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第八章 微生物遗传变异

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本章内容第一节 遗传变异的物质基础第二节 基因突变第三节 基因重组第四节 菌种的衰退复壮和保藏

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几 个 概 念遗传型（ genotype ）又称基因型指某一生物

个体所含有的全部遗传因子的总和是遗传物质上所负载的特定遗传信息

表型（ phenotype ）指某一生物体所具有的一切外表特征及内在特征的总和是遗传型在合适环境下的具体体现

遗传（ heredity 或 inheritance ）指生物上一代将自己的遗传因子传递给下一代的行为或功能具有极其稳定性

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变异（ variation ）指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变即遗传型的改变特点是出现频率低可稳定遗传

饰变（ modification ）指不涉及遗传物质的改变而只发生在转录转译水平上的表型变化其特点是在整个群体中普遍出现不能稳定遗传

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微生物是遗传学研究的模式生物（ 1 ）个体的结构极其简单（ 2 ）营养体一般都是单倍体（ 3 ）易于在成分简单的组合培养基上大

量生长繁殖（ 4 ）繁殖速度快（ 5 ）易于积累不同的中间代谢产物或终

产物（ 6 ）菌落形态特征的可见性和多样性

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（ 7 ）环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性

（ 8 ）易于形成营养缺陷型（ 9 ）各种微生物一般都有相应的病毒（ 10 ）存在多种处于进化过程中的原始

有性生殖方式

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一 3 个经典实验 经典转化实验 噬菌体感染实验 植物病毒的重建实验

第一节 遗传变异的物质基础

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1928 英国 Griffith （格里菲斯） Streptococcus penumoniae ( 肺炎双球菌 )

菌株 毒力 荚膜 菌落 型 野生型 有 产生 光滑 Smooth Ⅰ Ⅱ Ⅲ 突变型 无 不产生 粗糙 Rough Ⅰ Ⅱ Ⅲ

1 经典转化实验（ transformation ）

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（ 1 ）动物实验对小鼠注射活 RII 菌或死 SIII 菌 mdashmdashmdash小鼠存活对小鼠注射活 SIII 菌mdashmdashmdashmdash小鼠死亡对小鼠注射活 RII 菌和热死 SIII 菌 mdashmdashmdash小鼠死亡

mdashmdashmdash抽取心血分离mdashmdashmdash活的 SIII 菌

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混合培养

RII 型活菌

SIII 型活菌

SIII 型热死菌

RII 型活菌

SIII 型活菌

健康

健康

健康

健康

健康

健康

健康

病死

病死

病死

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（ 2 ）细菌培养实验热死 SIII 菌mdashmdashmdashmdashmdash不生长活 RII 菌mdashmdashmdashmdashmdash长出 RII 菌热死 SIII 菌 + 活 RII 菌mdashmdash长出大量 RII 菌和 10-6SIII 菌（ 3 ） S 型菌的无细胞抽提液试验活 RII 菌 +SIII 菌无细胞抽提液mdashmdash长出大量 R 菌和少量 S 菌

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Griffith 认为加热杀死的 SIII 型细菌细胞内可能存在一种转化物质它能通过某种方式进入 RII型细胞并使 RII 型细胞获得稳定的遗传性状转变为 SIII 型细胞并把转化物质称为转化因子

这种一种生物由于接受了另一种生物的遗传物质而表现出后者的遗传性状或发生遗传性状改变的现象叫做转化

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分别用降解 DNA RNA 蛋白质的酶作用于有毒的 S 型菌细胞抽提物

只有 DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNA 是转化所必需的转化因子1944 年 O T Avery C M MacLeod 和 M

McCarty从热死 S 型 S pneumoniae 中提纯了可能作为转化因子的各种成分并在离体条件下进行了转化试验

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只有 S 型细菌的 DNA才能将 S pneumoniae 的 R型转化为 S 型且 DNA纯度越高转化效率越高说明 S 型菌株转移给 R 型菌株的是遗传因子

①加 S 菌 DNA②加 S 菌 DNA 及 DNA酶以外的酶③加 S 菌的 DNA 和 DNA酶④加 S 菌的 RNA⑤加 S 菌的蛋白质⑥加 S 菌的荚膜多糖

活 R菌

长 出 S菌只 有 R菌

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2 噬菌体感染实验 1952 A D Hershey amp M Chase Ecoli T2 噬菌体

大肠杆菌培养在以放射性32PO4

3- 或 35SO42- 作为磷源

或硫源的培养基中制备出含 32P-DNA核心的噬菌体或含 35S-蛋白质外壳的噬菌体作了两个实验

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（ 1 ）含 32P-DNA 的一组

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 85在沉淀中

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（ 2 ）含 35S-蛋白质的一组

推论蛋白质外壳不进入细胞中推测 DNA 中存在着包括合成噬菌体蛋白质外壳在内的遗传信息

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 75在上清液中

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3 植物病毒的重建实验1956 H Fraenkel-Conrat 用含 RNA 的烟草花叶病毒（ TMV ）进行了植物病毒重建实验

将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡就能将其蛋白质外壳与 RNA核心相分离分离后的 RNA在没有蛋白质包裹的情况下也能感染烟草并使其患典型症状而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

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选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（ HRV ）分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

（ 1 ） RNA （ TMV ） 蛋白质（ HRV ）（ 2 ） RNA （ HRV ） 蛋白质（ TMV ） 用两种杂合病毒感染寄主(1) 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV粒子(2) 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV粒子说明在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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本章内容第一节 遗传变异的物质基础第二节 基因突变第三节 基因重组第四节 菌种的衰退复壮和保藏

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几 个 概 念遗传型（ genotype ）又称基因型指某一生物

个体所含有的全部遗传因子的总和是遗传物质上所负载的特定遗传信息

表型（ phenotype ）指某一生物体所具有的一切外表特征及内在特征的总和是遗传型在合适环境下的具体体现

遗传（ heredity 或 inheritance ）指生物上一代将自己的遗传因子传递给下一代的行为或功能具有极其稳定性

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变异（ variation ）指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变即遗传型的改变特点是出现频率低可稳定遗传

饰变（ modification ）指不涉及遗传物质的改变而只发生在转录转译水平上的表型变化其特点是在整个群体中普遍出现不能稳定遗传

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微生物是遗传学研究的模式生物（ 1 ）个体的结构极其简单（ 2 ）营养体一般都是单倍体（ 3 ）易于在成分简单的组合培养基上大

量生长繁殖（ 4 ）繁殖速度快（ 5 ）易于积累不同的中间代谢产物或终

产物（ 6 ）菌落形态特征的可见性和多样性

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（ 7 ）环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性

（ 8 ）易于形成营养缺陷型（ 9 ）各种微生物一般都有相应的病毒（ 10 ）存在多种处于进化过程中的原始

有性生殖方式

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一 3 个经典实验 经典转化实验 噬菌体感染实验 植物病毒的重建实验

第一节 遗传变异的物质基础

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1928 英国 Griffith （格里菲斯） Streptococcus penumoniae ( 肺炎双球菌 )

菌株 毒力 荚膜 菌落 型 野生型 有 产生 光滑 Smooth Ⅰ Ⅱ Ⅲ 突变型 无 不产生 粗糙 Rough Ⅰ Ⅱ Ⅲ

1 经典转化实验（ transformation ）

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（ 1 ）动物实验对小鼠注射活 RII 菌或死 SIII 菌 mdashmdashmdash小鼠存活对小鼠注射活 SIII 菌mdashmdashmdashmdash小鼠死亡对小鼠注射活 RII 菌和热死 SIII 菌 mdashmdashmdash小鼠死亡

mdashmdashmdash抽取心血分离mdashmdashmdash活的 SIII 菌

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混合培养

RII 型活菌

SIII 型活菌

SIII 型热死菌

RII 型活菌

SIII 型活菌

健康

健康

健康

健康

健康

健康

健康

病死

病死

病死

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（ 2 ）细菌培养实验热死 SIII 菌mdashmdashmdashmdashmdash不生长活 RII 菌mdashmdashmdashmdashmdash长出 RII 菌热死 SIII 菌 + 活 RII 菌mdashmdash长出大量 RII 菌和 10-6SIII 菌（ 3 ） S 型菌的无细胞抽提液试验活 RII 菌 +SIII 菌无细胞抽提液mdashmdash长出大量 R 菌和少量 S 菌

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Griffith 认为加热杀死的 SIII 型细菌细胞内可能存在一种转化物质它能通过某种方式进入 RII型细胞并使 RII 型细胞获得稳定的遗传性状转变为 SIII 型细胞并把转化物质称为转化因子

这种一种生物由于接受了另一种生物的遗传物质而表现出后者的遗传性状或发生遗传性状改变的现象叫做转化

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分别用降解 DNA RNA 蛋白质的酶作用于有毒的 S 型菌细胞抽提物

只有 DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNA 是转化所必需的转化因子1944 年 O T Avery C M MacLeod 和 M

McCarty从热死 S 型 S pneumoniae 中提纯了可能作为转化因子的各种成分并在离体条件下进行了转化试验

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只有 S 型细菌的 DNA才能将 S pneumoniae 的 R型转化为 S 型且 DNA纯度越高转化效率越高说明 S 型菌株转移给 R 型菌株的是遗传因子

①加 S 菌 DNA②加 S 菌 DNA 及 DNA酶以外的酶③加 S 菌的 DNA 和 DNA酶④加 S 菌的 RNA⑤加 S 菌的蛋白质⑥加 S 菌的荚膜多糖

活 R菌

长 出 S菌只 有 R菌

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2 噬菌体感染实验 1952 A D Hershey amp M Chase Ecoli T2 噬菌体

大肠杆菌培养在以放射性32PO4

3- 或 35SO42- 作为磷源

或硫源的培养基中制备出含 32P-DNA核心的噬菌体或含 35S-蛋白质外壳的噬菌体作了两个实验

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（ 1 ）含 32P-DNA 的一组

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 85在沉淀中

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（ 2 ）含 35S-蛋白质的一组

推论蛋白质外壳不进入细胞中推测 DNA 中存在着包括合成噬菌体蛋白质外壳在内的遗传信息

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 75在上清液中

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3 植物病毒的重建实验1956 H Fraenkel-Conrat 用含 RNA 的烟草花叶病毒（ TMV ）进行了植物病毒重建实验

将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡就能将其蛋白质外壳与 RNA核心相分离分离后的 RNA在没有蛋白质包裹的情况下也能感染烟草并使其患典型症状而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

