриба, люспи).

Ако се прави количествена оценка на съставките от животински произход, то използваният корективенкоефициент f също се упоменава.

Когато се установи наличието на кости от сухоземни животни, в отчета се добавя и следната клауза:"Не се изключва възможността гореизброените съставки да произхождат от бозайници".Тази допълнителна клауза не се изисква, ако парчетата кости на сухоземни животни са идентифицирани

като парчета кости на птици или бозайници.9. Незадължителен протокол от анализа на мас или маслаПри анализа на мас и масла може да се използва следният протокол:- За твърдата мас: тя трябва да се загрее до втечняването й, например в микровълнова печка.- Да се вземат с пипета 40 ml масти от дъното на пробата и да се накапят в центрофуга.- Да се центрофугира за 10 минути при 4000 оборота/минута.- Ако маста се втвърди при центрофугирането, да се загрее в печката, докато пак се върне в течно

състояние. Да се центрофугира отново за 5 минути при 4000 оборота/минута.- С малка лъжичка или с шпатула половината от получените примеси се прехвърлят в малка чашка на

Петри или върху микроскопско предметно стъкло с цел да се открие под микроскоп евентуалното наличие насъставки от животински произход (мускулни влакна, пера, парчета от кости и др.). Препоръчително е използванетона парафиново олио или глицерол като запечатващ агент (фиксатор) за микроскопския анализ.

- Остатъчните примеси се използват за подготвянето на утайката по начина, описан в точка 6.2.

LI. Определяне съдържанието на спирамицин чрез дифузия в хранителна среда агар-агар

1. Цел и обхватМетодът се използва за определяне съдържанието на спирамицин в храните за животни и предварително

приготвените смеси. Долната граница на определяне е 1 mg/kg (1ррm) (1 mg спирамицинова основа е еквивалентенна 3200 международни единици (UI)).

2. ПринципПробата се извлича със смес на метанол/фосфат-бикарбонатен буфер при рН 8. Извлекът се декантира или

центрофугира и разрежда. Неговата антибиотична активност се определя чрез измерване на дифузията наспирамицин в агар-агар среда, изкуствено заразена в Microccus luteus. Дифузията се показва чрез формиране на зонина инхибиране на микроорганизмите. Приема се, че диаметърът на тези зони е правопропорционален на логаритъмана антибиотичната концентрация в обхвата на използваните антибиотични концентрации.

3. Микроорганизъм: Microсоccus luteus АТСС 9341 (NCTC 834, NCIB 8553)

3.1. Поддържане на изходна култураВ тръби, съдържащи културална хранителна среда (4.1), се посява Microccus luteus и се слага в инкубатор

за 24 часа при 30°С. Културата се съхранява в хладилник при около 4 °С. Слага се отново в инкубатор на всеки 2седмици.

3.2. Приготвяне на бактериалната суспензия(а)Взема се продуктът на свежа хранителна среда агар-агар (3.1) с 2 до 3 ml разтвор на натриев хлорид (4.3).

Тази суспензия се използва, за да се посее в 250 ml културална среда (4.1), съдържаща се в Roux колба и се поставя винкубатор за 18 - 20 часа при 30°С. Полученото се слага в 25 ml разтвор на натриев хлорид (4.3) и се разбърква.Суспензията се разрежда до 1/10 с разтвор на натриев хлорид (4.3). Прозрачността на суспензията трябва да бъдеоколо 75 %, измерена при 650 nm в клетка 1 cm спрямо разтвор на натриев хлорид (4.3). Тази суспензия може да сесъхранява една седмица при около 4 °С.

4. Културална среда и реактиви4.1. Културална среда(б)Месен пептон - 6,0 gТриптон - 4,0 gЕкстракт от дрожди - 3,0 gМесен екстракт - 1,5 gГлюкоза - 1,0 gАгар-агар - 10,0 до 20,0 gВода - 1000 mlрН 6,5 до 6,6 (след стерилизация).4.2. Културална среда за извършване на анализабТриптон - 5,0 gЕкстракт от дрожди - 4,0 gМесен екстракт - 3,0 gАгар-агар - 10,0 до 20,0 gВода - 1000 mlрН 8,0 (след стерилизация).4.3. Разтвор на натриев хлорид 0,8 % ( w/v).Разтварят се 8 g натриев хлорид във вода и се разрежда до 1000 ml и се стерилизира.4.4. Фосфатно-бикарбонатен буфер, рН 8,0Двукалиев водороден фосфат К2НРO4 - 16,7 gКалиев двуводороден фосфат КН2РO4 - 0,5 gНатриев водороден карбонат NaHCO3 - 20,0 gВода до - 1000 ml.4.5. Смес на метанолов фосфатно-бикарбонатен буфер (4.4) 50/50 (w/v).4.6. Стандартна субстанцияСпирамицин с известна активност (в IU).________________________

