Лекция 3 Структура и функции РНК.. rna.pdf · 2014-10-20 ·...

Скоблов Михаил Юрьевич

Молекулярная биология

Лекция 3. Структура и функции РНК.

Часть 1. Общие характеристики транскриптома

Гипотеза мира РНК

Joyce GF. The antiquity of RNA-based evolution. Nature. 2002 Jul 11;418(6894):214-21.

Гипотеза мира РНК • В химическом синтезе, и в биохимических реакциях

рибонуклеотиды предшествуют дезоксирибонуклеотидам.

• В самых древних, универсальных процессах жизненного метаболизма широко представлены именно рибонуклеотиды, а не дезоксирибонуклеотиды, включая основные энергетические носители типа рибонуклеозид-полифосфатов (АТФ и т.п.).

• Репликация РНК может происходить без какого бы то ни было участия ДНК, а механизм редупликации ДНК даже в современном живом мире требует обязательного участия РНК-затравки в инициации синтеза цепи ДНК.

• Обладая всеми теми же матричными и генетическими функциями, что и ДНК, РНК способна также к выполнению ряда функций, присущих белкам, включая катализ химических реакций.

• Биосинтез белка почти целиком осуществляется с помощью различных видов РНК.

Состав РНК в клетке Клетка млекопитающего содержит около 20-30 пикограмм РНК, что составляет около 1% массы клетки.

Тотальная РНК

мРНК Около 4%

Рибосомальная РНК

Около 80%

Транспортная РНК

Около 15%

• Транскрипт — молекула РНК, образующаяся в результате транскрипции участка ДНК.

• Транскрипто́м — совокупность всех транскриптов, синтезируемых одной клеткой или группой клеток, включая мРНК и некодирующие РНК.

• Транскриптомика изучает структуру и динамику транскриптома

Основные понятия

Транскрибирующаяся часть генома

• по разным оценкам транскрибируется от 50% до 80% геномной

ДНК

• из которой 2% транслируется в белки

• оставшиеся 98% являются не-кодирующими РНК (ncRNAs)

3 May 2002 Vol 296 Science

Геном «любит» экспрессироваться

• Промоторы расположены повсеместно, с большинства из них экспрeссируются некодирующие РНК, функции которых большей частью неизучены.

• Наблюдение: в опухолях экспрессируется много некодирующих РНК, а также опухоль-специфичных изоформ известных генов.

• Общая эпигенетическая «разболтанность» опухолевой клетки высока

Гены транскрибируются на разном уровне в разных тканях

Если взять любую ткань, то мы увидим, что половина генов человека вообще в ней не экспрессируется, а другая половина имеет следующее распределение по уровням экспрессии

Гены транскрибируются на разном уровне в разных тканях разными наборами генов

Исследования проекта FANTOM5 выявили 7523 генов домашнего хозяйства (house-keeping).

Гены транскрибируются на разном уровне в разных тканях разными наборами генов и разными вариантами генов

Альтернативный сплайниг альфа-тропомиозина.

Гены транскрибируются на разном уровне в разных тканях разными наборами генов и разными вариантами генов

Ткане-специфичная экспрессиия альфа-тропомиозина

Гены транскрибируются на разном уровне в разных тканях разными наборами генов и разными вариантами генов на разных уровнях

Транскриптом

«ПолиА+» РНК «ПолиА-» РНК

Транскрипты генов имеют разное время жизни в клетке

Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Geisberg JV, Moqtaderi Z, Fan X, Ozsolak F, Struhl K. Cell. 2014 Feb 13;156(4):812-24.

Было исследовано время полужизни для 21,248 mRNA дрожжей


Белок-кодирующие РНК

Белок-некодирующие РНК

• К 2007 году из 7000 генов у дрожжей была известна функция только для 1000 генов.

• У человека известна функция примерно для половины генов

• Каждый год примерно для 100 генов открывают функцию

Заниматься исследованиями белок-

некодирующих РНК – модно!

• A non-coding RNA (ncRNA)

is a functional RNA

molecule that is not

translated into a protein

Возраст транскриптома



Из 14’682 белок-некодирующих РНК человека: • 81% - примато-специфичные lncRNA • 19% - произошли более 90 миллионов лет назад • 3% (425) - произошли более чем 300 миллионов лет назад

Возраст ДНК 3.5 миллиарда лет

Короткие: • miRNA • rasiRNA • piRNA • ….




House-keeping: • rRNAs • snRNAs • tRNAs • ….

