НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… ·...
TRANSCRIPT
4
�)�)�(
��.�� � ��-.��-��" ����")���* ��9�� «���" ���� ������.��'
���*��� ���!9�����,' ���"���� +��� ���� ++� � !�"��� ."���� –
"����+��� � ")< ��0 ��1 ������ +������+-'�"���� +�+�����»
/(� 0�1�� «2010-1.1-143-044-042»
��.� �� 102 ����� �'; ��-���� - 20; ��9" - 7; ��".���� �+�")0�����,'
���.���� - 28.
�������� ���: ��� ������� ���� , �������, ��������� � ��� �������,
�������������� �������, �������� ������ ������� ���� , �������� �
(����� �) ����� ������, ����� � � ��������� � ����
���� ��.�"� 6 8��+� +�����: 01.05.2012 �.
���� ����.��1 6 8��+� +�����: 18.10.2012 �.
�9=���! ��" ����* 1�"1��1 ����-�:���,* ���"��
+��� ���� ++� � – "����+���, �9"� �<>* ������.��! *���!
�� �����, �"�� ."���� � �-")�-�.
,���� �����1>�� +����� 1�"1��1 ��0��9���� +�� +�")�� ������
+������+-'�"���� +�+����� �� ����� ���"��� +��� ���� ++� �
!�"��� ."���� – "����+���.
� +����� -��+� �,+�"��1 +����� ��0��9����� �+�!�")��1 �'!�
��.���1 ���!9�������� ���"��� "����+��� (RL2) � 0����,!
'!����+��.��! �� ����! �� !� " �-")���-!,' �"���
0"���.������* �+-'�" !�"�.��* :"0, ."���� !�� ��
�-")�������1 ;��!!�� – �-+�+�� - ���� RL2 � +�+������,'
!��;��9�'.
� ������ -��+� ��9�� +��� �, +�����, ��" ����1, +��� ��
+�"�����!�� ��" ���� 0!��* �������+��!� �����,' �"���
."���� +� *���! RL2; ��0��9���� !�� �, "�1 RL2 �
+�+������,' !��;��9�'.
(����� -��+ �,+�"��1 +����� 9," +���1>� ��" ����<
.-�����")���� �"��� +��.�,' �-")�-� �+-'�"* !�"�.��* :"0,
5
."���� � �+�+���.���!- *���< RL2 ��0��9��� !�� �� ���"0�
.����, RL2, ����9�������� � +�+������,' !��;��9�'.
� ��������� -��+� +��� �� ��" ���� ����.����
���+��.����� *���1 RL2 � 8��+�!���' �� !,;�' �,���������,'
"�* GR �57Bl � .���� ��0���<>! �+������,! �+-'�"1!
!�"�.�,' :"0 ��0��9����� !�� �� ���"0� (0�"��.���*
�������� RL2.
&��"� -��+ +����� 9," +���1>� 0-.�< �"1�1 RL2 �� ����
!�����0����� � ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."����, +����*
!,;�! "� SCID ��0��9��� !�� �� ���"0� RL2.
� .����� -��+� �,+�"��1 +����� +��� �� �+�!0� 1 ���-��-�,
++� � !�� �! ����* �:�� +�"-.�, 9�" 8((����,
� -����, �+�+��0� �"��� � ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."����.
��0��9����, -�"��1 '����1 RL2.
�0-")���, ��� �� ��, � �9��0����")�,* +�� �� – +� �����"�,
��-.��-!�� .�� !����", "1 ��- ���� 3 – 5 �-���� ���-")���
�������,' ��-� (���) � ������ (��-")��� �2�.
1-��+: "��-.��-!�� .�� !����", � ��9�" ����!��,'
+������+-'�"�,' '!����+��.��' +�+�����' �'!�' '
��.���1 +� ".� ����"��.��' 0�9�"���*".
��0��9�����, !����", ��;" � �-�� "� * «�0�"��.���1 '!1»
"1 ��- ���� 3 - 5 �-���� ��� �2� �+ �")����* ".9�� "�
!�"�-"1���1 9�"��1.
2 -��+: "��-.��-!�� .�� !����", � !�� �' +�"�����!����
��" ����1 0!��* �������+��!� �"��� 8-����� +� *���!
9�"��.�� �����,' �>���".
��0��9�����, !����", ��;" � �-��, "� * «��'!1» "��� ,
��" ����1 9�+�"!���" "1 ��- ���� 4 - 5 �-���� ��� �2�
�+ �")���� !�"�-"1���1 9�"��1.
3 -��+: "��-.��-!�� .�� !����", � +����.��! 0��1�1! +�
6
�-")�������< �"��� 8-�����".
��0��9�����, ��-.��-!�� .�� !����", �+�")0-<��1 � ��!��'
«��");��� 9�'!.����� +�����-!�» "1 ��- ���� 4 �-��� ��� �2�
�+ �")���� !�"�-"1���1 9�"��1.
4 -��+: "��-.��-!�� .�� !����", � +����.��! 0��1�1! +�
� -� �+�+��0� !�� �� �� �� � 8��+�!���' �� �-")�-��'
�"��� 8-�����".
��0��9�����, ��-.��-!�� .�� !����", �+�")0-<��1 � ��!��'
«��");��� 9�'!.����� +�����-!�» "1 ��- ���� 4 �-��� ��� �2�
�+ �")���� !�"�-"1���1 9�"��1.
6 -��+: "��-.��-!�� .�� !����", � "�9��������!- +�����-!-
«��� , ������-�����1 +�� - ���� ++� ��» � ��!��' «��");���
9�'!.����� +�����-!�».
��0��9�����, ��-.��-!�� .�� !����", �+�")0-<��1 � ��!��'
«��");��� 9�'!.����� +�����-!�» "1 ��- ���� 4 �-��� ��� �2�
�+ �")���� !�"�-"1���1 9�"��1.
���! �9��0�!, � �0-")��� �,+�"��1 +����� +�"-.�, �" -<>
������"� ��/������":
- ��0��9����� �+�!�")��1 �'!� ��.���1 ���!9�������� ���"���
"����+��� (RL2) � 0����,! '!����+��.��! �� ����! ��
!� " �-")���-!,' �"��� 0"���.������* �+-'�" !�"�.��* :"0,
."����; 5���0���, .�� ��9��� +�������0 ���-���+��� +��1�"1�
� ���� �+�+���.��� *��� � ��.��� � RL2 �� �"�� MCF-7.
� ���� *��� ���-���+���� RL2 -��0,��� �� ��, .�� � -� 1
�+�+���.���� ����� � RL2 ��+����: ���1 !� -"1 * �"���
�"�0���!,' +�������0 �"��� MCF-7. RL2 � ���� -�"���
�+�+���.��� *��� (������ ����0� �+-'�" ? (���?) �� �"�� MCF-
7. ����(��� �")(� ����.�� -�"��� �+�+���.��� *��� RL2
�� �"�� MCF-7. ��.��� RL2 � ���? �,0,��� � �"���' !��;��9�-<
��+� < �����!!9������� +��� �"� !��'�� �*. 5�"-.��,
7
���, +�0��"1<� +� +�"�:�), .�� ����� 1 �+�+���.����� ����� �,
� - �-!�1 RL2, +���'� � � -.���! ��-"1����� �"��.���� �"� -
�"���, �"�0���!,' +�������0 p53.
- 5��� �� +�"�����!�� ��" ���� 0!��* �������+��!�
�����,' �"��� ."���� +� *���! RL2 9��(��!� ���,* ���"0
+�"-.��,' �0-")�����. 5���0���, .�� � �"���', ��-9������,' � RL2,
+���'� � 0!�� 8��+��� ���� �"��� A, C, B, F,
���������-<> �������� �"��.���� �"� � G2/M (�0 (8, 18 .
��-9� ). 5���0���, .�� 8��+���1 !��� 9"�� p53 -�".����1 �
�"���', ��-9������,' � RL2 � 28 . ��-9� . ��".� 8��+���
!��� 9"�� p53 ��+����: ���1 +� ��"�! �������+ ��-++, !���,
�� �-<>' 9"� �+"�������� �++�����, �������+ ������ �++�����,
�++����� ���0� ��� � !��'�� �1'
- ���" ����� .-�����")����) �"��� +��.�,' �-")�-� �+-'�"*
!�"�.��* :"0, ."���� � �+�+���.���!- *���< RL2. 5��� �
���"0 *���1 RL2 �� +��"(�� <, :0��+���9����) � -� <
�+�+��0� �"��� +��.�,' �-")�-� 0"���.�����,' �9����.�����,'
�+-'�"* 0 ����,' (�!�"��0�����,') ����* !�"�.��* :"0,
."����. ��� �! ���-���"0� +����.��* ��("-��!�� +���0���,
.�� RL2 +� ��"1� :0��+���9����) �+-'�"�,' �"��� - 0"���.������*
�9����.������* �+-'�"*, +����.�� � ���0,��� �"1�1 ��
:0��+���9����) +��"(�� < ������(��!������,' "0 ����,'"
�"��� !�"�.��* :"0, ."����.
- 5��� �� ��" ���� ����.���� ���+��.����� *���1
RL2 � 8��+�!���' �� !,;�' �,���������,' "�* GR �57Bl � .����
��0���<>! �+������,! �+-'�"1! !�"�.�,' :"0. �,1�"�� �
"�, .-�����")�, � RL2, � ��50 20 !��/!" �9���-:��
���'.-�����")��1 �+-'�"��1 "�1 - �+���!� �1 � ��50 8 !��/!".
5���0���, .�� +� � ��������! �� � � �0 � 9�" 0.5 !� +�
!����������! �� � � �0 2 !� +�+���� RL2 1�"1��1 �����.�,!.
8
��0��9����� �+�!�")��1 �'!� ���+ ���� !�"�.��* :"0, !,;*
+�+�����! RL2 in vivo. $.� :����,' RL2 � �0 20 !�/�� ��� �-���!
0 6-� ��-�����,' �=� * �,0,��� ���!�:� ����� �+-'�" � 2
��0�.
- �0-.�� �"1� RL2 �� ���� !�����0����� � ����� ��!,
!�"�.��* :"0, ."����, +����* !,;�! "� SCID. ��0��9�����
�+�!�")��1 �'!� ���+ � ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."����,
+����* !!-�� ( ��,! :����,! +�+�����! RL2 in vivo - 4 - 5
��-�����,' �� �1 +�+����� � �0 0,1 - 1,5 !�/!,;) � 500 !�"
��������, �� �1 +�+����� +��0�� 1� � � ��0 � �� �1.
- �+�!0������ ���-��-�, ++� � �� �� ����� +�"-.�, 9�"
8((����, � -����, �+�+��0� �"��� � ����� ��!, !�"�.��* :"0,
."���� !�� �! ����* �:��.
- ��0��9����, !�� , ���"0� .����, RL2, ����9�������� �
+�+������,' !��;��9�', ��"<.�<>: 1. �+����(���!��.��* ���"0
+�+����� RL2; 2. ���"0 8"����(���.���* ��!������� +�+�����
RL2; 3. ���"�.���1 �9��>���-(�0���1 '��!������(1 +�+����� RL2; 4.
�������0� 1 �!����"����* +��" ����")���� +�+��������� RL2
!�� �! MALDI TOF !���-�+����!��.
- ��0��9����� !�� �� ���"0� (0�"��.���* �������� RL2.
5���0���, .�� ��� ��� !�:� 9,�) �+�")0���� "1 ���"0�
+������+-'�"��* �������� RL2. �"�� � ����� ��!, !�"�.��*
:"0, ."���� MCF-7 !��-� 9,�) �,9���, ��� 8��+�!���")��1 !� ")
"1 ���"0� +������+-'�"��* �������� RL2.
- ��0��9����, !�� , ���"0� RL2. ��'� 1 0 ���*���
9�"��.�� ������* �-9���� RL2 ���"0� �->���-<>' !�� ��
���"0� , � ��.��� !�� � ���"0� ���!9�������� ���"���
"����+��� 9," �,9��� !�� !!9�����* (")��� .
9
- ��0 ��� ����>�� !����"�! �+,���1 -�������� "1
+�+�������* ����9���, �, "�1, �.��� ���"0�
+�+������,' ��".��� RL2.
�0-")���,, +�"-.��, +� �,+�"�� +�����, +� ����"�, �
�-�����* ��9�� ��- ��� 4�� �-��� ��� �2� "���" ����
+������+-'�"��* �������� ���!9�������� ���"��� "����+���", �
���: � +"�!��* ��9�� ��- ��� 5�� �-��� ��� �2� "��0��9���� !�� ��
+�"-.�1 �.��� ������.����� ���!9�������� ���"��� "����+���
RL2".
� �0-")��� �,+�"��1 +����� +� ����"�� � 0�>�
����� ����1 ��9��� �� ������ -.��* ��+� ��� ��� '!.��'
��-� +� �! "�+�+��0 �����,' �"��� ."����, � - �-!,*
���!9�����,! ���"���! "����+���". �.�,! �����! ����� �� ���
-���: �, �!, ����� ���,' ��9�� �� ������ -.�,' ��+�*
��� ��� '!.��' ��-� ������ 9�"��.��' ��-�.
5�"-.� 5���� RU � 2461566 "�+���9 ".�1 0"���.�����,'
�+-'�"* - !"��+��<>'". �����,: ����") �.�., ��" � �.�., �-"���
�.�., �!��� �.�., ��!� �.�., 5���+��� �.�., �'�� �.�.
10
��0)�1 �)
���6��#���7 � �����@���7 11
�������� 12
1. ������-����� +"�0! �,' �������, �� �-<>' ���,
���!9����, ���"�� "����+��� � 0�!��! �!����"���,'
�������� � ��0".�,' .���1' !�"�-", "����+���.
16
2. 5�"-.� �"��� E. coli – +�� - ���� ���,' ���!9�����,'
���"���� "����+���
31
3. ����9����, �, "� �.���� ���!9�����,' ���"���� "����+��� 35
4. ������")�,* ���"0 �"1�1 ���"���� �� :0��+���9����)
�+�+��0 �"��� MCF-7, ��+���"��,* �� �,1�"� � 99"���
���"���� ��9�" 8((����,' � -������ �9" �����,' �"���
!�"�.��* :"0,
46
5. ��0��9���� ��-.��-!�� .��' !����"�� � "�9��������!-
+�����-!- «��� , ������-�����1 +�� - ���� ++� ��» �
��!��' «��");��� 9�'!.����� +�����-!�»
50
6. ��0��9���� -�"��* '����1 RL2 85
7.�5�+�������1 ����9����, �, "� �.���� ��9�" 8((����,'
� -������ �9" �����,' �"��� !�"�.��* :"0,
93
�,�� , 95
6��"<.� 97
�+��� �+�")0�����,' ���.���� 100
5�"�:�1 103
11
�$�2 3) �4 � ��'�5) �4
MCF-7 "�1 �"��� � ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."����
A549 ��� ��!� "�����
Hp-2 8+ �!� ��1 ��� ��!� ������
��� �+-'�") !�"�.��* :"0,
��� ��� !�"�.��* :"0,
MTT 9��! 3-(4,5- !�"��0�"-2-")-2,5-����0�"1
PBS (��(����-��"��* 9-(�
5��2 +�"���"�! �,* �")
dNTP 0����-�"�0 ��(��(��
RL2, RL3
RL4
+��1�, ������! �9�0��.�1 ���!9�����,' ���"����
"����+���
12
66)0) �)
��������� � �����"� ���"� �� ��/������� ���": �������!
"1 +��� �1 ���, �,+�"�1!,' � ��!��' ( ��")��* "��*
+�����!!, «��-.�, ��-.��-+ ����.�� �� �, ����� ����*
����» �� 2009-2013, 1�"1��1 2��- �������,* �������� �� «05» �+�"1
2010 �. � 02.740.11.0715.
����"��.�� 0�9�"���1 1�"1<��1 � ��* 0 �"���,' +�.�
�!������ �0���"��� ���"�1 ����. ��:� �!������ "< * ��
0"���.�����,' �+-'�"* 1�"1��1 � ��* 0 0� �. ( ��")��* "��*
+�����!!, «5� -+�: � 9��)9� � �� �")�� 0��.!,!
0�9�"���1! (2007-2011 �� ,)», -���: ���* +�������"�!
5����")���� ����*���* � �� � 208 �� 10 !�1 2007 �� �. ��
"* +� +�����!!, «����"��1» 8��* +�����!!, �9�0��.�� ��0��9����
�� �� ����!��,' +������+-'�"�,' �� ���.
��� !�"�.��* :"0, (���) 1�"1��1 ��9�" ���+���������,!
:���! ����0�9�"���!. ��: ,* �� � ���� �������-��1 9�" 46
�,�. �"-.�� ���,' 0�9�"���* � �� . $.� +� ���� ��
0"���.�����,! �+-'�"1! !�"�.��* :"0, ��"<.�� � �91
'�-��.��� - �"� �+-'�" ("�!+8���!1 " !���8���!1), �
��.��� � "-.��* ���+*, ���!���")��* ���+* '!����+*.
�!����+1 1�"1��1 � �! 0 �"���,' !�� �� ".�1 ���,
8((�������) ���0��� ��� +� +��.��! ".�, ��� +�
���+����������! �+-'�"��! +�� ��. 5� ��� � ��.���
'!����+��.��' �� ��� �+�")0-<� �� ��1 � ��0".�,!
!�"�-"1���-9�"��.��! !'��0!�! *���1: �"�"�-<>
�� ��1, ���!��9�"�,, ��9���, �9��0����1 ����� "�1,
+������+-'�"�, ���9���, ������, [1].
3")< �����1>�� +����� 1�"1��1 ��0��9���� +�� +�")�� ������
+������+-'�"���� +�+����� �� ����� ���!9�������� ���"���
+��� ���� ++� � !�"��� ."���� – "����+���.
13
$����+�� - +��� �,* ++� , (���!�� ��++�-��0�� ."����,
�9"� �<>* ������.��! *���! �� �����, �"�� ."���� �
�-")�-� [2, 3]. � �����1>!- ��!� ��! +�"-.� ���!9�����,*
���"�� "����+��� RL2, ���0��� �+�+���.��� *��� 8���� ���"��� ��
�"�� � ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."���� MCF-7 [4]. 5�"-.��,
���, +�0��"" � "��) �,�� , .�� "����+�� �� ���!9�����,*
���"�� RL2 !��-� 1�"1�)�1 +��+�����* ������* "1 ��0 ��1 ������
�� ���� ���+ 0"���.�����,' �����9��0����* !�"�.��* :"0,
."����.
� �����1> ��!1 9"���,' +����������,' +�+������ �� �,��
���*� !�"�. ���! ����, +� "���!, +�+����, �.�) ����, .��
� �:��� ' +�!�� � +����.���! 0 �����'����. �1 ��-+�,'
(��!� ��.��' ��!+��* � ���� 0� �-9:�! � -� +����1��,* +���
+��� �")�,' +����������,' "������. $<9�* ���,* +�+���� ��
���+��!, ����-����, +�!->���� �� +��0�� �"1!.
� �0-")��� �,+�"��1 +����� ��0��9����� �+�!�")��1 �'!�
��.���1 ���!9�������� ���"��� "����+��� (RL2) � 0����,!
'!����+��.��! �� ����! �� !� " �-")���-!,' �"���
0"���.������* �+-'�" !�"�.��* :"0, ."����; +��� ��
+�"�����!�� ��" ���� 0!��* �������+��!� �����,' �"���
."���� +� *���! RL2; ��" ����� .-�����")����) �"���
+��.�,' �-")�-� �+-'�"* !�"�.��* :"0, ."���� � �+�+���.���!-
*���< RL2; +��� �� ��" ���� ����.���� ���+��.�����
*���1 RL2 � 8��+�!���' �� !,;�' �,���������,' "�* GR �57Bl
� .���� ��0���<>! �+������,! �+-'�"1! !�"�.�,' :"0; 0-.��
�"1� RL2 �� ���� !�����0����� � ����� ��!, !�"�.��* :"0,
."����, +����* !,;�! "� SCID; �+�!0������ ���-��-�, ++� �
+�"-.� �� �� ����� 9�" 8((����,' � -������ �+�+��0� �"���
� ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."���� !�� �! ����* �:��.
�0-")���, ��� �� ��, � �9��0����")�,* +�� ��.
14
5� �����"��, +� ��"0� +����� ��-.��-!�� .�� !����",
�+�")0-<��1 � �-���' "� * «�0�"��.���1 '!1», «��'!1»
"��� , ��" ����1 9�+�"!���" "1 ��- ���� 3 – 5 �-����
���-")��� �������,' ��-� (���) � ������ (��-")��� �2�
�+ �")����* «!�"�-"1���1 9�"��1» «".9�� "�", � ���: +�
+��� � +����.��' 0��1�* "��");��� 9�'!.����� +�����-!�"
��- ���� 4�� �-��� ��� +� �+ �")���� «!�"�-"1���1 9�"��1».
5��1�� � 0�>� ����� 1 ��!�� �.�. "�+�+��0 �����,' �"���
."����, � - �-!,* ���!9�����,! ���"���! "����+���" ��
������ -.��* ��+� ��� ��� '!.��' ��-�.
�.�,! �����! ����� �� ��� -���: �� �!� �����
5���+��� �.�. "5�"-.� ���*���� � -������ �+�+��0� �����,' �"���
�� ����� ++� � !�"��� ."���� "����+���" �� ������ ��+�
��� ��� '!.��' ��-� �!� ����� �'��� �.�. "$����+�� -
+��� �,* � -���� �+�+��0� �����,' �"���" �� ������ ��+�
������ 9�"��.��' ��-�.
5� �,+�"�� ��9�� .������ -��+� �;�, �" -<> 0� �.:
1. 5��� �� ������-����� +"�0! �,' �������, �� �-<>' ���,
���!9����, ���"�� "����+��� � 0�!��! �!����"���,' �������� �
��0".�,' .���1' !�"�-", "����+���.
2. 5�"-.�, �"�� E.coli – +�� - ��, ���,' ���!9�����,' ���"����
"����+���.
3. 5��� �� ����9����, �, "� �.���� ���!9�����,' ���"����
"����+���.
4. 5��� � ������")�,* ���"0 �"1�1 ���"���� �� :0��+���9����)
�+�+��0 �"��� MCF-7, ��+���"��,* �� �,1�"� � 99"��� ���"����
��9�" 8((����,' � -������ �9" �����,' �"��� !�"�.��* :"0,.
5. ��0��9����, ��-.��-!�� .�� !����", � "�9��������!-
+�����-!- «��� , ������-�����1 +�� - ���� ++� ��» � ��!��'
«��");��� 9�'!.����� +�����-!�»
15
6. ��0��9����, -�"��1 '����1 RL2
7. 5��� �� +�+�������1 ����9����, �, "� �.���� ��9�"
8((����,' � -������ �9" �����,' �"��� !�"�.��* :"0,
16
1 '�������������� +��/���"� ��������, ������7�� ���"�
�����������"� ������� �����+���� � /������� ������������"�
�������� � ��/����"� ������ �������" �����+����
5� ��" ���� ������.��' (������� !�"��� ."���� ��!
9," �, "� ++� , � - �-<>* �+�+���.��-< �9") �����,' �"���
� ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."���� MCF-7. ��� �! MALDI-TOF
!���-�+����!�� !, -������", .�� ���,* ++� – «"����+��» -
!� !�"�-"1��-< !���- 8,6 ��� 1�"1��1 (���!���! A-��0��
."����. �����,��1�) �� ���,' � ���-��-� A-��0�� !�"�-"1���*
!��� "����+���, 9,"� ����.���� �� ��9�" ���1���1 +��.��1
���-��-�� [2, 3].
�"1 ��" ����1 +������+-'�"��* �������� "����+��� !, +�"-."
�� ����-�:���,* ���"�� RL2, �����,* �,0,��� �9") �����,' �"���
��0".���� �������� +���'�: �1 � �-")�-� (A549, Hep2), � - �-�
�+�+���.��-< �9") �"��� MCF-7 � �"1� �� :0��+���9����)
!0�'!�")�,' ����"��,' �"��� :����* ���� ."���� MCS �"���
+��.��* �-")�-�, !�"�.��* :"0, ."���� [4, 5].
�"1 -��.��1 +��.��* ���-��-�, +��� � N-��� ��* ���"0
�!����"����* +��" ����")���� "����+���. 5�"-.��, ���, �
���-��-� +������+-'�"�,' ���*����' "����+���, ����,��<�
��0!�:����) ��0 ��1 ���,' 9�" 8((����,' ���!9�����,' ���"����
8���� 9"��.
1.1 &�������� ��������� 0 ', ������7�� ������������"� �������
��+������� RL3 � RL4
� '� �,+�"��1 ����* ��9��, 9," +�"-.�, ���!9�����,
++� ,, �!����"����1 +��" ����")����) �����,' ��9�" ��.��
���������-� +��.��* +��" ����")���� 9"�� "����+��� ((���!���
��++�-��0�� ."����). �� ����� �0-")����� ���������1 N-��� �
17
"����+���, �, "����� 0 :������ !�"���, 9," �,9���, �
�!����"���, +��" ����")����, ��9�" ��.�� ���������-<>
+��" ����")���� +��� ���� "����+��� (��-��� 1).
MKSFLLVVNALALTLPFLAVEVQNQKQPACHENDERPFYQKTAPYVPM
YYVPNSYPYYGTNLYQRRPAIAINNPYVPRTYYANPAVVRPHAQIPQRQYLP
NSHPPTVVRRPNLHPSFIAIPPKKIQDKIIIPTINTIATVEPT
$
NQKQPACHENDERPFYQKTAPYVPMYYVPNSYPYYGTNLYQRRPAIAINNP
YVPRTYYANPAVVRPHAQIPQRQYLPNSHPPTVVRRPNLHPSFIAIPPKKIQ
DKIIIPTI
6
HENDERPFYQKTAPYVPMYYVPNSYPYYGTNLYQRRPAIAINNPYVPR
TYYANPAVVRPHAQIPQRQYLPNS
8
YYVPNSYPYYGTNLYQRRPAIAINNPYVPRTYYANPAVVRPHAQIPQR
QYLPNSHPPTVVRRPNLHPSFIAIPP
������� 1. �!����"���, +��" ����")���� 9"�� "����+��� (��++�-��0��)
."���� (�) �� (���!����: (���!�� � 2 (�), (���!�� � 3 (�) (���!�� � 4 (2).
�� ����� �-�"�� ��* +��" ����")���� 9"�� ��++�-��0��
."���� 9," ����.���, +��*!�, "1 +�"-.�1 (���!���� ���,
�� �-<>' (���!��, A-��0�� ."���� � 3 � 4. �"1 +�"-.�1
(���!��� � 3:
+����� +������ 5'TATAGGATCCATGCATGAGAATGATGAA (��,!