(*а) Могат да бъдат използвани други методи, в случай че се установи, че при тях се получават сходнибактериални суспензии.

(*б) Може да се използва културална среда от търговски характер със сходен състав, даваща същитерезултати.

5. Стандартни разтвориРазтваря се точно претеглено количество стандартна субстанция (4.6) в сместа (4.5) и се разтваря със

същата смес, за да се получи изходен разтвор, съдържащ 1000 IU спирамицин на 1 ml. Съхраняван в запушена колбапри 4 °С, този разтвор е стабилен до 5 дни.

От този изходен разтвор се приготвят чрез последователно разреждане със сместа (4.5) следните разтвори:S8 - 1 - IU/mlS4 - 0,5 - IU/mlS2 - 0,25 - IU/mlS1 - 0,125 - IU/ml.6. Приготвяне на екстракта и разтворите за извършване на анализ6.1. ИзвличанеПретегля се проба от 20 g при храни за животни и от 1 до 20 g при предварително приготвени смеси.

Добавят се 100 ml от сместа (4.5) и се разтръсква в продължение на 30 min. Центрофугира се или се декантира иплаващият по повърхността слой се разрежда с разтвора (4.5), за да се получи очаквано съдържание на спирамицин

от 1 IU/ml (= U8).За очаквани нива на спирамицин, по-ниски от 2,5 mg/kg храна за животни, извличането се извършва, както

следва: претеглят се 20 g проба; добавят се 100 ml от сместа (4.5) и се разтръсква в продължение на 30 min;центрофугира се в продължение на няколко min, вземат се 50 ml от плаващия на повърхността разтвор и се изпаряватдо около 4 ml при намалено налягане в ротационен изпарител при температура, непревишаваща 40°С. Остатъкът серазрежда със сместа (4.5), за да се получи очаквано съдържание на спирамицин от 1 IU/ml (= U8).

6.2. Разтвори за извършване на анализОт разтвор U8 се приготвят разтвори U4 (очаквано съдържание 0,5 IU/ml), U2 (очаквано съдържание 0,25

IU/ml) и U1 (очаквано съдържание 0,125 IU/ml) чрез последователно разреждане (1+1) със сместа (4.5).7. Процедура на извършване на анализа7.1. Посяване на средата за изпитванеВ средата за изпитване (4.2) се посява бактериалната суспензия (3.2) при около 50°С. Чрез предварителни

опити в петрита със среда за изпитване (4.2) се определя количеството на бактериалната суспензия, необходимо дасе получат най-големите и най-ясни зони на инхибиране с различна концентрация на спирамицин.

7.2. Подготовка на петритатаДифузията през агар-агар се извършва в петрита с четирите концентрации на стандартния разтвор (S8, S4,

S2 и S1) и четирите концентрации на анализирания разтвор (U8, U4, U2 и U1). Тези четири концентрации наекстракта и стандарта трябва задължително да се поставят във всяко петри. В тази връзка се избират петрита,достатъчно големи, за да позволят в средата агар-агар да се направят поне 8 отвора с диаметър от 10 до 13 mm и непо-малко от 30 mm между центровете. Тестът трябва да се извърши в петрита, състоящи се от лист стъкло, покрит салуминиев или пластмасов пръстен, поставен отгоре, с вътрешен диаметър 200 mm и височина 20 mm.

В петритата се излива част от средата (4.2), посята както в 7.1, за да се получи слой, дебел около 2 mm (60ml за петри с диаметър 200 mm). Оставя се да се изравни, пробиват се дупките и в тях се обозначават точнопремерени обеми от разтворите за анализиране и стандартните разтвори (между 0,10 и 0,15 ml на дупка в зависимостот диаметъра). Всяка концентрация се полага поне 4 пъти, така че на всяко определяне да подлежат на оценка 32зони на инхибиране.

