Зав. КДЛ: Т.Н. Емельянова Зав. КДЛ: Т.Н. Емельянова Ульяновск 2014Ульяновск 2014

Лабораторная диагностика ВИЧ Лабораторная диагностика ВИЧ инфекцииинфекции

Исследования применяемые для диагностики ВИЧ-инфекции

ИФАИммунный блоттинг

Экспресс диагностика

ПЦР

антитела к ВИЧ 1

и ВИЧ 2

определение антител к

определенным белкамвируса

антитела к ВИЧ1 и ВИЧ 2

ДНК провируса

антиген ВИЧ (р24)

РНК ВИЧ

Иммуноферментный Иммуноферментный анализанализ

Использование тест-систем 4 поколения позволяет одновременно определять как антитела к ВИЧ 1-го и 2-го типа, так и антигены (р 24).

1 этап – скрининговый

2 этап – референтный

3 этап – экспертный

Алгоритм исследованияАлгоритм исследования

ИФА на ВИЧИФА на ВИЧ–– ++

СТОПСТОППовторное исследование в дублеПовторное исследование в дубле

хотя бы один результатхотя бы один результат

Подтверждающий тест (ИФА, Блот, ПЦР)Подтверждающий тест (ИФА, Блот, ПЦР)

Исследование в динамике (ПЦР,ИФА)

Исследование в динамике (ПЦР,ИФА)

Медицинское наблюдение

и/или терапии

Медицинское наблюдение

и/или терапии

–– ++

–– ++±±

• Иммунные реакции – это специфические реакции связывания антигена с антителом с образованием иммунного комплекса.

• Двух одинаковых копий индивидуальных антигенов в природе не существует! В диагностике используют только один вид антител, который наиболее специфичен в отношении определяемого возбудителя. То есть связывание данного вида антител с определяемым антигеном происходит всегда. Чаще всего применяются IgG и IgM.

• Именно этот принцип иммунной реакции (уникальная точность и специфичность узнавания определяемого биологического объекта) лежит в основе иммуноферментного анализа.В силу высокой точности антител в узнавании антигенов, точность всего метода иммуноферментного анализа оказывается также высочайшей.

Иммунный блоттингИммунный блоттингОбозначение Геном Природа

Gp 160 ENVГликопротеин

предшественник Gp 120 и Gp41

Gp 120 ENV Гликопротеин оболочкиP 68/66 POL Обратная транскриптаза

Р55 GAGПредшественник ядерных

белковР52/51 POL Обратная транскриптаза

Gp 41 ENVТрансмембранный

гликопротеин

Р 40 GAGПредшественник ядерных

белковР 34/31 POL эндонуклеазаР 24/25 GAG Ядерный белокР18/17 GAG Ядерный белок

Интерпретация результатов Интерпретация результатов ИБИБ

интерпретация профиль

Положительный2ENV+/- GAG+/-

POL

Неопределенный

ENV +/-GAG+/- POL или GAG+

POL или GAG илиPOL

Отрицательный

Полосы отсутствуют

вообще,нет

специфических полос

Антиген р 24Антиген р 24Заявленная чувствительность тест-систем

0,5 пг/мл• Антиген р24 может быть выявлен в крови методом

иммуноферментного анализа уже через 1-2 недели после заражения и определяться до 8-й недели, затем его содержание резко снижается.

• Далее в клиническом течении ВИЧ-инфекции отмечается второй подъем содержания в крови белка р 24. Он приходится на период формирования СПИД.

Полимеразная цепная Полимеразная цепная реакция - ДНКреакция - ДНК

Обнаружение ДНК провируса ВИЧ в мононуклеарных клетках периферической крови. Используется как

диагностическая методика для прямой диагностики ВИЧ-инфекции в следующих случаях:

• При обследовании детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей. Использование ПЦР в этом случае позволяет сократить сроки постановки диагноза ВИЧ-инфекции с 18 месяцев до 3-6 месяцев.