���! �, "� ��*� 8� ��-�"�0, ����� BamHI, +� .�����!
18
�, "� �� ��, �� �-<>* !����, �� ��,* � ������-� < +��"
�-�"�� ��* +��" ����")����, �� �-<>* ;��) �������� ��� ��);
������"� +������ 5'TATAAAGCTTTTAGCTATTTGGCAGGTAT
(��,! ���! �, "� ��*� 8� ��-�"�0, ����� Hind III, �-����!
�, "� �� ��,* ��!��-<>* �� ��).
�"1 +�"-.�1 (���!��� � 4 9," ���0�����, �" -<>
+��*!�,:
+����� +������ 5'TATAGGATCCATGTATTATGTGCCAAAT (��,!
���! �, "� ��*� 8� ��-�"�0, ����� BamHI, +� .�����!
�, "� �� ��, �� �-<>* !����, �� ��,* � ������-� < +��"
�-�"�� ��* +��" ����")����, �� �-<>* ;��) �������� ��� ��);
������"� +������ 5'TATAAAGCTTTTATGGGGGGATGGCAAT (��,!
���! �, "� ��*� 8� ��-�"�0, ����� Hind III, �-����! �, "�
�� ��,* ��!��-<>* �� ��).
�"���-�"�� �, +��*!�, 9," ���0�����, �� ����!��.���!
���0���� «ABI-394» («Applied Biosystems», �/�) � �����-�
'!.���* 9�"�� (-� �!���")��* ! �, �� ���
(�����9���).
�"1 +�"-.�1 (���!���� ���, �� �-<>' ���"�� "����+��� RL3
RL4, +���� " 53� � 50 !�" �!� � 0,2 !" ���������,'
!���+��9���' («Applied Biosystems», �/�). ��: �1 ��� ����1 �!�)
�� �:�"� �" -<> ��!+����,: 9-(� "1 53� (�-(� "1 53� (10'):
750 !� ���-HCl (pH 8.8 +� 25°�), 200 !� (NH4)2SO4, 10 !� MgCl2, 0.1 %
Tween 20), dNTP (200 !�� ��: ���), 6 .�. Taq ��� +�"!��0, («�����»,
����� �� ���), 0,3 !�! ��: ��� +��*!�� 10 �� ���-!��� ,. �
��.��� !��� , �+�")0���" +"�0! �-< ��� pGSDI/FK2, ������1
�� �:�"� ������- FK2, �� �-<>-< (���!�� A-��0�� RL2. � 53�
19
�+�")0���" Taq ���-+�"!��0-, +�0��"1<>-< ���0�����) +�� -��, �
.������* !-�� * ���"� 1 x 10-4
�;9�� / �-�"�� .
��� +���� " � �!+"(����� «Mastercycler gradient»
(«Eppendorf», �/�).
9������ +�������� &,�:
+� ����")��1 ���-�� 1 – 5 !�-� +� 95�C;
30 �"�� – 15 ��-� +� 95�C, 30 ��-� +� 58
�C, 20 ��-� +� 72
�C;
0��"<.�")��1 ��� 1 – 5 !�-� +� 72�C.
5�� -��, �!+"(�� +����: �" 8�"��,! �+���!, "1 8���� �
�9=!- ��� ����* �!� �9��"1" �� �9=!� 8����"� 1/10 �9=!� 3�
NaOAc, pH 5.2. ���: � +�� -���� �!+"(�� +���� " +� -20�C �
�.� 1 .���. �!+"���, 8"<����" 0 1,5% �����0���� �"1 � +�!�>)<
��9��� «GenElute Gel Extraction Kit» («Sigma», �/�). �� �!+"���, 9,"
�'������0����, 8"����(���.�� � 1,5% �����0��! �" � 9-(� TAE
� 9��!��,! 8� ! � ��� ���� 0,2 !��/!".
� �0-")��� +��� ���* 53� 9," +�"-.�, �!+"���,
+� ���0����* "�, (��-��� 2). �"1 (���!���� � 3 � 4 9,"
+�"-.�, �!+"���, "��* ���"� 245 +.�.
20
�
�
������� 2. B"����(�����!!� �!+"����� (���!���� � 3 � 4, +�"-.��,' � 53�
+� �+�")0���� ��� pGSDI/RF2. ����:�: 1 - ���-!����,, "�� (���!���� � +.�.
+�� �� �"��, 2 – +�� -�� �!+"(�� (���!��� � 3, 3 - +�� -�� �!+"(��
(���!��� � 4.
�
1.2 '�������������� +��/���"� 0 ', ����+������7�� -��+������
��������� 0 ', ������7�� RL3 � RL4
�"1 +�"-.�1 ���!9�����,' +"�0! 9,"� �,9���� �������1
+"�0! � pQE30 («QIAGEN», Netherlands) (��-��� 3). B��� ����� �� �:�
�5 +��!���� lac �+������, 8"!��,, � ���: +��" ����")����),
�� �-<>-< ;��) ��� ���,' �������� �� N-��� . 5�"��� ���,*
�!� +�0��"1� +���� �) �, "� ���!9�������� +�"++� � �
+�!�>)< �((���* '��!������( �� Ni-NTA �(���0.
21
5� "�:���1 �'!� ������-�����1 +�0��"1� ��->���"1�)
�������� (���!���� ��� 9"�� ��++�-��0�� ."���� +� +��!�����!
���-+�"!��0, (��� �5.
�"1 �����*� (���!���� ��� 9"�� ��++�-��0�� ."����
������-< +"�0! - pQE30 +��� " � "�*�-< (��!- � ��"0�!
8� ��-�"�0�! ����� BamHI HindIII. ����� < ������ pQE30
+���� " 8� ��-�"�0�! ����� BamHI HindIII (“Fermentas”,
Lithuania) +� ���� �����!- +������"-: �� 50 !�" ��� ����* �!� 9��" 5
!�" ����� ������ 9-(�� “TangoTM” (10'), 2 !�� +"�0! ��* ���, 1 !�"
BamHI (10 /!�"), 2 !�" HindIII (10 /!�") � �� �:�>-< �-�"�0
���")�-< �� -. ��!+����, ��� +�!;��" !1��!
++������!, �9���,��" ��+" �� ����� +��9�� +-�! !+-")�����
���(-������1. ��� ���-< �!�) ��-9����" +� 37�� � �.� 3
.����. ���0- +��" ��-9� ��� ���-< �!�) �����" �� 1,5%
�����0�,* �") "1 +��� �1 8"����(��0�. $�*�-< (��!- +"�0! ,
�, "1" 0 1,5% �����0���� �"1 � +�!�>)< ��9��� «GenElute Gel Extraction
Kit» («Sigma», �/�). �"1 8���� 0 �����0���� �"1 �,�0�" "�*�-<
(��!- +"�0! ��* ���, �0�;��" ��-9����" � ������� "1
��"<9"0� �"1 (� +��+�� 300 !�" �������� �� 100 !� �"1) �
��!�;*�� +� �!+���-� 50 - 60�� � �.� 10 !�-� " � +�"����
��������1 �"1. � +�"-.���!- �������- �9��"1" 100% 0�+��+���" �
�9=! �����! ��- �"1, +�!;��" � ��!������� �����1�1
�����" �� ��"���- “GenElute Binding Column G”, +� ����")��
+��!,�-< 500 !�" 9-(�� "1 +� ������ ��"���. 3���(-�����" 1
!�-�- +� 13,000 ' g. 6��! +"�0! �-< ���, 09���")�� ��10��;-<�1 �
���9���!, +��!,��" �� +�!�* 700 !�" 9-(�� "1 ��!,�� ��"���
���(-�����" 1 !�-�- +� 12,000 – 16,000 ' g. ������"���-
+����" � ���-< 2 !" +��9��- +������� ���(-�����" "1
+�"���� - �"�1 8����"�. 6��! !�����"���- +����" � ���-< 2 !"
+��9��-, �����" �� ��� !!9���, 50 !�" 9-(�� "1 8"<
22
(���!���� ���, �������� � �!+���-�, 65��, ��-9����" � �.�
1 !�-�,. $�*�-< (��!- +"�0! ��* ��� 8"<����"
���(-������! � �.� 1 !�-�, +� 12,000 – 16,000 ' g.
�����
�������
AMPr
T5 promoter / lac operator element
RBS
pBR322 origin
���������
����� ��
����� �
�� � ���
�� �� ��
��� �����
��� �����
��� ���
��� �����
��� �������
��� ��� ���
��� �������
�
������� 3. �'!� �������* +"�0! , pQE30.
����� < �-�"�� �,' +��" ����")����*,
�!+"( ������,' "1 �"�������1 � +"�0! - pQE30, ���: +���� "
8� ��-�"�0�! ����� BamHI HindIII (“Fermentas”, Lithuania) �
��� ����! �9=! 30 !�", �� �:�>! 0,4 !�� 53� +�� -���, 3 !�"
����� ������ 9-(�� “TangoTM” ( �1���������),1 !�" BamHI (10
/!�"), 2!�" HindIII (10 /!�") � �� �:�>-< �-�"�0 ���")�-< �� -.
��� ���-< �!�) ���-����� +�!;��" ��-9����" +� 37�� �
�.� 3 .����, 0��! +�� -��, ����� +����: �" 8�"��,!
23
�+���!. �"1 8���� � �9=!- ��� ����* �!� �9��"1" �� �9=!�
8����"� 1/10 �9=!� 3� NaOAc, pH 5.2. ���: � +�� -����
�!+"(�� +���� " +� -20�C � �.� 20 !�-�. �9��9�����,
�������0�! �-�"�� �, +��" ����")���� ���(-�����" 5 !�-�
+� 16,000 ' g, 8�"��,* �+�� - �"1", � ��� � +� �-;��" +� 30�� �
�.� 10 !�-� ��-�+� ����" � 10 !�" �� ,, � �� �:�>*
�-�"�0.
���!9�����, +"�0! �, ��� +�"-.�" �������0�� "��0�,!
!�� �! � �+�")0����! ���� ����,' +�� -�. $������ +���� " �
�� ����* �!� �9=!�! 20 !�", �� �:�>* 2 !�" 9-(�� "1
"������1 (10'), 10 . T4 ��� "��0, (“Fermentas”, Lithuania), 250 ��
������ pQE30, �9��9�������� �������0�!, 50 �� 53� +�� -���,
�9��9�������� �������0�!, ���")�-< �� -, � �� �:�>-< �-�"�0.
��!+����, ��� +�!;��" !1��! ++������!, �9���,��"
��+" �� ����� +��9�� +-�! !+-")����� ���(-������1.
��� ���-< �!�) ��-9����" +� 4�� � �.� 16 .����
5� 10 !�" "��0�,' �!�* �+�")0���" "1 �����(��!�
��!+����,' �"��� E. coli Top10.
�"1 +������"�1 ��!+����,' �"��� E.coli (;��!! Top10)
� � -�")�-< ��"��<, �,��>��-< �� .�;� 5�� �� ����0������*
�� , 0����" � 25 !" SOB-9-")��� (�� 100 !": 2 � ��+����, 0,5 �
��::���� 8��������, 0,65 � '"�� � ����1, 0,13 � '"�� � ��"1).
�-�+�0< �"��� ��-9����" +� 20�C � �+�.���* +"������ D600 =
0,3 +� �������* �8�� , 0��! �"�� ���(-�����" +� 3,000 x g
+� 4�C � �.� 10 !�-�. �"�� ���-����� ��-�+� ����" � 8 !"
" 1���� 9-(�� CCMB80 (10 !� KOAc pH 7.0, 80 !� CaCl2·2H2O, 20 !�
MnCl2·4H2O, 10 !� MgCl2·6H2O, 10% �" ��, pH 6.4) ��-9����" ��
") - � �.� 20 !�-�. �"�� ���: �" ���(-������! +� 3,000 '
g +� 4�C � �.� 10 !�-�. �-+������� �>��")�� - �"1". ��� ��
��-�+� ����" � 1 !" " 1���� 9-(�� CCMB80, ��-9����" �� ") - �
24
�.� 20 !�-�, +��" .�� �"����, +� 50 !�" 0�!���:��" '���"
+� -80 �C
�����(��!� < ��!+����,' �"��� E.coli (� �9=! 50 !�")
+���� " +��" ��0!���:���1 ' �� ") -. � �"���! �9��"1" 10 !�"
"��0��* �!�, �� �:�>* +"�0! �-< ���, ���-����� +�!;��"
��-9����" 30 !�-� �� ") -. 5��9�� +�!>�" � ��!����� �
�!+���-��* 42�C �� 1 !�-�- (�+"���* ;��), 0��! � +��9�� �9��"1"
250 !�" SOC-9-")���, ��-9����" � ;*�� � �.� 1 .��� +� 37�C.
5��" 8���� �"�� ������" �� ��� -< �� -, �� �:�>-< 100 !��/!"
�!+ ""��. 5��" �����(��!� ��!+����,' �"��� E.coli ��9��"
�"��, � (���+�! Lac—
.
�"1 �, "�1 +"�0! ��* ��� �+�")0���" «��9�� "1 �, "�1
+"�0! ��* ���» («���"��», ����1). �� � -�")�-< ��"��<
�����(��!������,' �"��� E.coli 0����" � 5 !" LB-9-")��� �
�!+ ""��! ����" ��.) +� 37�C. ������")�, �"�� ���: �" 0 5
!" �-")�-�, ���(-������! � +��9�� 1,5 !" +� 13,000 ' g � �.�
1 !�-�,. ��� �� �"��� ��-�+� ����" � 200 !�" 9-(�� R "1
�, "�1 +"�0! ��* ���, �� �:�>�� 0,1 !�/!" ����0, �, 0��!
�9��"1" 200 !�" 9-(�� L ������:�� +�!;��", .��9, "0�����)
�"��. 5��" 8���� � ������� �9��"1" 200 !�" 9-(�� N "1 �, "�1
+"�0! ��* ��� �>��")�� +�!;��" � �9��0����1 9"��� ��� ��.
5�"-.��-< �-�+�0< ���(-�����" +� 13,000 ' g 5 !�-�,
�-+������� ������:�� ��9��" +����" � !�����"���-,
+�!>��-< � 2 !" +��9��-. 5��9��- � !�����"����* ���(-�����"
1 !�-�- +� 13,000 ' g. 6��! +"�0! �-< ���, 09���")�� ��10��;-<�1
� ���9���!, +��!,��" �� +�!�* 700 !�" 9-(�� W, �� �:�>�� 80%
8����"�, ��"���- ���(-�����" 1 !�-�- +� 13,000 ' g.
������"���- +����" � ���-< 1,5 !" +��9��-, �����" �� ���
!!9���, 50 !�" 9-(�� �, �� �:�>�� 10 !� ���-HCl, �� 8.5,
25
��-9����" � �.� 1 !�-�,. 5"�0! �-< ��� 8"<����"
���(-������! � �.� 1 !�-�, +� 13,000 ' g.
��". ������� (���!���� ��� 9"�� ��++�-��0�� ."���� �
+�"-.��,' +�+�����' ��� ���!9�����,' +"�0! �+� "1" �
+�!�>)< ����� ������ ���"0� � �+�")0����! 8� ��-�"�0
����� BamHI HindIII. 2 ��"0 �.>��,' ������� (+� 4 !�" �
��� ���� * 0,3 !�/!") +���� " �������0�! BamHI HindIII
(“Fermentas”, Lithuania) +� ���� �����!- +������"-: �� 20 !�" ��� ����*
�!� 9��" 2 !�" ����� ������ 9-(�� “TangoTM” (10'), �� 0,5 � 1 !��
+"�0! ��* ���, 1 !�" BamHI (10 /!�"), 2 !�" HindIII (10 /!�") �
�� �:�>-< �-�"�0 �� -. ��� ���-< �!�) ���-����� +�!;��"
��-9����" +� 37�� � �.� 3 .����. �"1 +��� �1 8"����(��0� 10
!�" ��� ����* �!� �����" �� 1,5% �����0�,* �") (��-��� 4).
�
������� 4. B"����(�����!!, +�� -���� ����� ������ ���"0� (�!���! BamHI HindIII
+"�0! , �� �:�>' (���!��, � 3 � 4 ��� ��++�-��0�� ."����. �. ����:�: � - ���-
!����,, "�� (���!���� � +.�. +�� �� �"��. 1 - pFK3, 2 - 7 - pFK3, �, "��, 0 ��0�,'
�"���� E. coli � ��"0�����, (�!���! BamHI HindIII, �. ����:�: � - ���-!����,,
"�� (���!���� � +.�. +�� �� �"��. 1 - pFK4, 2 - 7 - pFK4, �, "��, 0 ��0�,' �"���� E.
coli � ��"0�����, (�!���! BamHI HindIII
26
5���")����) �����*� (���!���� ��� 9"�� ��++�-��0�� ."����
� ���!9�����, ������-� +� ���: �" ���������!.
�"1 8���� �-�"�� �, +��" ����")���� ���, ���������-<>
�������! (���!���� ��� 9"�� ��++�-��0�� ."���� � 3 � 4
�!+"( ����" � �+�")0����! ���!9�����,' +"�0! pFK3 pFK4
�"���-�"�� �,' +��*!���, ("����-<> ������-:
+����� +������ - 5'AACTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACG
������"� +������ 5' TATCAACAGGAGTCCAAGCTCAGCTAATTAAGCT
5�� -��, �!+"(�� �+�")0���" "1 �+� "�1 �-�"�� �,'
+��" ����")����* (���!���� ��� 9"�� ��++�-��0�� ."���� � 3 �
4 (��-��� 5).
��� < ���������1 +���� " � �+�")0����! BigDye
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, USA) �
+��" -<>! ���: �! +�� -���� ��� ���������1 8�"��,!
�+���!. �"1 8���� � ��: �!- �9��0 - �9��"1" 80 !�" 75% 8�"�����
�+���, +�!;��" �����"1" +� ��!�����* �!+���-� �� 15 !�-�
"1 ���: �1 +�� -���� �!+"(�� , 0��! ���(-�����" +�
16,000 ' g 20 !�-�. �>��")�� ��9��" �-+�������,, �����, �� �:��
� ��"<.�;�1 ��!�����, �������+ . ��� � +��!,��" 200 !�"
70% 8�"����� �+��� ����) ���(-�����" 10 !�-� +� 16,000 ' g.
5��" - �"�1 �-+��������� �9��0 , �,�-;��" � ���--!��*
���(-� 15 !�-� +� 30 �
C. ��0 "� �.>��,' +�� -���� ���
���������1 ��->���"1" �� ����!��.���! �������� ABI 310
Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). ���"0 ��" -!,'
�-�"�� �,' +��" ����")����* +���� " � +�!�>)< ��!+)<����*
+�����!!, «Chromas Version 2.24». ��: ,* �-�"�� +��.�,��"�1 +�
�-! +1!.
5� �0-")����! ���������1 �,9���, +"�0! �, ���!9�����,
���, �� �:�> +���")�-< ���-��-�- (���!���� ��� 9"�� ��++�-
��0�� ."���� � ��������� � 9�0�* ���,' GenBank (��-��� 6).
27
�
�
������� 5. B"����(�����!!, +�� -���� �!+"(�� �-�"�� �,'
+��" ����")����*, ���������-<>' (���!���! � 3 � 4 ��� 9"�� ��++�-��0�� ."����. � ��.��� !���.�,' ��� �+�")0���"�) pFK3 pFK4, �, "��, 0 � � -�")�,' �"���� �"��� E. coli. �"1 �!+"(�� �+�")0���"�) +��*!�,,
��!+"!�����, �� �-<>* + pQE30. �. ����:�: � - ���-!����,, "��
(���!���� � +.�. +�� �� �"��, � – ������"), � �� �:�>* +"�0! �-< ���, 1 – 9
– +�� -��, ��� �!+"(�� �-�"�� �,' +��" ����")����*,
���������-<>' (���!��- � 4 ��� 9"�� ��++�-��0�� ."����. �. ����:�: � -
���-!����,, "�� (���!���� � +.�. +�� �� �"��, 1 – 8 – +�� -��, ���
�!+"(�� �-�"�� �,' +��" ����")����*, ���������-<>' (���!��- � 3
��� 9"�� ��++�-��0�� ."����.
���! �9��0�!, 9," +�"-.�, ���!9�����, +"�0! , pFK3
pFK4, �� �:�> +��" ����")���� ���, �� �-<> (���!�� � 3
(���!�� � 4 ��++�-��0�� ."����, ������������. ����,
���!9�����,' +"�0! � "�,! +��" ����")����1! +�� �, ��
��-�� 7. �!����"���,* ������ 9"���, +�� - �-!,' �9!
������-� 1! � E. coli, +� ����"� �� ��-�� 8.
�������� 3 �
M R G S H H H H H H G S M H
1 ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCC ATG CAT
E N D E R P F Y Q K T A P Y
43 GAG AAT GAT GAA AGA CCA TTC TAT CAG AAA ACA GCT CCA TAT
V P M Y Y V P N S Y P Y Y G
85 GTC CCA ATG TAT TAT GTG CCA AAT AGC TAT CCT TAT TAT GGA
T N L Y Q R R P A I A I N N
127 ACC AAT TTG TAC CAA CGT AGA CCA GCT ATA GCA ATT AAT AAT
P Y V P R T Y Y A N P A V V
169 CCA TAT GTG CCT CGC ACA TAT TAT GCA AAC CCA GCT GTA GTT
R P H A Q I P Q R Q Y L P N
28
211 AGG CCA CAT GCC CAA ATT CCT CAG CGG CAA TAC CTG CCA AAT
S * K L N * L S L D S C *
253 AGC TAA AAG CTT AAT TAG CTG AGC TTG GAC TCC TGT TGA TA
�������� 4
M R G S H H H H H H G S M Y
1 ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCC ATG TAT
Y V P N S Y P Y Y G T N L Y
43 TAT GTG CCA AAT AGC TAT CCT TAT TAT GGA ACC AAT TTG TAC
Q R R P A I A I N N P Y V P
85 CAA CGT AGA CCA GCT ATA GCA ATT AAT AAT CCA TAT GTG CCT
R T Y Y A N P A V V R P H A
127 CGC ACA TAT TAT GCA AAC CCA GCT GTA GTT AGG CCA CAT GCC
Q I P Q R Q Y L P N S H P P
169 CAA ATT CCT CAG CGG CAA TAC CTG CCA AAT AGC CAC CCA CCC
T V V R R P N L H P S F I A
211 ACT GTG GTA CGT CGC CCA AAC CTG CAT CCA TCA TTT ATT GCC
I P P * K L N * L S L D S C
253 ATC CCC CCA TAA AAG CTT AAT TAG CTG AGC TTG GAC TCC TGT
*
295 TGA TA
������� 6. �-�"�� �, +��" ����")���� ����, �� �-<>' (���!�� � 3
(���!�� � 4 ��++�-��0�� ."����, ���������-<> ! �!����"���, +��" ����")����. 5� .�����! ��!.� ����������,* (���!�� +"�0! ��*
���, ("����-<>* ������-.
�
�
������� 7. ����, ���!9�����,' +"�0! , �� �:�>' +��" ����")���� ���,
�� �-<> (���!�� � 3 pFK3 (�) " (���!�� � 4 pFK4 (�) ��++�-��0�� ."����.
29
�������� :3 (��������!�� pFK3):
�"�� 86 aa
��"�-"1���1
!���� 10233.70 m.w.
1 !������!! = 97.716 pMoles
��"1��,*
��8(( ��
8�����
15360
1 A[280]
���������-�
0.67 mg/ml
A[280] of 1 mg/ml 1.50 AU
�0�8"���.���1
��.��
9.64
6��1 +� pH 7 5.45
����������(�) ���� ���� % �� ���� % �� ���
A Ala 6 4.54 6.98
C Cys 0 0.00 0.00
D Asp 1 1.13 1.16
E Glu 2 2.50 2.33
F Phe 1 1.40 1.16
G Gly 3 1.91 3.49
H His 8 10.55 9.30
I Ile 3 3.34 3.49
K Lys 1 1.24 1.16
L Leu 2 2.23 2.33
M Met 3 3.80 3.49
N Asn 7 7.86 8.14
P Pro 12 11.74 13.95
Q Gln 5 6.21 5.81
R Arg 7 10.36 8.14
S Ser 4 3.57 4.65
T Thr 3 3.04 3.49
V Val 5 4.98 5.81
W Trp 0 0.00 0.00
Y Tyr 12 18.47 13.95
�������� :4 (��������!�� pFK4):
�"�� 88 aa
��"�-"1��,*
��
10257.10 m.w.
30
1 !������!! = 97.493 pMoles
��"1��,*
��8(( ��
8�����
12800
1 A[280]
���������-�
0.80 mg/ml
A[280] of 1 mg/ml 1.25 AU
�0�8"���.���1
��.��
10.33
6��1 +� pH 7 8.53
����������(�) ���� ���� % �� ���� % �� ���
A Ala 6 4.52 6.82
C Cys 0 0.00 0.00
D Asp 0 0.00 0.00
E Glu 0 0.00 0.00
F Phe 1 1.40 1.14
G Gly 3 1.90 3.41
H His 9 11.81 10.23
I Ile 5 5.55 5.68
K Lys 0 0.00 0.00
L Leu 3 3.33 3.41
M Met 2 2.52 2.27
N Asn 7 7.82 7.95
P Pro 15 14.60 17.05
Q Gln 4 4.94 4.55
R Arg 8 11.79 9.09
S Ser 5 4.44 5.68
T Thr 3 3.02 3.41
V Val 6 5.94 6.82
W Trp 0 0.00 0.00
Y Tyr 10 15.31 11.36
������� 8. �!����"���,* ������ ���!9�����,' ���"���� "�+������ RL3 RL4,
�� �-!, (���!���! � 3 � 4, ������������.
31
2 &�������� ������ E.coli – +���!����� ���"� ������������"�
�������� �����+����
/��!!,-+�� - ��, ���!9�����,' ���"���� "����+��� ��0 ���"
�� ����� ;��!!� E.coli BL21(DE3). �0�����, .�� "1 8��+���
���!9�����,' 9"��� � ������' pQE («QIAGEN», Netherlands)
�+�")0-��1 (����,* +��!���� T5, �����,* ��'� ��1 +� ������"! �-'
+��" ����")����* lac �+������. 5��!���� T5 -0����1 ��� +�"!��0�*
E. coli, ������1 ������-���� 8��+����-��1 � 9�����")�,' �"���'.
5� �9��"� � �-")�-��")�-< �� - � -����� lac-�+���� IPTG
+���'� � ����9�: � +����* �+�������* +��" ����")���� �� Lac
�+������ ���-+�"!��0� (��� �5 �9�+.��� �,����8((����-<
�������+ < �� �+ (.����� +��!�����, .�� +��� � � �,����!-
-����< +�� -� "�,' 9"���.