Условное разделение

Длинные: • long ncRNA • pseudogenes • antisense • ….

Кодирует или не кодирует? – вот в чём вопрос!

Экспериментатор получает нуклеотидную последовательность РНК ….

Экспериментальная проверка Долгий путь, время и финансово затратный….

Биоинформатический анализ

Два основных критерия:

1. Кодирующая рамка более 300 нуклеотидов 2. Консервативность аминокислотной последовательности

• Корреляция между уровнями экспрессии белка и мРНК в клеточной линии VCaP достигает 0.61 – лучший результат на сегодня.

• Существуют сотни мРНК у которых нет белка, и наоборот!

Реализация кодирующего потенциала РНК

• Цель проекта Протеом - инвентаризация всех белков человека и выяснение взаимодействий между ними.

• Российская часть проекта – определение протеома 18-й хромосомы человека.

• Из 300 белок кодирующих генов с помощью масспектрометрических подходов идентифицировано 80% белков.

neXtProt

• В базе данных зарегистрировано 15’126 белков, чьё существование доказано экспериментально.

• Всего «ожидается» 20’119 белков, изоформ (за счет сплайсинга) - 38’391.

Часть 2. Описание и функции коротких некодирующих РНК

• miRNA • rasiRNA • piRNA • ….

Короткие белок-некодирующие РНК

Andrew Z. Fire & Craig C. Mello

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006

"for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA"

Nature 382, 713 - 716 (22 August 1996);

Repression of gene expression in the embryonic germ lineage of C. elegans Geraldine Seydoux*†, Craig C. Mello‡§, Jonathan Pettitt§ , William B. Wood , James R. Priess‡ & Andrew Fire* THE distinction between soma and germline was recognized more than a century ago: somatic cells form the body of an organism, whereas germ cells serve to produce future generations1. In Caenorhabditis elegans, the separation of soma and germline occurs through a series of asymmetrical divisions, in which embryonic germline blastomeres divide unequally to produce one somatic daughter and one germline daughter2. Here we show that after each asymmetrical division, embryonically transcribed RNAs are detected in somatic, but not germline, blastomeres. This asymmetry depends on the activity of the germline-specific factor, PIE-1. In the absence of PIE-1, embryonically transcribed RNAs are detected in both somatic and germline blastomeres. Furthermore, ectopic expression of PIE-1 in somatic blastomeres can significantly reduce the accumulation of new transcripts in these cells. Taken together, these results suggest that germ-cell fate depends on an inhibitory mechanism that blocks new gene expression in the early embryonic germ lineage.

RNA-интерференция – это подавление

экспрессии генов у эукариот (замалчивание

генов) на посттранскрипционном уровне,

индуцированное короткими

интерферирующими RNA (siRNA)

Механизм RNA-интерференции

RNA-интерференцию обнаружили у большинства эукариотических организмов

в частности у

простейших

кишечнополостных

насекомых

грибов

растений

млекопитающих

Биологическая роль RNA-интерференции

Репрессия чужеродных последовательностей

- ДНК- и RNA-содержащих вирусов

- мобильных элементов

Подобие иммунной системы на уровне

последовательностей нуклеиновых кислот

Молекулярные механизмы RNA-интерференции

siRNA

- двуцепочечные

- 21-25 п. н.

- 5’-фосфатный конец

- 3’-гидроксильный конец

- 2 неспаренных нуклеотида на 3’-конце

микроРНК

Оказалось, что некоторые гены могут сворачиваться в шпильки, тем самым образуя протяжённые двуцепочечные РНК, которые могут «нарезаться» в микроРНК схожим путём.

miRNA экспрессируются в виде: отдельных генов - 60% в составе кластеров - 15% в интронах - 25%

Транскрипция miRNA

• Время полужизни miRNA в среднем более 24 часа, а для некоторых составляет до 220 часов.

• Такая высокая стабильность является причиной высокой эффективности действия

микроРНК

miRNA и siRNA

• разрезание матричной RNA полная комплементарность к РНК

• репрессия трансляции

частичная комплементарность к РНК

• ремоделирование хроматина комплементарность к ДНК

Регуляция экспрессии генов на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях происходит с помощью малых RNA

Регуляция экспрессии генов с помощью miRNA

CLASH method - Cross-linking, Ligation, and Sequencing of Hybrids

Используя иммунопреципитацию за белок AGO1 были выявлены 18’514 miRNA-RNA взаимодействий в клеточной линии HEK293.