• В случае сомнительного результата ИБ.

• В период серологического "окна".

Обнаружение РНК ВИЧ -«вирусная нагрузка».

• Используется для количественного измерения концентрации вируса в крови с целью прогноза и мониторинга уже установленной ВИЧ-инфекции.

• Вирусная нагрузка отражает интенсивность репликативного процесса в инфицированных клетках.

• ВН при первичной инфекции высокая и находится в интервале 104-106, но с началом сероконверсии содержание РНК в плазме крови начинает резко снижаться вплоть до уровня, не выявляемого обычными методами

Иммунный статусИммунный статусПодсчёт CD4+ лимфоцитов является критическим параметром в мониторинге ВИЧ-инфекции и позволяет:

• Оценивать состояние иммунной системы.

• Наряду с клинической информацией определять момент начала антиретровирусной терапии.

• Определять сроки для профилактики оппортунистических инфекций .

• Оценивать эффективность лечения.

Экспресс диагностика ВИЧЭкспресс диагностика ВИЧ

проточный Цитофлюориметр «Citomics FC500»

ПЦМ позволяет проводить иммунофенотипирование любых клеток, к поверхностным или внутренним

антигенам которых получены моноклональные антитела

Амплификатор в режиме реального времени “Abbott m2000rt”

Станции пробоподготовки позволяют автоматически подготовить пробы к измерению и свести ручной труд к

минимуму.

Скорость, достоверность, воспроизводимость, точность, информативность и объективность полученных ПЦМ цитологических характеристик

настолько высоки, что существующие сегодня другие методы оценки иммуногенетических и фенотипических свойств клеток не могут серьезно

конкурировать с этой технологией.

Факторы, влияющие на результаты диагностики

• выбор соответствующего метода лабораторного исследования;

• правильная подготовка пациента к исследованию;• правильный забор крови;• правильная предварительная подготовка крови и

своевременное проведение исследований;• правильное хранение и доставка материала в лабораторию;• материально-техническое обеспечение лабораторного

исследования;• уровень квалификации медицинского персонала,

проводящего исследование.

Сыворотка кровиСыворотка крови..• Завершённое формирование фибринового сгустка Завершённое формирование фибринового сгустка (фибрин – (фибрин –

источник ложноположительных результатов)источник ложноположительных результатов)

• Исключение возможности контаминации одного образца Исключение возможности контаминации одного образца другим другим (использование индивидуальных палочек или наконечников для (использование индивидуальных палочек или наконечников для обведения сгустка, использование закрывающихся пробирок при обведения сгустка, использование закрывающихся пробирок при транспортировке). транспортировке).

• Сыворотки должны быть прозрачными, без признаков хилёза, Сыворотки должны быть прозрачными, без признаков хилёза, гемолиза, «проростов», клеточной взвеси.гемолиза, «проростов», клеточной взвеси.

Плазма.Плазма.• Должна быть свободна от тромбоцитов.Должна быть свободна от тромбоцитов.• Сроки хранения: На ИС 48 часов при комнатной температуре в Сроки хранения: На ИС 48 часов при комнатной температуре в

темном месте.темном месте.• На ИФА : сыворотка хранится в холодильнике не более 7 суток.На ИФА : сыворотка хранится в холодильнике не более 7 суток.• На ВН : если плазма не исследуется сразу, то должна быть На ВН : если плазма не исследуется сразу, то должна быть

заморожена при заморожена при t t – 20 град.– 20 град.

ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ

Для повышения уровня качества исследований, проводимых в лаборатории необходимо:• Регулярно участвовать в системах внешней оценки

качества;• для оценки правильности проводимых исследований

применять стандартные контрольные материалы;

• для оценки воспроизводимости исследований проводить внутрилабораторный контроль качества каждой постановки ИФА, с последующим построением контрольной карты и анализом полученных результатов;

• постоянное повышать квалификацию персонала;

• строго соблюдать инструкции к тест-системам

БлагодарюБлагодарю за за внимание!внимание!