Рубцова М.Ю., Уляшова М.М., Халилова Ю.И., Егоров А.М
DESCRIPTION
ДНК-МИКРОЧИПЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ МИКРОоорганизмов. Рубцова М.Ю., Уляшова М.М., Халилова Ю.И., Егоров А.М. Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова ЗАО «НПП ИММУНОТЕХ». Проблема: Устойчивость - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Рубцова М.Ю., Уляшова М.М., Халилова Ю.И., Егоров А.М.
Химический факультет МГУ имени М.В. ЛомоносоваЗАО «НПП ИММУНОТЕХ»
Проблема:
Устойчивостьмикроорганизмов к действию бета-лактамных антибиотиков
Причина : Продукция бактериальных ферментов – бета-лактамаз
Бета-лактамазы представляют собой группу бактериальных ферментов, способных гидролизовать бета-лактамные антибиотики
1940 – E. Abraham E. Chain описали инактивацию пенициллина в бесклеточном экстракте культуры E. coli
1965 – описана бета-лактамаза ТЕМ-1Наст. время – описано более 700 бета-лактамаз
NO
COOH
S
HN
COOH
S
OH
H2O
Классификация семейства бета-лактамаз
KPCKPC OXAOXA VIM SPMIMP GIM SIMVIM SPMIMP GIM SIM
TEMTEM SHVSHV CTX-MCTX-M
• Бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС)
• Ингибитор-устойчивые бета-лактамазы
• Карбапенемазы
5
Задача:
одновременная идентифицикация нескольких типов бета-лактамаз, определение мутаций в них
Возможное решение:• использование молекулярно-генетических
методов• использование мультипараметрических
методов исследований
6
Биологические микрочипы
Биологические микрочипы – это организованное размещение биологически активных молекулв виде миниатюризированных матриц на специальном носителе
Метод ДНК-зондов
Микрочип
7
Особенности технологии микрочипов
Одновременное определение множества параметров
Миниатюризация
Автоматизация
Высокая производительность
Одновременное определение множества параметров
Миниатюризация
Автоматизация
Высокая производительность
Выделение ДНК
• Амплификация гена (ПЦР)• Введение метки
Гибридизация Детекция результатовгибридизациипо активностиметки
Детекция результатов Детекция результатов гибридизационного анализагибридизационного анализа
9
Микрочипы с флуоресцентной детекцией
Cy3
СубстратОкрашенныйпродукт
Бт
Фермент
Микрочипы с колориметрической детекцией
10
Идентификация типа гена
C GA C
G U
T
G CA
A
U
CGA
G
T
CA U
T
A
G
C
Прямая цепь
Обратная цепь
11
Выявление точечных мутаций в генах
CCGCTTTTTTGCCCGCTTTTTTGCAACAACATGGGGGCAACATGGGGG
CCGCTTTTTTGCCCGCTTTTTTGCGGCAACATGGGGGCAACATGGGGG
CCGCTTTTTTGCCCGCTTTTTTGCCCCAACATGGGGGCAACATGGGGG
CCGCTTTTTTGCCCGCTTTTTTGCTTCAACATGGGGGCAACATGGGGG
TEM-1TEM-1
TEM-21TEM-21
TEM-1TEM-1
TEM-21TEM-21
151
...GSG...GSGHHYGT...YGT...
...GSG...GSGRRYGT...YGT...
AGCT
Анализ нуклеотидных последовательностей генов
ДНК-микрочип для идентификации генов БЛРС и ДНК-микрочип для идентификации генов БЛРС и ингибитор-устойчивых бета-лактамазингибитор-устойчивых бета-лактамаз
Контроль иммобилизацииОтр. контроль гибр.Полож. контроль гибр.Идентификация типа гена
Мутации в blaTEM
Мутации в blaSHV
Мутации в blaСТХ-М
Носитель: найлон
Размер чипа: 8 мм х 14 мм
Диаметр точки: ~ 350 µm
Количество точек: 246
Количество зондов: 78
Идентификация:• 3 типа генов β-лактамаз: TEM, SHV и СТХ-М
• 25 мутаций в них для определения БЛРС и ингибитор-уст. БЛ
13
TEM-1 + SHV-1 + TEM-1 + SHV-1 + SHV-12 + CTX-M-15SHV-12 + CTX-M-15 (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам I-IV I-IV пок-пок-нийний))
Ин
тен
си
вн
ост
ь,
отн
. е
д.