Регуляция экспрессии генов с помощью miRNA

Luo et al. BMC Medical Genomics 2012 5:3

RNA-интерференция

“Эндогенные”

последовательности Транспозоны Вирусы Трансгены

dsRNA

siRNA

Репрессия

трансляции Разрезание

mRNA

Метилирование

(ДНК/гистоны)

Замалчивание

транспозонов

Ремоделирование

хроматина

+ miRNA

Гены, интроны

DNA-интерференция

DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute. Swarts DC, Jore MM, Westra ER, Zhu Y, Janssen JH, Snijders AP, Wang Y, Patel DJ, Berenguer J, Brouns SJ, van der Oost J. Nature. 2014 Mar 13;507(7491):258-61.

• Механизм РНК-интерференции осуществляется за счет очень консервативного семейства белков Argonaute (Ago)

• Белки семейства Argonaute есть даже у прокариот, но механизма RNA-интерференции нет.

• Оказалось, что у одной эубуктерии Thermus thermophilus белок TtAgo реализует механизм DNA-интерференции, аналогичным образом.

• Затравкой для него являются 5’-фосфорилированные ДНК олигонуклеотиды длинной 13-25 нуклеотидов.

• Считается, что бактерия тем самым защищается от чужеродной ДНК.

Защита от ДНК

Защита от РНК

Регуляция экспрессии

The microRNA (miRNA)-virus vaccine strategy

Экзосомы

Экзосомы и миРНК

Норма – клеточное общение, взаимодействие…. Патология – инвазия опухолеспецифичного набора миРНК

• Одна miRNA может изменять экспрессию нескольких сотен mRNA (mRNA degradation)

• Одна miRNA может блокировать трансляцию нескольких сотен mRNA (translation suppression)

• Одна miRNA может регулировать белковый синтез нескольких тысяч генов (напрямую + опосредованно)

Andrew Z. Fire Craig C. Mello

2006 Нобелевская премия по Физиологии и Медицине за “их открытие РНК интерференции – генного замалчивания с помощью двухцепочечной РНК”

На сегодняшний день по данным базы данных miRBase у человека описано 1100 miRNA (Release 14.0).

Предсказание взаимодейств

ия миРНК с мРНК

• Если одна miRNA может регулировать экспрессию сотен РНК, то экспрессия этих РНК оказывается связанной

• ceRNA – competitive endogenous RNA – конкурентные эндогенные РНК

Регуляция экспрессии за счет miRNA

piРНК

• Piwi-interacting RNA (piRNA) – самый большой класс малых РНК, экспрессируемых в клетках животных. У мыши известно более 50’000 уникальных последовательностей piРНК, у Drosophila более 13’000.

• Названы так потому что образуют комплексы с белками Piwi.

• piРНК — одноцепочечные молекулы длиной в 24–30 нуклеотидов, закодированные в центромерных и теломерных областях хромосомы.

• Последовательности многих из них комплементарны известным мобильным генетическим элементам (в основном транспозонам), однако есть множество других piРНК, совпадающих с участками рабочих генов или с фрагментами генома, функции которых неизвестны.

• Обычно U на 5’ конце, 5’ монофосфат и 3’ O-метильная группа.

• Значительное число идентифицированных piРНК имеет А в 10й позиции.

Визуализация piРНК– содержащих комплексов на хромосомах Drosophila

piРНК

• У млекопитающих встречаются только в мужских половых клетках, около 1млн. копий на клетку.

• У беспозвоночных и в женских, и в мужских половых клетках.

piРНК

• Главная функция piРНК — подавление активности мигрирующих генетических элементов.

• piРНК активны только во время эмбриогенеза, когда непредсказуемые перетасовки генома особенно опасны и могут привести к гибели зародыша

• Один из предполагаемых механизмов биогенеза –”Ping Pong” (не у всех объектов объектов):

• Первичные piРНК узнают комплементарные им мишени (транскрипты с транспозонов и других повторов) и их комплекс привлекает белки Piwi.

• Piwi расщепляет мишень в позиции 10 н. от 5’ конца первичной piРНК, образуется вторичная piРНК, которая включается в Piwi.

• Одноцепочечные короткие РНК - 24- 29 нук. • Выявлены у Drosophila и некоторых одноклеточных эукариот. У

млекопитающих до сих пор не обнаружены. • Предполагается участие в формировании клеток зародышевого

пути. • Предполагаемый предшественник – дцРНК, образующаяся в

результате транскрипции с обеих цепей повторяющихся элементов генома.

• Биогенез не требует участия Dicer, но требует белка Ago3 (Argonaute, Piwi и Piwi- подобный белок Aub (от Aubergine –мутация у Drosophila), у растений нет Piwi белков, но есть rasiРНК, образующиеся с участием Dcl-белков.

• Мутации белков Piwi, ассоциированных с rasiРНК у Drosophila, приводят к стерильности и отсутствию формирования клеток зародышевого пути у особей обоего пола.

rasiРНК Repeat associated small interfering RNA

Малые ядерные РНК ‐ мяРНК (snRNA)

• Локализованы в ядре • Размер от 90 до 300 нуклеотидов • На 5’ конце имеют КЭП • Участвуют в сплайсинге пре-мРНК • Расщепляют полицистронные мРНК • Поддерживают редупликацию теломер • Регулируют транскрипцию.

Часть 3. Описание и функции длинных некодирующих РНК






Условное разделение


ENCyclopedia Of DNA Elements

The GENCODE Project

ENCyclopedia of genes and gene variants

long noncoding RNAs - lincRNA

• Было найдено и проаннотировано 9277 генов экспрессирующих 14’880 длинных некодирующих транскриптов

• Критерии lincRNA: • Транскрипт не должен содержать ORF • Длинна транскрипта должна быть более 200 н.п.

Картирование lincRNA

Intergenic lncRNA Genic lncRNA

Характеристики lincRNA

Анализ размеров транскриптов Анализ альтернативных изоформ

Характеристики lincRNA

Анализ повторов среди lncRNA и mRNA

экзоны

Консервативность lincRNA

Селективное давление на lncRNA человека слабее, чем на белок-кодирующие гены

Многие lncRNA являются примато-специфичными

Экспрессия lincRNA

Экспрессия lincRNA

Большинство белок-кодирующих генов (65%) были обнаружены во всех тканях по сравнению с 11% lncRNA

• 21% lncRNA не были обнаружены ни в одной ткани

• 11% lncRNA были обнаружены только в одной ткани

Локализация lincRNA

Во всех клеточных линиях, за исключением NHEK (Keratinocytes) наблюдалось обогащение lncRNA в ядре, по сравнению с белок-кодирующими мРНК

Long noncoding RNAs are rarely translated in two human cell lines. Bánfai B, Jia H, Khatun J, Wood E, Risk B, Gundling WE Jr, Kundaje A, Gunawardena HP, Yu Y, Xie L, Krajewski K, Strahl BD, Chen X, Bickel P, Giddings MC, Brown JB, Lipovich L. Genome Res. 2012 Sep;22(9):1646-57.

Трансляция lincRNA

• Для клеточных линий K562 и GMI2878 были сделаны RNAseq и масспектропетрия MS/MS

• Для lncRNA в 13 раз меньше находятся пептиды чем для mRNA

• Для 9640 lncRNA было показано, что 92% lncRNA не транслируется в белок

• Для 69 lncRNA было найдено 85 уникальных пептидов – неправильная аннотация как lncRNA

Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins. Mitchell Guttman, Pamela Russell, Nicholas T. Ingolia, Jonathan S. Weissman, Eric S. Lander. Cell. Vol. 154, Issue 1, 240-251, 27 June 2013

Трансляция lincRNA

• В статье проводился анализ данных экспериментов по рибосомному профайлингу.

• Авторы показали, что рибосома связывается с lincRNA также хорошо, как и с мРНК.

• Пробуя применять различные подходы, авторы разработали формулу позволяющую различить РНК способную транслироваться (мРНК) от неспособной (lincRNA).

• Она учитывает количество рибосом в кодирующей части относительно 3’UTR, уровни экспрессии данных участков, а так же частоту замен в кодонах.

Время жизни транскриптов в клетке

Для 800 не-кодирующих РНК и 12’000 кодирующих мРНК мыши были определены времена полужизни.

Genome-wide analysis of long noncoding RNA stability. Clark MB, Johnston RL, Inostroza-Ponta M, Fox AH, Fortini E, Moscato P, Dinger ME, Mattick JS. Genome Res. 2012 May; 22(5):885-98.

Результаты 1 контрольной

Приз лекторской симпатии

Елизарова Анна 3113 9 Власёнок М 3113 8 Конина Д 3112 8

Пинигин Константин 3113 8 Потапов Анатолий 3111 8

Пикунов Андрей 3114 7

Герои

Слабое звено

Бальков А 3111 3 Ворошилова Вика 3114 3

Иджилова 3114 3 Курилович Анна 3112 3

Тураев 3112 3 Ческидова Е.И. 3 Бурдакова Ольга 3111 2

Ивченко Дмитрий 3113 2 Пашкова Мария 3111 2

Часть 4. Примеры реализации функции длинных некодирующих РНК

Некодирующая XIST РНК

Тельце Барра — свёрнутая в пло́тную структуру неактивная X-хромосома, наблюдаемая в интерфазных ядрах соматических клеток самок плацентарных млекопитающих, включая человека.