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选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（ HRV ）分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

（ 1 ） RNA （ TMV ） 蛋白质（ HRV ）（ 2 ） RNA （ HRV ） 蛋白质（ TMV ） 用两种杂合病毒感染寄主(1) 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV粒子(2) 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV粒子说明在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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几 个 概 念遗传型（ genotype ）又称基因型指某一生物

个体所含有的全部遗传因子的总和是遗传物质上所负载的特定遗传信息

表型（ phenotype ）指某一生物体所具有的一切外表特征及内在特征的总和是遗传型在合适环境下的具体体现

遗传（ heredity 或 inheritance ）指生物上一代将自己的遗传因子传递给下一代的行为或功能具有极其稳定性

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变异（ variation ）指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变即遗传型的改变特点是出现频率低可稳定遗传

饰变（ modification ）指不涉及遗传物质的改变而只发生在转录转译水平上的表型变化其特点是在整个群体中普遍出现不能稳定遗传

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微生物是遗传学研究的模式生物（ 1 ）个体的结构极其简单（ 2 ）营养体一般都是单倍体（ 3 ）易于在成分简单的组合培养基上大

量生长繁殖（ 4 ）繁殖速度快（ 5 ）易于积累不同的中间代谢产物或终

产物（ 6 ）菌落形态特征的可见性和多样性

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（ 7 ）环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性

（ 8 ）易于形成营养缺陷型（ 9 ）各种微生物一般都有相应的病毒（ 10 ）存在多种处于进化过程中的原始

有性生殖方式

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一 3 个经典实验 经典转化实验 噬菌体感染实验 植物病毒的重建实验

第一节 遗传变异的物质基础

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1928 英国 Griffith （格里菲斯） Streptococcus penumoniae ( 肺炎双球菌 )

菌株 毒力 荚膜 菌落 型 野生型 有 产生 光滑 Smooth Ⅰ Ⅱ Ⅲ 突变型 无 不产生 粗糙 Rough Ⅰ Ⅱ Ⅲ

1 经典转化实验（ transformation ）

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（ 1 ）动物实验对小鼠注射活 RII 菌或死 SIII 菌 mdashmdashmdash小鼠存活对小鼠注射活 SIII 菌mdashmdashmdashmdash小鼠死亡对小鼠注射活 RII 菌和热死 SIII 菌 mdashmdashmdash小鼠死亡

mdashmdashmdash抽取心血分离mdashmdashmdash活的 SIII 菌

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混合培养

RII 型活菌

SIII 型活菌

SIII 型热死菌

RII 型活菌

SIII 型活菌

健康

健康

健康

健康

健康

健康

健康

病死

病死

病死

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（ 2 ）细菌培养实验热死 SIII 菌mdashmdashmdashmdashmdash不生长活 RII 菌mdashmdashmdashmdashmdash长出 RII 菌热死 SIII 菌 + 活 RII 菌mdashmdash长出大量 RII 菌和 10-6SIII 菌（ 3 ） S 型菌的无细胞抽提液试验活 RII 菌 +SIII 菌无细胞抽提液mdashmdash长出大量 R 菌和少量 S 菌

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Griffith 认为加热杀死的 SIII 型细菌细胞内可能存在一种转化物质它能通过某种方式进入 RII型细胞并使 RII 型细胞获得稳定的遗传性状转变为 SIII 型细胞并把转化物质称为转化因子

这种一种生物由于接受了另一种生物的遗传物质而表现出后者的遗传性状或发生遗传性状改变的现象叫做转化

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分别用降解 DNA RNA 蛋白质的酶作用于有毒的 S 型菌细胞抽提物

只有 DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNA 是转化所必需的转化因子1944 年 O T Avery C M MacLeod 和 M

McCarty从热死 S 型 S pneumoniae 中提纯了可能作为转化因子的各种成分并在离体条件下进行了转化试验

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只有 S 型细菌的 DNA才能将 S pneumoniae 的 R型转化为 S 型且 DNA纯度越高转化效率越高说明 S 型菌株转移给 R 型菌株的是遗传因子

①加 S 菌 DNA②加 S 菌 DNA 及 DNA酶以外的酶③加 S 菌的 DNA 和 DNA酶④加 S 菌的 RNA⑤加 S 菌的蛋白质⑥加 S 菌的荚膜多糖

活 R菌

长 出 S菌只 有 R菌

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2 噬菌体感染实验 1952 A D Hershey amp M Chase Ecoli T2 噬菌体

大肠杆菌培养在以放射性32PO4

3- 或 35SO42- 作为磷源

或硫源的培养基中制备出含 32P-DNA核心的噬菌体或含 35S-蛋白质外壳的噬菌体作了两个实验

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（ 1 ）含 32P-DNA 的一组

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 85在沉淀中

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（ 2 ）含 35S-蛋白质的一组

推论蛋白质外壳不进入细胞中推测 DNA 中存在着包括合成噬菌体蛋白质外壳在内的遗传信息

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 75在上清液中

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3 植物病毒的重建实验1956 H Fraenkel-Conrat 用含 RNA 的烟草花叶病毒（ TMV ）进行了植物病毒重建实验

将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡就能将其蛋白质外壳与 RNA核心相分离分离后的 RNA在没有蛋白质包裹的情况下也能感染烟草并使其患典型症状而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

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选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（ HRV ）分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

（ 1 ） RNA （ TMV ） 蛋白质（ HRV ）（ 2 ） RNA （ HRV ） 蛋白质（ TMV ） 用两种杂合病毒感染寄主(1) 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV粒子(2) 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV粒子说明在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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变异（ variation ）指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变即遗传型的改变特点是出现频率低可稳定遗传

饰变（ modification ）指不涉及遗传物质的改变而只发生在转录转译水平上的表型变化其特点是在整个群体中普遍出现不能稳定遗传

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微生物是遗传学研究的模式生物（ 1 ）个体的结构极其简单（ 2 ）营养体一般都是单倍体（ 3 ）易于在成分简单的组合培养基上大

量生长繁殖（ 4 ）繁殖速度快（ 5 ）易于积累不同的中间代谢产物或终

产物（ 6 ）菌落形态特征的可见性和多样性

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（ 7 ）环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性

（ 8 ）易于形成营养缺陷型（ 9 ）各种微生物一般都有相应的病毒（ 10 ）存在多种处于进化过程中的原始

有性生殖方式

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一 3 个经典实验 经典转化实验 噬菌体感染实验 植物病毒的重建实验

第一节 遗传变异的物质基础

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1928 英国 Griffith （格里菲斯） Streptococcus penumoniae ( 肺炎双球菌 )

菌株 毒力 荚膜 菌落 型 野生型 有 产生 光滑 Smooth Ⅰ Ⅱ Ⅲ 突变型 无 不产生 粗糙 Rough Ⅰ Ⅱ Ⅲ

1 经典转化实验（ transformation ）

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（ 1 ）动物实验对小鼠注射活 RII 菌或死 SIII 菌 mdashmdashmdash小鼠存活对小鼠注射活 SIII 菌mdashmdashmdashmdash小鼠死亡对小鼠注射活 RII 菌和热死 SIII 菌 mdashmdashmdash小鼠死亡

mdashmdashmdash抽取心血分离mdashmdashmdash活的 SIII 菌

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混合培养

RII 型活菌

SIII 型活菌

SIII 型热死菌

RII 型活菌

SIII 型活菌

健康

健康

健康

健康

健康

健康

健康

病死

病死

病死

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（ 2 ）细菌培养实验热死 SIII 菌mdashmdashmdashmdashmdash不生长活 RII 菌mdashmdashmdashmdashmdash长出 RII 菌热死 SIII 菌 + 活 RII 菌mdashmdash长出大量 RII 菌和 10-6SIII 菌（ 3 ） S 型菌的无细胞抽提液试验活 RII 菌 +SIII 菌无细胞抽提液mdashmdash长出大量 R 菌和少量 S 菌

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Griffith 认为加热杀死的 SIII 型细菌细胞内可能存在一种转化物质它能通过某种方式进入 RII型细胞并使 RII 型细胞获得稳定的遗传性状转变为 SIII 型细胞并把转化物质称为转化因子

这种一种生物由于接受了另一种生物的遗传物质而表现出后者的遗传性状或发生遗传性状改变的现象叫做转化

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分别用降解 DNA RNA 蛋白质的酶作用于有毒的 S 型菌细胞抽提物

只有 DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNA 是转化所必需的转化因子1944 年 O T Avery C M MacLeod 和 M

McCarty从热死 S 型 S pneumoniae 中提纯了可能作为转化因子的各种成分并在离体条件下进行了转化试验

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只有 S 型细菌的 DNA才能将 S pneumoniae 的 R型转化为 S 型且 DNA纯度越高转化效率越高说明 S 型菌株转移给 R 型菌株的是遗传因子

①加 S 菌 DNA②加 S 菌 DNA 及 DNA酶以外的酶③加 S 菌的 DNA 和 DNA酶④加 S 菌的 RNA⑤加 S 菌的蛋白质⑥加 S 菌的荚膜多糖

活 R菌

长 出 S菌只 有 R菌

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2 噬菌体感染实验 1952 A D Hershey amp M Chase Ecoli T2 噬菌体

大肠杆菌培养在以放射性32PO4

3- 或 35SO42- 作为磷源

或硫源的培养基中制备出含 32P-DNA核心的噬菌体或含 35S-蛋白质外壳的噬菌体作了两个实验

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（ 1 ）含 32P-DNA 的一组

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 85在沉淀中

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（ 2 ）含 35S-蛋白质的一组

推论蛋白质外壳不进入细胞中推测 DNA 中存在着包括合成噬菌体蛋白质外壳在内的遗传信息

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 75在上清液中

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3 植物病毒的重建实验1956 H Fraenkel-Conrat 用含 RNA 的烟草花叶病毒（ TMV ）进行了植物病毒重建实验

将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡就能将其蛋白质外壳与 RNA核心相分离分离后的 RNA在没有蛋白质包裹的情况下也能感染烟草并使其患典型症状而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

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选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（ HRV ）分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

（ 1 ） RNA （ TMV ） 蛋白质（ HRV ）（ 2 ） RNA （ HRV ） 蛋白质（ TMV ） 用两种杂合病毒感染寄主(1) 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV粒子(2) 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV粒子说明在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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微生物是遗传学研究的模式生物（ 1 ）个体的结构极其简单（ 2 ）营养体一般都是单倍体（ 3 ）易于在成分简单的组合培养基上大