�"1 +�"-.�1 ��!+����,' �"��� E.coli (;��!! BL21(DE3))
� � -�")�-< ��"��<, �,��>��-< �� .�;� 5�� �� ����0������*
�� , 0����" � 5 !" YTx2-9-")��� (�� 1 ": 16 � ��+����, 10 � ��::����
8��������, 5 � '"�� � ����1, �� 7,5) �����"1" � ;*�� �� ��.) +�
37�C. ��.�-< �-")�-�- ������" � 5 !" YTx2-9-")��� � ������;� 1 :
100 ��-9����" � �8�� * +� 37�C 160 �9/!� � �+�.���*
+"������ D600 = 0,6, +��" .�� �"�� +�!>�" �� " �� 30 !�-�.
�-�+�0< �"��� +����" � 2 !" +��9�� ���(-�����" 2
!�-�, +� 3,500 ' g +� 4�C. �-+������� - �"1", � � �"���! �9��"1"
1,5 !" 9-(�� MOPS1 (10 !� MOPS, 10 !� RbCl, pH 7.0), ���-�����
�-�+� ����" ����) ���(-�����" � �' : -�"��1'. �-+�������
- �"1", �"�� �-�+� ����" � 1,5 !" 9-(�� MOPS2 (100 !� MOPS, 10
!� RbCl, 50 !� CaCl2, pH 7.0) ��-9����" �� ") - 15 !�-�. �"��
���: �" ���(-������! +� 3,500 ' g +� 4�C � �.� 1 !�-�,.
�-+������� - �"1", � ��!+����,! �"���! �9��"1" 1,5 !�" ���� 1
!�" ��������, �� �:�>�� +"�0! �-< ��� (pQE30/FK3 " pQE30/FK4) �
��� ���� ���"� 1 !�/!", ���-����� +�!;��" ��-9����" 30
32
!�-� �� ") -. 5��9�� +�!>�" � ��!����� � �!+���-��* 42�C �� 2
!�-�, (�+"���* ;��), � 0��! � " �� 2 !�-�,. � +��9�� �9��"1"
500 !�" YTx2-9-")���, ��-9����" � ;*�� � �.� 40 !�-� +�
37�C. 5��" 8���� 150 !�" �-�+�0 �����(��!������,' �"��� �,���"
�� ����0�����-< �� -, �� �:�>-< 100 !��/!" �!+ ""��. 5��"
�����(��!� ��!+����,' �"��� E.coli ��9��" �"��, � (���+�!
Lac—
.
�� ")�, ��"�� �"��� ��9��" ���"0����" �� �� �:�� �
�' "���� 9"��. �"�� � ��9�");! �� �:��! "���� 9"��
�+�")0���" "1 +�"-.�1 +������� !����"� �")�*;* ����9���
9�!���,. �"1 ��9��� "�,' �"���� � � -�")�, �"��, E.coli
0����" � 5 !" �� , YTx2 c �!+ ""��! �-")������" � �.�
��. +� 37�C +� �������! +�!;���. ��" �"����, ��.�,'
�-")�-� +� 50 !�" 0����" � 5 !" �� , YTx2 c �! : ���9����!
��-9����" +� 37�C +� �������! +�!;��� (160 �9/!�) �
�+�.���* +"������ D600 = 0,4 - 0,6. 5��" 8���� � �� - �9��"1" �5�2
� ���.��* ��� ���� 0,3 mM +�� �":�" ��-9� < +� 37�C 2 .���
+� �������! +�!;��� (160 �9/!�). 6��! �"����,
� - ������,' �-")�-� (+� 0,1 !") ���(-�����" 5 !�-� ��
!��� ���(-� +� 5,000 ' g, �"�� ��-�+� ����" � 20 !�" 9-(��
"1 �����1 �9��0 �� �� SDS-PAGE 8"����(��0 (SDS-PAGE 9-(�). �"1
�����1 �� �") �+�")0���" 10 !�" �9��0 �. 5��" 8"����(��0� �
���-��-<>' -�"��1' 9"� +����" 8"����;���! ��
���� ""<"�0�-< !!9���- (��0!� +�� 0,45 !�!). �"1 ��
!!-��������,' 9"���, +�����,' �� !!9���-, �+�")0���"
!,;�, !����"���")�, ����"� +� �"���� IgG1 � ���!9������!-
���"��- "����+��� RL2.
5�!� !!-��9"���� � - ������,' � � -�")�,' �"����
E.coli, �� �:�>' ���!9�����-< +"�0! - pFK3 +�� � �� ��-�� 9.
33
5�"-.��,* (���!�� � 3 �":� �� �:��) 86 �!����"��,
�" ����")��, !�"�-"1���1 !���� �":�� ������"1�) ���"� 10,2 ���.
���"��.�� !!-��9"������! 9," ���9���, �"��,,
+�� - �-<> (���!�� �4 (��-��� 9, �). ����!�� � 4 �":�
�� �:��) 88 �!����"�� !�) !�"�-"1��-< !���- ���"� 10,2 ���.
�
������� 9. �!!-��9"��, 9"���, +�"-.��,' 0 � - ������,' � � -�")�,'
�"���� E.coli, �� �:�>' ���!9�����, +"�0! , pFK3 pFK4. �. ����:�: �1 –
���!9�����,* ���"�� "����+��� RL2 (17 ���), �2 - "0�� �"��� E.coli, � �� �:�>'
������-< +"�0! - pFK4 �-")��������,' � � -� * �5�2, 10, 20, 30 40 - "0��,
�"���� E.coli, �� �:�>' "�-< +"�0! - pFK4 �-")��������,' 90 � -�
�5�2, 1 - 4 - "0��, �"���� E.coli, �� �:�>' "�-< +"�0! - pFK4
�-")��������,' � � -� * �5�2. �. ����:�: �1 – ���!9�����,* ���"�� "����+��� RL2 (17 ���), �2 - "0�� �"��� E.coli, � �� �:�>' ������-< +"�0! -
pFR3 �-")��������,' � � -� * �5�2, 10, 20, 30, 40,50, 60, 70 80 - "0��, �"����
E.coli, �� �:�>' "�-< +"�0! - pFK3 �-")��������,' 90 � -� �5�2, 1 -
8 - "0��, �"���� E.coli, �� �:�>' "�-< +"�0! - pFK3 �-")��������,' � � -� * �5�2.
6��! 9,"� ��" ����� ��-���"��.��1 "���"0� 1 (���!��� � 3
(���!��� � 4, ������������. �"����, �-")�-� (1 !"), � - ������,'
0,3 !� �5�2 +� 30�C � �.� 20 .����, ���(-�����" 30 �� ��
!��� ���(-� («Eppendorf AG», 2�!��1) +� 9,500 ' g. �"��
��-�+� ����" � 500 !�" "0�-<>�� 9-(�� (50 !� Na-(��(���,*
9-(� �� 9.0, 300 !� NaCl, 10 !� ! �0�", 1 !� (�"!�"�-")(��"
(��� , 10 !� 2-!���+��8����"). �"�� ��0�-;�" �� ") -, �+�")0-1
-")���0�-����* 0�������� �6��-1 �4.2, � ��������! 22 �2 (5
+� '� �� +� 30 �, 200-300 W, c �'"�: �! �� ") - � +��,��' !: -
+� '� �!). 5�"-.��,* "0�� ���(-�����" �� !��� ���(-�
34
(«Eppendorf 5415R», 2�!��1) +� 16,000 ' g 5-10 !� +� 4�C. �-+�������
((��� 1 �������!,' 9"���) +����" � ���-< +��9��-. �"����- 5 -
10 !�" ���"0����" 8"����(��0�! (��-��� 10, �). ��� �� ((��� 1
��������!,' 9"���) ��-�+� ����" � 500 !�" "0�-<>�� 9-(�� �,
�� �:�>�� 8 � !�.��-. �"����- 5 – 10 !�" ���"0����"
8"����(��0�! � +�"���"�! ��! �" � ���-��-<>' -�"��1'
(��-��� 10, �)
�
������� 10. B"����(�����!!� (�) !!-��9"�� (�) 9"��� "0���� �"��� E.coli,
�� �:�>' ���!9�����-< +"�0! - pFK3 " pFK4. ���"��* -��0�� "��* 9"��.
����:�: 1 – ��9�� 9"��� � 0����,! !�"�-"1��,! !����!, !�"�-"1���1 !���� �
��� +�� �� �"��, 2 - ���!9�����,* ���"�� "����+��� RL2 (17 ���), 3 - "0�� �"��� E.coli, �� �:�>' "�-< +"�0! - pFK4 �-")��������,' 90 � -�
�5�2, 4 - "0�� �"��� E.coli, �� �:�>' "�-< +"�0! - pFK4 �-")��������,' � � -� * �5�2, 5 – (��� 1 �������!,' 9"��� "0��� �"��� E.coli, �� �:�>'
pFK4, 6 – (��� 1 ��������!,' 9"��� "0��� �"��� E.coli, �� �:�>' +"�0! -
pFK4, +��" � -� �5�2, 7 - "0�� �"��� E.coli, �� �:�>' "�-< +"�0! - pFK3
�-")��������,' 90 � -� �5�2, 8 - "0�� �"��� E.coli, �� �:�>' "�-<
+"�0! - pFK3 �-")��������,' � � -� * �5�2, 9 – (��� 1 �������!,' 9"���
"0��� �"��� E.coli, �� �:�>' pFK3, 10 – (��� 1 ��������!,' 9"��� "0��� �"��� E.coli, �� �:�>' +"�0! - pFK3, +��" � -� �5�2.
5� �0-")����! !!-��9"��� (��-��� 10, �, ���:� 5, 6 9, 10) 9,"�
� "��� 0��"<.�, .�� ��" -!, 9"� +�!->������ ��'� 1��1 �
��������!�* (��� �"��.���� "0��� (�") �' ��"<.�1).
35
3 ��������, �"������ � ������� ������������"� ��������
����9���- ���!9�����,' ���"���� "���+��� RL3 RL4 +���� "
� 1,5 " � - �������* �-")�-�, E.coli BL21(DE3) "1 ������-� pFK3
� 1,5 " � - �������* �-")�-�, "1 ������-� pFK4, ������������.
�� -� < �"��� E.coli BL21(DE3), �� �:�>' ���!9�����-< +"�0! -
����;' "����(!.���* (�0, ����� (D600 = 0,4-0,6), +���� " 0,3 !�
�5�2 +� 30�C 18 .���� +� �������! +�!;��� (160 �9/!�).
��" +� ��9�� -�"��1 +��� �1 � -� �+���, �,; (� ��0 " 2
"5�"-.� �"��� E.coli - +�� - ���� ���,' ���!9�����,' ���"����
"����+���").
���"0 8((������� � -� +�� -� ���!9�����,' 9"���
+���0�", .�� �"�� E.coli BL21(DE3), �����(��!������, +"�0! �*
pFK3, 1�"1<��1 8((����,! +�� - ���! ���!9�������� ���"���
"����+��� RL3. 5�� -� 1 RL4 � ���") 8((�����, �! � !�, �
+�!�>)< �((���* '��!������( �� Ni-NTA �(���0 - ���1 �, "�)
0 "0��� ���!9�����,* 9"�� � ��".����' ��9'� !,' "1 ��
'������0� ���"0� �� *���1 �� �"�� ."����.
�������-������, ���!9�����, ���"�� "����+��� ��-� �� N-
��� �+�"��")�-< 6-� ��� ���-< +��" ����")����), .��
+�0��"1� �, "1�) ' 0 "0���� �"��� E.coli � +�!�>)< �((���*
'��!������( �� Ni-'"���,' ���9���'.
3.1 ��/�� ������ E. coli
�"�� E.coli ���: �" 0 �-")�-��")��* �� , ���(-������!
+� 5,000 ' g 30 !� +� 4��. � �0-")��� � -� �����(��!������,'
�"��� E.coli 9,"� +�"-.�� 6,6 � �"�:��* 9�!���, "1 �"���,
8��+����-<>' RL3 5,2 � 9�!���, "1 �"���, 8��+����-<>' RL4.
��!���- �-�+� ����" � 50 !" "0�-<>�� 9-(�� (50 !� Na-
(��(���,* 9-(�, �� 9.0, 300 !� NaCl, 10 !� ! �0�", 1 !�
(�"!�"�-")(��" (��� , 10 !� C-!���+��8����", 4 � !�.���).
36
�"�� "0����" -")���0�-��! � �+�")0����! 0��������� �6��-1
�4.2, � ��������! 22 �2 (5 +� '� �� +� 30 �, 200 - 300 W, c �'"�: �!
�� ") - � +��,��' !: - +� '� �!). $0�� ���(-�����" 30 !� +�
10000 ' g +� 4 ��.
3.2 �+�������� ���!�����!�� ���������� ����� � ��/���� ������ E.coli
– +���!����� RL3 � RL4
�+� "� ��� ���� 9"�� � "0���' �"��� E. �oli, �� �:�>'
RL3 RL4, +���� " +� !�� - ��8 (�� � [6,7]. �"1 +������1
��"9����.��* ����* �+�")0���" ��� (Serva, �/�).
�+� "� ��� ���� 9"�� � �"��.��! "0��, �� �:�>!
���!9�����,* ���"�� "����+��� RL3, +���0�"�, .�� �9> �� �:��
9"�� � �! ������"1� 0,107 !�/!" � �-")�-� �"��� E.�oli.
��".������ �+� "� 9"�� � �"��.��! "0��, �� �:�>!
���!9�����,* ���"�� "����+��� RL4, +���0�"�, .�� � �! �� �:��1
0,031 !� �� 1 !" �-")�-�, �"���-+�� - ����.
� �0-")��� 9,"� +�"-.�� 160 !� ���!9�������� ���"���
"����+��� RL3 0 1,5 " �-")�-�, �"���-+�� - ���� E. �oli 47 !� RL4 0
1,5 " �-")�-�, �"��� E. �oli.
3.3 6"������ ������������"� �������� �����+���� � �����
���������� ��� �� Ni-NTA �� ���/�
��0 "� 9"��� "0��� �"��� E.coli +���� " ��
'��!������(.���* ���� �0���� ��"�1 BioLogic LP (Bio-Rad, �/�),
����>���* �+����(���!��.��! ������! +��"�>�1 8"<��� ��
"� ��"�, 280 �! +����.�,! ��� -���!���!.
5� +��� � '��!������(.����� ��0 "�1 9"��� "0����
9�!���, �+�")0���" �9>-< +��" ����")����) �!�, 8"<�-<>'
9-(��,' ���������.
37
�-+�������, +�"-.��,* +��" ���(-������1 "0���
9�����")�,' �"���, �����" �� �������)< 1 !"/!� �� ��"���- � 10 !"
Ni-NTA �(���0, (Profinity IMAC, Bio-rad, �/�), -������;���*
"0�-<>! 9-(��!. � ��10��;�1 � ���9���! 9"� 8"<����"
"0�-<>! 9-(��!. �"1 - �"�1 ��+ (.�� ���9�-<>'�1
9"��� �.coli +���� " +� ����")�-< 8"< < "0�-<>! 9-(��!,
�� �:�>! 50 !� ! �0�"�. ���"�� "����+��� 8"<����"
"0�-<>! 9-(��!, �� �:�>! 200 !� ! �0�"�, � 0��! +���� "
�+�"��")�-< 8"< < "�,' 9"��� � ���-��-<>' -�"��1'
9-(��!, �� �:�>! 6 � �-�� �� � ��'"�� � 0,1 � B��� (��-���
11). 5�"-.��, 9"���, (��� �"0���" +���� �� , ( � �!�, +�
18 . +� 5oC) ���"0����" SDS 8"����(��0�! � 5��2 (��-��� 12). �0
���,' ��-��� 12, � ��, .�� +�"-.��, +�+����, �� �:�� "�,
���!9�����, ���"�� "����+��� RL3 RL4 (��-��� 12, � �, ���:�
7).
�
������� 11. ���!������!!� "0��� �"��� E. coli – +�� - ��� RL3 �� Ni-NTA �(���0.
���!������(.�� (��� : 1 – 9"�, � ��10��;�1 � ���9���! +� �����, 2 –
9"�, �����, ��+ (.�� ��10��, � ���9���! 8"<�����, 9-(��!, �� �:�>!
50 !� ! �0�", 3 – RL3, 8"<������,* 9-(��!, �� �:�>! 200 !� ! �0�", 4 –
RL3, 8"<������,* 9-(��!, �� �:�>! 6 � �-�� �� � ��'"�� � 0,1 � B���.
38
������� 12. SDS-PAGE 8"����(�����!!� 9"��� (��� *, +�"-.��,' +� �((���*
'��!������( �� Ni-NTA �(���0 "0���� �"��� E. coli – +�� - ���� RL4 (�) RL3 (�).
���"��! -��0��, "�, 9"�. �. ����:�: 1 - ��9�� 9"��� � 0����,!
!�"�-"1��,! !����!, !�"�-"1���1 !���� � ��� +�� �� �"��, 2 - ���!9�����,*
���"�� "����+��� RL2 (17 ���), 3 – 9"� �-+�������� "0��� �"���-+�� - ���� E.coli,
�����(��!������,' +"�0! �* pFK4 �-")��������,' c � -� * �5�2, 4 –
9"�, � �0�!� *���-<> � ���9���!, 5 – 9"�, 8"<�-!, 50 !� ! �0�"�, 6 -
9"�, 8"<�-!, 200 !� ! �0�"�, 7 – 9"�, 8"<�-!, 6 � �-�� �-HCl � 0.1 �
B���; �. ����:�: 1 - ��9�� 9"��� � 0����,! !�"�-"1��,! !����!,
!�"�-"1���1 !���� � ��� +�� �� �"��, 2 - ���!9�����,* ���"�� "����+��� RL2
(17 ���), 3 – 9"� �-+�������� "0��� �"���-+�� - ���� E.coli, �����(��!������,'
+"�0! �* pFK3 �-")��������,' c � -� * �5�2, 4 – 9"�, �
�0�!� *���-<> � ���9���! ((��� 1 1, ��-��� 11), 5 – 9"�, 8"<�-!, 50 !�
! �0�"� ((��� 1 2, ��-��� 11), 6 - 9"�, 8"<�-!, 200 !� ! �0�"� ((��� 1 3,
��-��� 11), 7 – 9"�, 8"<�-!, 6 � �-�� �-HCl � 0.1 � B��� ((��� 1 4, ��-���
11).
�0 ���,' ��-��� 12 � ��, .�� �� � �+�"��")��* ���
8"< 9-(��!, �� �:�>! 50 !� ! �0�"�, +��� � � - �"�<
��+ (.�� ���9�-<>'�1 �� Ni-NTA �(���0 9"��� E.coli
+�0��"1� +�"-.�) ��!����, +�+����, ���!9�����,' 9"��� RL3
RL4. 5� 8��! 9,"� ��!.��, .�� 8"< 1 8���� 9"�� 9-(��!,
�� �:�>! 200 !� ! �0�"�, +��� "� � � +�"��!- - �"�< 9"�� �
���9���. 5�"��1 8"< 1 9"�� +���'� � � ���-��-<>' -�"��1' (6
� �-�� �-HCl 0.1 � B���).
39
��"0������1 �-9���� 1 +� ����"1� ��9�* !-��-< �0��) 9" ��-
:"���� ���. 5��" ���(-������1 �-+������� ��������1 9�"
+��0��.�,!, � �� �:�� 9"�� � ��� � ������"1� 9�" 50%
������")�� �9>�� 9"�� � �-9���� .
3.4 ������� ������������"� �������� �����+���� RL3 � RL4
��������������� ���������� ��� �� SP Sepharose Fast Flow
�.���- �-9���� , �� �:�>* RL3 RL4, +���� " �
�+�")0����! ���9��� SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Bio-Sciences
AB, /� 1). ����,* ���9�� �� �:� !!�9"0�����, �-")(���,
��-++, �9"� �� �,����* ���9 ����* !����)< +� ����;�< �
������,! 9"��!.
��0 "� 9"��� �-9���� *, �� �:�>' RL3 " RL4,
������������, +���� " �� '��!������(.���* ���� �0����
��"�1 BioLogic LP (Bio-Rad, �/�), ����>���*
�+����(���!��.��! ������! +��"�>�1 8"<��� �� "� ��"�,
280 �! +����.�,! ��� -���!���!.
�"1 +��� �1 �������9!���* '��!������( �"0�����-<
(��� <, �� �:�>-< � � 0 ���"���� "����+���, �����" �� �������)<
1 !"/!� �� ��"���- � SP-�(���0�*, -������;��-< 50 !� ���-HCl, pH
8.0. � ��10��;�1 � ���9���! 9"� 8"<����" 50 !� ���-HCl, pH 8.0.
��0 "� ��10��;'�1 � ���9���! 9"��� +���� " � �:!
��� ����* 8"< � "�*�,! -�".�! ��� ���� 9-(��,
�� �:�>�� 8 � !�.��,, 1 � NaCl 50 !� � ���� Na, pH 4.5.
�� ��-�� 13 +� ����"�� '��!������!!� �-9���� , �� �:�>*
RL4, +� -��0���,' -�"��1'. ���� 1, �� �:�>�1 "��* 9"��,
8"<����"��) � ���� �,! �+�.��! +��!. 5�"-.��-< (��� <
�"0���" +���� �.>���* �� , ( � �!�, +� 18 . +� 5oC)
���"0����" SDS 8"����(��0�! � 5��2 (��-��� 14). � �0-")���
40
�"0� 9," +�"-.�, �"��� �+�"� �-<> 9� ���, �������,
"�,' 9"���.
�
������� 13. ���!������!!� �-9���� , �� �:�>* RL4, �� �������9!���! ���9�� SP Sepharose Fast Flow; .���1 "�1 – (-�� 1 �+�.���* +"������ 8"<��� �� ��!�
(���"��* -��0��� (��� 1, �� �:�>�1 "��* 9"��); ������1 "�1 – (-�� 1
8"����+���� ���� 8"<��� �� ��!� (8"����+���� ����) +� �:��* (�0, 0!�1"��)
�� 1 � 100 !�!/�!).
�
������� 14. SDS-PAGE 8"����(�����!!� 9"��� (��� *, +�"-.��,' +��" �.���
���"���� "����+��� RL3 (�) RL4 (�) �������9!���* '��!������(* �� SP-�(���0.
�. ����:�: 1 - ��9�� 9"��� � 0����,! !�"�-"1��,! !����!, !�"�-"1���1 !����
41
� ��� +�� �� �"��, 2 - ���!9�����,* ���"�� "����+��� RL2 (17 ���), 3 –9"�,
8"<�-!, +� ����� �� ���9��, 4 –RL3, 8"<������,* � ��� �� !�.��,
NaCl, �. ����:�: 1 - ��9�� 9"��� � 0����,! !�"�-"1��,! !����!, !�"�-"1���1
!���� � ��� +�� �� �"��, 2 - ���!9�����,* ���"�� "����+��� RL2 (17 ���), 3 –
9"�, 8"<������, +� ����� �� ���9��, 4 –RL4, 8"<������,* � ��� �� !�.��, NaCl.
3.5 �+�������� ���!�����!�� RL3 � RL4 +���� ������� �� SP-�� ���/�
�+� "� ��� ���� 9"�� � +�+�����' ���!9�����,'
���"���� "����+��� +���� " +� !�� - ��8 (�� � [6, 7]. �"1 +������1
��"9����.��* ����* �+�")0���" ��� (Serva, �/�).
�+� "� ��� ���� 9"�� �� (��� , �� �:�>* RL3, +��"
��0 "�1 �������9!���* '��!������(*, +���0�"�, .�� �9>* �,'�
������"1� 45,9 !� 0 1,5 " �-")�-�, �"��� E. �oli, �.. ��� ���� 1 RL3 �
�-")�-� �"���-+�� - ���� ������"1� 0,031 !�/!".
��".������ �+� "� 9"�� �� (��� , �� �:�>* RL4,
+��" ��� �.��� ���!9�������� ���"��� "����+���
�������9!���* '��!������(* �� SP Sepharose Fast Flow (��-��� 14)
+���0�"�, .�� �,'� 9"�� RL4 0 1,5 " � - �������* �-")�-�, ������"
10,3 !� " 0,007 !� �� 1 !" �-")�-�, �"���-+�� - ����.
3.5 ����/ ��������� �����������"� -���������� �
���������� ������ ���7���"� ������������"� �������� �����+����
RL3 � RL4
���"0 �� �:��1 9�����")�,' 8� �������� � �.>��,'
�������9!���* '��!������(* ���!9�����,' ���"���' "����+���
RL3 RL4 +���� " � �+�")0����! $�$ ���� (��� "$�$-3���",
������) � ��������� � ��� 42-0062-07. �"1 8���� +������"
�" -<> ��0� �1 �"0�����,' (��� *, �� �:�>' "�, 9"�
RL3 RL4 � 10, 100, 1000, 10000 100000 ��0 � �+�")0����! �� , "1
$�$ ���� ($�$-3���, ������). � ��.��� +�"�:�")���� ������"1
�+�")0���" ���� ��� 8� ������� (��� "$�$-3���", ������). �
42
��.��� ��� ��")���� ������"1 �+�")0���" �� - "1 $�$ ����.
�0-")���, $�$ ���� +� ����"�, � ��9" 1.
6�1�"���1 .-�����")����) ���"0� �+�")0-!�* �� $�$ ����
������"1� 0,03 �B/!".
��!�")�� �� �:�� �B � +�+�����', �� �:�>' RL3 RL4,
+��" �.��� �� SP-�(���0, ������"� 30 �B/!".
(����!� 1. ���"0 �� �:��1 9�����")�,' 8� �������� � +�+�����' RL3 RL4
+��" �.��� �� SP-�(���0.
���� ���� ������ ������ ���� 1
10 100 500 1000 10000 100000
RL3 + + + - -
RL4 + + + - -
������
��B
0,04
�B/!"
+
+
��B
0,2 �B/!"
+
+
�� �
-
-
�
3.6 ������� RL3 � RL4 �������������� ���������� ��� �� MacroPrep
DEAE
��")�*;-< �.���- RL3 RL4 �� � ��(�9�,' ��!+������
�"��.��* ���� E. coli +���� " ������9!���* '��!������(* ��
MacroPrep DEAE (Bio-Rad, �/�). ����,* ���9�� �� �:�
!!�9"0�����, ��-++, ���.�,' �!��� �9"� �� �,����*
���9 ����* !����)< +� ����;�< � ��",! 9"��!.