• XIST (X-inactive specific transcript) ген экспрессирующий некодирующую РНК с Х-хромосомы плацентарных млекопитающих, которая участвует в инактивации Х-хромосомы.

• XIST РНК – транскрипт длинной около 17 kb (у человека), экспрессирующийся только с неактивной хромосомы.

• XIST РНК процессируется как и любая обыкновенная мРНК.

• TSIX РНК – некодирующая РНК, длинной около 37 Kb. • Транскрипт TSIX является антисмысловым к транскрипту гена XIST, и является

негативным регулятором гена XIST. • X-хромосомы, не экспрессирующие TSIX и имеющие поэтому повышенный уровень

экспрессии XIST, инактивированы намного чаще, чем обычные хромосомы

• Гены XIST и TSIX находятся в X хромосоме локуса XIC (X inactivation centre)

• Встраивание этого района в ЛЮБУЮ хромосому ведет к её сайленсингу

• Транскрипт гена XIST покрывает неактивную Х хромосому Xi, что в конечном счете приводит к ее инактивации

• В яйцеклетках и их предшественников обе Х активны

• На стадии 4 клеток пришедшая от отца X инактивируется

• Все клетки экстраэмбриональных тканей (амнион, плацента и т.п.) сохраняют этот импринт и содержат инактивированную отцовскую X, что обусловлено импринтингом локуса XIST


Виды Количество

генов

Количество

процессированных

псевдогенов

%

Arabidopsis 33583 4260 13

Caenorhabditis elegans 21187 2445 12

Drosophila melanogaster 22372 2208 10

Danio rerio 34291 16357 48

Gallus gallus 22720 5539 24

Canis lupus familiaris 24953 12852 52

Rattus norvegicus 42743 13962 33

Mus musculus 58433 19119 33

Pan troglodytes 32989 16785 51

Homo sapiens 42000 17609 42

Процессированные псевдогены

• Образованы десятью процентами кодирующих генов

• Около 80% примато-специфичные

• До 20% псевдогенов человека транскрипционно активно

функциональность

?

miR-17 miR-21 miR-214 miR-19 miR-26

• В нормальных образцах и рака простаты найдена прямая корреляция экспрессии между PTEN и PTENP1

• Локус PTENP1 селективно теряется при раке

• 3’ UTR PTENP1 проявляет активность опухолевого супрессора

“PTEN is a functionally haploinsufficient tumour suppressor gene”.

Псевдогены и miRNA


Позитивная регуляция генов за счет посредника miRNA

Endogenous miRNA sponge lincRNA-RoR regulates Oct4, Nanog, and Sox2 in human embryonic stem cell self-renewal. Wang Y, Xu Z, Jiang J, Xu C, Kang J, Xiao L, Wu M, Xiong J, Guo X, Liu H. Dev Cell. 2013 Apr 15;25(1):69-80.

sponge RNA

• lincRNA-RoR (Regulator of Reprogramming) - 2.6kb, 4 экзона

• Последовательности РНК linc-RoR и транскрипционных факторов Oct4, Sox2 и Nanog имеют общие сайты посадки с miRNA

• Таким образом linc-RoR способна предотвращать эти ТФ от miRNA-опосредованной супрессии в само-обновляющихся ESC человека.

• linc-RoR, miRNAs, and коровые ТФ образуют регуляторную схему состоящую из авторегуляторных и двух негативных цепей с обратной связью для регулирования поддержания и дифференциации ESC

sponge RNA

Вопрос

Является ли функция lncRNA в качестве губки для miRNA уникальной характеристикой lncRNA? Присущей только lncRNA, а не mRNA?

Кольцевые РНК – circular RNA


• В локусе гена CDR1 была обнаружена кольцевая антисмысловая некодирующая РНК.