量生长繁殖（ 4 ）繁殖速度快（ 5 ）易于积累不同的中间代谢产物或终

产物（ 6 ）菌落形态特征的可见性和多样性

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（ 7 ）环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性

（ 8 ）易于形成营养缺陷型（ 9 ）各种微生物一般都有相应的病毒（ 10 ）存在多种处于进化过程中的原始

有性生殖方式

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一 3 个经典实验 经典转化实验 噬菌体感染实验 植物病毒的重建实验

第一节 遗传变异的物质基础

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1928 英国 Griffith （格里菲斯） Streptococcus penumoniae ( 肺炎双球菌 )

菌株 毒力 荚膜 菌落 型 野生型 有 产生 光滑 Smooth Ⅰ Ⅱ Ⅲ 突变型 无 不产生 粗糙 Rough Ⅰ Ⅱ Ⅲ

1 经典转化实验（ transformation ）

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（ 1 ）动物实验对小鼠注射活 RII 菌或死 SIII 菌 mdashmdashmdash小鼠存活对小鼠注射活 SIII 菌mdashmdashmdashmdash小鼠死亡对小鼠注射活 RII 菌和热死 SIII 菌 mdashmdashmdash小鼠死亡

mdashmdashmdash抽取心血分离mdashmdashmdash活的 SIII 菌

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混合培养

RII 型活菌

SIII 型活菌

SIII 型热死菌

RII 型活菌

SIII 型活菌

健康

健康

健康

健康

健康

健康

健康

病死

病死

病死

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（ 2 ）细菌培养实验热死 SIII 菌mdashmdashmdashmdashmdash不生长活 RII 菌mdashmdashmdashmdashmdash长出 RII 菌热死 SIII 菌 + 活 RII 菌mdashmdash长出大量 RII 菌和 10-6SIII 菌（ 3 ） S 型菌的无细胞抽提液试验活 RII 菌 +SIII 菌无细胞抽提液mdashmdash长出大量 R 菌和少量 S 菌

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Griffith 认为加热杀死的 SIII 型细菌细胞内可能存在一种转化物质它能通过某种方式进入 RII型细胞并使 RII 型细胞获得稳定的遗传性状转变为 SIII 型细胞并把转化物质称为转化因子

这种一种生物由于接受了另一种生物的遗传物质而表现出后者的遗传性状或发生遗传性状改变的现象叫做转化

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分别用降解 DNA RNA 蛋白质的酶作用于有毒的 S 型菌细胞抽提物

只有 DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNA 是转化所必需的转化因子1944 年 O T Avery C M MacLeod 和 M

McCarty从热死 S 型 S pneumoniae 中提纯了可能作为转化因子的各种成分并在离体条件下进行了转化试验

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只有 S 型细菌的 DNA才能将 S pneumoniae 的 R型转化为 S 型且 DNA纯度越高转化效率越高说明 S 型菌株转移给 R 型菌株的是遗传因子

①加 S 菌 DNA②加 S 菌 DNA 及 DNA酶以外的酶③加 S 菌的 DNA 和 DNA酶④加 S 菌的 RNA⑤加 S 菌的蛋白质⑥加 S 菌的荚膜多糖

活 R菌

长 出 S菌只 有 R菌

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2 噬菌体感染实验 1952 A D Hershey amp M Chase Ecoli T2 噬菌体

大肠杆菌培养在以放射性32PO4

3- 或 35SO42- 作为磷源

或硫源的培养基中制备出含 32P-DNA核心的噬菌体或含 35S-蛋白质外壳的噬菌体作了两个实验

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（ 1 ）含 32P-DNA 的一组

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 85在沉淀中

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（ 2 ）含 35S-蛋白质的一组

推论蛋白质外壳不进入细胞中推测 DNA 中存在着包括合成噬菌体蛋白质外壳在内的遗传信息

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 75在上清液中

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3 植物病毒的重建实验1956 H Fraenkel-Conrat 用含 RNA 的烟草花叶病毒（ TMV ）进行了植物病毒重建实验

将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡就能将其蛋白质外壳与 RNA核心相分离分离后的 RNA在没有蛋白质包裹的情况下也能感染烟草并使其患典型症状而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

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选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（ HRV ）分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

（ 1 ） RNA （ TMV ） 蛋白质（ HRV ）（ 2 ） RNA （ HRV ） 蛋白质（ TMV ） 用两种杂合病毒感染寄主(1) 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV粒子(2) 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV粒子说明在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（ 7 ）环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性

（ 8 ）易于形成营养缺陷型（ 9 ）各种微生物一般都有相应的病毒（ 10 ）存在多种处于进化过程中的原始

有性生殖方式

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一 3 个经典实验 经典转化实验 噬菌体感染实验 植物病毒的重建实验

第一节 遗传变异的物质基础

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1928 英国 Griffith （格里菲斯） Streptococcus penumoniae ( 肺炎双球菌 )

菌株 毒力 荚膜 菌落 型 野生型 有 产生 光滑 Smooth Ⅰ Ⅱ Ⅲ 突变型 无 不产生 粗糙 Rough Ⅰ Ⅱ Ⅲ

1 经典转化实验（ transformation ）

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（ 1 ）动物实验对小鼠注射活 RII 菌或死 SIII 菌 mdashmdashmdash小鼠存活对小鼠注射活 SIII 菌mdashmdashmdashmdash小鼠死亡对小鼠注射活 RII 菌和热死 SIII 菌 mdashmdashmdash小鼠死亡

mdashmdashmdash抽取心血分离mdashmdashmdash活的 SIII 菌

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混合培养

RII 型活菌

SIII 型活菌

SIII 型热死菌

RII 型活菌

SIII 型活菌

健康

健康

健康

健康

健康

健康

健康

病死

病死

病死

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（ 2 ）细菌培养实验热死 SIII 菌mdashmdashmdashmdashmdash不生长活 RII 菌mdashmdashmdashmdashmdash长出 RII 菌热死 SIII 菌 + 活 RII 菌mdashmdash长出大量 RII 菌和 10-6SIII 菌（ 3 ） S 型菌的无细胞抽提液试验活 RII 菌 +SIII 菌无细胞抽提液mdashmdash长出大量 R 菌和少量 S 菌

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Griffith 认为加热杀死的 SIII 型细菌细胞内可能存在一种转化物质它能通过某种方式进入 RII型细胞并使 RII 型细胞获得稳定的遗传性状转变为 SIII 型细胞并把转化物质称为转化因子

这种一种生物由于接受了另一种生物的遗传物质而表现出后者的遗传性状或发生遗传性状改变的现象叫做转化

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分别用降解 DNA RNA 蛋白质的酶作用于有毒的 S 型菌细胞抽提物

只有 DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNA 是转化所必需的转化因子1944 年 O T Avery C M MacLeod 和 M

McCarty从热死 S 型 S pneumoniae 中提纯了可能作为转化因子的各种成分并在离体条件下进行了转化试验

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只有 S 型细菌的 DNA才能将 S pneumoniae 的 R型转化为 S 型且 DNA纯度越高转化效率越高说明 S 型菌株转移给 R 型菌株的是遗传因子

①加 S 菌 DNA②加 S 菌 DNA 及 DNA酶以外的酶③加 S 菌的 DNA 和 DNA酶④加 S 菌的 RNA⑤加 S 菌的蛋白质⑥加 S 菌的荚膜多糖

活 R菌

长 出 S菌只 有 R菌

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2 噬菌体感染实验 1952 A D Hershey amp M Chase Ecoli T2 噬菌体

大肠杆菌培养在以放射性32PO4

3- 或 35SO42- 作为磷源

或硫源的培养基中制备出含 32P-DNA核心的噬菌体或含 35S-蛋白质外壳的噬菌体作了两个实验

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（ 1 ）含 32P-DNA 的一组

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 85在沉淀中

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（ 2 ）含 35S-蛋白质的一组

推论蛋白质外壳不进入细胞中推测 DNA 中存在着包括合成噬菌体蛋白质外壳在内的遗传信息

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 75在上清液中

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3 植物病毒的重建实验1956 H Fraenkel-Conrat 用含 RNA 的烟草花叶病毒（ TMV ）进行了植物病毒重建实验

将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡就能将其蛋白质外壳与 RNA核心相分离分离后的 RNA在没有蛋白质包裹的情况下也能感染烟草并使其患典型症状而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

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选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（ HRV ）分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

（ 1 ） RNA （ TMV ） 蛋白质（ HRV ）（ 2 ） RNA （ HRV ） 蛋白质（ TMV ） 用两种杂合病毒感染寄主(1) 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV粒子(2) 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV粒子说明在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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一 3 个经典实验 经典转化实验 噬菌体感染实验 植物病毒的重建实验

第一节 遗传变异的物质基础

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1928 英国 Griffith （格里菲斯） Streptococcus penumoniae ( 肺炎双球菌 )

菌株 毒力 荚膜 菌落 型 野生型 有 产生 光滑 Smooth Ⅰ Ⅱ Ⅲ 突变型 无 不产生 粗糙 Rough Ⅰ Ⅱ Ⅲ

1 经典转化实验（ transformation ）

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（ 1 ）动物实验对小鼠注射活 RII 菌或死 SIII 菌 mdashmdashmdash小鼠存活对小鼠注射活 SIII 菌mdashmdashmdashmdash小鼠死亡对小鼠注射活 RII 菌和热死 SIII 菌 mdashmdashmdash小鼠死亡

mdashmdashmdash抽取心血分离mdashmdashmdash活的 SIII 菌

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混合培养

RII 型活菌

SIII 型活菌

SIII 型热死菌

RII 型活菌

SIII 型活菌

健康

健康

健康

健康

健康

健康

健康

病死

病死

病死

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（ 2 ）细菌培养实验热死 SIII 菌mdashmdashmdashmdashmdash不生长活 RII 菌mdashmdashmdashmdashmdash长出 RII 菌热死 SIII 菌 + 活 RII 菌mdashmdash长出大量 RII 菌和 10-6SIII 菌（ 3 ） S 型菌的无细胞抽提液试验活 RII 菌 +SIII 菌无细胞抽提液mdashmdash长出大量 R 菌和少量 S 菌

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Griffith 认为加热杀死的 SIII 型细菌细胞内可能存在一种转化物质它能通过某种方式进入 RII型细胞并使 RII 型细胞获得稳定的遗传性状转变为 SIII 型细胞并把转化物质称为转化因子

