第九章 生物物质分离与纯化
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第九章 生物物质分离与纯化. 王雪青. 9.1 概述. 生物物质分离( Bioseparation) 是生物化工的一个重要的组成部分,常称之为下游过程( Downstream processing )。其与上中游同样重要,在某种程度上,甚至大于它们。前者解决丰产问题,而下游分离过程解决丰收问题。 生物物质的分离区别于其它物质的分离在于 A: 目的产物浓度很低。因此耗能、费用增高和产物的价格也相应的增加。 B: 生物物质易受环境因素如温度、 pH 、金属离子和微生物等的影响,增加了分离的难度。 C: 对终产品的质量要求极高。特别是医药产品或作为生物制剂的产品。 - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
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第九章 生物物质分离与纯化第九章 生物物质分离与纯化
王雪青王雪青
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9.1 概述
生物物质分离( Bioseparation) 是生物化工的一个重要的组成部分,常称之为下游过程( Downstream processing )。其与上中游同样重要,在某种程度上,甚至大于它们。前者解决丰产问题,而下游分离过程解决丰收问题。
生物物质的分离区别于其它物质的分离在于
A: 目的产物浓度很低。因此耗能、费用增高和产物的价格也相应的增加。
B: 生物物质易受环境因素如温度、 pH 、金属离子和微生物等的影响,增加了分离的难度。
C: 对终产品的质量要求极高。特别是医药产品或作为生物制剂的产品。
因此它是一项十分艰巨和耗资巨大的工作。对于传统发酵工业
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Separation Processes: Separation Processes:
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来说,(如抗生素、乙醇、柠檬酸等生产 ), 分离和提纯部分费用占总投资的 60% ,而对基因工程菌的发酵占到90% ,对其下功夫研究和设计是一项十分重要和有意义的工作。
表 9-1 几种典型产品发酵液的浓度
产品产品 典型浓度典型浓度(( g/L)g/L)
产品产品 典型浓度典型浓度(( g/L)g/L)
抗生素抗生素氨基酸氨基酸酒精酒精
2525
100100
100100
有机酸有机酸酶酶R-DNAR-DNA 蛋白蛋白质质
100100
2020
1010
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下游加工过程应遵循的原则下游加工过程应遵循的原则
时间短;时间短; 温度低温度低 pHpH 适中适中 严格的清洗和消毒严格的清洗和消毒
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下游加工一般工艺流程下游加工一般工艺流程发酵液
细胞分离
提取、分离
纯化、精制
产物
胞外产物 胞内产物
离心或过滤
细胞破碎 整体细胞萃取
离心或过滤
离心或过滤
干燥
含产物的清液
废物
离心或过滤
干燥
产物
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一、发酵液的预处理一、发酵液的预处理 改变发酵液的性质,以利于固液分离。通过酸化、加热、改变发酵液的性质,以利于固液分离。通过酸化、加热、
以降低发酵液的黏度。以降低发酵液的黏度。 通过加入絮凝剂,使细胞或溶解的大分子聚结成较大的通过加入絮凝剂,使细胞或溶解的大分子聚结成较大的
颗粒。絮凝剂为人工合成的高分子聚合物,如聚丙烯酰颗粒。絮凝剂为人工合成的高分子聚合物,如聚丙烯酰胺和聚乙烯亚胺衍生物,天然的有机高分子物质,如壳胺和聚乙烯亚胺衍生物,天然的有机高分子物质,如壳聚糖和葡聚糖的聚糖类,明胶和海藻酸钠,以及由微生聚糖和葡聚糖的聚糖类,明胶和海藻酸钠,以及由微生物产生的物质如糖蛋白、粘多糖、纤维素和核酸等,絮物产生的物质如糖蛋白、粘多糖、纤维素和核酸等,絮凝法常可得到粗大的絮团。凝法常可得到粗大的絮团。
通过加入一些中性盐,导致胶体出现凝聚的不稳定的现通过加入一些中性盐,导致胶体出现凝聚的不稳定的现象。表征电解质凝聚能力的大小用凝聚价,即使胶粒 发象。表征电解质凝聚能力的大小用凝聚价,即使胶粒 发生凝聚作用的最小电解质的浓度。因此反离子价数越高生凝聚作用的最小电解质的浓度。因此反离子价数越高该值就越小,凝聚能力就越强。常用的凝聚剂为明该值就越小,凝聚能力就越强。常用的凝聚剂为明矾,矾, AlCl3AlCl3·6H2O, FeCl3, ZnSO4, MgCO3·6H2O, FeCl3, ZnSO4, MgCO3 。采用凝聚。采用凝聚的方法得到的凝聚体颗粒比较小。的方法得到的凝聚体颗粒比较小。
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二、发酵液的固液分离二、发酵液的固液分离 通过固液分离,去除了发酵液中的固相通过固液分离,去除了发酵液中的固相
物质,为后续过程提供澄清或洁净的原物质,为后续过程提供澄清或洁净的原料液体。通常采用的单元操作为过滤和料液体。通常采用的单元操作为过滤和离心。离心。
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设备设备 特点特点 缺点缺点板框过滤机平板过滤机
真空旋转过滤机管式过滤机蜂窝式过滤机深层过滤机
设备简设备简单,操单,操作容易,作容易,适合大适合大规模工规模工业生产业生产
分离速度低,分离速度低,分离效果受分离效果受物料性质变物料性质变化影响,劳化影响,劳动强度大动强度大
过滤设备的种类和特点过滤设备的种类和特点
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主要离心设备
设备设备 特点特点 缺点缺点高速冷冻离心机
碟片式离心机
管式离心机
倾析式离心机
框式离心机
适用于粒径小,热稳定适用于粒径小,热稳定性差物质的回收,常试性差物质的回收,常试验实用验实用适用于大规模生产,可适用于大规模生产,可连续或间歇操作,稳定连续或间歇操作,稳定性好,以放大和推广。性好,以放大和推广。
批式操作、转速高、分批式操作、转速高、分离效果好,含水率低,离效果好,含水率低,易放大。易放大。
连续操作,易放大和工连续操作,易放大和工业应用,操作稳定。业应用,操作稳定。
适用于大颗粒物质回收,适用于大颗粒物质回收,放大易,适于工业应用。放大易,适于工业应用。
容量小,连续操作和规容量小,连续操作和规模化生产困难,模化生产困难,
半连续或间歇操作出渣半连续或间歇操作出渣及清洗繁杂,连续操作及清洗繁杂,连续操作出渣的固形物含水率大。出渣的固形物含水率大。容量有限,噪声大。容量有限,噪声大。
设备投资高,小颗粒物设备投资高,小颗粒物质回收困难。质回收困难。
分离效果差,设备投资分离效果差,设备投资高,操作成本高。高,操作成本高。
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Disc-Centrifuges
Solids-retainingcentrifuge
Nozzle with pressurizeddischarge of concentrate
Nozzle with peripheralnozzles
Periodicallysolids-ejectingcentrifuge
Periodicallysolids-ejectingcentrifuge withaxial channels
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Centrifuges
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三、细胞破碎破碎方法
机械方法 非机械方法
固体剪切力 流体剪切力 干燥处理 溶胞处理
球磨法
压榨法
高压匀浆
超声法
酶溶法
化学法
物理法
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压力破碎法:利用压力释放时的固液剪切进行破碎。操作简单,可连续操作,适用面广,但操作会产生热,需有冷却系统,同时破碎率低。
珠磨破碎法:利用固体的剪切进行破碎。操作简单,可连续 /批式操作,适用面广,但操作会产生热,需有冷却系统,不同细胞的破碎条件差异大。
超声破碎法:利用超声波形成空穴产生压力冲击进行破碎。操作简单,可连续 / 批式操作,但操作会产生热,需有冷却系统,破碎率低,适应性差。
渗透压法:利用渗透压的突变,造成细胞内压力差而引起细胞的破碎。破碎率低,产物释放较好,操作复杂,条件要求苛刻,适用于少量样品的处理,费用高。
有机溶剂法:利用有机溶剂或表面活性剂改变细胞壁 /膜的通透性,使包内产物释放的方法。该法简单,内含物释放少,产物较纯,可规模化生产,但适用面窄。
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碱或酶处理法:利用碱或酶的处理是细胞壁或膜破坏,产物得以释放。该法简单,可规模化生产,但适用面窄。
选择破碎法的依据:
细胞的处理量:
大规模,则一般采用机械法,而实验室规模的,则选择非机械法。
细胞壁的强度和结构:
酵母和真菌,含有纤维素和几丁质,比细菌的胞壁强度大,应选择高压匀浆法。而对于有高度分之的微生物,会阻塞匀浆气阀而不能应用。
目的产物对破碎条件的敏感性:
破碎程度:由于破碎会使细胞碎片细小,使固液分离困难,
所以,适宜的操作条件是高的产物释放率,低能耗和便于后续提取三个方面权衡。
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Cell disruption Cell disruption equipmentequipment
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四、分离和纯化
主要任务是提高溶液中的产品的浓度,同时也取出一些杂质。传统的方法包括沉淀法、吸附法、离子交换、萃取法,另外,含有超滤、反渗透,电渗析、凝胶电泳等,常用的为蒸发、萃取和吸附。
1. 液体蒸发:又称浓缩,通过加热是溶液中的部分水汽化并出去,以提高溶液的浓度。蒸发的持续进行必须满足而个条件:其一,保证连续的提供不断汽化所需的热量,同时不断的移去二次蒸汽。
2. 液 -液萃取:是一种常用的方法。应用于抗生素、有机酸、维生素、激素等发酵产物的分离和提取。特别是近 20年,与其它的技术性结合产生了新的分离技术,用于提取酶、蛋白质、核酸、多肽和氨基酸。 如:反胶囊萃取( reversed micelle extraction), 超临界萃取( supercritical fluid extraction ) 和液膜萃取( liquid membrane extraction) 等适合 DNA重组技术和遗传工程的发展
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ExtractorsExtractors
溶质在二个互不相容的溶剂的分配系数不同,所造成的溶质的转移。
混合器和澄清器
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3. 双水相萃取; 二种互不溶的聚合物,这两种的聚合物中的含水率很高,一般在 70-90% ,这样就可以防止在有机相中的变性,同时这些高聚物含有保护和稳定蛋白质等生物活性物质的作用。
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4. 反胶团萃取; 在有机相中加入一定量的表面活性剂,形成大小为毫微米级的微胶团。当此有机相与含有目的产物的水相形成液 -液萃取时,由于微胶团中的表面活性剂带有与水相中的蛋白质相反的电荷,而将水相中的蛋白质迁移入微团内水池中,实现物质的提取。
5. 超临界萃取; 同样为溶剂萃取。而此方法使用的溶剂是在超临界状态下的液态气体,常用的为 CO2, 它具有液体的密度和气体的高扩散性,产品分离容易等特点。受到广泛的关注。
For pure CO2, the critical conditions ; For pure CO2, the critical conditions ; Pressure(73atm), temperature(31.1°C)Pressure(73atm), temperature(31.1°C)
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Supercritical Fluid Supercritical Fluid ExtractionExtraction
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6; 固体吸附:
是物质从液相(发酵液)到固相(吸附剂)发生物质的转移。此法用于蛋白质、核酸、氨基酸、抗生素等物质的分离和提取。
按照吸附剂的作用原理:分为三大类。
A 物理吸附:
依靠范德华力的作用。吸附剂可用活性炭、硅藻土、硅胶、分子筛和氧化铝等。
B 静电吸附:
借助静电引力吸附物质。主要为合成的树脂。
C: 亲和吸附:
在树脂上嫁接一个能与要分离的物质发生特异性反应的配基。
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五、提纯
1 ,层析法( Elution Chromatography) 又称洗脱法 / 色谱法。他们与吸附法本质上是相同的。但在操作过程不同。造成了结果不同。
吸附法吸附和洗脱间断进行,收集洗脱液也为一次性、不分段。因此,只有浓缩而无分离。
层析法则是吸附和洗脱同时进行,分段收集洗脱液,因此分离和浓缩同时完成。
层析法又分为离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析
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Column Column ChromatographyChromatography
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Ion ExchangeIon Exchange
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Gel FiltrationGel Filtration
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Affinity Affinity ChromatographyChromatography
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2 :沉淀法
适合大规模生产,通过采取不同的手段使发酵液中目的物质溶解度降低,使之发生沉淀,达到分离提纯的目的。
常用等电点沉淀法、盐析法、加热沉淀法、有机溶剂沉淀法等
3. 超滤法
是一种半透膜,使溶液中的溶剂和小分子物质通过,而阻止截流大分子物质的方法。
超滤区别于常规过滤主要采用了错流手段消除浓差极化
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4 :电泳法
在电场的作用下发生的带电粒子定向运动,其移动的速度受到物质所带电荷多少而不同,依据此而进行分离纯化的方法。
该法无法实现规模化生产,价格贵。量少。
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SDS PAGE of SDS PAGE of PurificationPurification
10 micrograms loaded in each lane
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六、最后加工包括结晶和干燥
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Industrial Scale upIndustrial Scale up To transfer the To transfer the
pilot scale results pilot scale results into a into a commercially commercially feasible feasible production setting.production setting.
Fermentor sizes Fermentor sizes range from 100 L range from 100 L to 500,000 L, to 500,000 L, depending on depending on products.products.