7.3. Поставяне в инкубаторПетритата се поставят в инкубатор за 16 - 18 часа при температура 30 ± 2 °С.8. ОценяванеИзмерва се диаметърът на зоните на инхибиране с точност 0,1 mm. Отбелязват се средноаритметичните

стойности на измерванията за всяка концентрация върху милиметрова хартия, показваща логаритъма наконцентрациите във връзка с диаметрите на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на най-добро съответствиена стандартния разтвор и екстракта.

Определя се "най-точно съответстващата" точка за стандартното най-ниско ниво (SL), като се използваформулата:

SL = (7S1 + 4S2 + S4 - S8) / 10 .

Определя се "най-точно съответстващата" точка за стандартното най-високо ниво (SH), като се използваформулата:

SH = (7S8 + 4S4 + S2 - S1) / 10 .

По подобен начин се изчисляват и "най-точно съответстващите" точки за най-ниските нива на екстракта(UL) и най-високите нива на екстракта (UH), като във формулите се заменят S1, S2, S4 и S8 с U1, U2, U4 и U8(Малките букви "s" и "u" се отнасят за диаметрите на зоните на инхибиране.).

Изчислените стойности на SL и SH се нанасят на същата милиметрова хартия и се свързват, за да сеполучи линията на "най-точно съответствие" за стандартния разтвор. По подобен начин се нанасят UL и UH и сесвързват, за да се получи линията на "най-точно съответствие" за екстракта.

При отсъствие на интерференции линиите трябва да са паралелни. За практически цели линиите могат дасе считат паралелни, ако стойностите (SH - SL) и (UH - UL) не се различават с повече от 10% от тяхната среднааритметична стойност.

Ако се окаже, че линиите не са паралелни, u1 и s1 или u8 и s8 могат да се изключат и SL, SH, UL и UH дасе изчислят, като се използват алтернативните формули, за да се получат линиите на "най-точно съответствие":

и по-подобен начин за UL и UH. Трябва да бъде удовлетворен същият критерий за успоредност. Фактът, черезултатът е изчислен от три нива, трябва да бъде отбелязан в крайния отчет.

Когато линиите се считат за успоредни, се изчислява логаритъмът на относителна активност (log A)посредством една от следните формули в зависимост от това, дали са използвани три или четири нива за оценка науспоредността.


Активността на пробвания екстракт е равна на активността на релевантния стандарт, умножена по А:

(U8 = S8 x A).

Ако относителната активност се окаже извън обхвата от 0,5 до 2, анализът се повтаря, като се правятподходящи корекции на концентрациите на екстракта или ако това не е възможно - на стандартните разтвори. Когатоотносителната активност не може да се доведе в изисквания обхват, всеки получен резултат се счита заприблизителен и това се отбелязва в крайния отчет.

Когато линиите не могат да се считат за успоредни, определянето се повтaря. Ако пак не може да сеполучи успоредност, определянето се счита за незадоволително.

Резултатите се изразяват в mg спирамицинова база на kg храна за животни.9. ПовторяемостРазликата между резултатите на две успоредни определяния, направени на същата проба от същия

лаборант, не трябва да превишава:- 2 mg/kg в абсолютна стойност - за съдържание на спирамицинова база до 10 g/kg;- 20% от най-високата стойност - за съдържания от 10 до 25 mg/kg;- 5 mg/kg в абсолютна стойност - за съдържание от 25 до 50 mg/kg;- 10% от най-високата стойност - за съдържания над 50 mg/kg.

LII. Определяне на количеството влакнеста маса

1. Цел и обхватТози метод позволява определянето на органични субстанции без мазнини в храни, които са неразтворими

в киселини и основи и са наричани конвенционално влакнеста маса.2. ПринципОбразецът, обезмаслен, когато е необходимо, се третира последователно с кипящи разтвори на сярна

киселина и калиев хидроокис с определени концентрации. Утайката се отделя чрез филтриране с помощта на филтърот синтеровано стъкло, след което се изпира, изсушава, претегля и изгаря до пепел при температури в диапазона от475 до 500°С. Намалението в теглото, получено в резултат на изгарянето до пепел, съответства на влакнестата маса,налична в изпитвания образец.

3. Реагенти3.1. Сярна киселина, с = 0,13 mol/l.3.2. Агент срещу образуване на пяна (например n-октанол).3.3. Филтрираща маса (Селит 545 или еквивалент), загрята на температура 500°С в продължение на четири

часа (8.6).3.4. Ацетон3.5. Петролен етер с диапазон на кипене от 40 до 60°С.3.6. Солна киселина, с = 0,5 mol/l.3.7. Разтвор на калиев хидроокис,с = 0,23 mol/l.4. Уреди4.1. Загряващо устройство за обработка със сярна киселина или с разтвор на калиев хидроокис, оборудвано

с поставка за филтърния тигел (4.2) и снабдено с извеждаща тръба с кран към резервоар за течности и към вакуум.Възможно е да се използва сгъстен въздух. Преди използване всеки ден устройството се затопля с кипяща вода впродължение на пет минути.

4.2. Стъклен филтърен тигел с филтърна плоскост от синтеровано стъкло с филтърни пори с размер 40 - 90µm. Преди първа употреба се загрява до 500°С за няколко минути и се изстудява (8.6).

4.3. Цилиндър с обем най-малко 270 ml, снабден с обратен втечнител, подходящ за кипене.4.4. Пещ за сушене с термостат.4.5. Пещ за изпичане на порцелан с термостат.4.6. Устройство за извличане, състоящо се от поддържаща плоскост за филтърния тигел (4.2), и с тръба за

оттичане с кран към вакуум и към резервоар за течности.4.7. Свързващи обръчи за монтаж на загряващото устройство (4.1), филтърния тигел (4.2) и цилиндъра (4.3)

и за свързване на устройството за студено извличане (4.6) и тигела.5. Процедура1 g от подготвения образец се претегля с точност до най-близките 0,001 g и се поставя в тигела (4.2) (виж

наблюдения 8.1, 8.2 и 8.3) и се добавя 1 g от филтриращата маса (3.3).Сглобяват се загряващото устройство (4.1) и филтърният тигел (4.2), след което към тигела се добавя

цилиндърът. 150 ml от кипящата сярна киселина (3.1) се наливат в сглобените цилиндър и тигел и ако е необходимо,се добавят няколко капки от агента срещу образуване на пяна (3.2).

Течността се довежда до точката на кипене в рамките на 5 ± 2 минути и се оставя силно да кипи точно 30минути.

Отваря се кранът към резервоара за течности (4.1) и при условия на вакуум сярната киселина се филтрирапрез филтърния тигел. Утайката се изпира с три последователни порции от по 30 ml кипяща вода, като при товаутайката се изсушава след всяко изпиране.

Кранът към резервоара за течности се затваря и в сглобените цилиндър и тигел се наливат 150 ml кипящкалиев хидроокис (3.7) и се добавят няколко капки от агента срещу образуване на пяна (3.2). Течността се довеждадо точката на кипене в рамките на 5 ± 2 минути и се оставя силно да кипи точно 30 минути. Филтрира се и сеповтаря процедурата по изпиране, използвана на етапа с използване на сярна киселина.

След финалното изпиране и изсушаване тигелът и неговото съдържимо се отделят и се свързват отновокъм устройството за студено извличане (4.6). Прилага се вакуум и утайката се изпира в тигела с три последователнипорции от по 25 ml ацетон (3.4), като при това тя се изсушава след всяко изпиране.

Тигелът се изсушава до постоянно тегло в пещ при температура 130°С. След всяко изсушаванесъдържимото на тигела се изстудява в сушилня и бързо се претегля. Тигелът се поставя в пещ за изпичане напорцелан и неговото съдържимо се изгаря до пепел с постоянно тегло при температури в диапазона от 475 до 500°Сза най-малко 30 минути.

След всяко загряване се изстудява първо пещта и след това сушилнята преди претегляне.Провежда се контролно изпитване без образеца. Загубата на тегло в резултат на изгарянето до пепел не

трябва да превишава 4 mg.6. Изчисляване на резултатитеСъдържанието на влакнеста маса е процент от образеца, получен по формулата:

къдетоa = масата на образеца в g;b = загубата на маса след изгаряне до пепел по време на изпитването за определяне на количеството

влакнеста маса, в g;c = загубата на маса след изгаряне до пепел след контролното изпитване, в g;7. ПовторимостРазликата между две паралелни определяния на количеството влакнеста маса, проведени върху един и същ

образец, не трябва да надхвърля:- 0,3 по абсолютна стойност за съдържание на влакнеста маса под 10 %;- 3 % по отношение на най-високия резултат за съдържание на влакнеста маса, равно или по-голямо от 10

%.8. Наблюдения8.1. Храни, съдържащи повече от 10 % влакнеста маса, трябва да бъдат обезмаслени преди анализа с

петролен етер (3.5). Филтърният тигел (4.2) и неговото съдържимо се свързват с устройството за студено извличане(4.6), прилага се вакуум и утайката се изпира с три последователни порции от по 30 ml петролен етер, като при товасе осигурява утайката да е суха. Тигелът и неговото съдържимо се свързват към устройството за загряване (4.1) и сепродължава, както е описано в т. 5.

8.2. Храни, съдържащи мазнини, които не могат да бъдат извлечени директно с петролен етер (3.5), трябвада бъдат обезмаслени, както е показано в т. 8.1, и още веднъж обезмаслени след кипене с киселина.

След кипене с киселина и последващото изсушаване тигелът и неговото съдържимо се свързват къмустройството за студено извличане (4.6) и се изпират три пъти с по 30 ml ацетон, последвани от три следващиизпирания с порции от по 30 ml петролен етер. Извършва се филтриране във вакуум до изсушаване и анализът сепродължава, както е описано в т. 5, като се започва с обработка с калиев хидроокис.

8.3. Ако храните съдържат повече от 5 % карбонати, изразени в калциев карбонат, тигелът (4.2) спретегления образец се свързват към устройството за загряване (4.1). Образецът се изпира три пъти с по 30 ml солнакиселина (3.6). След всяко добавяне образецът се оставя за около една минута преди филтриране. Изпира се веднъжс 30 ml вода и след това се продължава както е описано в т. 5.

8.4. Ако се използва уред във формата на стенд (няколко тигела, прикрепени към едно и също загряващоустройство), то две индивидуални определяния на един и същи образец за анализ не могат да бъдат направени в еднаи съща серия.

8.5. Ако след кипене е трудно да се филтрират киселини и основи, използва се сгъстен въздух през тръбатаза оттичане на загряващото устройство и след това филтрирането продължава.

8.6. Температурата на изгарянето до пепел не трябва да бъде по-висока от 500°С, за да се удължи животътна стъклените филтърни тигели. Трябва да се внимава да не се предизвика температурен шок по време на циклите назагряване и изстудяване.

LIII. Насоки за оценка на някои продукти, използвани при храненето на животните

Общи аспектиНастоящите насоки представляват наръчник, предназначен за изготвянето на документация за продуктите,

изброени в точки 1.1 и 1.2 от Приложението към Директива 82/471/ЕИО, получени от култивиране намикроорганизми и за които има вероятност да бъдат допуснати като нов източник на протеини при храненето наживотните. Чрез тази документация следва да се направи оценка на въпросните продукти въз основа на настоящотосъстояние на познанията и следва да гарантират тяхното съответствие с фундаменталните принципи, определени сцел допускане на тяхната употреба, които са предмет на член 6, параграф 2 от гореупоменатата директива.

Могат да бъдат поискани всички изследвания, очертани в този документ, и при необходимост да се поискадопълнителна информация. Като общо правило трябва да се осигури цялата информация, необходима заустановяване идентичността на микроорганизма и състава на културната среда, както и производствения процес,характеристиката, представянето, условията на употреба, методите за определяне и хранителните свойства напродукта. Същото важи за информацията, необходима за оценяване на допустимото ниво на продукта посредствомцелевите видове и рисковете за човека и за околната среда, които пряко или непряко произтичат от използването напродукта. Токсикологичните изследвания, необходими за тази цел, зависят от естеството на продукта, съответнитеживотински видове и метаболизма на продукта в лабораторните животни.

Документацията, която следва да се предостави, трябва да включва подробни доклади, представени всъответния ред и с номерирането, предложени тези насоки и придружена от резюме. Липсата на което и да е отпредложените изследвания трябва да бъде аргументирана. Прилагат се публикациите, цитирани като препратки.

НаблюденияТерминът "продукт", така както се използва в настоящите насоки, се отнася за който и да е съдържащ

протеини продукт - в състоянието, в което той ще се представя като храна за животни или като компонент от храназа животни.

При всяка промяна в производствения процес или в условията за употреба на продукта ще се изисквауведомяване и при необходимост допълнителна документация за нова оценка.

Представяне на изследваниятаI. Микроорганизъм, културна среда и производствен процес, характеристики на продукта, представяне и

условия на употреба, методи на определянеII. Изследвания за хранителните свойства на продуктаIII. Изследвания за биологичните последици от употребата на продукта при храненето на животнитеIV. Други подходящи изследвания

Раздел ІМикроорганизъм, хранителна среда и производствен процес, характеристики на продукта, представяне и

условия на употреба, методи на определяне

1. Микроорганизъм1.1. Класификация, произход, морфология, биологични свойства, генетични манипулации.1.2. Безвредност, възможно оцеляване извън ферментора и последици за околната среда.1.3. Устойчивост и чистота на култивираните щамове, методи, използвани за проверка на тези критерии.2. Културна среда и производствен процес2.1. Състав на субстрата, добавени субстанции и т. н.2.2. Процеси на производство, изсушаване и очистване. Процес на умъртвяване на микроорганизмите.

Методи, използвани за проверка константността на състава на култивирания продукт и откриване на всякаквихимически, физически и биологични замърсители по време на производството.

2.3. Технически процеси на подготовка за употреба.3. Характеристики на продукта3.1. Физически и физико-химични свойства: макро- и микроморфология, размер на частиците, плътност,

специфично тегло, хигроскопичност, разтворимост, електростатични свойства и т.н.3.2. Химически състав и характеристики3.2.1. Съдържание на влага, груб протеин, груби масти, груба целулоза, груба пепел, въглехидрати,

граници за вариране на тези съдържания.3.2.2. Съдържание на общия амоняк, амин, нитрат и нитритен нитроген, нуклеинови киселини, протеин,

количествен и качествен състав на общите и на свободните аминокиселини и на пириновите и пиримидиновите бази.3.2.3. Количествен и качествен състав на общите липиди: мастни киселини, несапунообразуваща материя,

разтворими в липиди пигменти, фосфолипиди.3.2.4. Състав на въглехидратната фракция.3.2.5. Количествен и качествен състав на неорганичните компоненти.3.2.6. Количествен и качествен състав на витамините.3.2.7. Количествен и качествен състав на другите съставки: добавки, остатъци от субстрата и

разтворителите, други потенциално вредни остатъци от метаболизма на субстрата, на културната среда, напроизводствения процес.

3.3. Микробиологично замърсяване на продукта.3.4. Поведение и стабилност на продукта - като такъв и когато е смесен с храни в текуща употреба, по

време на съхранението му.4. Представяне и условия на употреба4.1. Предложени имена за търговия на продукта.4.2. Предложени формули за търговия на продукта.4.3. Планирана употреба на продукта при храненето на животните. Планирани концентрации в пълноценни

фуражи и в планираните количества за дневните дажби за съответните животински видове.5. Методи на определянеКоличествени и качествени методи за определяне на продукта в комплектни и в допълващи храни.NB Описанието на тези методи се придружава от информация относно специфичност, чувствителност,

граници на откриване, граници на грешка, възможни намеси от страна на други субстанции. Трябва да имапредставени мостри от продукта в неговите различни предложени представяния.

Раздел ІІИзследвания за хранителните свойства на продукта

1. Оценка на протеиновата стойност1.1. Химични, биохимични и микробиологични изследвания.1.2. Изследвания върху лабораторни животни, сравнени с оглед протеините.2. Изследвания върху целеви видовеЗа всеки целеви вид трябва да се направят следните изследвания в сравнение с контролната група, която

получава, при същите условия на хранителен баланс, диета в текуща употреба, съдържаща еквивалентни количестваот протеинов азот, за преживни животни с общ азот.

2.1. Протеин и стойност на енергийната добавка на продукта в дажбите съгласно предложените условия наупотреба при различните физиологични стадии (например в периода на растеж, бременност, люпене).

2.2. Влиянието на продукта при предложените условия на употреба върху степента на растеж, степен наусвояване на храната, заболеваемост, смъртност.