��0 "� 9"��� �-9���� *, �� �:�>' RL3 RL4, +���� " ��
'��!������(.���* ���� �0���� ��"�1 BioLogic LP (Bio-Rad, �/�)
����>���* �+����(���!��.��! ������! +��"�>�1 8"<��� ��
"� ��"�, 280 �!, +����.�,! ��� -���!���!.
�"1 +��� �1 ������9!���* '��!������( �"0�����,*
+�+���� � ���� 0 ���"���� "����+��� � 20 !� NaOAc (pH 4.5) �����"
�� �������)< 1 !"/!� �� ��"���- � MacroPrep DEAE, -������;��-< 50
!� ���-HCl, pH 8.0. � ��10��;�1 � ���9���! 9"� 8"<����" ���:
43
50 !� NaOAc pH 4.5. 6��! ���9�� +��!,��" 9-(��!, �� �:�>! 4 �
!�.��,, 0,5 � NaCl 50 !� NaOAc pH 4.5. �� ��-�� 15 +� ����"��
'��!������!!� ��0 "�1 �-9���� , �� �:�>* RL3, +� -��0���,'
-�"��1'. ���"���� ���,! ��-��� � ��, .�� 0��.�")��1 .���) 9"��,
�����!��� �� ��"���-, � �0�!� *���-� � ���9���! �,'� � +�
�����.
�
������� 15 ���!������!!� �-9���� , �� �:�>* RL3 �� ������9!���!
���9�� Macro-Prep DEAE; .���1 "�1 – (-�� 1 �+�.���* +"������ 8"<��� �� ��!� (���"��* -��0��� (��� 1, �� �:�>�1 "��* 9"��); ������1 "�1 –
(-�� 1 8"����+���� ���� 8"<��� �� ��!� ��!� (8"����+���� ����)
+� �:��* (�0, 0!�1"��) �� 1 � 100 !�!/�!)
5�"-.��, '��!������(.�� (��� �"0���" +����
�.>���* �� , ( � �!�, +� 18 . +� 5oC) ���"0����" SDS
8"����(��0�! � 5��2 �����-9"����! (��-��� 16).
�
44
�
������� 16. SDS-PAGE 8"����(�����!!� (�) �����-9"�� (�) 9"��� (��� *,
+�"-.��,' +� �.��� RL3 RL4 ������9!���* '��!������(* �� MacroPrep
DEAE. ����:�: 1 - ��9�� 9"��� � 0����,! !�"�-"1��,! !����!, !�"�-"1���1
!���� � ��� +�� �� �"��, 2 - ���!9�����,* ���"�� "����+��� RL2 (17 ���), 3 –
9"�, 8"<�-!, +� ����� �� ���9�� �-9���� , �� �:�>* RL3, 4 – 9"�,
8"<�-!, � ��� �� !�.��, NaCl +� ��0 "� �-9���� , �� �:�>* RL3,
5 – 9"�, 8"<�-!, +� ����� �� ���9�� �-9���� , �� �:�>* RL4, 6 – 9"�,
8"<�-!, � ��� �� !�.��, NaCl +� ��0 "� �-9���� , �� �:�>* RL4
��"0�����, �-9���� +� ����"1" ��9�* ����,* ������� �
�� �:�" ��������!,' ��!+������ �"��.��* ����.
���"0 (��� *, 8"<�-!,' � ���9��� MacroPrep DEAE,
���-��-<>! 8"����(��0�! � 5��2 � +��" -<>* �������* �"1
��������! �oomassie G250 +���0�", .�� "�, 9"� �� �:���1 � ������
(��� *, � �0�!� *���-<>' � ���9���!, 1�"1<��1
8"����(���.�� ��!����,! 9"��!, +� ����"��,! � !���!���*
(��! (� �"-.� � RL3 - � �9�");�* +�!�)< ��!� !��).
45
3.7 �+�������� ���!�����!�� RL3 � RL4, ���7���"� ������������
���������� ��� �� MacroPrep DEAE
�+� "� ��� ���� 9"�� � �9��0 �' �,+�"�1", ��� �+����
�,;.
�9=!, (��� *, �� �:�>' "�, 9"�, +��" �"0� ������"
45 !" "1 RL3 c ��� ���� * 9"�� 0,95 !�/!" 35 !" "1 RL4 c
��� ���� * 9"�� 0,25 !�/!", .�� ���������-� 42,5 !� 8,6 !� 9"��,
������������. B�� ������"1� 26% 18% �� �9>�� ��".���� 9"�� �
"0���' �"��� E. coli.
���! �9��0�!, 0 "0��� �"��� +�� - ���� E.coli �((���*
'��!������(* �� Ni-NTA �(���0 �, "�, ���!9�����, ���"��
"����+��� RL3 RL4. 5�"-.��, ���"�� �.>�, �������9!���*
'��!������(* �� SP Sepharose Fast Flow ������9!���*
'��!������(* �� MacroPrep DEAE.
46
4 �����������"� �����/ ������� �������� �� ��/���+��������� �
�+�+��/ ������ MCF-7, ��+�������"� �� �"������� � ����������
�������� �������� - ������"� ��������� ������ �����"� ������
�������� ����/".
4.1 ����/ ������� ������������"� �������� �����+����, ���7���"�
� ����� ���������� ���, �� ������ �������!����" ��������
����/" �������� MCF-7 � ��������.
�"�� � ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."���� "� MCF-7
(����*���* ��""� �"��.�,' �-")�-� +�0����.�,', ��3 ���, �����-
5��9-��) �-")������" � �� IMDM � 10 !� L-�"-��!�� 40 !��/!"
����! �� � +��-���� 10% 8!9����")��* �,������ ��-+����
�������� ����� +� 37�� � ��!��(� 5% ��2 � �-")�-��")�,' ("�����' �
+"�>� )< +���'���� �� 25 �!2. 5� �.� ��".���� �"��� +���� " �
��!� 2��1�� +� ���� �����* !�� � [8].
�"1 ���"0� �"1�1 ���"���� "����+��� �� :0��+���9����)
2,5*103 �"��� MCF-7 � 100 !�" �� , RPMI-1640, �� �:�>* 5%
8!9����")��* �,������ �"��� 20 !� 9-(�� Hepes, �-")������" �
"-���' 96 "-��.���� +"���� ������ +"��;�� � ���� ����,' -�"��1'
(37��, 5% ��2, 95% �"�:����) � �.� 24 .���� (8��+��� �")��1 (�0�
�����, 50% !����"�*). � �-")�-��")��* �� �9��"1" ���!9�����,
���"�� "����+��� � 100 !�" �� , � �,�������* ��-9����" 72 .���,
+��" .�� � ���" !��(�"��.�� 0!��1 � +�!�>)< ������*
!������+ ���"0����" :0��+���9����) �"��� � +�!�>)< MTT-
����. �"1 8���� �� �:�>-< +�+���� �� - - �"1", � "-�� �9��"1" +�
100 !�" �� , RPMI-1640 90 �,������, �� �:�>* ��� � ��� ����
0,5 !�/!". �"�� MCF-7 ��-9����" � +��-���� ��� 4 ., 370�. �� -
� ��� - �"1". ���!�0�� �������1" � ���� �+� "1" �+�.��-<
+"������) �������� +� "� ��"�, 570 �! �� +"��;���! �����
"Multiskan RC", ThermoLabs (C/�) [9] (��9" � 2).
47
(����!� 2. �0��+���9����) �"��� MCF-7, ��-9������,' 72 .��� � +�"��*
�-")�-��")��* �� � +��-���� 9"��� '��!������(.��' (��� *, +�"-.��,'
+� ��0 "� "0���� �"��� E. coli – +�� - ���� RL3 RL4 �((���*
'��!������(* �� Ni-NTA �(���0. ��� ���� 1 9"�� � "-�� "1 ��: ��� 0 +� ����"��,' +�+������, ������"1� 60 !��/!".
���� , �� �:�> RL3
���� , �� �:�> RL4
5�+����
������"),
�
�� �:�>* 9"��
RL2
B"< 1
0,2�
! �0�"�!
B"< 1
�-�� ��!
B"< 1
0,2�
! �0�"�!
B"< 1
�-�� ��!
OD570 1,224±0,0
15
0,817±0,0
95
0,760±0,0
82
0,062±0,0
02
0,355±0,0
50
0,060±0,0
02
�0��+���9
�, �"��, %
100±1,3 66,7±11,6 62±10,9 5±3,2 29±14,0 5±2,9
6� 100 % +��1�� :0��+���9����) �"��� MCF-7, ��-9������,' � ���-����
���"���� "����+���.
�0 ���,' ��9" , 2 � ��, .�� �� ���"�� "����+��� �"1<� ��
:0��+���9����) �"��� � ����� ��!, ."���� MCF-7 � �-")�-�. � ��
: ��!1 ��-9� 1 MCF-7 � +��-���� RL4, 8"<��������� 0,2 �
! �0�"�!, 8((���� ��:�"� :0��+���9����) �"��� (�� 71% +�
��� ���� 0,06 !�/!", 72 .��� ��-9� ) +� ������< � RL2 RL3.
5����.�� +�"��1 �9") �"���, �9��9�����,' 9"���,! (��� 1!
���!9�����,' ���"���� "����+��� RL3 RL4, �����, 9," 8"<�����,
� Ni-'"������ ���9��� � ��'"�� �! �-�� ��, !�:� 9,�) ��10��� �
������.�,! +��-����! �-�� �� � �9��0 �'.
4.2 ����/ ������� ������������"� �������� �����+����, ���7���"�
��������������� ���������� ���, �� ������ �������!����"
�������� ����/" �������� MCF-7 � ��������
��"��1 �-")�������1 �"��� ��" ����1 ������.����
+�+������ ���"���� "����+��� RL3 RL4 +� ��9�� �+���, �,;.
� ��9" 2 +� ����"�, �0-")���, *���1 ��0�,' ��� ���� *
RL3 RL4, �.>��,' �������9!���* '��!������(*, �� MCF-7.
48
(����!� 3. �0��+���9����) �"��� MCF-7, ��-9������,' 48 .���� � +�"��*
�-")�-��")��* �� � +��-���� ��0".�,' ��� ���� * ���"���� "����+��� RL2,
RL3 RL4.
��50 ��90
��� ���� 1
���"��� RL3 �
�-")�-��")��*
�� , !�/!"
0,124
0,149
0,310
�0��+���9����)
�"��� MCF-7, %
58,7 50,5 47,2
0,24
1,10
��� ���� 1
���"��� RL4 �
�-")�-��")��*
�� , !�/!"
0,028
0,042
0,07
�0��+���9����)
�"��� MCF-7, %
92,9 84,4 57,4
0,08
0,13
��� ���� 1
���"��� RL2 �
�-")�-��")��*
�� , !�/!"
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
�0��+���9����)
�"��� MCF-7, %
108,5 67,0 63,3 48,9 41,3 37,6
0,45
0,73
6� 100 % +��1�� :0��+���9����) �"��� MCF-7, ��-9������,' � ���-����
���"���� "����+���.
�0 ���,' ��9" , 3 � ��, .�� �� ���"�� "����+��� ��:�<�
:0��+���9����) �"��� MCF-7. 5� 8��! ��-9� 1 MCF-7 � +��-����
RL4 ��9�" 8((����� ��:�"� :0��+���9����) �"��� (�� 42,7 % +�
��� ���� 0,07 !�/!", 48 .���� ��-9� ). ��:� :0��+���9����
+� *���! ���"���� "����+��� ��+����: �"��) !��(�"��.��!
0!��1! '�������,! "1 �+�+��0� �"��� � �-")�-�: ����+"�!
�� +"�������* +� "�:�, ��� ��� * ��+"�0!, 1 �, +�1�"�!
����.�,' �����.��' �"��� ����;��!,' ��+����,! ��!.
�0 ���,' ��9" , 3 � ��, .�� ������.��� *��� ���"����
"����+��� �� �"�� MCF-7 +�1!� +��+�� ���")�� ��� ����
���"���� � �-")�-��")��* �� . ��50 – ��� ���� 1 +�+�����,
�,0,��<>�1 ���!�:� ����� �"��� �� 50% - ������"1� 0,24 !�/!" "1�
49
���"��� RL3 0,08 !�/!" "1 ���"��� RL4, .��, -.�,��1 ���.��-< !���-
9"���, ����-< 10,2 ���, ������"1� ~ 23,5 !�� "1 RL3 7,8 !�� "1 RL4.
���! �9��0�!, +���0���, .�� +�"-.��, ���!9�����, ���"��
"����+��� RL3 RL4 8((����� � - �-<� �+�+��0 �"���
� ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."���� MCF-7. ��50 "1 RL3
������"� 23,5 !��, "1 RL4 - 7,8 !��.
50
5 ��/������� ������-����������� ���������� � �������������
+��������� «%���" ��������������� +���!����� +�+����» �
������ «$���.��� �������������� +���������»
6������
2��.���1 �:�D�1 (����1 �:��1) — �����-+����) +�!��,
!�� �� �'��"��* +�"-.�1 ���!9�����,' ��� ���, �, "�1
���� 0 �����0!� (�"���), ��->���"�1 !��+-"1 * � ���!
�� �1 ' � �-� �����0!,.
2��.���1 �:��1 � 1�"1��1 ��-��* � ;����! �!,�", �� 1�"1��1
����-!���! 9��'��"��, �+�")0-1 !�� , ���' 9�"��.��' ��-�,
��� !�"�-"1���1 �"��.��1 9�"��1, ��"��1, �����,
!���9�"��1 ��-��"��1 [10].
��� , ���.���* �:�� +�0��"1<� ��+���"�� ������-�����)
���.��* !����", ��0 ���1 ��-������, ���.�� ������-� , �
�����,' �� ")�, .��� ���� " ��, "��! �9= �1<��1 � ��9-!�*
+��" ����")����, ��� �) 8� ���, ������-� � :�, �"��, �
+�!�>)< +��" �' ��"0��,���) 8�- ���.��-< �(��!� <. ����,
!�� , +�0��"1<� �+� "1�) �0�!�� �"1� (-�� ���")�� 0��.�
����, � ���: +���� �) 8��+���< ���� � ����! ���.���!
���-:�. 2���1 �:��1 !�� �! in vivo " in vitro �;�� 0� �.
�� �1 � ���! � +����* �"�� � ���� " ����")�' (�9,.��
.-:�� �,') ���� "9� ��0 ��1 � ���! ���,' �+�� ��-"1����,'
��10*. � ���' �"-.�1' � ���1 +��� ":����) � +���,' �����0!��
� !�1��1, �� +�1�"1<��1 ����*�����, ! +�0���.
� +��� �9!� 9"���! ����, �� ")�,! ���! ' (���!���!, ��� �
+� "�' ���!��, ��� !: - ��0".�,! ���!�! �����0!�! -
�9,.�� 1�"�. 5�!��! ������ +����� ���.���* �(��!�
1�"1<��1 �+ (.���1 ��+ (.���1 ����� -� 9�����")�,'
���� ������,! -!���,! (���!, �9!� ���! � +�!�>)<
���=<�����,' +"�0! �����+�0���� � 9����1', � .�������,
51
���+�������� ���� -���*.���� � ��0".�,! '!.��! �>����!
��� � +�+-"1 1' �� �����,' 9����*, ��� !: - +� �����"1!
�������!.�� - �"��,' �-� �� �-�� ��-++. � 8-����� ���:
�->���-� 1�"� +����� ����. ��+�!�, ������-�, �+���9�,
��->���"1�) ���0����")�,* +���� ���� - !"��+��<>'.
�����(��!� < �����")�,' �"��� � +��� ��->���"1<� Ti-+"�0! ,
9����* Agrobacterium tumefaciens. �0�����, .�� ��! 9����
�����")��* �"���* � +��"�>�<��1, �� +� !:�"��.��! ������� �
�"-.� +�����1 0 Ti-+"�0! �,�0���1 +��" ����")����) �-���,
������1 ������"1� 6 – 10 % (10 – 15 �+�) ���� +"�0! ���� ���!�; �-���
+������1 � ����� ���9")�� �����-��1 � �� ���! [11].
5�!>� ���.���* �(��!� 0!�� '�������
8��+��� !�:� +���'� �) � +� "�' � ���� �����0!� +�
*���! !�9")�,' ���.��' 8"!���� " +� ��0 *���
!-�����,' (������� ���-:�<>* �� ,. � �0-")��� 8�' ��9,�*
+����!, ��, � ��")�� ��'���1<� ���< �+���9����) � 8��+��� �
����! ���.���! ���-:�, �� !��-� 0��.�")�� !�1�) -����),
.�� .���� ��+����: ���1 '�������,! 0!��! (���+� �����0!��.
5.1 (���������, +��;������"� � �������"� ��������
��+�")0���� � "�9�������,' -�"��1' ���.��' +�� +��, ":�>'
� ����� +�� ���� +����� ���� � +��� , +� ���0�"� +-� 0�".�1
���� 0 �"��.���� ���!� +�0��""� ��0��9����) ���!, +� �.
���.���* �(��!� !: - �����0!�!. ������,! �9=���!
����-�:���,' !��+-"1 * 1�"1<��1 ��, – ���-��-��,
(-�� ���")�, � , ���" �������� :�,' �����0!��,
+� ����"1<> ��9�* -.���� ���, ��!��-<> +��" ����")����)
!���!��,' 0��)� � �� �-!,' ! +�"++� �' " +�"�-�"�� �'.
��9��� � 0�"������,! ���! ����,��� ��0!�:����) ��" ����)
���.�� 1�"�1 �� !�"�-"1���! -����. �'��"��1 ���!9�����,'
52
��� +�0��"1� �, "1�) � � -�")�, ��, � .���! � , � ���:
��( �����) 8"!��, ���-��-�,, �->�����, "1 '
(-�� �������1, ���0�����) !� ( �����) ��,, �� �1�) '
�-� � �-��!, +�"-.�1 «�"�, ��,», +�� - �-<> 9"� � ����;���
���,! ���*����! (9"����1 �:��1).
����0��")����! (-�� ���")��* 0��.!��� �, "����� -.����� ���!�
!�:� 9,�) ��")�� �� ���!�")��1 8��+���1 � !� ")��* ���.���*
���!. 5�8��!- �" -<>! 8��+�! ��" ����1 �, "����� ���
1�"1��1 +�!>� �� � ���-< ���.��-< ���!-, � 8��+���1
��� "��� �9���-:����1. �0-")���, 8��+��� � ���<� "9� +�
+�1�"�< 9"������ +�� -���, �� �-!��� ��" -!,! ���!, "9� +�
0!��< (-�� * 9�"��.���* ���!, ��" ��� +�1�"�1 � �*
����* (�!�������* " �-��* ��������, ��+�!�, +� ��!+���
+��-����-<>* � 8��* ���! !-�� . � �0-")��� ��" ����1
���-��-�, ���������� ��� !� "�����1 �� 8��+��� �
��-�������* ���.���* ���! !�:�� +��1�) ���9����� ��
(-�� �������1 � :��! �����0!. 5� �9�,* +� '� !�:� 9,�)
+�!�� ��� � 0����,! ���!, �����, �, "1<��1 "��+���"���, ���
� � ��( ������,! ��� +��" ����")����1! �-�"�� ��,
(-�� ���")�-< 0��.!���) �����,' �+� "1<� ";) +��" �, "�1 '
� .���! � .
� ��.��� �������, �.. +����.��� (���!���� �-�"���,' ��"��
�+�")0-<� +"�0! ,, 9�����(��, ��-�, " "<9-< �-�-< (��!- ���
" ���, �9"� �<>-< �+���9����)< � ������!��* �+"�� �
9�����")�,' " 8-�����.��' �"���'. �������1 !�"�-"� �":��
�9"� ��) ����")�! �910��")�,! ���*����!. ��-+��,', "<9�* �����
�":� "�")�� ��!1 �->�������) � +�+-"1 �"���-'�01�, �..
�+" �����)�1 ������!�� " �!�� � '��!���!�! �"���. ��- ����,', �
����� �":�, �� �:��)�1 9�'!.�� " ���.�� �"����,
!����,, �����, +�0��"1" 9, �9���-:���) �� +��-���� � �"���'. �-
53
���)', ���-��-�� �������* !�"�-", �":�� !�) � ��: �* !�"�-"
!�!�")�� ��".���� ��*��� -0�����1 "1 ��* " ��* �������0,
�+-����) �������� � !�"�-"- .-:�� ��* +��" ����")����
�-�"�� �� ��0".��* !�"�-"1���* !���, 90 ���-;�1
(-�� ���")��* "������� -�� �+���9���� � �+"�� [11,12].
5.2 '����� ���!�� �������"� ������
������,! ����! +� �,9�� ������ 1�"1��1 ��0!� �"���-!�*
���. ��0!� ������� �"���-!�* ��� � +"�0! �,' ������', �����,
�+���9�, ���9")�� � �' �->�������), ��� +���"�, � +��,;��
����")�' �,�1. +�� �������*. �����,, �������-������, �� �����
��� 9�����(��� "1!9 �, �9"� �<� 0��.�")�� 9�");* !����)< +�
������< � +"�0! �,! ������!, � �' !�:�� �"�������) (���!��,
��� "��* �� 5 � 25 �.+.�. 5� ��9'� !��� �"�������1
���' "��,' !�"�-" ��� �+�")0-<� ���'=!� �����, �� �����
��-������� +�"-.��,' '��!���! 9����*, 9�����(���� ��::*.
��+�!�, ����� YAC (yeast artificial chromosome) +� ����"1� ��9�*
��-������� +�"-.��-< !�-'��!���!- ��::*, �->���-<>-< �
�"���' ��::* �� ��'��!���!��! �����1�. � ����! ����� - ���"��)
��->���"1�) �"������� (���!���� ��� "��* � 700 �.+.�. �
������,' ���!�' BAC (bacterial artificial chromosome), ��������,' ��
��-������,' '��!���!�' 9����*, �+�")0-��1 ��� +�"����� (������
(F-(������) E. coli. F-(����� – 8�� ��������1 +"�0! � !-:��'
9�����")�,' �"���, �����, 1�"1<��1 �����! 9�����")��* ��� +�
���=<�� � :���! �"���!. BAC-�����, +�0��"1<� �"�������)
(���!��, ��� "��* � 300 �.+.�. �,;. ���!9�����, !�"�-",
��� 1��1 � �"�� E. coli � +�!�>)< 8"����+��� , +�.! 8((�������)
�9��0����1 �����(��!����� � 10-100 ��0 �,;, .! +� �9,.��*
�����(��!� �(��+"����� ��::* ������! �!*���� YAC. ��)!�
54
�->�����,! ���*����! ���!, �"�������1, ���������* �� ������'
�!*���� BAC, 1�"1��1 ���.���1 ���9")����). ��'� ��1 ���-��-��
�"��������,' (���!���� ��� � +� "�' ��.���� �+�")0�����,'
!�� �� ��'���1��1 � ���' ������' �: +��" 100 ��*�,' +�����
9�����")�,' �"���, �� �:�>' ���!9�����, !�"�-", ���.
�����, �!*���� PAC (P1-derived artificial chromosome) �� �:�� ��,
9�����(��� �1, �9�+.��<> �+"�� < (�����* '��!���!, �
0���:��,' 9�����")�,' �"���'. �+�!�")�,* ��0!� �"���-!,'
(���!���� ��� � PAC-�����, ������"1� 150 – 200 �.+.�.
5.3 ��+���/������ +��/���"� �������� �� ��/���� .������-
+���!����� +�+����
�����.�� �"�:"��), .�� ���� * !: - ++� �! 9"��!
�.��<� �� ��1 � !�"�-"1���* !����* ~10000 ��, +�8��!- -�"����
�.��<�, .�� ++� , �� �:�� � !�"�-" � 100 �!����"��
(���������-� !�"�-"1���* !��� � 10000 ��), � 9"� - ��,; 100
�!����"���,' �������� (!�"�-"1���1 !���� �� 10000 �� � ����")�'
!""���� ��). 5� 8��! � ��-++ ++� �� ��0".�<� �"��++� ,,
�� �:�> � + � 9�" 10 �!����"���,' ��������, +�"++� ,,
�� �:�> � 100 �!����"���,' �������� [13]. 5�8��!- "1 +�"-.�1
+�� - ���� ++� �� �+�")0-<� ��9�" ���+���������,* �+���9
�� �1 ���!9�����,' ��� � � +���, �"�� - �����(��!� <
9����* +"�0! �,! ������!. 5��" �� ��1 ("������1) ������
� (���!���! ���, ��->! ��, �9��0-��1 ���!9������1 ���. 6��!
����� � ���! ��� 1� � �"�� !��������0!�� (�����(��!� 1), � ��
�!+"( �-<��1 8��+���-<��1. � �0-")��� +�"-.���1 !��:����
��+* � ���� ��� - �"����. ����* �+���9 +�"-.�1 � � -�")���� ���
��0,��<� �"�������!. 2�, :����,', ."���� �����*,
�"���-!, ���! +-�! � 9����1' (��� +���"�, "1 +�"-.�1
55
+�� - ���� �+�")0-<� ;��!!, �. coli), � +��1�"1<� � �' ���*
9�"��.���* ��������.
5.3.1 ��+���/������ ����������"� +����������������� �����
+�������� +�� ��/���� ������������ ��������!��
$<9�* (-�� ���")�� �����,* ��, � ��! .�" ���!9�����,*,
������ 0 ��-"1�����* ���-��-���* .���*. 2��.��* �� , �
+�!�>)< �������� +��" ����")����) �-�"�� �� � �� �-<>*
���-��-���* .��� ��� �+� "1� +��" ����")����) �!����"�� �
�� �-!�! 8�! ���! 9"�, -�����"� "1 ��' �����0!��. B�� ��
+�� +�")�-< ��0!�:����) +�"-.�1 +�"�� ���* 8��+��� ��!,'
��0".�,' +��" ����")����* �-�"�� ��, � ��! .�" ��-�������
���0������,', � "<9�! +��� ��! ���.���! ���-:�.
��-"1�����1 .���) ���� ���+�0����1 ���������-<>!
(�!���,! ���!�! �����0!� �9�+.��� 8��+���< ��
���-��-���* .���. ��!���1 �� +�� +�")�� �'� ���� �+���9��
��"0� ���.���* �(��!� �� ��' �"���', �����,
0�+�����!!�����, � ���-��-� "<9��� ��� ��"<.�<� � �91 ��
������,' 8��+� �� 8��+��� – �������+ < �����"1 < ���,
���-��-�� ���� ' ��-"1����,' 8"!����, � ���: ����� �++������
�������+ �����"1 - +��- 8-����� �->������ ��0".�<��1.
��-"1�����1 .���) ��� �,�����+ (.�� � ����;� +��� �,'
���.��' 8((������ (���-+�"!��0, �9���!, (������� �������+
�����"1 , 9"���,' (������� �+"�*����, (�!����, ��->���"1<>'
+��������"1 ���, !� (�� +�"++� �� �.+.), .�> ���� ��� �
!�:� 8((����� (-�� �������) � ����"��.��! ���.���!
���-:�. 5� ������-����� 8��+����-<>' ������� ��9'� !�
-.�,���) ���9����� ���-��-�, ��-"1�����* .��� ���!9��������
���, �'� 1 0 ����, � ���' ���.��' -�"��1' �"��������,* ��
+� +�"�����1 8��+��������).
56
� ��")�� ��-"1����, +��" ����")���� ���� 1�"1<��1
+�+1����! "1 8��+��� .-:�� �,' ���!9�����,' ����. 2�,
8-����� � ��-++�-<��1 � �+���,, +�8��!- ��: ,* 0 �' !�
��9�����, +��!���� ��!����� �������+ . ��".�")��*
���-��-���* ���9�����)< 9�");����� ���� 8-����� 1�"1��1
.� ���� � �' �� �-<>' (8�0����) ��� �-<>' (�������)
+��" ����")����* �-�"�� ��, � ��10 � .! ' ��0,��<� !�0�.�,!
" +��,��,!. � 8-����� (��!����� ���� ��� �+��,���* 9"��-
�� �-<>* +��" ����")���� �-�"�� �� +���'� � � +�� ��
�+"�*����. �" ����")��, ��, 8-����� � !��-� 8((�����
8��+��������)�1 � �"���' +�������, � !<>' ���������-<>��
�++�����.
���! ����, - +� ;�������� 8-�����.��' !��� � �"���'
+������� � 9- � ��->���"1�)�1 +�� ���� 5'- 3'-��� �,'
��� �-<>' +��" ����")����* (�8+����� +�"� �"�����).
�������+ 1 ���� - 8-����� +���'� � � 1 ��', .�� +��� � �
�9��0����< !���-+� ;�������� (1 ��,' !���). ��") !��� !���
�,+�"�1<� ��")�� � ��+"�0!. 5� +�!>� 0 1 �� � ��+"�0!-
.�0 1 ��-< !!9���- !���-+� ;������ -����.��<��1
+����>�<��1 � ��� ��0,��!, ��+"�0!��.�� !���. ��0� � �
"��' 1 ���* ��+"�0!��.���* !��� 1�"1��1 �" ���!
�+"�*���� – - �"�1 0 !���-+� ;������� +��" ����")����*
�-�"�� �� �������, +�+1����-<>' ���0- 9"��. ������,
����.�<��1 ��� � 9"��-�� �-<>* �9"���, ��� � " ���* (5’)
��� ��* (3’) .���1' !���. #�"� ' � ���' !�:� ���)�����) �� �-"1
(��, ���(�����, ������� �.) � +1� �1� (�� +����""���� ?2
�.). �.���� ���, ����<>�1 � ��+"�0!��.���* !��� +��" - �"�1
�������, ��0,��<� 8�0���!.
���9�����)< !��� 8-����� 1�"1��1 ���: �+���9����) �
�")��������!- �+"�*���-, .�� +��� � � ���0- ��0".�,' ++� ��. �
57
+�!�-, �� ��") ����� ��,�, +� ��0��!- 8��+����-��1 � ��0".�,'
����1'. � >��� ��* :"0 �� �9�+.��� ���0 ���!��� ��") �����,
��-"�-<>�� �� �:�� � �����0! ��") 1, � � !�0���,' �"���'
�9�+.��� �9��0���� �*��++� � CGRP (calcitonin gene related
protein). �+���9����) ��� ��") ����� 0�"�:�� � �� ���-��-�. ��
�� �:� �� ��� �-<>' .�,� �� �-<>' 8�0���, � ���: +1�)
�������. ������, �+���9���-<� �")��������!- �+"�*���-
�9��0����< 0 !���-+� ;������� �-' ��+"�0!��.��' !���,
!<>' �9> 5’- ��0�, 3’-��� ,. B� !��� �+� "1<� ���0 �-'
++� ��, 0 �����,' � �0-")��� +�� ����� (��!�-<��1 �����,
���!��, – ��") ���� �*��++� CGRP [11].
��!���1 �� �->�����, ��0".1 � ���-��-� ��-"1 ����,
��0��9����, !�� , -�+;���� �"�������1 8��+��� 8-�����.��'
���� � �"���' +�������.
5.3.2 (�������+!�� -�������������� ����� � ������� +��������
B��+���1 ���� ��->���"1��1 +-�! ' �������+ �����"1 .
B((�������) �������+ 0���� �� ��+� ��� ���� ���-+�"!��0,
� +��!����-. B��+���1 8-�����.��' ����, +�����,' � 9����
�!�� � ��9�����,! ��-"1����,! 8"!���!, +���'� � �.�) � ��
0-0� ��0".* � ���!�' �������+ �����"1 +��- 8-�����.
�" ����")��, "1 8((�����* 8��+��� � �"���' E. coli
�"��������,* �� �":� ��'� �)�1 +� ������"! ��-"1����,'
8"!���� ������ !��������0!�. ��0�")�,* -����) �������+
���!9�����,' ���� �������-��1 �9�");! ��9���! -+��1 �.��,'
��-"1����,' +��" ����")����*. � ������ +��!����� +������� �'� 1�
� ����������, +��" ����")����: ������������������ ��������
(����!� 5’-TTGACA-3’), ������1 ����-��1 ���"� ���� ���, -35
������")�� ������ �������+ ��9'� !� "1 -0�����1 +��!�����
���-+�"!��0�*, ������������������ ������� (����!� 5’-TATAAT-
3’), ���+�"�:���1 ���"� ���� ���, -10 ��9'� !�1 "1 ������
58
��10,���1 +��!����� � ���-+�"!��0�*. 5�"�:�1 �9'
+��" ����")����* � ��0�,' +��!�����' E. coli ����")�� ��0".�<��1, ��
� +� ��"1<>! 9�");���� ��0 "1<��1 16 – 18 +.�. 5��" ����")����)
5�9��- ������ �� +����� �������9�-!��� �-�"�� � � �� �! ��
������1� 6 – 7 +.�. [11].
��-"1 1 8��+��� ���� +������� ��->���"1��1 � �������! ��
-���� �������+ . B�� �9�+.����1 ���!�* 9"���- �+�������
����������, � ���: �0��!�"�-"1��,' 8((������, �"1<>' ��
�0�!� *��� ���-+�"!��0, � �������9�-!,! ���!.
��9'� !���) ��-"�����1 8��+��� ���� � ����* �:��
�9=1��1��1 �!, .�� ���'8��+���1 �"��������,' ���� � �"���'-
+�� - ���' ���!9�����,' 9"��� +� �+�")0���� �")�,'
������-���,' +��!������ !�:� ��� ��")�� ���0,���)�1 �� '
:0��+���9����, +����")�- +�� -��, 8��+��� .���� �9"� �<�
������.��! *���!. � 8��! �"-.� ���'8��+���1 �"��������,'
���� ��+����: ���1 � -� * �������,' ��� *, ��:�! �������
" ���������* ����� �"��� �: ' �9")<.
B((�������) 8��+��� +� �"������� � 9�����")�,' �"���'
��9�����,' " .-:�� �,' ���� 0���� �"���,! �9��0�! �� �,9���
+��!�����, +�0��"1<>�� ������"�����) -����) !���, �� �-<>*
���������-<>* 9"��. ��9�" 0-.�, 9�����")�, +��!����,,
������"�-<> �+���, !��9�"0!� ��'���� (lacZYA, araBAD, rhaBAD).
�������* � ������� +����.�� ��' lac +��!������ – ���0!�:����)
+�"���� ���"<.�1 8��+��� � +��-���� 9"��-�+������ LacI.
��");����� 8��+����-<>' ������� �� �-<� !� ( ������,* lac
+��!����. ���, +��!���� lacUV5 !� � !-�� � �9"��� -10 �-�"�� �
lac +��!����� � �- !-�� < � ��*� ��10,���1 9"��-���������
����9�"��,' �+����� (� �9"��� -66 �-�"�� �). B� !-��
-�".��<� �"- +��!����� +� ������< � +��!�����! ���� �+�
"�<� 8��+���< � ��� !� 0���!�* �� ����9�".���* �+���.
59
5��!���� tac, �+����,* �+��, deBoer �����., 1�"1��1 �9� �! -10
�9"��� lacUV5 +��!����� -35 �9"��� trp +��!�����. B��� +��!����, +�
!�);* !�, � +1�) ��0 9�" 8((����,*, .! lacUV5 +��!����.
B����"���! tac +��!����� 1�"1��1 +��!���� trc, �����,* ��".���1
� �! �������! � ������-���* +��" ����")���� !: - -35 -10
�-�"�� �!. �9� +��" �' +��!����� '������0-<��1 ���-����! ��*��
��10,���1 ������������ 9"�� CAP [14].
�"1 ��-"�����1 8��+��� ���!9�����,' ���� �+�")0-<�
����-�:���, ������-� , � �����,' 8��+���1 �"��������,' ����
� 0��.�")��* ��+� +� ��"�� (�+���������) �� ����' (�0�' �����
�-")�-�, ���!9�����,' �"��� !�:� 9,�) � - ������ � �-:�,*
!�!�� ��!�. �"1 8���� � ������, !�"�-", ��� 1��1 ��-"1����,
+��" ����")����, ��+�!� lac-�+����, 0� �����,! �" -<�
+��" ����")���� �-�"�� �� +�""���� � ����")�! -���")�,!
��*��! ����� , +� �����,! +���� ��1 �"������� ��" -!���
���. � ����!��� � ��� : ����� ��� ��1 ��-��-"1��� lacI " lacIq,
�� �-<>* 9"��-�+����� LacI. � ���-���� � - �-<>��
��0 *���1 !�"�-", �+������, �� �������� 8��+����-��1
������-����, ��10,��<��1 � �+������!, +�+1����-1 �0�!� *���<
���-+�"!��0, � +��!�����!, +� ������"! �������� ��'� ��1
�"��������,* ���!9�����,* ��. B�� +��� � � �0��!- ��:�<
-����1 �������+ �"����������� ���, �0��!- ��-���"��.��!-
�� �:��< ���������-<>* !��� 9"������ +�� -��� �����"1 .
�"1 � -� 8��+��� ���, ��'� 1>���1 +� ������"! lac-�+����
.�> ���� �+�")0-<� ����.��* ���"�� +��� ���� � -����� �""�-
"����0, - 0�+��+"-9��-D-����"����+����0 (IPTG). �� -����
��10,����1 � !�"�-"�* �+������ ���-;�� �� �0�!� *��� �
�+������,! -.�����! ���. �9"���) lac-+��!����� ��������1 ���-+��*
"1 ���-+�"!��0,, ������1 ��.��� �������9�����) ��,,
���+�"�:��, ��" 0� +��!�����!.
60
����"�! �� 0���;� ���0� !��� 1�"1<��1 ��!�����,
�������+ . �� !<� �� '�������,' -.�����. 5��,* -.�����
�� �:� ����������, +��" ����")���� �-�"�� �� (+�"� ��!,)
��0��* +���1:�����, �9��0-<> ;+".�-< ���-��-�-. �� �����!
-.���� ��'� 1��1 �� ��' � � ��� �� GC-+��, +��" ����")��
���+�"���<>'�1 � ��!�* ;+")� " �+���� �� �. �"��� ��1 8�! �-!
-.�����! 0�! "1��1 �:� ���-+�"!��0, +� ���. ���* -.�����
�9���>� �! ���,! �������!. � �! �� ������1� ���"� 20
�-�"�� �� �� �� ;+")� +����>���1 ���0 !��� ���-+�"!��0�
���� �1��1 �� ���. ���1 - � +��!�����!, �����,, 8��+����-<>
���!9�����, ��, � �"���' E. coli, �":�, �� �:��) ��!�"��.�,
��!�����, �������+ . ��9'� !���) � 8��! �,0���� �!, .�� �:
������"�-!, 09,��.�, 3'-��� �, +��" ����")���� �-�"�� ��
!���, �������9�������* � ���!9�������� ���, ��� ��")��
���0,��<��1 �� 8((������� �����"1 , .��, +�-� !�!-, ��10��� �
-.���! ���' +��" ����")����* � �9��0���� �"�:��* ���.��*
���-��-�, ���!9�����,' !���.
5.4 (������!�� -�������������� ����� � ������� +��������
B((�������) �����"1 �"����������� ��� �+� "1��1
���9")����)< !��� �+���9����)< ��10,���)�1 � �9���!�!. ��
8((�������) �����"1 .-:�� �,' !��� � 9�����")�,' �"���'
���0,��� �"1� +��.��1 ���-��-�� 5'-��� ��* .��� !��� +� AUG-
�� ���!, � �-<>! ���0 9"��. �����"1 1 ��� ��.����1 �
+��� � �9���! �� !���, .�� ��->���"1��1 9"��� ��1 ��".<
��!+"!�����,' +��" ����")����* �-�"�� �� �� 3’-��� 16S ����
� " ���* .��� !��� �� ������1� 4 – 8 �-�"�� �� �� �� ��� AUG.
B��� -.����� !��� ��0,��<� ��*��! ��10,���1 �9���! (RBS) "
������������������� ����-�������� (" SD-�������������������). ���
�9�+.��� � � < �����"1 � +���")���� AUG-�� ��� (�:
61
�+�0��<��1 GUG, UUG AUU �� ��,) ������ 0 5 – 9 +�!->������
+-����,' �-�"�� ��, 1 ��! �����,' 1�"1��1 5’-AGGA-3’ [10].
��-���"��.��1 ���9")����) !��� �+� "1��1 ���: ����.��*
���-��-��*. ���, �9��0���� ;+"� �� 3'-��� !��� +�+1����-�
��� � +� *���! 9�����")�,' 8�0��-�"�0, ����0, II
+�"�-�"�� (��(��"�0,. 5����")�- 0!�� +��.��* ���-��-�, �
-.��! ��0!�:��* ����.��* ���-��-�, 90 0!��1 (-�� ���")�,'
���*��� +� ����"1��1 �"�:��* 0� �.*, +��9"!� ��-���"��.��*
���9")���� ���!9�����,' ��� �;���1 +-�! �� �1 !-�� * �
��, 8�0�- 8� ��-�"�0 9�����")��* �"��-'�01��. ��� ��0,��!,
90����0�, ;��!!, E. coli +�!�1<��1 � ��.��� � +����
���!9�����,' +"�0! . � ���' �"���' +��,;���1 ���9")����)
�������+��� ���!9�����,' ����, � +��:��,* ��-���"��.�,*
-����) �+� "��,' ����0 �+���9���-� 9�" 8((�����* �.���
���!9�����,' 9"���.
��0".1 � 8((������� ���+�0�����1 ������ ��*�� �� !���
�9���!�! +��� 1� � ��0".1! � ������� �����"1 9"�� ("
8((�������) � � �����"1 ) �� �9���! , ������������, �
��0".1! � 8((������� 8��+��� ���������-<>' ����. �������.��
��".1 � SD-��*� ��' �-�"�� ��, ��!+"!�����,' ���������-<>!-
-.����- 16S ���, .��9, �9���!, +��9���" �+���9����) ��10,���) 8�-
!���. B��+�!���")�� �9���-:��, .�� ��� � �1 �! ��'� 1��1 ����")��
� �-<>' �� ����, �9���!, ��.��<� �����"1 < � ����, ������!-
+� ;���-� ��9�" +���1:��,* -.����� ��!+"!�������� 16S ���
[15, 18]. 5�!!� SD-+��" ����")����, � !��� !<��1 �-� -.����,
��9'� !, "1 8((�����* � � �����"1 �9���!�!, ��� ���
�� ������� ��")�� +��.��* ���-��-�, !��� ���0!�:�� +� ���0��)
8((�������) ��*�� ��10,���1 �9���!. ��*�, � � �����"1 ��
!���, �9"� �<> +���1:���* ��!�"��* � 16S ����, 1�"1<��1
!�"�8((����,!, ��0!�:��, 0-0� �";��! +��.���� ��10,���1 �9���!
62
� !���. � .�������, �������� ��0".�,' ��*��� ��10,���1 �9���!
(RBSs) �� 8((�������) �9��� +�"��+���� !!9������� 9"��,
�+��� ������* p8CBDek, +���0�"�, .�� �"��, �� �:�>* 9�" �"�9,*
RBS (AGGACGGCCGGATG) +�� - ����" 9�" �,���* -����) 9"�� �
�"�� +��" 20-.������� +�� � 8��+��� +� 20º�; , ��+����, 9�"
�")�,* RBS �9�+.��" 9�");* �,'� 9"�� � �"�� �� ��.�")��*
��� 8��+���, �� +��� " � 0���- ��< �����"��� 0-0� �,����*
��� ���� 9"�� +����>�< ����� �-")�-�, [14].
B��+����-<> �����, +������, ���! �9��0�!, .�� +��!����, �
�������� ��.����1 �������+ 1 �"����������� ���, �" -<>�1 0�
�! +��" ����")����) �-�"�� ��, ��"<.�<>�1 � �-<>* ATG-
�� ��, 1�"1<��1 .���)< ����, 8((����� 8��+����-<>'�1 � �"���' E.
coli. ���0- ��" 0� ATG-�� ���! ������ ���+�"���<� -���")�, ��*�,
����� , +� �����,! +���� 1� �������� �� �-<>* .���
�"���-!��� ���, 8��+���< �������� '��1� +�"-.�). ��" ��*�
����� , +� ������!- +��0�� ��1 �"�������, ���+�"�:� � ��.�"
�� �-<>* .��� +��� ���� ���, +� �������+ �9��0-��1 '!���1
!���. 5'-��� ��1 .���) 8��* !��� �� +��!����� � ��*�� ����� "1
�"�������1 ���������-� +��" ����")���� �-�"�� �� ������
�� �-� ����")�� �!����"�� +��� ���� ���, ��-"1����,
+��" ����")���� �������� �+�")0���" "1 ������-�����1
8��+����-<>�� ������. 5���1:���1 : 3'- ��� ��1 .���) ����* !���
9- � �������������) �"���������* +��" ����")���� �-�"�� ��. �"1
�9��0����1 '!����� +�"++� �, N-��� ��1 .���) �������� �� �-��1
������!, � �-��� ��1 - �"��������,! (���!���! ���, ��������
�"���-!��� ��� �":�� 9,�) �,+�"��� � � ��* ��!� �.�,���1.
�� �-�' (�������, ���0,��<>' �"1� �� 8((�������)
�����"1 , �" -� -+�!1�-�) .�����- ����.�!��� �� ���� +�
�� ����� 9"��� � ���-��-��,' .���1' ��0�,' ���� (��9" , 4 - 6).
�0�����, .�� 0-0� �,��: ����� ���.����� �� � � ��* ��* :
63
�!����"�� ���������-� ����")�� �� ����. ��+�")0����
����!.��' �� ���� � �"-.�*�� ����:�� ��".�����-<
+� ����"�����) �� ")�,' 0��� +����,' ���� � �"���' �����0!�.
#�����, ����.�!��� ��0".�,' ���� � ��0�,' �"���' +��- 8-�����
��0".�, +�"�:�")�� ����"�-<� � .������! �+�")0����1 �� ����
� �"���' �' : �����0!��. 6�!�, �� ���� � !��� �� ����!.��
+��� 1� � ��")�� � ��:�< -����1 �����"1 0!���,' !��� �
�"���', �� ��+����: �<��1 -!�);�! ���9")���� ��!' !���. �
�-��* ������,, .������ �+�")0����1 �� ���� � ��0�,' ���' � ����
���� : �����0!� 1�"1��1 8((����,! (������!, ��-"�-<>! -����)
8��+��� 8�' ���� � +�� �� �����"1 . #! �: ��� " ��* �� ��
�+�")0-��1 "1 �� �����1 �!����"��, � ����! �����0!, �! �
!�);* �������)< �� 9- � �����"�����)�1 �9���!�! ��" ���
�0��* ��-���"��.��* ��� ���� ����, -0��<>* ����* �� ��.
5��-���� �9�");��� .�"� � �' �� ���� � ������,' ���!�' �
�,���! -����! 8��+���, �� �:�>' ����"��.�, ��,, �
�,0,��� ������ 0��.�")���� ��:�1 � ���0 !;��,' 9"���, ���
�" �� �� �-��1 �"�����! � �' "1 E. coli �� ���� [16, 17]. 6�!��
+� +�.��")�,' �� ���� � 5'-��� �,' .���1' ���� 9"��� � �,���!
-����! 8��+��� �� � �� ����.�<>�1 �� ��, ��:�� -����)
���0� ��� 9"���, ��� ' !���. �0-")���, �-�"�� ���� ���"0�
��0".�,' ���� E. coli +���0,��<�, .�� �" 9"� ���0�-<��1 � �"���'
� 9�");' ��".����', �� �� �-<> ' ��, �����1� � �������! 0
�+�!�")�,' �� ���� (��+�!�, ��, �9���!�")�,' 9"��� (rpl rps),
9"��� ��;�* !!9���, (ompA), �"��.��* ���� (lpp), ���-+�"!��0,
(rpoB), (������ 8"���� �����"1 Tu (tufA), 9"�� recA �.). ��+����,
�" .�"� !�"�-" 9"�� �� �"��- 0!�1��1 � �! (��+�!�,
��-"1����,* 9"��, �� �-!,* ���! trpR), �"1 ��+�!�")�,' �� ����
0�!��� ��0������ [18].
64
� �����1> ��!1 "1 8��+��� ����, �� �:�>' � � �� ��,,
+�"-.�, +"�0! , (pRIG, pRARE, pACYC, pSC101 �.), �� �-<>
��, ��0".�,' � �' ���� (argU, ileX, glyT leuW) [16].
(����!� 4 #������ (�� �,�1.-) �+�")0����1 �� ���� � ���!�' E. coli, B. subtilis,
��::* S. cerevisiae ."���� [19, 20].
�!����"��� �� �� E. coli
(199)
B. subtilis (7) S. cerevisiae (64) Homo
sapiens
(135)
Arg CGA
CGC
CGG
CGU
AGA
AGG
2,2
21,5
2,9
28,5
1,0
0,6
3,3
5,2
4,3
10,0
9,5
2,8
1,8
1,4
0,7
8,1
28,0
6,0
5,2
11,1
7,7
3,6
10,8
11,4
Leu CUA
CUC
CUG
CUU
UUA
UUG
2,3
9,2
59,1
7,9
8,2
9,7
4,7
8,1
16,1
23,2
17,6
10,0
10,8
3,7
6,8
8,2
20,3
38,3
6,1
22,0
43,7
10,7
5,9
11,5
Ser UCA
UCC
UCG
UCU
AGC
AGU
5,0
11,4
7,2
11,5
15,4
5,5
15,2
10,4
7,1
25,1
28,5
5,7
11,0
15,7
5,4
27,0
5,7
9,4
9,2
18,7
4,3
14,3
20,5
8,7
Thr ACA
ACC
ACG
ACU
4,8
25,2
10,9
11,0
31,3
6,2
16,6
10,4
12,7
17,2
4,7
23,3
14,1
25,1
5,5
13,4
Pro CCA
CCC
CCG
CCU
7,2
3,0
25,5
5,1
7,1
2,8
11,4
13,3
22,4
3,9
2,8
10,6
11,8
18,5
6,0
14,3
Ala GCA
GCC
GCG
GCU
21,3
23,0
34,5
20,0
24,2
19,4
16,1
27,5
13,8
19,6
5,1
35,1
12,7
29,8
5,9
20,1
Gly GGA
GGC
GGG
GGU
4,7
31,2
7,6
32,5
22,3
23,7
7,6
22,3
6,5
9,5
4,1
44,8
14,6
24,3
13,7
10,3
65
Val GUA
GUC
GUG
GUU
13,1
13,0
24,3
23,5
12,3
14,2
10,9
24,2
8,6
19,0
10,2
30,1
6,2
16,2
30,9
10,6
Lys AAA
AAG
38,7
12,2
50,3
19,9
32,4
45,0
22,0
35,8
Asn AAC
AAU
27,3
13,0
26,6
20,9
28,5
23,9
23,6
16,9
Gln CAA
CAG
12,3
31,6
19,9
17,1
28,1
8,3
11,5
32,7
His CAC
CAU
11,8
9,4
10,0
13,8
9,2
9,9
14,3
9,8
Glu CAA
GAG
47,4
19,0
42,2
20,9
51,4
14,6
26,8
41,6
Asp GAC
GAU
25,1
29,7
24,2
30,4
25,7
33,4
30,2
21,4
Tyr UAC
UAU
14,7
13,4
15,7
22,8
20,1
14,6
18,4
12,4
Cys UGC
UGU
5,5
4,0
2,8
4,7
3,6
9,0
15,1
10,0
Phe UUC
UUU
20,1
15,6
12,3
24,2
19,6
18,1
25,7
17,3
Ile AUA
AUC
AUU
2,1
31,9
23,9
6,6
18,0
31,8
9,7
19,6
30,3
5,1
24,0
13,5
Met AUG 27,1 23,7 19,3 25,1
Trp UGG 10,7 7,1 10,2 14,2
Ter UAA
UAG
UGA
2,0
0,2
0,6
1,9
0,5
0,9
1,5
0,9
0,7
1,1
0,5
1,7
�9> .�"�
���"0������,'
�� ����
71736 2108 20891 40328
5�!.��. � ���9��' -��0��� ��".���� ����, +� �����,! +���� "��) -�� ��.
(����!� 5 ��9�" � �� �+�")0-!, �� ��, � E. coli, ��::�', ��0�(", �����"-! +�!���' [16].
E. coli ���:: ���0�("� ������"-! 5�!��, �!����"��� AGG, AGA,
CGA, CGG
AGG, CGA,
CGG, CGC
AGA, CGA,
CGG
AGG, CGA,
CGG, CGC
CGA, CGG,
CGC, CGU
�����
AUA AUA �0�"* �
CUA CUC UUA CUG $* �
CCC CCG CCG CCG 5��"�
UCG AGU UCG UCG ���
66
GCG GCG GCG �"���
ACG ACG ACG �����
GGG GGG 2" �
UGU 3���
CAG 2"-��!�
GUG ��"�
(����!� 6 ������")�, .�����, �+�")0����1 �� ���� � ���' E. coli [11].
�����* �-�"�� 5��,*
�-�"�� U C A G
���*
�-�"��
U �� �
�� �
$* �
$* �
�� –
�� –
�� –
�� –
�� �
�� �
��
��
3� –
3� –
��
�� I
U
C
A
G
C $* �
$* �
$* �
$* O
5�� �
5�� �
5�� �
5�� �
2� –
2� –
2"� �
2"� �
��� �
��� �
��� �
��� �
U
C
A
G
A �" �
�" O
�" �
�� I
�� �
�� �
�� �
�� �
��� �
��� �
$0 �
$0 �
�� –
�� –
��� �
��� �
U
C
A
G
G ��" �
��" �
��" �
��" �
�"� �
�"� �
�"� �
�"� �
��+ –
��+ –
2"- �
2"- �
2" �
2" �
2" �
2" �
U
C
A
G
5�!.��: �, � – ������������ �+�!�")�,* ��+�!�")�,* �� ��,; � –
����")�� �+�!�")�,' �� ���� "1 � ��* �!����"��,; I – ������,* �� ��;
+��.�� (–) – �� ���,'.
�� 8((�������) �����"1 �� ��� ���0,��� �"1� �������
�� ���, �.. ��� �, ���-:�<> �� �� +��" ����")���� �-�"�� ��.
B��� (��!� +� +�.��")���� �+�")0����1 � �' �� ���� +�
�-�! ��9'� !� -.�,���) � �+,��' +� �+�!0� 8��+���
.-:�� ���� ���.����� !����"� � ����"��.��! ���.���!
���-:�, +����")�- ���������� � .������' �+�")0����1 �� ���� -
�����0!�� ��0�,' � �� !�:� �"-:�) ��)0�,! +�+1����! "1
+�"-.�1 8((�����* 8��+��� �"���-!,' ����. ��:� -����1
8��+��� +� �"1�! +� �9�,' (�������, � .�������, ��9"< �" +�
67
+�+,���' 8��+��� ���� �����* � �"���' ��::*, � ���: � �-�'
����"��.�,' ���!�'.
���! �9��0�!, 8((��,, ��0���<> � ��10 � ��0".��* .������*
�+�")0����1 �� ����, ��9'� !� -.�,���) +� +� 9�� ���.��'
���! "1 8((�����* 8��+��� �"��������,' .-:�� �,' ����. B���
(����� !�:� ���0��)�1 � �! 0 �;�<>' +� +�"-.� +�"����)<
����.��' ����, ��+�!�, ���� ++� �,' ���!����, "1
�+�")0����1 ' � 9��'��"��, � ���: +� +"������� !-�� ���,'
0�!� �-�"�� �� � 9"����* �:��.
5.5 <��+������ +�+���� � ����!�� ���������
5� 8��+��� 8-�����.��' ���� � 9�����")�,' �"���' .���)
���!9�����,' 8-�����.��' 9"��� ������, +�������.��
9"� +� �,����! -���� 9����0� +�'� 1� � ��������!� �����1�,
�9��0-1 ��� ��0,��!, �") � ��"<.�1. �") � ��"<.�1 +� ����"1<�
��9�* .��� ,, �����1> 0 �������� ���!9�������� 9"�� �1 �
9�����")�,' 9"���. ���!9�����, 9"� � �") �' ��"<.�1
��'� 1��1 � ���-��������! �������! �����1�, "1 ' +�"-.�1 �
�������!�! � +�'� ��1 +�!�1�) !�>�, ���-��-<> ����,,
��� ��� !�.���, �-�� �'"�� �����,. ��"<9"0������,* �
8�' :���' -�"��1' ���!9�����,* 9"�� "1 ���������"�1 ������*
���(��!� ��9-� ����-�� , � +�� �� �9��9��� 9"� !��-�
0!�1�) ���< ���-��-�-, � +� ��� �������� 0 ��09��"��,'
���������, � �����,' +���� ��1 ����-�� 1, .���� ����) �,+� �<� �
��� ��. B��+���1 ���!9�������� 9"�� � �") �' ��"<.�1 ���0,����1
�� 0!�� ���' �� ���*���, ��� �������!���) 9"��, �� ���9")����)
��'���� 9�"��.���* ��������.
���"���� !� " �"������-��������, +� ���0,��<>*
�������!���) ���!9�����,' 9"��� � �"���' E. coli, �+� "1<>! �
�9��0���� �" ��"<.�1 1�"1<��1 �� (������ – 8�� �-!!���,* 0��1
68
9"�� ��".���� � +��.��* +��" ����")���� �!����"���,'
��������, (��!�-<>' ���. 5��> �����1, !� ") -���: ��, .��
�,���� 0��1:��, (+�"�:�")�� " ��� ��")��) 9"� � �9�");!
��".����! ����-�9��0-<>' �!����"���,' �������� � ' ������
(�" �, +��"�, ��� ��+�����) � �,����* ���1�����)< 9- -�
8��+��������)�1 � E. coli � �������!�* (��!.
���"���� �-'+���!�����* !� " �������!��� �����.���1
+�!���1 (CV) �+� "1��1 ���:
CV = E1 [(N+G+P+S)/n] + E2 F[{(R+K) – (D+E)}/n] – 0.03F,
� n – .�"� �!����"�� � 9"�,
N, G, P, S – .�"� Asn, Gly, Pro " Ser ��������, ������������,
R, K, D, E – ��".���� �������� Arg, Lys, Asp " Gln, ������������,
E1, E2 – ��8(( ��, (15.43 -29.56, ������������).
���1�����) �������!��� 9"�� �+� "1��1 +���!���! CV – CV’,
� CV’ – ���!����, ����,* 1.71. ���"���� ����* !� " 9"�� 9- �
��������!,!, �" ��0� � CV – CV’ +�"�:�")��1, ���9����,
�������!,!, �" ��0� � CV – CV’ ��� ��")��1.
���1�����) �������!��� " ��������!��� 9"��
+� ���0,����1 �" -<>! �,��:�!:
���1�����) �������!��� " ��������!���
= 0.4934 + 0.276 F CV – CV’F - 0.0392 (CV – CV’)2 [21].
� �"���' 8-����� "1 +� �:��1 9"��� � �������!�! �����1�
��"0-<��1 �� ������,' !'��0!�: ��!+���!���"0� 1 +�� -����
�����"1 , 9"��-9"���, �0�!� *���1 +��������"1 ���,
!� (�� . � 8-�����.���* �"�� +�"++� �, +,
�9��0-<>�1 � �0-")��� �����"1 !��� �9���!�! �
8� �+"�0!��.���! ���-"-!, +��" ����")�� +��'� 1� .�0 �1
��!+���!����, � +���+��<� +��������"1 ���, !� (��
((��(��"�����, � ����"�����, �"��0"����� �����.��,*
+����"0). 5���")�� �����.��� ((�" ��) +�"++� �,' +*
69
������,' 9"��� � �"���' 8-����� �9�+.����1 �+ (.��!
9"��! ;�+����!, � ��� : (�" �0�! 0�!��0�!.
5����")�- -�"��1, ��9'� !, "1 +� �:��1 8-�����.��'
���!9�����,' 9"��� � �������!�* (��!, � !��-� 9,�) ��"0����, �
9�����")�,' �"���', � �' +���'� � ����� 1 ���!9�����,' 9"���
� �9��0����! �" ��"<.�1. � �->���-� -�����")���� !�� �,
+�0��"1<>�� +�"-.��) ���!9�����, 8-�����.�� 9"� �
9�����")�,' �"���' � ������! � . � ������,' �"-.�1' ������.��
+��:�1 �!+���-�, �,��>���1 ���!9�����,' 9����* "1
+�"-.�1 +�"����)< �������!,' ���!9�����,' 9"���, +����")�-
� ��(�9�, �0�!� *���1, �+� "1<> �9��0���� �" ��"<.�1,
�!+���-��0���!,. 5��:� �!+���-�, �,��>���1
���!9�����,' 9����* +��� � � -�"�< 8��+��� ;�+����� E.
coli, 9"��� ��1 �����,! +���'� � -�".� 8��+��� ��������
���!9�������� 9"�� [22]. � ��!- : ��9"< �"��), .�� � - �-!, +�
+��,;���* 8��+��� 9"��� +����0, �+"����� ;��� +����.��
������, � -�"��1' �0�' �!+���-�, +�8��!- 9"�, 8��+���1
�����,' � - ������ +� �!+���-��' 15 - 23º�, ����0 � !�);
+� ��:�, +����"�.���* ��� � [23].
��-��* �+���9 +��,;�1 8��+��� �������!��� ����"��.�,'
9"��� � E. coli 0��"<.���1 � +�"-.� '!��,' 9"���, �� �:�>'
�"-�����-S-�����(��0- (GST), !�")��0- ��10,��<>* 9"�� (MBP)
��� ���� [21, 24]. ��"<.� ++� � � ������ �9� ���� 9"�� ���:
1�"1��1 �+���9�! ���9"0� ������' .-:�� �,' ++� �� � �"���'
E. coli, �����, !� ���9")�, � 9�����")�,' �"���', .! ��-+�,
�����, 9"�. � 8��! �"-.� +��" ����")����) �-�"�� ��,
�� �-<>-< �9� �,* 9"��, �� �1<� � ������ 8��+����-<>��
������ � � ��* ��!� �.�,���1 � 9�����")�,! ���!, �� �-<>!
9"�� (��+�!�, ���! 9��-��"����0 �0,). �9��0-<>*�1 �9� �,*
9"�� � ���! ������ �� �:� � N- " �-��� ��* .��� ��9-!,*
70
++� , 0�>>��,* ������,! 9"��!-����"! �� +����"�.���*
��� � . �"1 �� "�1 ++� � �� 9"��-����"1 ' �� �1<� �-� �
�-��! +��" ����")����)< �!����"��, +� ������* !�:�� +�����
�+ (.��� ���>+"� +�"++� ��* +.
��0!�:�,! +� '� �! � 8((�����!- ���0- �������!,'
����"��.�,' 9"��� � 9�����")�,' �"���' 1�"1��1 ��8��+���1 �
�"���' 9����*-'�01� ����, �� �-<>' ;�+���, "�,
���!9�����, +�"++� ,. ��"�-"1��, ;�+���, +� ����"1<�
��9�* 9"�, �����, �+���9���-< (�" ��- 9"��� de novo +��9���<
������* ���(��!� 8��+����-!,' +�"++� ��, � ���: ��-"�-<�
�"��.�-< "���"0� < 9"���, � ������1�) .���)< ' ���.��*
���-��-�,. 5� !'��0!- *���1 ��0".�<� �� (-�� ���")�,'
+� �"���� ;�+�����:
�) ;�+���, (�" ��� (��+�!�, DnaK GroEL) �+��� -<�
�(�" �� ���' �-9������� .�0 ���-0���!, ���(��!� ���,
0!��1, +�+1����-1 �9��0����< �" ��"<.�1 +-�! ��:�1
����� ���!9�������� 9"�� +����"0� 9"��� � ���-;���*
���.��* ���-��-��*;
9) ;�+���, ��10,���1 (��+�!�, IbpA, IbpB) +� �+� "��,'
-�"��1' - �:��<� � +�"����)< �(��!�����; ���.�-< ���-��-�-
9"� �� ���* +���'����, +�+1����-1 ��9���!�* �����
���-�������,' +� *���! �!+���-�, 9"���;
�) ;�+���, 0����� (ClpB, HtpG) +��� 1� � �������!-< (��!-
9"�, ����������, +� *���! �������,' (������� [16].
��" -�����")�,! +� '� �! � +�"-.�< ���!9�����,' 9"���
� �������!�* (��! +�0��"1<>! 0�>>��) ���!9�����, 9"� ��
��-���"��.���� +����"0� 1�"1��1 �9�+.� �����-!���
'������� ' 8��+���, �.. ��� ���0�-<>'�1 ���!9�����,'
9"��� � +�+"�0!��.��� +����������� " ���-:�<>-< �� - +��"
0���;�1 9����0�. �0�����, .�� ��� 8-�����.��, ���
71
+�������.�� �������, 9"� �� N-��� 8��+����-<� �'�:
����")�, +��" ����")����. 5� 8��+��� +�������.��'
�������,' 9"��� � +�+"�0!- " �� ���"��.�� +����������� N-
��� ��* ����")�,* ++� ��>+"1��1 ����")��* ++� �0�* [25]. �,"�
���: -������"��, .�� 8-�����.�� 9"� � ��9�����,! ����")�,!
+��" ����")����1! !��-� ���������)�1 �"���! E. coli 8�
+��" ����")���� ��>+"1<��1 9�����")�,! (�!���!. ��"
���!9����,* 9"�� � �� �:� ����")��* +��" ����")����,
��9'� !�* "1 �� ��� , �� +� ������-����� +�� - ���� �
�"���-!,! ���! +��� �1<� (���!��, ���, �� �-<>
����")�, +��" ����")���� �����-!,' 9"���. � 8��+�!���' �
�"���! E. coli "1 8���� �+�")0-<� ����")�, +��" ����")���� 9��-
"����!�0,, >"�.��* (��(���0, (PhoA), � ���: 9"��� ��;�* !!9���,
(OmpA OmpF). 5�"-.� ���!9�����,' 8-�����.��' 9"��� �
�����-!�* (��! �,�����'��"��.��, +����")�- 0��.�")��
�9"�.�� ' �.���-. ���! ����, - �����-!,' 9"��� 9�"); ;�����
+��9��� �����-< ���(��!� <, ��� ��� �����.��� +�"++� �,'
+* +���'� � � 9�");�! �9=!, , �" ����")��, 9�" �0��* '
��� ���� , .�� +� �����>�� ����� < +�"++� �,' +*, �
+�"����)< �(��!�����;' ���< ���.�-< ���-��-�-.
� 9�����")��* �"�� �� �:��1 2 – 3 �,�. ��0".�,' 9"���,
��: ,* 0 �����,' ������"1� � �� �! 0,04% �� ' �9>* !���,. 5�
�"������� 8��+��� � 9����1' .-:�� ���� ��� �"1 �� �-!���
! � � -�")���� 9"�� !�:� ������) 20%. �"��, � �����,' 8��
�".�� ������"1� 2% 9�", ��0,��<� �-+�+�� - ���!.
�->�����-< +��9"!- +� �-")������� �-+�+�� - ����
+� ����"1� ����9")����) ���!9�����,' +"�0! �,' �������. B��
����9")����) !�:� 9,�) (-�� ���")��* " ���-��-���*.
�-�� ���")��1 ����9")����) ��0���� ��" ��� ���-;�*
!'��0!� �+"�� " ���+� "�1 ������,' !�"�-" ��� +�
72
�.��! �"���!. 5� 8��! �����, ���!9�����, ��� .�>
��"<.�<��1 0 �"���, .! +"�0! ,, �� 9�0 �����,' �� 9,"
�������-�����,. �-�� ���")��1 ����9")����) +��� � � -!�);�<
.�"� �+"����� , ��� �" ���, � -�".�< ���1����� �9��0����1
9�+"�0! �,' �"��� � +�� �� "�1. �"1 8"!�� 9�+"�0! �,'
�"��� � �����, ��� 1� !����, ���9����-���*.���� +���� 1�
�"����,* ��9�� �"��� � +��-���� ���������-<>' ���9�����.
���-��-���1 ����9")����) ���!9�����,' !�"�-" ���
0��"<.���1 � ��!, .�� �� !��-� ��!�+��0��")�� -����.���)�1. B��
��.��� ��10��� � !�"�* !����)< +"�0! �,' ������� "1 �"�������1 �
����;� �"���-!,' (���!���� ���. ��0!� ������� �"���-!�*
��� � +"�0! �,' ������', �����, �+���9�, ���9")�� � �'
�->�������), ��� +���"�, � +��,;�� ����")�' �,�1. +�� �������*.
��"); ������ ��� � ������,' +"�0! �' ����9")�,, ' ��0!�,
+���+��� -!�);�<��1 +� !� -�".�1 .�"� ��-� �� �+"��
���!9�����,' +"�0! in vivo. 5�!->������ "������
.-:�� ��* ��� � +"�0! �' 9�");��� ��0!�� ��10��� � �!, .�� �
9�����")�,' �"���' �"����� +�!->���� +�"-.�<� � +"�0! ,,
��!1 �+"�� �����,' !�!�")��.
5.6. %���" ��������������� +���!����� +�+���� �� ������
+��/���"� �������� � .������ E. coli
� �! 0 !�� �� ������-�����1 �9� �,' !�"�-" 1�"1��1
���������,* !�� , �����,* 0��"<.���1 � ��!, .�� � 3’-��� �! � ���� 0
���!9��-!,' in vitro "���0�����,' (���!���� ��� � +�!�>)<
��!��")��* 0����-�"�� "�����(��0, �������<�
� �� +�..�, �"��(d�)-+��" ����")����, � � 3’-��� �! �-����
(���!��� �"��(d�)-+��" ����")���� +�!��� ����* : "�,. 5�
��:� +�"-.��,' (���!���� (��!�-<��1 ��") �, !�"�-", 0� �.�
�9��0����1 �� ��� �,' ��10* !: - �"��(d�)- �"��(d�)-
73
+��" ����")����1!. � �� +�..�, 9�; �9� �,' !�"�-" ���
0�������<� � +�!�>)< ���-+�"!��0, I E. coli, + ����"����
�;��<� ���-"��0�*.
��9�" .����-�+�")0-!,! !�� �! ������-�����1 �9� �,'
!�"�-" ��� in vitro 1�"1��1 �������0��-"��0�,* !�� . �"1 8����
������-< !�"�-"-, �� �:�>-< ��*�, -0�����1 �������0 �"���� II,
�!+"( ������,* (���!�� ��� � �� ��,! � ��� ���������-<>!
��*��! ����� , � ��"0-<� �+ (.��! �������0�!. 5� 8��!
�9��0-<��1 (���!��, ��� � �0�!���!+"!�����,! "+�! ��� �!.
5� �!;� (���!��, �9= �1<��1 � ������ �+� "���* �����
������")�� �-� �-��, "1 ' ����"������ ��10,���1 � ��� ���-<
�!�) �9��"1<� ���-"��0- (��� �4. 5��" ��: �* "��0��* ���
�9��0-��1 �!�) ��0���9��0�,' �9� �,' !�"�-" ���, 0 ������*
"�, !�"�-", � 0� ����* ���-��-��* ��9��<� �� ��� �� �1 �
�"�� ��0!��:�1 �9� ��, � ���: �� ��� �"� /" ���"0�
�9� �,' �"���� �� +��-���� ����-<>* ���.���* ������-� .
5.6.1 �������� ��������+!��.
2��! 8-����� !� !�0�.�-< ���-��-�-, �.. "<9�* �� ������ 0
8�0���� �������, �� �-<>' ��� �-<>' -.������ ���. �"1
+�"-.�1 (���!��� ���, �� �-<>�� "��* �� " �� (���!��,
�9,.�� �+�")0-<� �9����-< �������+ < !���.��* ��� (!���) �
��!+"!�����-< ��� (����). ��� < �9�����* �������+ +���� 1� �
+��-���� �")�,' ��9����� ����0��* ��������. � ��.���
+��*!��� +� �9�����* �������+ �+�")0-<� �"��(dT) " '!.��
���0������, �"���-�"�� ,, ��!+"!�����, 3’-��� - !���. 5�
8��! - ���1 +�"-.��) +�"����0!��, ���-��+ "�,' !�"�-" ���.
1. �"1 �, "�1 �-!!����* ��� ����) �0���) ��!���0�����) � 5
�9=!�' 0,5% SDS 10 �9=!�' �� ����,>����� (��"�.
2. 2�!����� +���� � .��-< +��9��- �9���) � ��� ����1 (��
4,2) � ��� ���� 0,2 �. �������� +�!;��).
74
3. ��0 "�) (�0, ���(-������! � �.� 10 !�-� +� 12,000g.
4. �� �-< (��'�<<) (�0- +���� � .��-< +��9��- +�������
8�����������) �!�)< (��"-'"���(��!.
5. �� �-< (�0- +���� � .��-< +��9��-, ��� �,�� �), �9���
�� �9=!� 96% 8����"�, ��-9�����) +��9, � �.� 1 .��� +� -70º� "
� �.� ��. +� -20º�. ��� �� ��� +�"-.�<� ���(-������! �
�.� 20 !�, 16000g, 4 º�, ��9��<� �-+������� +��!,��<� 80%
8����"�!. ��� �� +� �-;�) ��������) � �� .
6. �"1 - �"�1 +�!�* ��� +�"-.��-< !��� �9��9����) ����0�* I
(1 . �������� ����0, I/!�� ��� � 9-(�, �� �:�>! 40 !� ���-��l
(�� 8.0), 10 !� NaCl, 6 !� MgCl2, 1 !� KCl 15 – 20 . RNAsin) � �.�
30 !�. +� 37º�.
7. ��� 8�����������) (��" – '"���(��!�!, '"���(��!�!, 0��!
�9���) � ��� ����1 � ��� ���� 0.3 � ��� �) ��� ��!1
�9=!�! 8����"�. ���-9�����) � �.� ��. +� -20º�.
8. �"1 +�"-.�1 ���� +����� ��� < �9�����* �������+ �
�+�")0����! 1 !�� �-!!����* ���, 0�1�������� �"��(dT)-+��*!��
15 – 20 . ��. ���-0���!�* ���-+�"!��0, ��-�� !!-�� ( ��
."���� +����� �+� � 20 !�" 9-(��, �� �:�>�� 50 !� ���-��l (��
8.0), 5 !� Mg(Ac)2, 5!� DTT, 0,5 !� EDTA, 80 !� KCl, 100 !�� dNTPs
15 – 20 . RNAsin) � �.� � ���� .��� +� 37º�. 5�����) �!�) 15 !�-�
+� 75º� "1 ������ �����0,.
5�"-.��-< ���� �" !�:�� ��� �) �+���! 0 ��� ����*
�!�, "9� �+��� ������ �+�")0����) � ��.��� !��� , "1
�!+"(�� �-:���� (���!��� ��� � +�"!��0��* +��* ��� .
5.6.2 �+�� ���!�� �0 ' !������� ���� ������ +�������/��� !�+���
����!�� (&,�)
5�"!��0��1 +��1 ��� 1 �+�")0-��1 � '� ������-�����1 ��
!���' ��� 1': �� 8��+ ��0 ��1 ���.��' ������-� *, +� ���"0
9�����")�,' ��"��* +�+������ +"�0! �,' ���. ��"��1 +��� �1
75
53� ���)�-<� � 0���!��� �� �: �!�* "�, (���!���, +��� ,
!���.��* ��� ��9'� !��� ��".���� +�� -���.
5� ������-����� :"��")�� �+�")0����) �,������.�-< Pfu –
+�"!��0-, 53� +���� �) � 50 !�" 9-(��: 20 !� ���-��l (pH 8.8), 10
!� KCl, 10 !� (NH4)2SO4, 2 !� MgSO4, 0.1% Triton X-100, 0.1 !� dNTP,
0.002 !� +��*!���, 0.1 . ���. Pfu - +�"!��0,, 30-200 �� !���.��*
���. �������) +������1 +: 2 !�./1 �.+.�.
�� ��' ����")�,' �"-.�1' 53� +���� " � 20 !�" 9-(��,
�� �:�>�� 67 !M ���-HCl pH 8.9, 16 !M (NH4)2SO4, 1.5 !M MgCl2, 0.01%
Tween 20, C-!���+��8����", 0.1 !M dNTP, 0.002 !M +��*!���, 1 . ���.
Tag-+�"!��0,, 10 �� – 1 !�� !���.��* ��� (� �"-.� 53� � ��"��*,
��"��1 �� ���.� �����). �������) +������1 +: 1 !�./1 �.+.�.
5�"!��0��1 +��1 ��� 1 ��.����1 � +� ����")���� +������
!��� ,, ��9'� !��� "1 ���-�� . 5� �+�")0���� � ��.���
!��� , � �� +�..��* ��� " +�� -��� 53� 8��� 8��+ � ��9-��1.
�!+���-�� ��!1 ���-�� +� 9��<��1 ���, .��9, +�����
���-�� < !��� ,, +� 8��! � ��0�-;� ��� +�"!��0-. ���,
��!1 "+�"-���+� �" Taq +�"!��0, � 0���!��� �� �!+���-�,:
92.5o� 130'
95.0o� 40'
97.5o� 5-6'
6��! +���� 1� ��:� +��*!��� +� �!+���-�, ������1 �� 1 – 2º�
!�); �!+���-�, +"��"�1 �"���-�"�� ��. B��+, �� ������!
+���'� � �������* ���0 ���, ��0,����1 8"���� *. #�> ����
8"���� < +���� 1� +� �!+���-� 72º�, �.�. +� 8��* �!+���-�
+�"!��0��1 ��������) !���!�")��, �� ����1 �!+���-�� 8"����
+�!"!� � "1 ��' �"-.��. ��+�!�, !��� , � �� �:��! �-�
~90% - ���1 �!+"( �����) ��")�� ��0� � � ~60o�. #�"� �"��
�!+"(�� �9,.�� 25 - 35. �";��! 9�");� .�"� �"�� .�����
���,>�! PCR ��� .
76
5.6.3 ������� ���������
5� ������-����� (���!��, +"�0! ��* ���, +�"-.��, �
�0-")��� ����� , ���!� -��1 �.>��) �� +�9�.�,' +�� -����
(�!�������* ��� , .��9, +��,��) 8((�������) ��9��, "��0,
-!�);�) ��".���� ��������� ������, .�� -�"�:�� +�� �� �"�
�"����.
�"1 �.��� "���0������* +"�0! ��* ��� �+�")0-<� !��
�")-8"����(��0� � �����0 � +��" -<>! �, "�! "��* (��!,
+"�0! , 0 �"1 (!�� � +�� �, �:). �!+"( �������1 ����
"���� ��� (������) +��" ����� �.>���1 �+����,!
+����: �! (!�� �� �+���� � ��0 " "�, "� +"�0! ��*
���"), +� 8��! �0��!�"�-"1��, (���!��, ����<��1 � �� ��-
�+�����* (�0.
B"����(��0 � �����0��! �"
���"0�-<>* 8"����(��0 ��� +���� 1� � 1% �����0��! �"
(�" -� !�1�) +�� �� �����0, � �" � 0���!��� �� "�, ��0 "1!,'
+��" ����")����*), � TAE 9-(� (40!M T��-HCl, 20!M -��-���*
��"�� 1!M B���), +� ��+�1:� 10 - 20 �/�!. � �"-.�, �"
8"����(��0 �+�")0-��1 "1 ��0 "�1 (���!���� ��� � ")<
�")�*;�� �, "�1 ' 0 �"1 ��0 ��1 ���.��' ������-� *,
"1 0�����"�1 �"1 +�!�1<� "���+"���-< �����0-. � 8��! �"-.�
(���!��, ��� ��0 "1<� +� ��+�1:�: 5 - 7 �/�!.