这种一种生物由于接受了另一种生物的遗传物质而表现出后者的遗传性状或发生遗传性状改变的现象叫做转化

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分别用降解 DNA RNA 蛋白质的酶作用于有毒的 S 型菌细胞抽提物

只有 DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNA 是转化所必需的转化因子1944 年 O T Avery C M MacLeod 和 M

McCarty从热死 S 型 S pneumoniae 中提纯了可能作为转化因子的各种成分并在离体条件下进行了转化试验

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只有 S 型细菌的 DNA才能将 S pneumoniae 的 R型转化为 S 型且 DNA纯度越高转化效率越高说明 S 型菌株转移给 R 型菌株的是遗传因子

①加 S 菌 DNA②加 S 菌 DNA 及 DNA酶以外的酶③加 S 菌的 DNA 和 DNA酶④加 S 菌的 RNA⑤加 S 菌的蛋白质⑥加 S 菌的荚膜多糖

活 R菌

长 出 S菌只 有 R菌

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2 噬菌体感染实验 1952 A D Hershey amp M Chase Ecoli T2 噬菌体

大肠杆菌培养在以放射性32PO4

3- 或 35SO42- 作为磷源

或硫源的培养基中制备出含 32P-DNA核心的噬菌体或含 35S-蛋白质外壳的噬菌体作了两个实验

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（ 1 ）含 32P-DNA 的一组

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 85在沉淀中

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（ 2 ）含 35S-蛋白质的一组

推论蛋白质外壳不进入细胞中推测 DNA 中存在着包括合成噬菌体蛋白质外壳在内的遗传信息

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 75在上清液中

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3 植物病毒的重建实验1956 H Fraenkel-Conrat 用含 RNA 的烟草花叶病毒（ TMV ）进行了植物病毒重建实验

将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡就能将其蛋白质外壳与 RNA核心相分离分离后的 RNA在没有蛋白质包裹的情况下也能感染烟草并使其患典型症状而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

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选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（ HRV ）分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

（ 1 ） RNA （ TMV ） 蛋白质（ HRV ）（ 2 ） RNA （ HRV ） 蛋白质（ TMV ） 用两种杂合病毒感染寄主(1) 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV粒子(2) 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV粒子说明在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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1928 英国 Griffith （格里菲斯） Streptococcus penumoniae ( 肺炎双球菌 )

菌株 毒力 荚膜 菌落 型 野生型 有 产生 光滑 Smooth Ⅰ Ⅱ Ⅲ 突变型 无 不产生 粗糙 Rough Ⅰ Ⅱ Ⅲ

1 经典转化实验（ transformation ）

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（ 1 ）动物实验对小鼠注射活 RII 菌或死 SIII 菌 mdashmdashmdash小鼠存活对小鼠注射活 SIII 菌mdashmdashmdashmdash小鼠死亡对小鼠注射活 RII 菌和热死 SIII 菌 mdashmdashmdash小鼠死亡

mdashmdashmdash抽取心血分离mdashmdashmdash活的 SIII 菌

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混合培养

RII 型活菌

SIII 型活菌

SIII 型热死菌

RII 型活菌

SIII 型活菌

健康

健康

健康

健康

健康

健康

健康

病死

病死

病死

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（ 2 ）细菌培养实验热死 SIII 菌mdashmdashmdashmdashmdash不生长活 RII 菌mdashmdashmdashmdashmdash长出 RII 菌热死 SIII 菌 + 活 RII 菌mdashmdash长出大量 RII 菌和 10-6SIII 菌（ 3 ） S 型菌的无细胞抽提液试验活 RII 菌 +SIII 菌无细胞抽提液mdashmdash长出大量 R 菌和少量 S 菌

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Griffith 认为加热杀死的 SIII 型细菌细胞内可能存在一种转化物质它能通过某种方式进入 RII型细胞并使 RII 型细胞获得稳定的遗传性状转变为 SIII 型细胞并把转化物质称为转化因子

这种一种生物由于接受了另一种生物的遗传物质而表现出后者的遗传性状或发生遗传性状改变的现象叫做转化

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分别用降解 DNA RNA 蛋白质的酶作用于有毒的 S 型菌细胞抽提物

只有 DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNA 是转化所必需的转化因子1944 年 O T Avery C M MacLeod 和 M

McCarty从热死 S 型 S pneumoniae 中提纯了可能作为转化因子的各种成分并在离体条件下进行了转化试验

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只有 S 型细菌的 DNA才能将 S pneumoniae 的 R型转化为 S 型且 DNA纯度越高转化效率越高说明 S 型菌株转移给 R 型菌株的是遗传因子

①加 S 菌 DNA②加 S 菌 DNA 及 DNA酶以外的酶③加 S 菌的 DNA 和 DNA酶④加 S 菌的 RNA⑤加 S 菌的蛋白质⑥加 S 菌的荚膜多糖

活 R菌

长 出 S菌只 有 R菌

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2 噬菌体感染实验 1952 A D Hershey amp M Chase Ecoli T2 噬菌体

大肠杆菌培养在以放射性32PO4

3- 或 35SO42- 作为磷源

或硫源的培养基中制备出含 32P-DNA核心的噬菌体或含 35S-蛋白质外壳的噬菌体作了两个实验

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（ 1 ）含 32P-DNA 的一组

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 85在沉淀中

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（ 2 ）含 35S-蛋白质的一组

推论蛋白质外壳不进入细胞中推测 DNA 中存在着包括合成噬菌体蛋白质外壳在内的遗传信息

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 75在上清液中

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3 植物病毒的重建实验1956 H Fraenkel-Conrat 用含 RNA 的烟草花叶病毒（ TMV ）进行了植物病毒重建实验

将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡就能将其蛋白质外壳与 RNA核心相分离分离后的 RNA在没有蛋白质包裹的情况下也能感染烟草并使其患典型症状而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

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选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（ HRV ）分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

（ 1 ） RNA （ TMV ） 蛋白质（ HRV ）（ 2 ） RNA （ HRV ） 蛋白质（ TMV ） 用两种杂合病毒感染寄主(1) 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV粒子(2) 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV粒子说明在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（ 1 ）动物实验对小鼠注射活 RII 菌或死 SIII 菌 mdashmdashmdash小鼠存活对小鼠注射活 SIII 菌mdashmdashmdashmdash小鼠死亡对小鼠注射活 RII 菌和热死 SIII 菌 mdashmdashmdash小鼠死亡

mdashmdashmdash抽取心血分离mdashmdashmdash活的 SIII 菌

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混合培养

RII 型活菌

SIII 型活菌

SIII 型热死菌

RII 型活菌

SIII 型活菌

健康

健康

健康

健康

健康

健康

健康

病死

病死

病死

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（ 2 ）细菌培养实验热死 SIII 菌mdashmdashmdashmdashmdash不生长活 RII 菌mdashmdashmdashmdashmdash长出 RII 菌热死 SIII 菌 + 活 RII 菌mdashmdash长出大量 RII 菌和 10-6SIII 菌（ 3 ） S 型菌的无细胞抽提液试验活 RII 菌 +SIII 菌无细胞抽提液mdashmdash长出大量 R 菌和少量 S 菌

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Griffith 认为加热杀死的 SIII 型细菌细胞内可能存在一种转化物质它能通过某种方式进入 RII型细胞并使 RII 型细胞获得稳定的遗传性状转变为 SIII 型细胞并把转化物质称为转化因子

这种一种生物由于接受了另一种生物的遗传物质而表现出后者的遗传性状或发生遗传性状改变的现象叫做转化

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分别用降解 DNA RNA 蛋白质的酶作用于有毒的 S 型菌细胞抽提物

只有 DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNA 是转化所必需的转化因子1944 年 O T Avery C M MacLeod 和 M

McCarty从热死 S 型 S pneumoniae 中提纯了可能作为转化因子的各种成分并在离体条件下进行了转化试验

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只有 S 型细菌的 DNA才能将 S pneumoniae 的 R型转化为 S 型且 DNA纯度越高转化效率越高说明 S 型菌株转移给 R 型菌株的是遗传因子

①加 S 菌 DNA②加 S 菌 DNA 及 DNA酶以外的酶③加 S 菌的 DNA 和 DNA酶④加 S 菌的 RNA⑤加 S 菌的蛋白质⑥加 S 菌的荚膜多糖

活 R菌

长 出 S菌只 有 R菌

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2 噬菌体感染实验 1952 A D Hershey amp M Chase Ecoli T2 噬菌体

大肠杆菌培养在以放射性32PO4

3- 或 35SO42- 作为磷源

或硫源的培养基中制备出含 32P-DNA核心的噬菌体或含 35S-蛋白质外壳的噬菌体作了两个实验

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（ 1 ）含 32P-DNA 的一组

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 85在沉淀中

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（ 2 ）含 35S-蛋白质的一组

推论蛋白质外壳不进入细胞中推测 DNA 中存在着包括合成噬菌体蛋白质外壳在内的遗传信息

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 75在上清液中

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3 植物病毒的重建实验1956 H Fraenkel-Conrat 用含 RNA 的烟草花叶病毒（ TMV ）进行了植物病毒重建实验

将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡就能将其蛋白质外壳与 RNA核心相分离分离后的 RNA在没有蛋白质包裹的情况下也能感染烟草并使其患典型症状而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

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选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（ HRV ）分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

（ 1 ） RNA （ TMV ） 蛋白质（ HRV ）（ 2 ） RNA （ HRV ） 蛋白质（ TMV ） 用两种杂合病毒感染寄主(1) 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV粒子(2) 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV粒子说明在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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混合培养

RII 型活菌

SIII 型活菌

SIII 型热死菌

RII 型活菌

SIII 型活菌

健康

健康

健康

健康

健康

健康

健康

病死

病死

病死

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（ 2 ）细菌培养实验热死 SIII 菌mdashmdashmdashmdashmdash不生长活 RII 菌mdashmdashmdashmdashmdash长出 RII 菌热死 SIII 菌 + 活 RII 菌mdashmdash长出大量 RII 菌和 10-6SIII 菌（ 3 ） S 型菌的无细胞抽提液试验活 RII 菌 +SIII 菌无细胞抽提液mdashmdash长出大量 R 菌和少量 S 菌

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Griffith 认为加热杀死的 SIII 型细菌细胞内可能存在一种转化物质它能通过某种方式进入 RII型细胞并使 RII 型细胞获得稳定的遗传性状转变为 SIII 型细胞并把转化物质称为转化因子

这种一种生物由于接受了另一种生物的遗传物质而表现出后者的遗传性状或发生遗传性状改变的现象叫做转化

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分别用降解 DNA RNA 蛋白质的酶作用于有毒的 S 型菌细胞抽提物

只有 DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNA 是转化所必需的转化因子1944 年 O T Avery C M MacLeod 和 M

McCarty从热死 S 型 S pneumoniae 中提纯了可能作为转化因子的各种成分并在离体条件下进行了转化试验

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只有 S 型细菌的 DNA才能将 S pneumoniae 的 R型转化为 S 型且 DNA纯度越高转化效率越高说明 S 型菌株转移给 R 型菌株的是遗传因子

①加 S 菌 DNA②加 S 菌 DNA 及 DNA酶以外的酶③加 S 菌的 DNA 和 DNA酶④加 S 菌的 RNA⑤加 S 菌的蛋白质⑥加 S 菌的荚膜多糖

活 R菌

长 出 S菌只 有 R菌

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2 噬菌体感染实验 1952 A D Hershey amp M Chase Ecoli T2 噬菌体

大肠杆菌培养在以放射性32PO4

3- 或 35SO42- 作为磷源

或硫源的培养基中制备出含 32P-DNA核心的噬菌体或含 35S-蛋白质外壳的噬菌体作了两个实验

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（ 1 ）含 32P-DNA 的一组

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 85在沉淀中

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（ 2 ）含 35S-蛋白质的一组

推论蛋白质外壳不进入细胞中推测 DNA 中存在着包括合成噬菌体蛋白质外壳在内的遗传信息

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 75在上清液中

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3 植物病毒的重建实验1956 H Fraenkel-Conrat 用含 RNA 的烟草花叶病毒（ TMV ）进行了植物病毒重建实验

将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡就能将其蛋白质外壳与 RNA核心相分离分离后的 RNA在没有蛋白质包裹的情况下也能感染烟草并使其患典型症状而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

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选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（ HRV ）分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

（ 1 ） RNA （ TMV ） 蛋白质（ HRV ）（ 2 ） RNA （ HRV ） 蛋白质（ TMV ） 用两种杂合病毒感染寄主(1) 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV粒子(2) 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV粒子说明在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（ 2 ）细菌培养实验热死 SIII 菌mdashmdashmdashmdashmdash不生长活 RII 菌mdashmdashmdashmdashmdash长出 RII 菌热死 SIII 菌 + 活 RII 菌mdashmdash长出大量 RII 菌和 10-6SIII 菌（ 3 ） S 型菌的无细胞抽提液试验活 RII 菌 +SIII 菌无细胞抽提液mdashmdash长出大量 R 菌和少量 S 菌

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Griffith 认为加热杀死的 SIII 型细菌细胞内可能存在一种转化物质它能通过某种方式进入 RII型细胞并使 RII 型细胞获得稳定的遗传性状转变为 SIII 型细胞并把转化物质称为转化因子

这种一种生物由于接受了另一种生物的遗传物质而表现出后者的遗传性状或发生遗传性状改变的现象叫做转化

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分别用降解 DNA RNA 蛋白质的酶作用于有毒的 S 型菌细胞抽提物

只有 DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNA 是转化所必需的转化因子1944 年 O T Avery C M MacLeod 和 M

McCarty从热死 S 型 S pneumoniae 中提纯了可能作为转化因子的各种成分并在离体条件下进行了转化试验

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只有 S 型细菌的 DNA才能将 S pneumoniae 的 R型转化为 S 型且 DNA纯度越高转化效率越高说明 S 型菌株转移给 R 型菌株的是遗传因子

①加 S 菌 DNA②加 S 菌 DNA 及 DNA酶以外的酶③加 S 菌的 DNA 和 DNA酶④加 S 菌的 RNA⑤加 S 菌的蛋白质⑥加 S 菌的荚膜多糖

活 R菌

长 出 S菌只 有 R菌

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2 噬菌体感染实验 1952 A D Hershey amp M Chase Ecoli T2 噬菌体

大肠杆菌培养在以放射性32PO4

3- 或 35SO42- 作为磷源

或硫源的培养基中制备出含 32P-DNA核心的噬菌体或含 35S-蛋白质外壳的噬菌体作了两个实验

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（ 1 ）含 32P-DNA 的一组

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 85在沉淀中

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（ 2 ）含 35S-蛋白质的一组

推论蛋白质外壳不进入细胞中推测 DNA 中存在着包括合成噬菌体蛋白质外壳在内的遗传信息

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 75在上清液中

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3 植物病毒的重建实验1956 H Fraenkel-Conrat 用含 RNA 的烟草花叶病毒（ TMV ）进行了植物病毒重建实验

将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡就能将其蛋白质外壳与 RNA核心相分离分离后的 RNA在没有蛋白质包裹的情况下也能感染烟草并使其患典型症状而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

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选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（ HRV ）分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

（ 1 ） RNA （ TMV ） 蛋白质（ HRV ）（ 2 ） RNA （ HRV ） 蛋白质（ TMV ） 用两种杂合病毒感染寄主(1) 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV粒子(2) 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV粒子说明在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（ 2 ）细菌培养实验热死 SIII 菌mdashmdashmdashmdashmdash不生长活 RII 菌mdashmdashmdashmdashmdash长出 RII 菌热死 SIII 菌 + 活 RII 菌mdashmdash长出大量 RII 菌和 10-6SIII 菌（ 3 ） S 型菌的无细胞抽提液试验活 RII 菌 +SIII 菌无细胞抽提液mdashmdash长出大量 R 菌和少量 S 菌

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Griffith 认为加热杀死的 SIII 型细菌细胞内可能存在一种转化物质它能通过某种方式进入 RII型细胞并使 RII 型细胞获得稳定的遗传性状转变为 SIII 型细胞并把转化物质称为转化因子

这种一种生物由于接受了另一种生物的遗传物质而表现出后者的遗传性状或发生遗传性状改变的现象叫做转化

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分别用降解 DNA RNA 蛋白质的酶作用于有毒的 S 型菌细胞抽提物

只有 DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNA 是转化所必需的转化因子1944 年 O T Avery C M MacLeod 和 M

McCarty从热死 S 型 S pneumoniae 中提纯了可能作为转化因子的各种成分并在离体条件下进行了转化试验

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只有 S 型细菌的 DNA才能将 S pneumoniae 的 R型转化为 S 型且 DNA纯度越高转化效率越高说明 S 型菌株转移给 R 型菌株的是遗传因子

①加 S 菌 DNA②加 S 菌 DNA 及 DNA酶以外的酶③加 S 菌的 DNA 和 DNA酶④加 S 菌的 RNA⑤加 S 菌的蛋白质⑥加 S 菌的荚膜多糖

活 R菌

长 出 S菌只 有 R菌

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2 噬菌体感染实验 1952 A D Hershey amp M Chase Ecoli T2 噬菌体

大肠杆菌培养在以放射性32PO4

3- 或 35SO42- 作为磷源

或硫源的培养基中制备出含 32P-DNA核心的噬菌体或含 35S-蛋白质外壳的噬菌体作了两个实验

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（ 1 ）含 32P-DNA 的一组

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 85在沉淀中

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（ 2 ）含 35S-蛋白质的一组

推论蛋白质外壳不进入细胞中推测 DNA 中存在着包括合成噬菌体蛋白质外壳在内的遗传信息

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 75在上清液中

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3 植物病毒的重建实验1956 H Fraenkel-Conrat 用含 RNA 的烟草花叶病毒（ TMV ）进行了植物病毒重建实验

将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡就能将其蛋白质外壳与 RNA核心相分离分离后的 RNA在没有蛋白质包裹的情况下也能感染烟草并使其患典型症状而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

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选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（ HRV ）分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

（ 1 ） RNA （ TMV ） 蛋白质（ HRV ）（ 2 ） RNA （ HRV ） 蛋白质（ TMV ） 用两种杂合病毒感染寄主(1) 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV粒子(2) 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV粒子说明在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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Griffith 认为加热杀死的 SIII 型细菌细胞内可能存在一种转化物质它能通过某种方式进入 RII型细胞并使 RII 型细胞获得稳定的遗传性状转变为 SIII 型细胞并把转化物质称为转化因子

这种一种生物由于接受了另一种生物的遗传物质而表现出后者的遗传性状或发生遗传性状改变的现象叫做转化

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分别用降解 DNA RNA 蛋白质的酶作用于有毒的 S 型菌细胞抽提物

只有 DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNA 是转化所必需的转化因子1944 年 O T Avery C M MacLeod 和 M

McCarty从热死 S 型 S pneumoniae 中提纯了可能作为转化因子的各种成分并在离体条件下进行了转化试验

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只有 S 型细菌的 DNA才能将 S pneumoniae 的 R型转化为 S 型且 DNA纯度越高转化效率越高说明 S 型菌株转移给 R 型菌株的是遗传因子

①加 S 菌 DNA②加 S 菌 DNA 及 DNA酶以外的酶③加 S 菌的 DNA 和 DNA酶④加 S 菌的 RNA⑤加 S 菌的蛋白质⑥加 S 菌的荚膜多糖

活 R菌

长 出 S菌只 有 R菌

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2 噬菌体感染实验 1952 A D Hershey amp M Chase Ecoli T2 噬菌体

大肠杆菌培养在以放射性32PO4

3- 或 35SO42- 作为磷源

或硫源的培养基中制备出含 32P-DNA核心的噬菌体或含 35S-蛋白质外壳的噬菌体作了两个实验

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（ 1 ）含 32P-DNA 的一组

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 85在沉淀中

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（ 2 ）含 35S-蛋白质的一组

推论蛋白质外壳不进入细胞中推测 DNA 中存在着包括合成噬菌体蛋白质外壳在内的遗传信息

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 75在上清液中

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3 植物病毒的重建实验1956 H Fraenkel-Conrat 用含 RNA 的烟草花叶病毒（ TMV ）进行了植物病毒重建实验

将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡就能将其蛋白质外壳与 RNA核心相分离分离后的 RNA在没有蛋白质包裹的情况下也能感染烟草并使其患典型症状而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

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选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（ HRV ）分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

（ 1 ） RNA （ TMV ） 蛋白质（ HRV ）（ 2 ） RNA （ HRV ） 蛋白质（ TMV ） 用两种杂合病毒感染寄主(1) 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV粒子(2) 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV粒子说明在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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分别用降解 DNA RNA 蛋白质的酶作用于有毒的 S 型菌细胞抽提物

只有 DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNA 是转化所必需的转化因子1944 年 O T Avery C M MacLeod 和 M

McCarty从热死 S 型 S pneumoniae 中提纯了可能作为转化因子的各种成分并在离体条件下进行了转化试验

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只有 S 型细菌的 DNA才能将 S pneumoniae 的 R型转化为 S 型且 DNA纯度越高转化效率越高说明 S 型菌株转移给 R 型菌株的是遗传因子

①加 S 菌 DNA②加 S 菌 DNA 及 DNA酶以外的酶③加 S 菌的 DNA 和 DNA酶④加 S 菌的 RNA⑤加 S 菌的蛋白质⑥加 S 菌的荚膜多糖

活 R菌

长 出 S菌只 有 R菌

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2 噬菌体感染实验 1952 A D Hershey amp M Chase Ecoli T2 噬菌体

大肠杆菌培养在以放射性32PO4

3- 或 35SO42- 作为磷源

或硫源的培养基中制备出含 32P-DNA核心的噬菌体或含 35S-蛋白质外壳的噬菌体作了两个实验

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（ 1 ）含 32P-DNA 的一组

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 85在沉淀中

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（ 2 ）含 35S-蛋白质的一组

推论蛋白质外壳不进入细胞中推测 DNA 中存在着包括合成噬菌体蛋白质外壳在内的遗传信息

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 75在上清液中

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3 植物病毒的重建实验1956 H Fraenkel-Conrat 用含 RNA 的烟草花叶病毒（ TMV ）进行了植物病毒重建实验

将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡就能将其蛋白质外壳与 RNA核心相分离分离后的 RNA在没有蛋白质包裹的情况下也能感染烟草并使其患典型症状而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

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选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（ HRV ）分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

（ 1 ） RNA （ TMV ） 蛋白质（ HRV ）（ 2 ） RNA （ HRV ） 蛋白质（ TMV ） 用两种杂合病毒感染寄主(1) 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV粒子(2) 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV粒子说明在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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只有 S 型细菌的 DNA才能将 S pneumoniae 的 R型转化为 S 型且 DNA纯度越高转化效率越高说明 S 型菌株转移给 R 型菌株的是遗传因子

①加 S 菌 DNA②加 S 菌 DNA 及 DNA酶以外的酶③加 S 菌的 DNA 和 DNA酶④加 S 菌的 RNA⑤加 S 菌的蛋白质⑥加 S 菌的荚膜多糖

活 R菌

长 出 S菌只 有 R菌

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2 噬菌体感染实验 1952 A D Hershey amp M Chase Ecoli T2 噬菌体

大肠杆菌培养在以放射性32PO4

3- 或 35SO42- 作为磷源

或硫源的培养基中制备出含 32P-DNA核心的噬菌体或含 35S-蛋白质外壳的噬菌体作了两个实验

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（ 1 ）含 32P-DNA 的一组

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 85在沉淀中

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（ 2 ）含 35S-蛋白质的一组

推论蛋白质外壳不进入细胞中推测 DNA 中存在着包括合成噬菌体蛋白质外壳在内的遗传信息

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 75在上清液中

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3 植物病毒的重建实验1956 H Fraenkel-Conrat 用含 RNA 的烟草花叶病毒（ TMV ）进行了植物病毒重建实验

将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡就能将其蛋白质外壳与 RNA核心相分离分离后的 RNA在没有蛋白质包裹的情况下也能感染烟草并使其患典型症状而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

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选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（ HRV ）分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

（ 1 ） RNA （ TMV ） 蛋白质（ HRV ）（ 2 ） RNA （ HRV ） 蛋白质（ TMV ） 用两种杂合病毒感染寄主(1) 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV粒子(2) 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV粒子说明在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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2 噬菌体感染实验 1952 A D Hershey amp M Chase Ecoli T2 噬菌体

大肠杆菌培养在以放射性32PO4

3- 或 35SO42- 作为磷源

或硫源的培养基中制备出含 32P-DNA核心的噬菌体或含 35S-蛋白质外壳的噬菌体作了两个实验

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（ 1 ）含 32P-DNA 的一组

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 85在沉淀中

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（ 2 ）含 35S-蛋白质的一组

推论蛋白质外壳不进入细胞中推测 DNA 中存在着包括合成噬菌体蛋白质外壳在内的遗传信息

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 75在上清液中

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3 植物病毒的重建实验1956 H Fraenkel-Conrat 用含 RNA 的烟草花叶病毒（ TMV ）进行了植物病毒重建实验

将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡就能将其蛋白质外壳与 RNA核心相分离分离后的 RNA在没有蛋白质包裹的情况下也能感染烟草并使其患典型症状而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

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选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（ HRV ）分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

（ 1 ） RNA （ TMV ） 蛋白质（ HRV ）（ 2 ） RNA （ HRV ） 蛋白质（ TMV ） 用两种杂合病毒感染寄主(1) 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV粒子(2) 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV粒子说明在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（ 1 ）含 32P-DNA 的一组

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 85在沉淀中

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（ 2 ）含 35S-蛋白质的一组

推论蛋白质外壳不进入细胞中推测 DNA 中存在着包括合成噬菌体蛋白质外壳在内的遗传信息

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 75在上清液中

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3 植物病毒的重建实验1956 H Fraenkel-Conrat 用含 RNA 的烟草花叶病毒（ TMV ）进行了植物病毒重建实验

将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡就能将其蛋白质外壳与 RNA核心相分离分离后的 RNA在没有蛋白质包裹的情况下也能感染烟草并使其患典型症状而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

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选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（ HRV ）分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

（ 1 ） RNA （ TMV ） 蛋白质（ HRV ）（ 2 ） RNA （ HRV ） 蛋白质（ TMV ） 用两种杂合病毒感染寄主(1) 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV粒子(2) 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV粒子说明在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（ 2 ）含 35S-蛋白质的一组

推论蛋白质外壳不进入细胞中推测 DNA 中存在着包括合成噬菌体蛋白质外壳在内的遗传信息

10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附 离心

沉淀细胞进一步培养后可产生大量完整的子代噬菌体结论放射性 75在上清液中

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3 植物病毒的重建实验1956 H Fraenkel-Conrat 用含 RNA 的烟草花叶病毒（ TMV ）进行了植物病毒重建实验

将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡就能将其蛋白质外壳与 RNA核心相分离分离后的 RNA在没有蛋白质包裹的情况下也能感染烟草并使其患典型症状而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

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选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（ HRV ）分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

（ 1 ） RNA （ TMV ） 蛋白质（ HRV ）（ 2 ） RNA （ HRV ） 蛋白质（ TMV ） 用两种杂合病毒感染寄主(1) 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV粒子(2) 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV粒子说明在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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3 植物病毒的重建实验1956 H Fraenkel-Conrat 用含 RNA 的烟草花叶病毒（ TMV ）进行了植物病毒重建实验

将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡就能将其蛋白质外壳与 RNA核心相分离分离后的 RNA在没有蛋白质包裹的情况下也能感染烟草并使其患典型症状而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

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选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（ HRV ）分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

（ 1 ） RNA （ TMV ） 蛋白质（ HRV ）（ 2 ） RNA （ HRV ） 蛋白质（ TMV ） 用两种杂合病毒感染寄主(1) 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV粒子(2) 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV粒子说明在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（ HRV ）分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

（ 1 ） RNA （ TMV ） 蛋白质（ HRV ）（ 2 ） RNA （ HRV ） 蛋白质（ TMV ） 用两种杂合病毒感染寄主(1) 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV粒子(2) 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV粒子说明在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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结论证明核酸（ DNA

或 RNA）是遗传的物质基础

简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题

微生物与高等生物具有共同的遗传本质

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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二遗传物质在细胞内的存在部位和方式 （一） 7 个水平细胞水平细胞核核区多核微生物细胞核水平基因组质粒（仅 2μm 质粒在核内）染色体水平部分双倍体核酸水平 DNA RNA基因水平操纵子内含子和外显子 基因蛋白抗性基因书写方式密码子水平密码子三联体核苷酸水平 TACGU 最低突变单位或交换单位

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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基因组 单倍体细胞核内整套染色体所含的 DNA 分子及其所携带的全部基因

基因组的大小

病毒 103bp

原核生物 106bp

真核生物 109bp

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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2 原核生物的质粒(1) 质粒游离于原核生物基因组外具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子即cccDNA （ circlularcovalently closed DNA ）

(2) 类型严紧型质粒其复制过程与核染色体的复制同步

一般细胞中只含有 1~2 个 松弛型质粒其复制过程与核染色体的复制不同步在细胞中一般有 10~15 个

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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几种重要的质粒 ① F 因子（ fertility factorfertility factor ）） 又称致育因子是大肠杆菌等细菌中决定 ldquo性别rdquo的

质粒可通过接合转移

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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②R 因子（ resistance factor ） 又称抗药性质粒具有多种抗生素抗性基因且

可在不同细菌中传递 作为基因工程的载体③Ti 质粒（ tumor inducing plasmidtumor

plasmid ） 即诱癌质粒存在于根癌农杆菌

（ Agrobacterium tumefaciens ）中可引起多种双子叶植物的根癌

Ti 质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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④降解性质粒 只在假单孢菌属（ pseudomonas ）存在的一系列质粒的总称它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质这些质粒以其所分解的底物命名如 CAM （樟脑）质粒 XYL （二甲苯）质粒NAP （萘）质粒等

在环境保护上具有重大的应用价值

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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第二节 基因突变基因突变（ gene mutation ）简称突变指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化可自发或诱导产生

狭义的突变一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变包括一对或少数几对碱基的缺失插入或置换而导致的基因突变其发生变化的范围很小又称点突变

广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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广义的突变包括染色体畸变和点突变染色体畸变是指大段染色体的缺失重复倒位易位

野生型菌株从自然界分离得到的菌株突变株野生型经突变后形成的带有新性状的菌株

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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一基因突变（一）基因突变的类型1 营养缺陷型（ auxotroph ） 某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子碱基或氨基酸的能力因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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营养缺陷型的表示方法基因型 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示 hisC （组氨酸缺陷型其中的大写字母 C 同一表型中不同

基因的突变）表型同上但第一个字母大写不用斜体 HisC使用时多用 hisC-mdashmdash 缺陷型 hisC+mdashmdash 野生型

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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2 抗性突变型（ resistant mutant ） 野生型菌株因发生基因突变而产生的对某种化

学药物或致死物理因子的抗性变异类型可在加有相应因子的培养基上选出

表示方法所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上ldquo rrdquo 表示

str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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3 条件致死突变型（ conditional lethal mutant ） 某菌株或病毒经基因突变后在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型

如 Ecoil 的 Ts 突变株（温度敏感突变型）在 37下正常生长 42 下不能生长

4 形态突变型（ morphological mutant ） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异如孢子的颜色有无鞭毛荚膜的有无菌落的表面情况等

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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5 抗原突变型（ antigenic mutant ） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型如细胞壁缺陷型鞭毛突变型等

6 产量突变型（ producing mutant ） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌

株有明显差别的突变株两种 ldquo正变株rdquo（ plus-mutant ） ldquo负变株rdquo（ minus-mutant ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（二） 突变率 ( mutation rate )

某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率

或每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（三） 基因突变的特点①不对应性突变的性状与引起突变的原

因间无直接对应关系②自发性突变可以在没有人为因素的处理下自发发生

③稀有性自发突变的频率是极低和稳定的常在 10-6～ 10-9之间

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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④独立性某一基因的突变不会对其他基因的突变频率产生影响

⑤诱变性通过诱变剂的作用可以提高自发突变的几率 10 ～ 105 倍

⑥稳定性突变性状是稳定的可遗传的⑦可逆性任何性状都会发生正向突变也会发生回复突变

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（四）基因突变自发性和不对应性实验证明

三个经典实验 变量实验涂布实验影印实验

突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（ 1 ）变量试验（ fluctuation analysis ） Salvador Luria and Max Delbruck （ 1943 ）波动试验彷徨试

验

结果说明

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（ 2 ） Newcombe 的涂布试验（ 1949 ）

结果说明

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（ 3 ）影印平板培养法（ replica plating ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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Joshua Lederberg and Esther Lederberg （ 1952 ）

结果说明

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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诱变剂与致癌物质mdashmdash Ames 试验

ldquo生物化学统一性rdquo法则所有生物的 DNA 在结构及特性上具有一致性

人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA 使其发生突变最后造成癌变或其他不良的后果

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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Ames 试验Ames 试验 (艾姆氏实验 ) 美国加利福尼亚大

学 Bruce Ames教授于 1966年发明检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株 (his-) 的回复突变率用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂 P215

回复突变 (reverse mutation 或 back mutation) 突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复这种第二次突变称为回复突变

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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证明 Ames 试验重要性的应用实例 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物ldquo反

应停rdquo由于其药效显著在 60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高而且生产畸形儿的妇女大多曾服用ldquo反应停rdquo后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（五）基因突变及其机制

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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1 诱发突变 ( induced mutation ) ①碱基的置换（ substitutionsubstitution ） 转换（ transitiontransition ）即 DNA链

中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 A G T C

颠换 (transversiontransversion) 即 DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 A T 或 C G C 或 T

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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碱基置换的机制直接引起置换的诱变剂如亚硝酸羟胺等

不论体内还是体外均可直接与核酸反应间接引起置换的诱变剂如 5-BU 2-

AP 5-AU等均为碱基类似物

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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②移码突变 (frame-shift mutation

移码突变指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变移码突变诱变剂丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄原黄素等）和一系列 ICR类的化合物1048729

ICR 由美国的肿瘤研究所（ Institute for Cancer Research ）合成是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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③染色体畸变（ chromosomal aberration ）

即 DNA 分子大损伤染色体结构的缺失重复插入易位倒位

染色体易位是分子遗传学研究的热点转座 DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座这段 DNA顺序称为转座因子包括插入序列转座子 Mu 噬菌体等

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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插入序列（ IS insertion sequence ）分子量最小（ 07 ～ 14kb ）只能引起转座效应而不含其它任何基因

转座子（ Tn transposon ）分子量居中（ 2 ～25kb ）除了与转座有关的基因外常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因

Mu 噬菌体（ mutatorphage 即诱变噬菌体）是Ecoil 的一种温和噬菌体无特定整合位点分子量最大（ 37kb ）含有 20 多个基因

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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2 自发突变自发突变没有人工参与下的生物体自然发生的突变可能的机制 A 背景辐射和环境因素的诱变 B 微生物本身有害代谢物的诱变效应 C 复制过程中碱基配对错误引起

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（六）紫外线对 DNA 的损伤及修复

损伤机制 主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结

合的胸腺嘧啶二聚体二聚体的出现会减弱双链氢键的作用并引起双链结构扭曲变形阻碍碱基间的正常配对从而有可能引起突变或死亡

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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修复机制①光复活作用（ photoreactivation ） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时

可明显降低其死亡率的现象又称为 SOS修复是一种倾向差错型修复作用

②暗修复（ dark repair ）又称切除修复（ excision repair ）这种修复与光无关必须有四种酶的参与ａ核酸内切酶ｂ核酸外切酶ｃ DNA聚合酶ｄ连接酶

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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第三节 基因重组基因重组两个独立基因组内的遗传基因通过一定

的途径转移到一起经过遗传分子间的重新组合形成新的稳定基因组的过程称为基因重组 (gene recombination) 或遗传重组 (genetic recombination) 是分子水平上的杂交

原核生物转化转导接合和原生质体融合 真核微生物有性杂交准性杂交原生质体融合

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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一原核生物的基因重组（一）转化（ transformation ） 1928年 Griffith （格里菲斯）发现肺炎链球菌

（ Streptococcus pneumoniae ）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力是现代生物学发展史上重要的里程碑

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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转化（ transformation ）指受体菌（ recipient cell receptor ）直接吸收供体菌（ donor cell ）的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象

转化子通过转化方式形成的杂种后代感受态（ competence ）受体细胞最易接受

外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态自然转化rarrrarrrarr人工转化rarrrarrrarr基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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1 自然转化定义通常将不经特殊处理的细菌细胞从

其环境中吸收外来 DNA 的过程自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ① 感受态的出现 ②DNA 的结合与进入 ③DNA 的整合

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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2 人工转化如果通过二价阳离子处理大肠杆菌和

许多 G- 细菌能产生感受态对另一些细菌特别是某些 G+ 细菌则可通过制备原生质体实现 DNA 转化

（ 1 ）大肠杆菌的转化 1970 年 Mandel和 Higa 首先发现 DNA 在高 Ca+ 的条件下能够被受体细胞摄入和转化

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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DNA 转化过程

StrS

StrR

StrR

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（ 2 ） PEG 介导的转化 （ 3 ）电穿孔法电穿孔法是用高压脉冲电流击破

细胞膜或将细胞膜击成小孔使各种大分子能通过这些小孔进入细胞又称电转化

（ 4 ）基因枪转化将包裹有 DNA 的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使 DNA 留在细胞内特别是留在细胞器中

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（二）转导 (transduction)

1952 年 Joshua Lederberg （莱德伯格）和Norton Zinder （辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验

用ldquo Urdquo 型管进行同样的实验时在供体和受体细胞不接触的情况下同样出现野生型细菌

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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转导模型

溶源性菌株色氨酸营养缺陷型 LA-22 trp-his+

敏感菌株组氨酸营养缺陷型 LA-2 trp+his-

比细菌小的噬菌体培养基游离的 DNA片段能通过

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

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一株为沙门氏菌 LT22A 是携带 P22 噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌基因的传递很可能是由可透过ldquo Urdquo 型管滤板

的 P22 噬菌体介导的一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现

发现普遍性转导这一重要的基因转移途径

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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转导利用缺陷噬菌体为媒介将供体菌的小片段 DNA 转移到受体细胞中通过交换和整合使后者获得前者部分遗传性状的现象

转导子由转导作用获得部分新性状的重组细胞通常用温和噬菌体作为媒介转导 DNA位于噬菌体蛋白外壳内不易被外界

的 DNA 水解酶所破坏所以比较稳定分为普遍性转导和局限性转导两种类型

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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1 普遍转导（ generalized transduction ） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的ldquo误

包rdquo而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 完全普遍转导简称完全转导 (complete transduction)

由完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源 DNA 片段导入受体细胞内

流产普遍转导简称流产转导 (abortive transduction) 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受体菌如果外源DNA 在其内既不进行交换整合和复制也不迅速消失而仅进行转录转译和性状表达这种现象就称流产转导

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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2 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 特点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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局限转导

温和噬菌体 λ 只能整合到宿主染色体的特定位点裂解时的不正常切割包含 gal 或 bio 基因（几率一般仅有 10-6 ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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①低频转导（ 10-5 ）不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体 DNA 上形成一种特殊的噬菌体mdashmdash缺陷噬菌体

②高频转导（ high frequency transduction HFT ）（ 50）在局限转导中若对双重溶源菌进行诱导就会产生含 50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物 HFT 用这种裂解物去转导受体菌就可获得高达 50左右的转导子

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象称为溶源转变

溶源转变不同于转导 ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重

组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（三）接合 (conjugation)

定义供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程

1946年 Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward LTaturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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1 接合现象的发现与证实

他们用大肠杆菌 K12 的两个营养缺陷型菌株混合培养结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组 ① 转化作用的排除② F 质粒的发现

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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结论重组子不是转化的结果 接合需要两亲本的接触

比细菌小的培养基游离的DNA片段能通过

ldquoUrdquo 型管实验（ Bernard Davis 1950 ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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2 F 质粒的结构及其在细胞中的存在状态(1) F 质粒的遗传结构 F 质粒双链环状 DNA 分子 99159bp F 质粒整个基因组由三个主要区段组成 ①转移区 ②复制区 ③插入区

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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两株 Ecoli 的接合电镜照片F 质粒

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（ 2 ） F 质粒在细胞内存在形式 根据 F 质粒在大肠杆菌细胞内

有无及存在状态可将细胞分为四种类型

F- 雌性不含 F 质粒F+ 雄性含有 F 质粒游离Hfr F 质粒整合到宿主染色

体上并随之复制Frsquo 携带了宿主的一部分染色

体的 F 质粒

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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① F+ timesF- rarrF++ F+

（ 3 ） F 质粒与接合作用

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② HfrtimesF- rarr HfrtimesHfr HfrtimesF- rarr HfrtimesF-

F 因子不易转入受体细胞中故 HfrtimesF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是 F-

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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③Frsquo timesF-rarr Frsquo + Frsquo

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四原生质体融合（ protoplast fusion ）

1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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1 概念 通过人为的方法使遗传性状不同的两

细胞的原生质体发生融合并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程称为原生质体融合

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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2 原生质融合的主要步骤

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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二真核微生物的基因重组1 有性杂交（ sexual hybridization ）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重

组方式有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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2 准性杂交（ parascxualhybridization ）通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子类似于有性生殖但更原始的生殖方式为半知菌育种提供了一个重要手段准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象准性生殖包括四个过程 ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化异核体同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长 同核体同一菌丝中只有一种核

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现几率低 正常出现几率高

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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准性杂交选择亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合将两菌亲株的分生孢子（ 106~107 ）混合涂

[-] 平板并做各单亲本对照 [-] 平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落纯化菌落并将纯化后的菌落移入 [-]斜面 验稳定性在 [-]夹层平板上培养后再倒上一层 [+] 再培养后若出现大量新菌落说明是不稳定的异核体反之是杂合二倍体促进变异用诱变剂进行处理以促进染色体发生交换染色体在子细胞分配不均染色体缺失或畸变点突变等使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

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Penicillum urticae 的准性杂交步骤

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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第四节 菌种的衰退复壮与保藏一菌种的衰退与复壮1 菌种退化 (Degeneration ) 生产菌株生产性

状的劣化遗传标记的丢失菌种退化可以是形态上的也可以是生理上的如产孢子能力发酵主产物比例下降等

退化的表现减产原有的典型性状变得不典型最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变抗不良环境条件能力的减弱等

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis) 的芽孢和伴孢晶体变得小而少生长速度缓慢产孢子越来越少

细黄链霉菌（ Streptomycesmicroflavus)ldquo5406rdquo 在平板培养基上菌苔变薄生长缓慢不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降

赤霉素生产菌种藤仓赤霉（ Gibberellafujikuroi ）产赤霉素能力的下降

枯草杆菌（ Bacillus subtilis ）ldquo BF7658rdquo 生产 α-淀粉酶能力的衰退

白僵菌（ Beauveriabassiana) 对宿主致病能力的下降

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程

首先在细胞群体中出现个别发生负变的菌株这时如不及时发现并采取有效的措施而一味地移种传代则群体中这种负变个体的比例逐渐增大最后占据了优势整个群体发生严重的退化

所以开始时所谓ldquo纯rdquo的菌株实际上其中已包含着一定程度的不纯因素

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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2 菌种退化的原因 （ 1 ）基因突变控制生产性状的基因发生负突变遗传性变异是绝对的它的稳定性是相对的退化性变异是大量存在的而进化性变异则是

个别的

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（ 2 ）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核或是单核但 DNA 双链之

一发生突变随着传代其生产性状也将发生退化 这种退化不是基因突变引起的而是由于诱变获得的高产

株本身不纯高产突变只发生在一个核和一条 DNA 单链上随着细胞分裂核发生分离突变基因和未突变基因发生分离出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株

退化是菌种自发突变的结果培养环境营养不良发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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3 菌种退化的防止（ 1 ）从菌种选育时考虑在育种过程中应尽可能使用孢子或单核菌株避免对多核细胞进行处理采用较高剂量使单链突变的同时另一条单链丧失了模板作用可以减少出现分离回复现象

同时在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化以保证获得菌株的ldquo纯度rdquo

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（ 2 ）从菌种保藏角度考虑微生物都存在着自发突变而突变都是在繁殖过

程中发生或表现出来的减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性

（ 3 ）从菌种培养角度考虑培养条件要有利于生产菌株不利于退化菌株的

生长如控制碳源氮源 pH 和温度避免出现对生产菌不利的环境限制退化菌株在数量上的增加

（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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（ 4 ）从菌种管理的角度考虑最有效的方法是定期使菌种复壮 (rejuvenation)

菌种复壮在菌种发生退化后通过纯种分离和性能测定从退化的群体中找出尚未退化的个体以达到恢复该菌种原有性状的一种措施

广义的复壮在菌种尚未退化之前定期地进行纯种分离和性能测定以使菌种的生产性能保持稳定是一项积极的措施

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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二菌种的保藏菌种保藏的目的保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力不被其它杂菌污染形态特征和生理性状应尽可能不变异以便今后长期使用

基本原理选用优良的纯种最好是休眠体（分生孢子芽孢等）创造一个使微生物代谢不活泼生长繁殖受抑制难以突变的环境条件

环境要素干燥低温缺氧缺营养以及添加保护剂

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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影响微生物菌种稳定性的因素a ）变异b ）污染c ）死亡

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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1 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基也可进行穿刺培

养待生长成健壮的菌体（对数期细胞有性孢子或无性孢子）后将菌种放置 4冰箱保藏每间隔一定时间需重新移植培养一次

移种时间芽孢杆菌 3~6 个月一次其它细菌每月一次如保藏温度高则间隔的时间要短

放线菌 4~6 保藏每 3 个月移种一次 酵母菌在 4~6 保藏每 4~6 个月移种一次某些种类酵母如芽裂酵母阿氏假囊酵母棉病囊霉等必须每1~2月移种一次

丝状真菌在 4~6 保藏每 4月移种一次担子菌4~6 保藏每 3月移种一次

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优点最早使用普遍采用在实验室和工厂中即便同时采用几种方法保藏同一菌种这种方法仍是必不可少的该法简单易行代价小能随时观察保藏菌株是否死亡变异退化或染菌

缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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缺点保藏过程中微生物仍然有活动所以保藏的时间较短菌种容易退化采用橡皮塞代替棉塞可以避免水分散发并且能隔氧能适当延长保藏期

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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2 液体石蜡保藏法

在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡液面高出培养基 1厘米将其置试管架上以直立状态低温保藏

优点液体石蜡可以防止水分蒸发隔绝氧气延长保藏时间

缺点必须直立放在冰箱内占据较大的空间

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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3 沙管保藏法土壤保藏法

沙土管取河沙过 24目筛用 10~20 的盐酸浸泡除去有机质洗涤烘干分装入安瓿管加塞灭菌需要保藏的菌株先用斜面培养基培养再用无菌水制成细胞或孢子悬液将 10滴悬液注入装有洗净灭菌河沙的沙管内使细胞或孢子吸附在沙上放到干燥器中吸干沙中的水分将干燥后的沙管用火焰熔封管口可以室温或低温保藏

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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土壤法以土壤代替河沙不需酸洗经风干粉碎过 24目筛分装灭菌后同上制备

特点干燥低温隔氧无营养物保藏的效果较好制作简单比液体石蜡法保藏时间长

适用对象芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌和一些丝状真菌

保藏时间可达数年甚至数十年

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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4 麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏

方法将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀加水或培养液与麸皮的比例为108 或 11 或 115 原则是按照不同菌种对水分要求不同而定将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中装入的麸皮应保持疏松不要紧压高温灭菌后将菌种的孢子液接入适宜温度下培养直至长出菌丝再放在干燥器中干燥后 20以下温度保藏优点操作简单保藏时间长不易退化工厂中常用

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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5 蒸馏水保藏法 方法每个试管中装 5毫升灭菌的无菌水用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞接入蒸馏水中并使之悬浮试管用无菌的橡皮塞塞紧放置 10 低温保藏需用时可从管内移出一环接到培养基上而原来的管加塞后仍可继续保藏特点该法为菌种创造了一个无营养的环境适用对象诡谲棒状杆菌（ Cornebacteriuminsidiosum) 根瘤病土壤杆菌（ Agrobacteriumtumefaciens) 假单孢菌（ Pseudomonas sp)等也有人将其用于酵母菌保藏

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6 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分最后获得干燥的菌体

样品它同时具备干燥低温和缺氧的菌种保藏条件可使微生物菌种得到较长时间的保存冻干的菌种密封在较小的安瓿中避免了保藏期间的污染也便于大量保藏它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法但是该法操作相对繁琐技术要求较高除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外其它多数微生物如病毒细菌放线菌酵母菌丝状真菌等都能冻干保藏许多菌种用此法可保藏 10年以上

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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7 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法而其它方法又

不能长期保藏根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一也是适用范围最广的微生物保藏法几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏只有少量对低温损伤敏感的微生物例外液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏不论孢子或菌体液体培养物或固体培养物均可使用该法

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8 甘油保藏法该法与液氮超低温保藏法类似菌种悬浮在 10

（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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（ VV ）甘油蒸馏水置低温（ -70~-80 ）保藏该法较简便保藏期较长但需要有超低温冰箱

实际工作中常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中并使甘油的终浓度在 10~30左右再分装于小离心管中置低温保藏基因工程菌常采用该法保藏

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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三国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种菌株的基础上把它们妥善保藏使之达到不死不衰不乱和便于交换使用的目的 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（ CCCCM ） 美国典型菌种保藏中心（ ATCC ） 美国的北部地区研究实验室（ NRRL ） 英国的国家典型菌种保藏所（ NCTC ） 日本的大阪发酵研究所（ IFO ） 东京大学应用微生物研究所（ IAM ） 荷兰的真菌中心收藏所（ CBS ） 法国的里昂巴斯德研究所（ IPL ） 德国的科赫研究所（ RKI ）

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中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于 1979年该委员会下设六个菌种保藏管理中

心其负责单位代号和保藏菌种的性质如下 普通微生物菌种保藏管理中心（ CCGMC ） 中科院微生物所北京（ AS ）真菌细菌 中科院武汉病毒研究所武汉（ AS-IV ）病毒农业微生物菌种保藏管理中心（ ACCC ） 中国农业科学院土壤肥料研究所北京（ ISF ）

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工业微生物菌种保藏管理中心（ CICC ） 轻工业部食品发酵工业科学研究所北京（ IFFI ） 医学微生物菌种保藏管理中心（ CMCC ） 中国医学科学院皮肤病研究所南京（ ID ）真菌 卫生部药品生物制品检定所北京（ NICPBP ）细菌 中国医学科学院病毒研究所北京（ IV) 病毒 抗生素菌种保藏管理中心（ CACC ） 中国医学科学院抗生素研究所北京（ IA ） 四川抗生素工业研究所成都（ SIA ） 华北制药厂抗生素研究所石家庄（ IANP ） 兽医微生物菌种保藏管理中心 (CVCC ） 农业部兽医药品检察所北京（ CIVBP ）

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