2.3. Оптимални хранителни нива на включване на продукта в дажбите.2.4. Ефектът на продукта при предложените условия на употреба върху технологичните, органолептичните

или другите качества на ядливите продукти с животински произход.3. Експериментални условия в изследванията върху целевите видовеДа се направи подробно описание на проведените тестове, като се уточнят следните данни:3.1. Вид, подвид, възраст и пол на животните, процедура за идентификация.3.2. Брой на тестовете и контролните групи, брой на животните във всяка от групите (броят трябва да е

достатъчно голям за статистически анализ с използване на подходящи статистически параметри).3.3. Нива на включване на продукта, количествен и качествен състав на дажбата и нейния анализ.3.4. Местоположение на всеки експеримент, физиологично състояние и условия за здравето на животните,

условия за отглеждане (последните трябва да отразяват тези условия, които се използват на практика в Общността).3.5. Точна продължителност на тестването и дата на проведения анализ.

Раздел ІІІИзследвания за биологичните последици от употребата на продукта при храненето на животните

Изследванията, очертани в този раздел, са предназначени да позволят оценка на безопасността приупотребата на продукта в целевите видове и рисковете за човека и за околната среда, които биха могли да се получатпряко или косвено от тази употреба. Токсикологичните изследвания, необходими за тази цел, ще зависят отестеството на продукта, от съответния животински вид и метаболизма на продукта в лабораторните животни.

1. Изследвания върху целеви видовеЗа всеки целеви вид следва да се направят следните изследвания в сравнение с контролната група, която

получава, при същите условия на хранителен баланс, диета в текуща употреба, съдържаща еквивалентни количестваот протеинов азот, за преживни животни с общ азот.

1.1. Максимални степени на включване на продукта в дневната дажба, без при това да се създаванеблагоприятен ефект.

1.2. Възможният ефект от продукта върху плодородието и възпроизводството по целесъобразност.1.3. Ефектите от консумацията на продукта при предложените условия на употреба на микроорганизмите

във флората на хранопровода и върху колонизацията на патогенни микроорганизми в хранопровода.1.4. Проучване при предложените условия на употреба на възможните остатъци от продукта (субстрат,

културна среда, разтворители, замърсители) в ядливите продукти от животински произход.1.5. Проучване при предложените условия на употреба на възможните остатъци от продукта (субстрат,

културна среда, разтворители, замърсители) в екскрементите.2. Изследвания върху лабораторни животни2.1. МетаболизъмСъдбата на продукта в животното: усвояване, натрупване, биологично превръщане, елиминиране.2.2. МутагенностПроучване на потенциалната мутагенност поради замърсители (по-специално микотоксини и бактерии)

или остатъци от продукта (субстрат, културна среда, разтворители), включително в тестовете със скрининг ин витро,като се използват системи за активиране на метаболизма.

2.3. Токсикологични изследванияДолупосочените изследвания трябва да се направят в сравнение с контролни групи, получавайки - при

същите условия на хранителен баланс, диета в текуща употреба, съдържаща еквивалентни количества протеиновазот. Трябва да се изследват токсичните ефекти, така че да се осветли тяхната причина и механизмите и да сегарантира, че те не се получават в резултат на хранителния дисбаланс или от свръхдоза на продукта в диетата.

2.3.1. Субхронична токсичност (поне 90 дни)Най-общо тези изследвания трябва да се проведат върху два животински вида, като единият от тях е

гризач. Продуктът трябва да се администрира в дневната дажба в поне две нива на включване. Тези нива трябва да

бъдат избрани по такъв начин, че да се определи, ако е възможно, нивото на липса на ефект и ниво, което да показваизвестен неблагоприятен ефект. Групите животни трябва да включват адекватен брой субекти от всеки пол. Приопита винаги трябва да се включва една контролна група.

Всички релевантни биологични данни трябва да бъдат записвани на подходящи интервали от време,особено данните за степента на растеж, консумацията на храна, хематологията, анализът на урината, биохимичнитепараметри, смъртността, теглото на органите, общата патология и хистопатология на основните органи и тъкани.Резултатите трябва да се представят в детайли и доколкото това е възможно, да включват и статистическа оценка.

2.3.2. Хронична токсичностНай-общо изследванията за хронична токсичност трябва да се проведат върху два животински вида, като

единият от тях е гризач. Продуктът трябва да се администрира в дневната дажба в поне две нива на включване.Експериментите трябва да продължат поне две години при плъхове или 80 седмици при мишки. Групите животнитрябва да включват адекватен брой субекти от всеки пол. При опита винаги трябва да се включва една контролнагрупа.

За предпочитане е биологичните изследвания, посочени в точка 2.3.1, да се проведат върху малкасателитна група от животни (една група, разделена от и зависима от основната група) на подходящи интервали отвреме през време на целия експеримент и върху преживелите животни в края на експеримента.

2.3.3. КанцерогенностЗа оценката на канцерогенност трябва да се обърне особено внимание на времето на появата,

хистологичните типове на всякакви наблюдавани тумори и тяхната повторяемост. Всеки ефект върхуповторяемостта на туморите и/или повторяемостта или напредъка на заболяванията трябва да се оценяват спрепратка към контролните групи, така както е посочено в параграф 2.3. Резултатите трябва да се представят вдетайли и доколкото това е възможно, да включват и статистическа оценка.

2.4. Други изследванияИзследванията за възпроизводство трябва да обхващат поне две дъщерни поколения и могат да бъдат

комбинирани с изследвания за ембриотоксичност, включително и тератогеничност. Специално внимание трябва дасе обърне на плодовитостта, продуктивността и на наблюденията върху следродовото развитие на поколенията.Може да се предвиди и всякакъв друг метод, който е научно аргументиран и за който е вероятно да доведе доизмерими резултати (например "relay toxicity").

2.5. Експериментални условия в изследванията върху лабораторните животниДа се направи подробно описание на проведените тестове, като се уточнят следните данни:

2.5.1. Вид, подвид, щам и пол на животните, процедура на идентификация.2.5.2. Брой на тестовете и контролните групи, брой на животните във всяка от групите (броят трябва да е

достатъчно голям за статистически анализ, като се използват подходящи статистически параметри).2.5.3. Нива на включване на продукта, количествен и качествен състав на дажбата и нейния анализ.2.5.4. Общи условия за научна подкрепа през време на целия период на тестване.2.5.5. Точна продължителност на тестването и дата на проведеното изследване.2.5.6. Процент и разпределение на смъртността във всяка партида.2.5.7. Клинични симптоми и патологични изменения, възникнали по време на експеримента и момента на

появата им.3. Изследвания, свързани с околната средаСпоред естеството на възможните остатъци (субстрат, културна среда, разтворители, замърсители) в

изпражненията на целевите видове могат да бъдат изискани данни за промяната на тези остатъци в торовете,почвите, водите, както и за ефекта им върху биологичния състав на почвата, растителността и водните организми.

Раздел ІVДруги подходящи изследвания

Според естеството и условията на употреба на продукта могат да бъдат изискани данни, свързани салергията, раздразнението на кожата, очните, дихателните или хранителните лигавици, за да се направи оценка напотенциалните рискове по време на обработката на продукта и те да бъдат предотвратени.

LIV. Метод за изчисление на енергийната стойност на храните за домашни птици

1. Метод за изчисление и формула на енергийната стойностЕнергийната стойност на комбинираните храни за домашни птици трябва да бъде изчислявана в

съответствие с посочената по-долу формула въз основа на процентното съдържание на определените за анализхранителни компоненти. Тази стойност трябва да бъде изразена в мегаджаули (MJ) обменна енергия (ОЕ), отделеназот на килограм от хранителната смес:

MJ/kg ОЕ = 0,1551 Ч % суров протеин + 0,3431 Ч % сурови мазнини + 0,1669 Ч % скорбяла + 0,1301 Ч %общо захари (изразени като захароза).

2. Допустими отклонения от декларираните стойностиАко официалната проверка, предвидена в член 12, установи несъответствие (повишена или занижена

енергийна стойност на храната за животни) между резултата от проверката и декларираната енергийна стойност, седопуска минимално отклонение от 0,4 MJ/kg ОЕ.

3. Израз на резултатаСлед прилагането на гореизложената формула полученият резултат трябва да бъде отчетен до първия знак

след десетичната запетая.4. Методи за вземане на проби и анализВземането на проби от комбинираната храна и определянето на съдържанието на компонентите за анализ,

посочени в метода за изчисление, трябва да бъде извършено в съответствие с общностните методи за вземане напроби или в съответствие с методите за анализ, използвани при официалния контрол на храните за животни.

НАРЕДБА № 44 ОТ 7 ОКТОМВРИ 2002 Г. ЗА ВЗЕМАНЕ НА...

Documents