��9�" - �9�,* !�� �0-�"0� ��� � �����0�,' �"1' –
����;��� ("-��� �-<>! �����"! 8� ! 9��! �!. ��"�-"�
8���� �>���� �� �:� ��-++-, ������1 �����"�-� !: - ��� �!
�������1! ���. � �0-")��� ����* �����"1 � �+��� ������*
9"0��� �� �������* �����") ��10,����1 � ���, .�� ��+����: ���1
-�".�! ��������� ("-��� � . ��-0"-.�, +��"�>�!�
��� � �9"��� 260 �! +� ���!� �� �����") (" : 0"-.�,
77
+��"�>�!� ��!! �����"! +� "��' ��"� 302 366 �!), �+-�����1
0��! � ������-����:��* �9"��� � !��� �+���� (590 �!).
�9,.�� 8� * 9��! (0,5 !��/!") �9��"1<� � �"), �
8"����(���.��* 9-(�. � �� +��-���� 8"����(���.���1
+� �:����) "�*��* �-' +�..��* ��� ��:���1 +�!��� �� 15%,
�� +� 8��! +�1�"1��1 ��0!�:����) ��9"< ��) 0� +�� ���! ��0 "�1
�+��� ������ +� ���.���! ��-0"-.�1 �� ��!1 " � ���
��0 "�1. � �"-.� ��9'� !��� 9�" ��.�������� ��0 "�1
(���!���� +� +� �:���� 8"����(��0 +���� 1� � ���-���� 9��!�����
8� 1, ����;��<� ��� -: +��" 0���;�1 ��0 "�1. � +��" �!
�"-.� �") +�!>���1 � 8"����(��0�,* 9-(� " �� -, �� �:�>
9��!��,* 8� *, �� 45 !�. +� ��!�����* �!+���-�.
�, "� (���!���� 0 �����0���� �"1
�"1 �, "�1 ��� 0 �"1 �+�")0-<��1 "9� ��!!�.�� ��9��,,
��+�!� QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen Cat. No. 28704), "9�
���� �����1 !�� �� "1 �, "�1 ��� 0 �"1 +� +�!�> «�"�».
• �-��.� �����0���� �"1, �� �:�>* �-:�,* (���!�� ���,
�������1<� � 6� �-�� �-� ��'"�� � �.� 10 !�-� +� t=70º�.
• ��9��"1<� �-�+�0< ��� � ��!�1 � �� (3 !�" �� 1 !�� ���),
+�!;��<�, ���(-��-<� 15 ��., 13000 �9/!�.
• 5��!,��<� «�"�-» � ��� " 1�,! +��!,��.�,! 9-(��! (50 !M
NaCl, 10 !M T��-HCl pH 7.5, 2.5 !M B���, 50% 8����"�) (+�� -�-
+�����1<� 3 ��0�).
• ��� �� ��� � ��!�1 �-�+� �-<� � 13 - 20 !�" H2O (�9=! �� ,
�":� ������"1�) � !� ��' �9=!�� �+�")0������* "1 �, "�1
«�"�»), ��-9�-<� 2 - 5 !�-� +� 55º�, 0��! ���(-��-<� 3 !�.
13000 �9/!�. �-+�������, �� �:�>* ���, ��9��<� �+�")0-<� �
�")�*;' +�� -��'.
78
5.6.4 �������!��
�"1 ��0 ��1 "��* ������-� !�� �! �������0��-"��0��*
��� �,9��<� �����, ���"0�-<� �� +�""��� +� 9��<�
�+�!�")�, ��*�, ��������1 "���� ���. ����, ��*�, ��� 1� �
+��*!�, "1 ����9��� +��" ����")���� ���� "���� ��� !�� �!
�9�����* �������+ (�+��� �,;).
��� ����1 �!�) �� �:� 0,2 -1 !�� ��� � �9=! � 9�" 20 !�".
1. ��9��)� �� - � �������- ��� � ���")��* +��9�� (�!, B++� ��(
� �9=!� 18 !�" +�!;�*�.
2. ��9��)� 2 !�" 9-(�� ����� 10-������* ��� ���� ( "1
�+�")0-!��� (�!���) +�!;�*�, �"��� +���-���1 +� +��9��.
3. ��9��)� 1 . ���. �������0, +�!;�*�, �"��� +���-���1 +�
+��9��. (1 ��. ���������� ������� – 8�� ��".���� (�!���,
��9'� !� "1 +�"���� ���>+"�1 1 !�� ��� 0� 1 .)
��� +���"�, ���>+"� �������0�!, +���� !� � �.� 9�"
"�")�,' +�� �� ��!� " +� 09,�� (�!���, � +��� � �
��"�:��1!, �" � +�+���� (�!��� ���-����-<� +�!� ����0, "
8�0��-�"�0,. � !<>'�1 � +�� �: ��!!�.��' +�+�����' �������0
(Fermentas, USA) ��� +�!� �9���-:��<��1 � ��.
��" �->���-� ��9'� !���) �+�")0����) 2 ��0".�, �������0, "1
������-�����1, �� �� +���! 8��+ +"�������1 8��+�!��� �" -�
+� �9���) �������0,, �+���9�, !���!�")�� 8((����� ��9����) �
� ��! 9-(�, "1 ����, .��9, ��->���"1�) ����� < �9!
�������0�! � ����!���. �"1 8���� !, ���!� -! �+�")0����)
+�����!!�� �9�+.� Double Digest ��!+�� Thermo
(http://www.fermentas.com/en/tools/doubledigest).
4. ���-9�-*� �!�) +� +� '� 1>* �!+���-� � �.� ��9'� !���
��!� (���"���� +������"�! +��0�� �"1 (�!���).
5. �������� ��� < �9��"�! 0,5 � B���, �� 7,5, � ���.��*
��� ���� 10 !� " �������! � �.� ��������-<>�� ��!�
79
� �!+���-�, ������ (�!��� ( ���, -��0��, � +��+���
(�!���, ��� +���"� "1 9�");����� �������0 - 65º�, 20 !�).
��" ��� ���"0�-<� ���0- � �", �9��)� 6 !�" �����"1 �
9-(� "1 �����1, +�!;�*� �!�) ����1'���! �����
���>+"��-< ��� �� �").
5.6.5 �����������
!���������� - ��"<.� (���!���� ��� ."���� � +"�0! ,, 9"��� ��1
�;���< "+�' ��� �� (�!���! "��0�*.
• �9=! "��0��* ��� ��� ���� 1 ��� 0���1� �� �+�
"������1. ��" �: �!,* +�� -�� "������1 �������!�, �� ��� <
+���� 1� � 10!�" �!�, � �� �:��! ��� > 100��/!�", "9� � 10 !�"
9�" � ��� ���� * ��� < 10��/!�" (� �"-.� ��") ���� +�� -���
"������1).
• � �"-.� "������1 +� "+�! ��� �! ���!� -��1 +��0�� �)
+� ����")�,* ��:� ������ ������ "1 +��,;�1 8((�������
"������1. �"1 8���� �!�) ������ ������ � !�"1���! ������;� 1:3
+� ,��-9�-<�: 45°� - 3 !�., 4°� - 3 !�. (�" ��".���� (���!����
+�0��"1�, :"��")�� �����) ��� < � ����")�' !�"1��,'
������;�1' �����:�������, ��+�!� 1:1, 1:3, 1:5).
• � +������"��-< �!�), �� �:�>-< (���!��, ��� ������
������, 1' "��0�,* 9-(� (0.066 � T��-HCl pH 7.6, 5!� MgCl2, 5!�
���, 1!� ���) �� - �9��"1<� T4 ��� "��0- � ��".��� 0.25 .�./!��
��� � �"-.� "������1 "+�' ��� �� 2.5 .�./!�� ��� � �"-.�
"������1 �-+,' ��� ��.
• ��� ���-< �!�) ��-9�-<� +� 15°� � �.� 1-16 .����.
• 5��" .�� 9�-� �"����- "��0��* �!�, ������-<� �4 ���
"��0- +�������! +� 80°� � �.� 20 !�., �����(��!�-<�
"��0��* �!�)< ��!+����, �"�� E. coli (+������"� ��!+����,'
�"��� �+���� �:).
80
• � �����;-<�1 "��0�-< �!�) �9��"1<� ��:-< �4 ��� "��0-
�����"1<� ��� ���-< �!�) +� +4°�. � �"-.�, �" +��"
�����(��!� �� .�;��' 5�� ���-���-<� �"��,, �" -� +������)
+�� -�- � �������! "��0��* �!�. �"1 �")�*;�� �+�")0����1
"��0�-< �!�) '���1� +� -70°�.
5.6.6 &������������ ���+������"� ������ E. coli ����� (op 10
5���")�, �� ,: SOB/SOC (SOB: � 800 !" H2O �9���) �����:
20 � Bacto-tryptone (2% w/v), 5 � Yeast Extract (0.5% w/v),0.5 � NaCl (0.05%
w/v), 1.3 � KCl (0.13%), ���� pH � 7.0, �+�")0-1 NaOH, ���� �9>*
�9=! �� , � 1 " �� �*, ���"0����) �����"�������!. SOC: �
+�������"���������* �� SOB �9���) ���"0�����,*
�����"�������! MgCl2 � ��� ���� 2�, ���"0�����,*
(")������! ( �!�� +�� (")��� 0, 22 !�!) ������� �"<��0, �
��� ���� 1�.
1. 5� ����")�� ���!� -�1 +����� 1 - 2 +����:� �� ��� �* ��
+� ��!�����* �!+���-�, 0��! +��� �) .���) �-")�-�, � 5 !" : ��*
�� , ��-9�����) +� ��!�����* �!+���-� �� ��.�"� (160-170
�9/!�) ��.).
2. 6��! 1 !" �"��.��* �-")�-�, ���-"�����) � 250 !" ��:* SOB
" SOC �,��>���) �� ��.�"� (160 - 170 �9/!�, 37°�), � OD600=0,3 �.
. ������ ��.��* �-")�-�, ���(������) +� 1 !" +�!���) �� -80°�,
+� ����")�� �� 1 �� �:�� �" ��� � �� � 15%. ��" ����
!�:�� �+�")0����) "1 +������"�1 ��!+����,' �"���, +��+-���1 ;��
1.
3. 5��" ���:�1 ��9'� !�* �+�.���* +"������ �"��.�-<
�-")�-�- +�!>�<� � " �� 20 - 30 !�-�, ���(-��-<� +� 4°�, 3000 g
� �.� 10 !�. �"��.�,* ��� �� ��-�+� �-<� � 80 !"
+� ����")�� �'"�: �����, ���"0�������� (")������! CCMB-80
9-(�� ��-9�-<� � �.� 20 !� �� ") -. 3���(-��-<� (4°�, 3000
g, 10 !�.), ��-�+� �-<� � 10 !" �'"�: ����� CCMB-80 9-(�� (10 !M
81
KOAc pH=7.0, 80 !M CaCl2×2H2O, 20 !M MnCl2×4H2O, 10 !�
MgCl2×6H2O, 10% �" ���). ���� 1� pH � 6.4 +� +�!�> HCl.
���"0-<� (")������! '���1� +� 4°C. 5��" .�� ���(����,��<�
+� 50-100 !�" � ���, ���")�, +��9��.
5.6.7 (���� ����!��
5���")�, �� ,: SOB/SOC, LB ���� (� 800 !" H2O �9���)
�����:•10 � ����� ��+���- (1% w/v), 5 � ��::���� 8�������� (0.5% w/v),
10 � NaCl (1% w/v). ����� pH � 7.5, �+�")0-1 NaOH, ���� �9>*
�9=! �� , � 1" �� �*. ���"0����) �����"�������!.
�"1 +������"�1 ��� �* �� , �� 1" : ��* �� , �" -�
�9���) 15� ����� � �����"�������1.
"���� ����#�� - �� � ���!9�����,' +"�0! � 9�����")�,
�"��, �9��9�����, �+ �")�,! �9��0�! - ���, .��9, �� �� �������
��!1 ���" +��� �!,! "1 !����!�"�-". � ���� +"�0! , +�����<�
";) � .���) �9��9�����,' 9����*. �����(��!������, 9���� �!��
� +"�0! �* +��9���<� -���*.����) � �+� "���!- ���9���-. B��
+�0��"1� �� "�) ' �� ������(��!������,' 9����*, +��9�<>' ��
�� , �� �:�>* 8��� ���9���.
• ��0!���0�) 0���� +������"���, ��!+����, �"�� �� ") -. �
100 !�" ��!+����,' �"��� E. �oli �9���) +"�0! �-< ���/"��0�-<
�!�), ���-����� +�!;��), +���-���1 +� +��9��, ��-9�����)
�"�� � ��� 20 - 30 !� �� ") -.
• 5�!���) �"�� � ��� ��")�,* ��!����� �� 1!� +� 42°� " ��
5!� +� 37°�. 5��" �+"����� ;��� �"�� +�!>�<��1 � " �� 1 -2 !�.
• � �"��.��* �-�+�0 �9��"1<� 500 !�" SOB/SOC ����>��<�
�"��.�-< !���- � �.� 30 - 60 !� +� 37°�.
• �����(��!������, �"�� ���: �<� ���(-������! � �.�
1 !�., 13000 �9/!�. �-+������� ��9��<�, �"��.�,* ��� ��
��-�+� �-<� � 100 !�" +���")��* �� ,, �"����- �"���, "9� ��
�"�� (� 0���!��� �� 8��+�!���), ������<� ;+��"! ����")�����
82
+� 0���� +������"��,! .�;��! 5�� � +���")��* ����0������*
�� �* LB, �� �:�>* �"����,* ����. #�;� ��-9�-<� G 18 .����
+� 37°�.
5.6.8 �����!�� ������ � �����/ +�������"� ������
5��.�,* ��9�� �"���� +���� 1� � �+�")0����! �"����,'
������ - ���9�����. � �" �" -� +� 9���) ��� ���� <
���9���� 0 ��������* +��� +� �������,* ;��!!, �+�")0-1 !��
+������1 ����* « �0�-8((��». ���: �->���-<� ���� ���,
�+�")0-!,' ��� ���� * "1 �1 � ���9�����, ��+�!�: �!+ ""�
35 - 50 !��/!" �� ,, ���+��! � 25 !��/!", ���� �"� 12,5-15 !��/!".
5�"-.��-< �!�) �����(��!������,' �"��� ������,' �"��� E.
�oli �,���<� �� ��- ��9��0�-< +���")�-< �� -, +� ����")��
��0� 1 ' ���, .��9, +� ����� �"�� ��'� "�) �� 0��.�")��!
������1� �-� �� �-��. ��: �1 0 �����(��!������,' 9����*
��0!��:���1 �9��0-� ��"��< 0 !���' �,�1. +���!��� - �"��.
5�"-.��, ���! !�� �! �"��, ���"0�-<��1 !�� �! 53�,
���9����, +�"�:�")�, �"��, �+�")0-<� "1 �, "�1 +"�0! ��*
���, �����-< �+��" ��� ���"0�-<� !�� �! 53�, !�� �!
����� (� +�!��! �������0, �+�")0�����,' +� �"�������)
!�� �! �8����.
5.6.9 6"������ +��/����� 0 '
�"1 �, "�1 +"�0! ��* ��� +�")0-<��1 !���! !�� �!. ��
�� ��"<.�<� �� ������,' 8��+�: ���� 9����* �!+"(�� <
+"�0! ,; �9�� 9����* ' "0�; �.���- +"�0! ��* ���.
� ����! �"-.� !, ����!���! �, "� +"�0! ��* ��� 0 E. �oli.
�!+"(�� < +"�0! +��0�� 1� +� �,��>���
�����(��!��������� ;��!!� E. �oli � 9�����* �� � +��-����
�"������� ����� (��+�!� �!+ ""��). �"1 �, "�1 +"�0! ��*
��� 0 !�"��� �9=!� �+�")0-��1 5 - 10 !" ��.��* �-")�-�,, �,��>���*
� LB �� � �"����,! �����!.
83
• �"1 �, "�1 +"�0! ��* ��� �"�� ���: �<�
���(-������! 10000 �9/!�. ��9��<� ����9�����-< �� -
�"��.�,* ��� �� ��-�+� �-<� � 200 !�" �������� I (50!� �"<��0,,
25!� ���-HCl (pH 8.0), 10 !� B���). ��:�� +� ����")�� +��!,�)
�"�� � TE 9-(� (10!� ���-HCl (pH 8.0), 1 !� B���).
• �"1 ��0�-;�1 �"��� E. �oli �+�")0-<� !�� >"�.���� "0��.
�"1 8���� � �"���! �9��"1<� 400 !�" �������� II (0,2� NaOH, 1% SDS),
���-����� +�!;��<�, .��9, 09:��) !'��.����� ��0�-;�1
���!��* ���, !"� (���!��, ������* !��-� 0���10��) +�+����
+"�0! ��* ���. �"�� �����"1<� "0�����)�1 �� ") - � �.� 5 !�-�.
�,9�� !�� � �9-�"��"� ��0".1! !: - ��� Escherichia coli
+"�0! ��* ���: 1) '��!���!� E. coli +� ��0!�- !���� 9�"); ���
+"�0! , �9,.�� �+�")0-!,' � ��.��� �������; 2) �������1 !���� ���
E. �oli �, "1��1 0 �"��� � � (���!��������,' "�*�,' !�"�-",
��� � ��� 9�");����� +"�0! ��* ��� 8�������-��1 � � ����"����
0�!��-�,' ��") �,' !�"�-".
• 6��! � +�"-.���!- "0��- �9��"1<� 300 !�" �*���"0�-<>��
9-(�� (3� NaAc, pH 5.2), +�!;��<� ��9"< �<� +�1�"�
�����:����� ��� ��. �� ����! 8��+ "0�� !�:�� '����) +� +4º� �
�.� �-���.
• �� �9"�!��� �"��.��* ���� 9"��� (��� ��) 09��"1<��1 �
+�!�>)< ���(-������1 13000 �9/!�, 20 !�.
• �-+������� +����1� � 2 !" +��9��, �9��"1<� ����0- �
���.��* ��� ���� 0.1 !�/!" ��-9�-<� 30 !� +� 37º�.
• 6��! �9��"1<� � �������-, �� �:�>!- +"�0! �-< ���, ����,*
�9=! (��"�. 5�!;��!, ���(-��-! 2 - 5 !�., 13000 �9/!�.
��9��<� �� �-< (�0-, �9��"1<� ����,* �9=! �!� (��":'"���(��!
(1:1), +�!;��<� ���(-��-<� 2 - 5 !�, 13000 �9/!�. ��9��<�
84
�� �-< (�0-, �9��"1<� ����,* �9=! �!� '"���(��!�, +�!;��<�,
���(-��-<� 2 - 5 !�, 13000 �9/!�.
• ��9��<� �� �-< (�0-, �� �:�>-< �.>���-< +"�0! �-< ���,
��� ����-<� +�+���� �+����,! +����: �!. �"1 .�� �9��"1<�
� +�"-.���!- +�+����- 1/10 �9=!� NaAc (3� NaAc, pH 5.2),
+�!;��<� �9��"1<� 0�+��+���" � ������;� 1:1 " 8����" �
������;� 2:1. 5�!;��<� ��-9�-<� 20 !�, +� - 20º�. 6��!
���(-��-<� �9��0 20 !�., 13000 �9/!�, +� +4º�. 5��!,��<�
+�"-.��,* ��� �� 80% 8����"�!, �,�-;��<� �������1<� � �� .
85
6 ��/������� ������� �������� RL2
� ����!���* ��� "��������,' �� ��� ($�) 9�");� 0��.�
���� ��1 ��0��9��� -�"��* '����1 $�, �9�+.��<>' '
���9")����) � �.� �+� "����� ����� �� ����. ���� �� ���� $�
0���1� �� +�����<>' � �' (0.��', '!.��' 9�"��.��'
+�� ����. �� 8� +�� ��, 9�");� �"1� ���0,��<� �!+���-��,
�"�:����), ���, pH �� ,, ���"�")��-���������")�, ��� ,
��� � ��"0�, +�"!�0� , +�����<> � $�, � ���: (�����,,
+��� 1> � 0!��< $� +� �"1�! :0� 1�")����
!��������0!��. �"1 -������1 " �� �1 � !�!-!- (�������,
+��� 1>' � -!�);�< ������ �� ���� $�, ��0��9����, ���� ����,
�+���9, '����1, ��"<.�<> '���� $� +� �!+���-��' �:
��!�����* (+2 �� - 25
��) � -�"��1' +��:��* �"�:���� ���-����1
����. �"1 ��:�1 ������� ���"�")��-����������")�,' ��� *
��� * � ��"0� $� '���1� � -�"��1', +� �����>�<>' +����1��,*
������� � ��"��� �! ��0 -'�, � ��!�.��* -+����� " � �-'�! � .
���! ���� �-'� �>���� 9�" -���*.�� � *���< ���� .! ��
�"�:��! �����1� " � �������. �"1 ��"<.�1 �"1�1 �����!��
"����������� �� ���� !��������0!�! �� ��� �� +�"-.�1
��9'� !� +���� �) ���"0� < '���� $� � ��+�.��'
-�"��1' [26, 27].
��0��9���- -�"��* '����1 RL2 +���� " � ��������� ��
���� ����,! ���!� � 1! "1 '����1 $�. �"1 8���� 9,"
+� �����"�, �9��0 , : ��* ��� ,' (��! RL2, ��" ����� �"1�
��0".�,' -�"��* '����1 8�' (��! �� ���9")����) ������.��-<
��������) +�+�����.
����" +��+������ ��������������� ������� �����+���� RL2
� ��.��� : ��* (��!, '����1 +�+����� RL2 �+�")0���"
���")�,* �� �,* �������, �� �:�>* 2,5 – 3 !�/!" RL2 150 !�
'"�� � ����1.
86
� ��.��� ��� �* (��!, '����1 RL2 �+�")0���"
"�("0�����,* RL2.
�+�����- ��" -!,' +�+������ RL2 +���� " � ��+�.��'
-�"��1' � ���"1��, ("����, c ��!�.��* ��,;��*.
��� ���/�!�� ��������������� ������� �����+���� RL2
$�("0� 1 1�"1��1 +�� ���! �-9"!� �� , +� �0�'
�!+���-��' � -�"��1' ���--!�. $�("0� 1 ������ 0 ��' ������,'
8��+��: 0�!���:��� �9��0 �, +��.��1 �-;�� ���-;��. ��9�"
���.��! 8��+�! "�("0� , ���0,��<>! ������� �"1� ��
9�"��.��-< ��������) 9"��, 1�"1��1 0�!���0��. 6�!���:���
�9��0 �, ��� +���"�, +���� 1� +� +���+���! ��:� �!+���-�, �
-70 – -80 ��, .�� !�:� +��� �) � �0���!+���-���* ���-�� 9"��,
��+�1:���* �� ��:�! �� ��������. �"1 ��:�1
�0���!+���-���* ���-�� 9"�� � +�� �� �� "�(")����
�,�-;���1 +�!�1<� ��0".�, ���9"0����,, ��+�!�:
�,������.�,* �")9-!� ."���� (#��), :"���, ��'��� �. [28].
5� +� 9�� -�"��* "�("0� ���!9�������� ���"���
"����+��� RL2 0� �����- �!+���-���-��!����� �:!� "�("0�
9,"� +��1�� !�� �� "�("0� ���!9�����,' 9"���,'
+�+������, +� �����"���1 �� "�! ��0��9��� 9��'��"�� ����
�2�� 2�3 �� «�����».
5������" � ��-++, �+,��,' �9��0 ��:
1) "�("0�����,* +�+���� RL2 90 ���9"0�����;
2) "�("0�����,* +�+���� RL2 �� ���9"0�����! – �")9-!�
."��.��* �,������.�,* (#��). ������;� #�� : RL2 – 1 : 3;
��� �� ��0"�� �-9���� RL2 �!+���-���-��!���* �:!
"�("0� �-9���� +� ����"�, � 5�"�:� 1.
6������ ������ �������� �� ������������ ��������" �
!�������������� ���������� RL2
87
�"1� -�"��* ������ '����1 �� ���9")����) ���-��-�, RL2
���"0����" !�� �! �����-9"������ � !����"���")�,! ����"�!
� RL2 8"����(��0�! � 5��2 � SDS � +��" -<>* �������* �"1
�-!���. �"1 8���� +���" ���"0 9"������ ������� ��" -!,' (��!
RL2, ��"<.�<>' 1- : �-< (��!- RL2, 2 – "�("0������-< (��!-
RL2 90 ���9"0����� "�("0������-< (��!- RL2 �� ���9"0�����!
(#��), 0�"�:" �� '���� +� �!+���-� +4 - +8 �� � �!���.
�0 ���,' ��-��� 17 � ��, .�� � �9��0 �' 1 – 3 RL2 �->���-� �
(��! !���!�� � !�"�-"1���* !����* ~14 ��� �� ����"������
��!� !�� � !�"�-"1���* !����* 28 ���. 5� ���"0 +�+������ !�� �!
�����-9"������ � �+�")0����! !����"���")�,' ����" � RL2
(��-��� 17, �) � ��, .�� � ��" -!,' �9��0 �' +��-����-<� ������
(���!��, RL2, �� �:�> ������-< ��!����-. B� ������
(���!��, 1�"1<��1 +�� -���! ��� � RL2, �9��0-<>!�1 �
+�� �� �� �, "�1. ���: 0 ��-��� 17, 9 � ��, .�� � �9��0 1
+��-����-� #�� � !�"�-"1���* !����* 45 – 66 ���.
������� 17 ���"0 ���9")���� ��0".�,' (��! RL2 � ��.�"� '����1; � – !�� �!
�����-9"������ � �+�")0����! !����"���")�,' ����" � RL2, � – !�� �!
8"����(��0� � +�"���"�! ��! �" � SDS � �������* �"1 �-!���, ���:�: 1 –
: ��1 (��!� RL2, 2 – "�("0�������1 (��!� RL2 90 ���9"0�����, 3 –
88
"�("0�������1 (��!� RL2 �� ���9"0�����! (#��), 4 – ��9�� 9"��� � 0����,!
!�"�-"1��,! !����!.
5��" '����1 �9��0 �� RL2 � �.� 5 !�1 � +���" ���"0 '
9"������ ������� (��-��� 18). �0 ������1 ���,' ��-���� 17 18
� ��, .�� '���� +�+������ RL2 � �.� 5 !�1 � � +��� � �
0��.�")�,! 0!��1! 9"������ ������� ��" -!,' �9��0 ��. 5�
8��! � ��9"< ���1 �->�������� ����+"�1 ������' (���!���� RL2
� +���'� � -!�);�1 ��".���� !���!�� RL2. 5� ������
��-���� 17, � 18, � � ��, .�� +���'� � -!�);� ��".���� !��
RL2 � �9��0 �' +��" 5 !�1 � '����1. ����� 0!�� 9"������
������� ��" -!,' +�+������ RL2 � �0-")��� '����1 !�:� 9,�)
�9-�"��"�� ��� � * " .���.��* ��� � * ��!� !��,'
��!+"���� RL2 � �.�! ��!�. � �0-")��� ���' 0!��* !�:�
�9��0��,���)�1 !���!� RL2, � ���: ������ (���!��, RL2.
������� 18 ���"0 ���9")���� ��0".�,' (��! RL2 +� '���� 5 !�1 �, � –
!�� �! �����-9"������ � �+�")0����! !����"���")�,' ����" � RL2, � –
!�� �! 8"����(��0� � +�"���"�! ��! �" � SDS � �������* �"1 �-!���,
���:�: 1 – : ��1 (��!� RL2, 2 – "�("0�������1 (��!� RL2 90 ���9"0�����, 3
– "�("0�������1 (��!� RL2 �� ���9"0�����! (#��), 4 – ��9�� 9"��� �
0����,! !�"�-"1��,! !����!.
89
���! �9��0�!, +���0���, .�� +� '���� +�+������ RL2 � �.� 5
!�1 � +� �!+���-� +4 - +8 �� � �!��� � +���'� � -!�);�1
!���!�� RL2 �->�������� ����+"�1 +�� -���� �� ��� � . �0
8���� �" -�, .�� ���-��-�� RL2 ������.�� ���9")�� ��'���1��1 ���
"1 : ��* (��!, RL2, ��� "1 �� "�("0�����,' (��! +� ���,'
-�"��1' '����1.
���"0 �"1�1 ����� -�"��* '����1 �� �+ (.��-<
��������) RL2 +���� " � �+�")0����! �-")�-�, �"���
� ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."���� MCF-7. �"1 8���� �"�� MCF-7
�9��9��,��" +�+�����! RL2 � ���.�,' ��� ���� 1' 7,1 – 42,8
!�!�")/" ��-9����" � �.� 48 . +� 37�� � ��!��(� � 5% ��2.
�0��+���9����) �"��� +��" ��-9� � RL2 �+� "1" � +�!�>)<
��� ����. �0-")���, ���"0� :0��+���9���� �"��� MCF-7 +�
*���! +�+������ RL2 � '����1 +��" 5 !�1 � '����1
+� ����"�, � ��9" 7. 5� ���,! ��9" , 7 +������, ���,
0���!��� :0��+���9���� �"��� MCF-7 �� ��� ���� RL2
(��-��� 19 ��-��� 20). 5� ���"0 ���,' ��:�1 :0��+���9����
�"��� MCF-7 9," ����.���, ��50 "1 +�+������ RL2 (��50 –
��� ���� 1 +�+�����, �,0,��<>�1 ���!�:� ����� �-")�-�, �"��� ��
50%). ��50 1�"1��1 ��".������* '����������* ������.���*
�������� +�+������. �������1 ��50 "1 ��0".�,' (��! RL2 !: -
��9�* +�+������ RL2 � +��" '����1 !�:�� � ��) 0!��1 '
������.���* ��������.
�0 ���,' +� ����"��,' � ��9" 7 � ��, .�� ��50 "1 ��0".�,'
(��! RL2 � -.��! +���;���� 0!��1 !<� 9"0� 0��.�1 (26,3 –
27,7 !��). �0 8���� �" -�, .�� +�� �� "�("0� RL2, ��� �
+��-���� ���9"0�����, ��� 90 ���, � +��� � � ��:�< ��
������.���* ��������. ���! ����, +� '���� +�+������ RL2 �
�.� 5 !�1 � � +���'� � ���������� -�".�1 ' ��50, .��
90
�� �")���-� � ���9")���� ������.���* �������� +�+������ �
���,' -�"��1' '����1.
(����!� 7 �0-")���, ���"0� ������.����� *���1 +�+������ ��0".�,' (��!
RL2 �� �"�� MCF-7 � '����1 +��" '����1 � �.� 5 !�.
� ��1 (��!� RL2
$�("0������1
(��!� RL2 90 ���9"0�����
$�("0������1
(��!� RL2 ��
���9"0�����!
����� +�+������ RL2 – 0 !�.
��� ���� 1
RL2, !�� MTT, % HMTT
, % MTT, % HMTT, % MTT, % HMTT
, %
42.8 25.66 1.56 28.94 2.27 28.64 2.32
35.7 28.22 1.25 31.7 1.18 30.83 2.44
28.5 41.08 3.5 48.43 2.39 42.65 4.05
21.4 74.82 1.08 78.1 3.43 78.31 5.34
14.2 82.69 5.71 86.56 3.5 93.26 5.52
7.1 94.5 4.7 90.5 7.79 97.5 3.7
0 100 7.05 100 5.63 100 13.35
��50, !�� 26.3±0.8 27.7±0.7 27.1±0.6
����� +�+������ RL2 – 5 !�.
��� ���� 1
RL2, !�� MTT, % HMTT
, % MTT, % HMTT, % MTT, % HMTT
, %
42.8 26.5 2.56 28.17 1.57 27.34 3.21
35.7 31.42 1.11 29.35 2.39 31.71 1.35
28.5 45.15 4.3 38.16 3.72 42.11 5.21
21.4 70.21 2.17 73.42 1.65 67.22 4.23
14.2 81.92 4.55 85.57 2.21 89.16 7.29
7.1 95.7 3.32 93.73 15.79 96.41 3.81
0 100 6.24 100 2.75 100 11.27
��50, !�� 27.1±0.5 26.1±0.8 26.2±0.7
91
MTT, % - � ��, ����:�<>* ������")�-< :0��+���9����) �"��� MCF-7
HMTT, % - ���� ����� ���"��� MTT � ��� � �+,�
������� 19. ���, 0���!��� :0��+���9���� �"��� MCF-7 �� ��� ���� RL2
� +�+�����' � ��.�"� '����1; 1 – : ��1 (��!� RL2, 2 – "�("0������1 (��!� RL2
90 ���9"0�����, 3 – "�("0������1 (��!� RL2 �� ���9"0�����! (#��); 0� 100 %
+��1�� :0��+���9����) �"���, ��-9������,' � ���-���� RL2.
������� 20. ���, 0���!��� :0��+���9���� �"��� MCF-7 �� ��� ���� RL2
� +�+�����', '����;'�1 � �.� 5 !�1 �; 1 – : ��1 (��!� RL2, 2 –
"�("0������1 (��!� RL2 90 ���9"0�����, 3 – "�("0������1 (��!� RL2 ��
���9"0�����! (#��); 0� 100 % +��1�� :0��+���9����) �"���, ��-9������,' �
���-���� RL2.
92
���! �9��0�!, +� ��" ���� �"1�1 -�"��* '����1 ��
���9")����) ������.��-< ��������) RL2 +���0���, .�� +�
'��� +�+������ RL2 � : ��* "�("0�����,' (��!�' � �.� 5
!�. +� �!+���-� +4 - +8 �� � �!��� � +���'� � 0��.�")��*
��� � ��:�1 ������.���* �������� RL2. �0 .�� �" -�,
.�� �+�")0-!, -�"��1 '����1 +�+������ RL2 ������.�, "1
+� �:��1 ���9")���� RL2 � �.� ����!�����!��� +�� �
'����1.
93
7 &��+��������� ���������, �"������ � ������� ��������
- ������"� ��������� ������ �����"� ������ �������� ����/"
� '� �,+�"��1 +����� 9,"� ��0 ��� -�������� "1 ����9���,
�, "�1 �.��� ���!9�����,' ���"���� "����+��� � +�+������,'
��".����'.
�"1 ����9��� ���"���� "����+��� � +�+������,' !��;��9�',
��9'� !,' "1 ��" ����1 ' ���*���, 9,"� ��0 ��� -��������,
+�0��"1<>�1 ���)�����) ��".���� ����9��,��!��� 9"�� � 0���!���
�� ��->' +���9����* ��" ����")����� +�� ���. ��������� ������
0 �" -<>' ������,' 9"����: - �����"�� "1 ���"0� ���������
!����"��; - "�!����,* 9��� "1 ���")�,' ��9��; - ��!������-!,*
;*�� "1 +� ����")���� ����>���1 +������� !����"� ;��!!�
�-+�+�� - ���; - !���9�"��.��* (�!��� "1 ����>���1
��9-!,' �9=!�� 9�!���,; - ���(-� "1 ��� ��������1
9�!���,.
��������� "1 �, "�1 ���!9�����,' ���"���� ������ 0
-")���0�-������ 0��������� '��!������(� �0���� ��"�1.
�, "� ���!9�����,' ���"���� ' "0��� �"���-+�� - ����
+���� " �((���* '��!������(* �� Ni-'"����! ���9��.
�"1 �.��� ���"���� "����+��� �� ��� "+�+�"��'�� �� �"���
+�� - ���� �+�")0���" �����- �������9!��-< '��!������(.
���"0 ��.���� +�"-.��,' ���"���� +���� " !�� �!
�,����8((�����* : ������* '��!������(* � �+�")0����!
'��!������(� «�"'��! �-02» (B������, �����9���), 8"����(��0� �
�+�")0����! +�9��� "1 8"����(��0� (�!, «Bio-Rad», �/�
�����-9"�� ���"0�! � �+�")0����! +�9��� (�!, «GE Helthcare»,
�/�.
�.���- +�+������ ���!9�����,' ���"���� �� ��������!,'
+�!�* ���"0� < +���� " !�� �! -")���(")��� .�0
���� ""<"�0�, (")��, � ���")�,' -�"��1'.
94
���+�"��"! +����� ��!+��* «����� �» � '� �,+�"��1
��9�� +� +����- 0����.�� �����")���� �� "�� 0 ��1, � ������!
��0!>� �9��- �����,* -.����� +� ����9��� +�+������,' ��".���
���!9�����,' ���"���� "����+���.
95
6=6�0=:�
� �0-")��� ��" ����*, +��� ��,' �� 6 8��+ �,+�"��1 +�����,
�;�, �" -<> 0� �.:
1. 5��� �� ������-����� +"�0! �,' �������, �� �-<>'
���, ���!9����, ���"�� "����+��� � 0�!��! �!����"���,'
�������� � ��0".�,' .���1' !�"�-", "����+���. 5�"-.�,
���!9�����, +"�0! , pFK3 pFK4, �� �:�> +��" ����")����
���, �� �-<> (���!�� � 3 (RL3) (���!�� � 4 (RL4) ��++�-��0��
."����, ������������.
2. ��� �! ���.���* �:�� +�"-.�, �"�� E.coli –
+�� - ��, ���,' ���!9�����,' ���"���� "����+��� RL3 RL4.
3. 5��� �� ����9����, �, "� �.���� ���!9�����,'
���"���� "����+���. ���!9�����, ���"�� "����+��� RL3 RL4
����9����, � �"���'-+�� - ���' E.coli, �, "�, �((���*
'��!������(* �� Ni-NTA �(���0 �.>�, �������9!���*
'��!������(* �� SP Sepharose Fast Flow ������9!���*
'��!������(* �� MacroPrep DEAE.
4. 5��� � ������")�,* ���"0 �"1�1 ���"���� �� :0��+���9����)
�+�+��0 �"��� MCF-7, ��+���"��,* �� �,1�"� � 99"��� ���"����
��9�" 8((����,' � -������ �9" �����,' �"��� !�"�.��* :"0,.
5���0���, .�� +�"-.��, ���!9�����, ���"�� "����+��� RL3 RL4
8((����� � - �-<� �+�+��0 �"��� MCF-7 (��50 "1 RL3 ������"�
23,5 !��, "1 RL4 - 7,8 !��). ��9�" 8((����,! � -�����! �+�+��0�
�����,' �"��� 1�"1��1 RL4.
5. ��0��9����, ��-.��-!�� .�� !����", � "�9��������!-
+�����-!- «��� , ������-�����1 +�� - ���� ++� ��» � ��!��'
«��");��� 9�'!.����� +�����-!�».
6. ��0��9����, -�"��1 '����1 RL2. 5���0���, .�� +� '����
+�+������ RL2 � : ��* "�("0�����,' (��!�' � �.� 5 !�1 �
+� �!+���-� +4 - +8 �� � �!��� � +���'� � 0��.�")��*
96
��� � ��:�1 ������.���* �������� RL2.
7. 5��� �� +�+�������1 ����9����, �, "� �.���� ��9�"
8((����,' � -������ �9" �����,' �"��� !�"�.��* :"0,.
97
2'�>3) �)
� XX �� ���� .�"� ����"��.��' 0�9�"���* +���'� " ���!
9,���,! �!+�!, .�� �"� ������� "1 ������1 �� � 8+ !*.
�:�� �� �� ��I! !� �� 0"���.�����,' �+-'�"* -!��� ��,; 7
!""���� ."��� �������-��1 ���"� 10 !"�. ���,' �"-.��
����"��.��' 0�9�"���*. 5� � ���! ��!���* �����0�
0 �����'����1 ����"��.�� 0�9�"���1 � 2020 �� - �,* -� �� +���
!��� � !� +� �!������, �9����� +� 8��! «��� ������ " ��» –
�� .�����- ��, 0�9�"���1. � 2030 �� - .�"� ���,' ����0�� !�:�
��0���� � 27 !""����, � .�"� :�->' � ����! +� ���� ������ 75
!""����.
���! �9��0�!, �,����1 ���-�")����) +��9"! ����"��
�9-�"��"��� ��9'� !���) +����1����� +���� ��0 ��1 8((����,'
"��������,' +������+-'�"�,' +�+������.
� ���� �->���-� �1 ��!+��*, �����, +��0�� 1� ����!��,
"��������, +�+����, 9"����* +��� , (�5� «������», ���
«���� », �2�� 2�3 ��-��"�� 9��'��"�� «�����») �.
5������, (-�� ���-<� +��0�� �����, ���+-��, �(��!"��, +�
��9����1! ���� ����� GMP.
5����")�- ")< ������ +����� 1�"1��1 ��0��9���� +�� +�")��
������ +������+-'�"���� +�+�����, �0-")���, ��" ����* !��-� 9,�)
�+�")0����, � (��!� ��.���* +��!,;"����� +����.���!
0 �����'����.
� +����� -��+� �,+�"��1 +����� ��0��9����� �+�!�")��1 �'!�
��.���1 ���!9�������� ���"��� "����+��� (RL2) � 0����,!
'!����+��.��! �� ����! �� !� " �-")���-!,' �"���
0"���.������* �+-'�" !�"�.��* :"0, ."���� !�� ��
�-")�������1 ;��!!�� – �-+�+�� - ���� RL2 � +�+������,'
!��;��9�'. � ������ -��+� ��9�� +��� �, +�����, ��" ����1,
+��� �� +�"�����!�� ��" ���� 0!��* �������+��!� �����,'
98
�"��� ."���� +� *���! RL2; ��0��9���� !�� �, "�1 RL2 �
+�+������,' !��;��9�'. (����� -��+ �,+�"��1 +����� 9," +���1>�
��" ����< .-�����")���� �"��� +��.�,' �-")�-� �+-'�"*
!�"�.��* :"0, ."���� � �+�+���.���!- *���< RL2 ��0��9���
!�� �� ���"0� .����, RL2, ����9�������� � +�+������,' !��;��9�'.
� ��������� -��+� +��� �� ��" ���� ����.����
���+��.����� *���1 RL2 � 8��+�!���' �� !,;�' �,���������,'
"�* GR �57Bl � .���� ��0���<>! �+������,! �+-'�"1!
!�"�.�,' :"0 ��0��9����� !�� �� ���"0� (0�"��.���*
�������� RL2. &��"� -��+ +����� 9," +���1>� 0-.�< �"1�1 RL2
�� ���� !�����0����� � ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."����,
+����* !,;�! "� SCID ��0��9��� !�� �� ���"0� RL2.
� .����� -��+� �,+�"��1 +����� +��� �� �+�!0� 1 ���-��-�,
++� � !�� �! ����* �:�� +�"-.�, 9�" 8((����,
� -����, �+�+��0� �"��� � ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."����.
5��� �� ����9����, �, "� �.���� �������-������,' ���"����
"����+��� RL3 RL4. 5���0���, .�� ��9�" 8((����,! � -�����!
�+�+��0� �"��� � ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."���� MCF-71�"1��1
���"�� "����+��� RL4.
�0-")���, ��� �� ��, � �9��0����")�,* +�� ��.
5� �����"��, +� ��"0� +����� ��-.��-!�� .�� !����",
�+�")0-<��1 � �-���' "� * «�0�"��.���1 '!1», «��'!1»
"��� , ��" ����1 9�+�"!���" "1 ��- ���� 3 – 5 �-����
���-")��� �������,' ��-� (���) � ������ (��-")��� �2�
�+ �")����* «!�"�-"1���1 9�"��1» «".9�� "�", � ���: +�
+��� � +����.��' 0��1�* "��");��� 9�'!.����� +�����-!�"
��- ���� 4�� �-��� ��� +� �+ �")���� «!�"�-"1���1 9�"��1».
�0-")���,, +�"-.��, +� �,+�"�� +�����, +� ����"�, �
�-�����* ��9�� ��- ��� 4�� �-��� ��� �2� "���" ����
+������+-'�"��* �������� ���!9�������� ���"��� "����+���", �
99
���: � +"�!��* ��9�� ��- ��� 5�� �-��� ��� �2� "��0��9���� !�� ��
+�"-.�1 �.��� ������.����� ���!9�������� ���"��� "����+���
RL2".
5� ����"�� � 0�>� ����� ����1 ��9��� �� 0��� ��� ���
'!.��' ��-� +� �! "�+�+��0 �����,' �"��� ."����, � - �-!,*
���!9�����,! ���"���! "����+���".
5�"-.� 5���� RU � 2461566 "�+���9 ".�1 0"���.�����,'
�+-'�"* - !"��+��<>'". �����,: ����") �.�., ��" � �.�., �-"���
�.�., �!��� �.�., ��!� �.�., 5���+��� �.�., �'�� �.�.
���! �9��0�!, ��9��, 2��- ���������� ��������� +� �!
«���" ���� ������.��' ���*��� ���!9�����,' ���"����
+��� ���� ++� � !�"��� ."���� – "����+��� � ")< ��0 ��1 ������
+������+-'�"���� +�+�����» �� «05» �+�"1 2010 �. � 02.740.11.0715
�,+�"��, � -������"��,* ���� - ��"����1<� -�"��1!
2��- ���������� ��������� ���!�����* ��-!��� .
100
�+���� ��+���/�����"� ����������:
1. ��-'�! �., ��9�� �:. ��� �� ".�. ���!, �. 2009, �. 203
2. ��+"�1 �.�., �!��� �.�., 5���+��� �.�., �-"��� �.�., �� �.7.,
��!����� �.�., �'�� �.�. $����+�� - 9"�� ."��.����� !�"���,
� - �-<>* �+�+��0 �"��� � ����� ��!, MCF-7. ���"� , ��� !
��-�. 2008. �. 419. �. 268-271.
3. �"���� �.�., �'�� �.�., �!��� �.�., ��+"�1 �.�., �-"��� �.�.,
5���+��� �.�. «5+� , �9"� �<>* �+�+���.���* ��������)< +�
����;�< � �����,! �"���! ."����». 5���� �� � 2317304.
4. Dmitry V. Semenov , Alexander S. Fomin, Elena V. Kuligina, Olga A. Koval,
Vera A. Matveeva, Irina N. Babkina, Nina V. Tikunova, Vladimir A. Richter.
Recombinant analogues of novel milk pro-apoptotic peptide lactaptin and their
effect on cultured human cells. // The Protein Journal, 2010, V. 29 (3), p. 174 –
180.
5. ��-���� �.�., �!��� �.�., ��9��� �.�., �-"��� �.�., ����") �.�.,
��!� �.�., ������ �.�., ����� �.$., ����� $.B., �'�� �.�.
���!9������1 +"�0! ��1 ��� pFK2, �9�+.��<>�1 ���0
���!9�������� ++� �, 1�"1<>���1 ���"���! ��++�-��0�� ."����,
���!9�����,* ++� , ���"�� (���!��� ��++�-��0�� ."����,
�9"� �<>* �+�+���.���* ��������)< +� ����;�< � �����,!
�"���!. // 5���� � 2401307 (10 ���19�1 2010 �)
6. 2��- ��������1 (��!���+1 ����*���* � �� , XII 0 ��, #���) 1,
2007. �+� "� 9"�� (��� 42-0053-07).
7. Bradford M.M. (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254.
8. Use of tripan blue stain and the hemocytometer to determinate total cell counts
and viable cell number. Sigma. _ 1996.
_ P. 1702.
9. Mosmann T.J. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
Application to proliferation and cytotoxic assays. Journal of Immunological
Methods. 1983. V. 65. P. 55–63.
101
10. @"�-��� �.�. 2��.���1 �:��1. - �����9���: �9. ���. �0 -
��, 2004. — 496 �.
11. �,9.� �.�. �����, ���.���* �:��. - ��.: �,;. ;�., 1986. –
186 �.
12. �*" �:., �""� �. �����, 9�'!.���* �:��. #.1. – �.: ��,
1989. - 692 �.
13. 7�-9� �.-�., �;��*� �. �!����"��,, ++� ,, 9"�. – �.: ��,
1985. – 456 �.
14. Samuelson J. Bacterial Systems // Production of Membrane Proteins:
Strategies for Expression and Isolation (Robinson, A. S., ed). 2011. P. 13-35.
15. Steege D.A. 5'-Terminal nucleotide sequence of Escherichia coli lactose
repressor mRNA: features of translational initiation and reinitiation sites // Proc
Natl Acad Sci U S A. 1977. V 74. P. 4163-4167.
16. Sachdev S., Khattar S.K., Saini K.S. Production of active eukaryotic proteins
through bacterial expression systems: a review of existing biotechnology strategies
// Mol Cell Biochem. 2008. V. 307. P. 249 – 264.
17. Nakamura Y., Gojobori T., Ikemura T. Codon usage tabulated from
international DNA sequence databases: status for the year 2000. // Nucleic Acids
Research. 2000. V. 28. P. 292.
18. Ikemura T. Correlation between the abundance of yeast transfer RNAs and the
occurrence of the respective codons in protein genes. Differences in synonymous
codon choice patterns of yeast and Escherichia coli with reference to the
abundance of isoaccepting transfer RNAs. // Journal of Molecular Biology. 1982.
V. 158. P. 573 - 597.
19. ��0� �.�., �-0� "�� �.�., ���� �.�. �. ��� , !�"�-"1���*
���� ����* �:��. - ��-��. �9���� �� "�, 1990. - 248 �.
20. Maryama T., Gojobori T., Aota S.-I., Ikemura T. Codon usage tabulated from
the GenBank genetic sequence data // Nucleic Acids Research. 1986. V.14. P. 151
– 197.
102
21. Davis G.D., Harrison R.G. E coli gene expression protocols: Discovery of new
fusion protein systems designed to enhance solubility in E. coli. // Methods in
Molecular Biology. 2003. V. 205. P. 141 - 154
22. Ferrer M., Chernikova T.N., Yakimov M.M. Chaperonins govern growth of
Escherichia coli at low temperatures. // Nature Biotechnology. 2003. V.21. P. 1266
– 1267.
23. Spiess C., Beil A., Ehrmann M. A Temperature-Dependent Switch from
Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. // Cell. 1999.
V. 97. P. 339-347.
24. Fox J.D., Waugh D.S. E coli gene expression protocols: Maltose-binding
protein as a solubility enhancer. // Methods in Molecular Biology. 2003. V. 205. P.
99 – 117.
25. Neilson H., Engekbrechet J. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal
peptides and prediction of their cleavage sites. // Protein Engineering. 1997. V. 10.
P. 1-6.
26. $������ �.�., 5�"�0�� 2.�., �� � � (��!� ��.��-< '!<,
����, «B"�������1 ���� �2�», 2004
27. 2"->��� �.�., 5"���� �.�., 5�+��� �.�., ���!� ��.���1 '!1,
������, «��� !1», 2004
28. 2-����� �.�., $�("0� 1 9�(��!� ��.��' 9"��� //
��(��!� ��.��* :-���", 2010, �., 2., � 5., �., 3 – 7
103
&��������� 1:
%������ ��/���� � ��� ������ ��.�� �������!�� RL2.
��0"� +���� " � ���")�,' -�"��1' � "�!�����! ;��(-
��!+"��� "1 ���9� .��,' +�!>�* ��# «$�!��� - �». �9��9����
;��(� +���� "��) 70 %-! �+���! � +��" -<>! �9"-.�!
9���� �,! "�!+�! � �.� 30 !�-�.
�"����,, +��9�, +��- � ��6 +��!,��" �����"������".
���")��1 (")��� 1 �-9���� +���� "��) .�0 (")��-<>-<
;+� �-< ���� �- �� 0,20Jm Slerile.
�"����, 0���," +��9��! � +���0)< �� +�"���- �,���, +��9�
+�!��" � ��!�- �-;")��* �-;�.
$�("0� < �-9���� "����+��� +���� " � "�(")��* �-;�
«FreeZone» � �+ * +��!��.���* -�-+���, +��0�� �") �/�.
(��+��������-��������� ����� ��.��:
1. 5���+���1 0�!���0�� �-9���� �� 220 � � -74
0� � �.� 1 .���;
2. �, �:�� +� �!+���-� -740� - 7 .����;
3. $�(")��1 �-;�� +� �!+���-� -740 � � -�"��1' ���--!� – 12 .����;
��"� ���--!� �������1 +���+��� �� 0,133 !""9�� � 0,033
!""9��;
4. 5���+��� +��,;� �!+���-�, � (28-30)0 � � -�"��1' ���--!� – 4
.���;
5. �9> ��!1 �-;� – 24 .���.
6. 5� ����.�� �-;� - �9��� ���--!� – +���+��� � �.� 5 !�-�;
7. 5��!��.���1 -�-+���� ("������ +��9��! – � �.� 5 !�-�.
$����+�� - "�("0�� �,��-0" 0 �-;")��* ��!�, "�(")��*
�-;�, 0�����" �"<!��,! ��"+�.��! � +�!�>)< 0�����.��* !�;�,
"1 ("������ 0 ���� 6�� ��� – 5�, +��0�� �") ��� �5�
«���������».