Ин
тен
си
вн
ост
ь,
отн
. е
д.
TEM-1 + SHV-1TEM-1 + SHV-1 (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам I I поколения)поколения)
Результаты тестирования штамма Результаты тестирования штамма K. pneumoniaK. pneumonia, , продуцирующего три продуцирующего три ββ-лактамазы:-лактамазы:TEM-1, SHV-1 TEM-1, SHV-1 и Си СTX-M-9TX-M-9
14
Ин
тен
си
вн
ост
ь,
отн
. е
д.
TEM-1 SHV-1 CTX-M-9
Апробация ДНК-микрочипа на клинических штаммах Enterobacteriaceae (n=100)
БЛРC – (n = 10): БЛРС+ (n = 90):
24,6% штаммов продуцировали 2 БЛРС
SHV-5-likeCTX-M-1-likeCTX-M-2-likeCTX-M-9-likeTEM-1-like + SHV-2-likeTEM-1-like + SHV-5-likeTEM-1-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + CTX-M-9-likeSHV-1-like + SHV-5-likeSHV-1-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + SHV-1-like + SHV-2-likeTEM-1-like + SHV-1-like + SHV-5-likeTEM-1-like + SHV-1-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + SHV-1-like + CTX-M-9-likeSHV-2-like + CTX-M-1-likeSHV-5-like + CTX-M-9-likeTEM-1-like + SHV-2-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + SHV-2-like + CTX-M-2-likeTEM-1-like + SHV-5-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + SHV-5-like + CTX-M-9-likeSHV-1-like + SHV-2-like + CTX-M-1-likeSHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-1-likeSHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-9-likeTEM-1-like + SHV-1-like + SHV-2-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + SHV-1-like + SHV-2-like + CTX-M-9-likeTEM-1-like + SHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + SHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-2-like
Не обн.ТЕМ-1SHV-1(TEM-1+SHV-1)
20%
20%
10%
50%
ДНК-микрочип для определения генов карбапенемаз Id_IMP Id_VIM Id_OXA
IMP-1 VIM-1 OXA-23
IMP-2 VIM-2 OXA-40
IMP-5 VIM-7 OXA-51
IMP-11 Id_SPM OXA-58
IMP-14 Id_SIM Id_KPC
Id_GIM
Контроль иммобилизацииПоложительный контроль гибридизацииОтрицательный контроль гибридизацииИдентификация для металло-β-лактамазИдентификация OXA-β-лактамазИдентификация KPC-β-лактамаз
Носитель: найлонРазмер микрочипа: 11мм×15ммДиаметр одной точки: 350 мкмКоличество точек: 132
Идентификация карбапенемаз:VIM, IMP, SPM, GIM, SIM (класс B)OXA ( класс D)KPC (класс A)
Апробация ДНК-микрочипа для определения генов карбапенемаз на клинических штаммах
МикроорганизмЧисло
штаммов
Типы обнаруженных карбапенемаз
OXA-23-like
OXA-40-like
OXA-51-like
OXA-58-like
VIM-2-like
Acinetobacter baumanii
n=15 1 5 15 4 -
Pseudomonas aeruginosa
n=15 - - - - 11
Скрининг клинических образцов на наличие БЛРС, ингибитор-устойчивых бета-лактамаз класса А и карбапенемаз классов A, B, D
Интегрированный ДНК-микрочипдля идентификации β-лактамаз
Благодарности:Благодарности:
• Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова Уляшова М.М. Халилова Ю.И. Григоренко В.Г. Игнатенко О.В.
• НИИ антимикробной химиотерапии, Смоленская гос. мед. академия Эдельштейн М.В.
• Институт нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко Александрова И.А.
Финансовая поддержка:ФЦП "Национальная технологическая база" на 2007-2011 годы (Контракт ГП/07/442/НТБ/К)
СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ !СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ !