扬州五台山医院 张晓斌

抗抑郁药物以及抑郁症与胶质

源性神经生长因子的关系

抑郁症的流行病学• 全球有抑郁症患者约 1.2-2.0 亿

• WHO （ 1996 ）在中国的调查发现抑郁症的患病率已经达到 7%

到 2020 年，抑郁症在全球疾病总负担中将升至第二位 我国有超过 2600 万人患有抑郁症，造成直接和间接经济损失每

年超过 640 亿元人民币 抑郁症引起的精神残疾给患者、家庭和社会带来了沉重的负担，

而在其支配下的自伤、自杀、扩大性自杀等暴力行为更是危害巨大

抑郁症病因• 遗传因素

家系研究、双生子研究、分子遗传学研究• 神经生物学因素

神经传递异常、神经生理异常 (睡眠 )、神经内分泌异常

• 素质和躯体因素体质体型学说、早年经历和人格特点、躯体状况和疾病

• 心理社会因素

抑郁症的病理机制假说

•“三个”假说

–单胺神经递质（ 5-HT 、 NE 和 DA ）的缺乏

–单胺递质缺乏引起相应受体上调

–神经可塑性：神经再生受损，海马体积减少

抗抑郁剂的作用示意图

33 维脑影像显示海马体积：有抑郁史者减少大约维脑影像显示海马体积：有抑郁史者减少大约 10%10%

Reduced Glia in MDD & BPD● Density/size of glia in dorsolateral prefrontal cortex and caudal oribito frontal cortex in

MDD & BPD-layer specific (Miguel-Hidalgo and Rajkowska 2002; Rajkowska et al 1999)

● Glial cell density in sublayer IIIc (19%) (and a trend to decrease in layer Va) in dorsolateral prefrontal cortex (area 9) in BPD (Selemon, unpublished data)

● Glial number in subgenual prefrontal cortex in familial MDD (24%) and BPD (41%) (Ongur et al 1998)

● Glial cell density in layer V (30%) in prefrontal cortex (area 9) in MDD (Cotter et al 2002)

● Glial cell density in layer VI (22%) in anterior cingulate cortex in MDD (Cotter et al 2001)

● Glial cell counts, glial density, and glia-to-neuron ratios in amygdala in MDD (Bowley et al 2002)

星形胶质细胞的生理功能星形胶质细胞的生理功能

1 、成年脑中近 90 % 的细胞是胶质细胞 , 其中主要是星型胶质细胞 (ast ro

cytes , AS) ， AS 长期以来被认为是脑组织中简单的堆积物，发挥着连接、

支持、固定脑组织的作用，为神经元提供营养以及清除突触间隙中过多的

离子和 / 或神经递质。

2 、 1997 年 Pfrieger 等首次报道 AS 能强烈促进神经元间的突触联系后，

对 AS 的认识进入了一个崭新的阶段。一系列对于 AS 的研究证实 :AS 还

可以调节神经元的周围环境 , 分泌神经营养因子（如： GDNF 、 BDNF 、

NGF 、 NT3/4 等 ），参与血脑屏障构成 , 调节神经元突触的生长和功能

成熟，调控神经的发生，参与脑中信号传递等。

3 、 AS 能够回吸收 5-羟色胺（ 5-HT ），在 AS 细胞膜存在有 5-HT 和

类固醇受体。

胶质源性神经生长因子（ GDNF ）生理特点

1 、 1993 年 Lin 等从大鼠 B49 胶质细胞系中分离、纯化并成功克隆。人的 G

DNF基因位于 5P13.1-13.3, 大鼠与人的 GDNF氨基酸序列有 93% 相同。

2 、 GDNF 以前体形式合成，修饰为含 134 个氨基酸的成熟蛋白形式分泌。GDNF含 7 个保守的半胱氨基酸残基， GDNF 为 TGF- β 超家族的一员。

3 、 GDNF 的神经营养作用主要是通过胶质细胞源性神经营养因子受体 alpha

( GFRαs) 亚基和受体酪氨酸激酶 Ret 亚基结合，并引起酪氨酸残基自磷酸化 , 从而引起下游的信号转导。

4 、 GDNF 的生理功能：对运动神经元、感觉神经元、多巴胺神经元的营养支持； GDNF 对缺血性损伤的保护作用；在痛觉通路中发挥作用；参与血 - 脑屏障的形成。

抗抑郁剂、情感稳定剂及电休克治疗（抗抑郁剂、情感稳定剂及电休克治疗（ ECECT T ）的可能机制）的可能机制

11 、不同类型的抗抑郁药能够促进神经病胶质瘤、不同类型的抗抑郁药能够促进神经病胶质瘤 C6C6 细胞株分泌细胞株分泌 GDGD

NFNF ， ， GDNFGDNF 的分泌量与抗抑郁药干预存在时间和浓度的依赖。的分泌量与抗抑郁药干预存在时间和浓度的依赖。22 、抗抑郁药（氟西汀）能够阻断应激导致的大鼠模型中星型胶质细、抗抑郁药（氟西汀）能够阻断应激导致的大鼠模型中星型胶质细

胞的体积和数目的减少。胞的体积和数目的减少。33 、情感稳定剂（如：碳酸锂、丙戊酸盐）能够使抑郁大鼠模型中、情感稳定剂（如：碳酸锂、丙戊酸盐）能够使抑郁大鼠模型中 mm

RNA BDNFRNA BDNF 表达上调。表达上调。44 、电休克的治疗作用与神经胶质细胞可能有部分联系。 在电休克、电休克的治疗作用与神经胶质细胞可能有部分联系。 在电休克治疗的动物模型的齿状回等脑区治疗的动物模型的齿状回等脑区 GFAPGFAP （神经胶质酸性蛋白）表（神经胶质酸性蛋白）表达与合成增加。达与合成增加。

抗抑郁剂、情感稳定剂及电休克治疗（抗抑郁剂、情感稳定剂及电休克治疗（ ECT ECT ）对抑郁的治疗作）对抑郁的治疗作用可能是通过星型胶质细胞来发挥效果？用可能是通过星型胶质细胞来发挥效果？

研究目标本课题拟做如下研究：

1 、给予纯化培养的大鼠海马星型胶质细胞氟西汀处理， ELISA检测星型胶质细胞分泌的 GDNF水平、 real-time PCR检测mRNA GD

NF 的表达。

2 、 建立应激大鼠模型，给予氟西汀干预后， 来研究星型胶质细胞的数目和密度。通过 real-time PCR 和 WestBlot 分别检测mRNA G

DNF 和 GDNF蛋白的表达。

3 、 ELISA检测抑郁症患者抗抑郁药和电休克治疗前后血清 GDNF

水平的变化。

实验技术路线（ 1）

氟西汀干预组

出生 24 小时的 SD 大鼠

星型胶质细胞的纯化培养和鉴定

空白对照组

ELISA 、 real-time PCR

不同时间点

不同药物浓度

实验技术路线（ 2）

氟西汀

无应激

应 激

应激 +氟西汀

对照组 + 氟西汀

应激组 +氟西汀

应激组

对照组

21 days

GDNF mRNA表达

GDNF蛋白的表达

实验技术路线（ 3）

抑郁症患者

治疗前

GDNF 浓度

HDRS 评定

治疗 4 周 治疗 8 周

GDNF 浓度

HDRS 评定

GDNF 浓度

HDRS 评定

难治疗性抑郁症患者

MECT 前 MECT 后

GDNF 浓度

HDRS 评定

GDNF 浓度

HDRS 评定

实验方案1 、大鼠海马星型胶质细胞的培养、纯化和鉴定

海马的分离：机械法分离出大鼠海马—胰酶消化法收集单个细胞

　培养和纯化：将细胞种植于包被多聚赖酸的培养瓶中，使用含 20%FBS 的 DMEM/F12培养液培养细胞。采用差速贴壁和传代法纯化星型胶质细胞。

鉴定：通过细胞免疫化学法标记星型胶质细胞特异性表达的细胞骨架蛋白 -GFAP 。

实验方案2、探讨对海马星型胶质细胞产生最佳作用的氟 西汀药物浓度

星型胶质细胞的培养、纯化

探讨氟西汀的最佳药物浓度：使用 MTT法检 测不同浓度氟西汀（ 0-50μM）对星型胶质细胞存活力影响。

实验方案3 、在不同时间点，氟西汀药物对海马星型胶质细胞的作用

星型胶质细胞的培养、纯化

不同浓度的氟西汀作用星型胶质细胞 48h后

同一浓度的氟西汀（最佳浓度）作用星型胶质细胞不同时间后（ 0-6-12-24-48h后）

检测指标： ELISA检测细胞培养液中 GDNF 水平、 real-

time PCR 检测mRNAGDNF 表达。

实验方案4、应激大鼠模型层面的研究 实验动物选取：选取清洁级健康成年雄性 SD 大鼠， 12月龄，体重

275(±25) g ，大鼠经 Y 型迷宫测试，选择活跃，对电击反应较敏感，逃避反应迅速，达到连续 2 次正确反应、电击次数≤ 3 次者供实验用，同时排除过度活跃和反应迟钝的大鼠。

应激模型的建立：按Willner 等方法改良的 CUMS 和孤养法建立应激模型，孤养同时连续随机给予 CUMS 。

实验动物分组：对照组、对照组 +氟西汀、应激组、应激组 +氟西汀。

检测指标：使用 Real-time PCR 、 Western blot 分别检测海马区m

RNA GDNF 和 GDNF蛋白表达。

实验方案5 、临床层面的研究 研究对象 抑郁症组 (76 例 ) ：选择住院病人，均符合 CCMD-3复发性抑郁症

的诊断标准。 难治性抑郁症组 (16 例 ) ：符合 CCMD-3复发性抑郁症诊断标准，并符合难治性抑郁的临床定义：至少对三种抗抑郁药在足剂量和足疗程时无治疗效果。

正常对照组 (50例 ):与患者组性别、年龄相匹配，无烟酒嗜好、无酒精药物成瘾和其他精神神经科疾病。

量表评定：采用汉密尔顿抑郁量表 (HDRS)评定抑郁症状严重程度、。 无抽搐电休克治疗：采用美国产 SPECTRUM 5000 型无抽搐电休克治疗仪，治疗约 8-10 次。

血清 GDNF 浓度测定：采不抗凝的空腹静脉血 5ml，分离血清，采用酶联免疫吸附法（ ELISA ）测定血清 GDNF 浓度。

实验方案6 、统计学检验

用 SPSS统计软件包处理所有实验数据，求出

各组观察指标的均值和标准差；用方差分析、

t 检验或非参数学分析比较各组各定量指标；

用 χ2检验比较各组间定性指标。

实验结果 (1)

细胞层面的研究

2 天 5 天 6 天

P0 原代细胞

细胞照片

P4 传代细胞

6 天6 天

细胞照片

星形胶质细胞免疫组化照片

星型胶质细胞免疫荧光组化照片

与 0μM 浓度组比较，★ P<0.05 ，★★ P<0.01

不同浓度氟西汀对星型胶质细胞活性影响

同一浓度氟西汀干预星型胶质细胞 不同时间后对 GDNF 水平的影响

与同时间组比较，★★ P< 0.01

不同浓度氟西汀对星型胶质细胞所分 泌的 GDNF 水平的影响

与 0μM 、 1μM 浓度组比较，★ P<0.05

氟西汀对星型胶质细胞作用的后遗效应

药物作用 48h 后，与 0μM 浓度组比较，★★ P<0.01 ；撤药 24h 后，与

原 0μM 浓度组比较，★ P<0.05 ，★★ P<0.01

氟西汀对 GDNFmRNA 表达水平的影响

与 0μM 、 1μM 、 5μM 浓度组比较，★★ P<0.01 ；与 10μM 浓度组比较★ P<0.05

实验结果 (2)

动物层面的研究

各组大鼠的糖水消耗

应激第 21 天后抑郁组与对照组、对照加药组及抑郁加药

组相比，★ P<0.05

应激第 21 天后抑郁组与对照组、对照加药组及抑郁加药组相比，★★ P<0.01 ，★ P<0.05

各组大鼠的旷野试验得分

与对照加药组相比，★★ P<0.01 ；与对照组相比，★ P<0.05

GDNF mRNA 表达水平

对照组 对照加药组 抑郁组 抑郁加药组

β-actin

GDNF

GDNF 蛋白表达水平

各组大鼠海马区 GDNF 蛋白表达图片

实验结果 (3)

抑郁症患者层面的研究

与治疗前血清 GDNF 浓度比较，★★ P<0.01

抑郁症患者抗抑郁药物治疗前后血清 GDNF 浓度的比较

难治性抑郁症患者 MECT 前后血清 GDNF 浓度的比较

与治疗前比较，★ P<0.05

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