• Показано, что miR-671 расщепляет эту кольцевую РНК, что приводит также к уменьшению уровня мРНК гена CDR1

• Авторы справедливо замечают, что это их работа является первой по исследованию некодирующего антисмыслового транскрипта как мишени для miRNA, что определяет новый механизм позитивной регуляции между смысловой мРНК и антисмыслово кольцевой РНК


21 March 2013 Volume 495

• Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency (Германия)

• Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges (Дания)

Было найдено:

• 1’950 circRNA у человека

• 1'903 circRNA у мыши

• 724 circRNA у C.elegans

А где были кольцевые РНК раньше?


miR-7

РНК CDR1as человека содержит 74 сайта для miR-7, 63 из которых консервативны


ciRS-7 - circular RNA sponge for miR-7

Но это только одна охарактеризованная РНК, остальные ждут своего часа…

Вопрос

Может ли кольцевая РНК содержать в себе открытую рамку считывания? Что тогда?


Initiation of protein synthesis by the eukaryotic translational apparatus on circular RNAs. Chen CY1, Sarnow P. Science. 1995 Apr 21; 268(5209):415-7.

• Эукариотическая рибосома может осуществить трансляцию белка с кольцевой РНК при наличии IRES элемента в её последовательности

• В результате получается длинный повторяющийся полипептид содержащий протяжённые открытые рамки считывания

Long noncoding RNAs with snoRNA ends. Yin QF, Yang L, Zhang Y, Xiang JF, Wu YW, Carmichael GG, Chen LL. Mol Cell. 2012 Oct 26;48(2):219-30.

Некодирующая sno-lncRNA РНК

• snoRNA – small nucleolar RNA - малые ядрышковые РНК – семейство консервативных ядерных РНК, длинной от 70 до 200 нуклеотидов

• Обычно локализуются в тельцах Кахаля (Cajal bodies) или в ядрышках

• Участвуют в модификациях (метилировании и псевдоуридилировании) рибосомных РНК, а также тРНК и малых ядерных РНК.

• Известно около нескольких сотен snoRNA, основная доля которых закодирована в интронах белок-кодирующих генов.

У большинства больных синдромом Прадера-Вилли делетирован импринтированный локус q11-q13 отцовской хромосомы 15

• Среди неполиаденилированных РНК были найдены длинные некодирующие РНК (от 1200 до 2900 нуклеотидов) содержащие в себе последовательности snoRNA

Long noncoding RNAs with snoRNA ends. Yin QF, Yang L, Zhang Y, Xiang JF, Wu YW, Carmichael GG, Chen LL. Mol Cell. 2012 Oct 26;48(2):219-30.

Некодирующая sno-lncRNA РНК После сплайсинга SNORD116 интрон, содержащий последовательности snoRNA, подвергается дальнейшему процессингу

Каждая sno- lncRNA содержит множество сайтов связывания Fox2, регулятора альтернативного сплайсинга.

Некодирующая MALAT1 РНК

• MALAT1 известна также под другим названием NEAT2 (nuclear-enriched abundant transcript 2)

• MALAT1 является lncRNA длинной более 8000 нуклеотидов. • В геноме человека находится в районе q13 хромосомы 11,

имеющему отношение к онкогенезу и метастазированию. • В первые была обнаружена в 2003 году как РНК, ассоциированная

с раком лёгких • MALAT1 является высоко консервативной среди млекопитающих и

широко экспрессируется в нормальных тканях человека и мыши • Позже было найдено, что MALAT1 оверэкспрессирована при раке

легкого, груда, толстой кишки, печени. • Оверэкспрессия MALAT1 в различных клеточных линиях

приводила к увеличению клеточной пролиферации, а в «голых мышах» увеличенный уровень MALAT1 приводил к образованию опухоли.


3' end processing of a long nuclear-retained noncoding RNA yields a tRNA-like cytoplasmic RNA. Wilusz JE, Freier SM, Spector DL. Cell. 2008 Nov 28;135(5):919-32.

Уникальный 3’ концевой процессинг

The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1 regulates alternative splicing by modulating SR splicing factor phosphorylation. Tripathi V, Ellis JD, Shen Z, Song DY, Pan Q, Watt AT, Freier SM, Bennett CF, Sharma A, Bubulya PA, Blencowe BJ, Prasanth SG, Prasanth KV. Mol Cell. 2010 Sep 24;39(6):925-38.

• В нормальных клетках MALAT1 ассоциирована с SR белками факторов сплайсинга в интерхроматиновых гранулах (nuclear speckles) и в нуклеоплазме, регулируя привлечение pre-mRNA, и тем самым регулируя альтернативный сплайсинг.

• При нокдауне MALAT1, увеличивается клеточный уровень SR белков причем преимущественно в дефосфорилированной форме, что приводит к изменениям альтернативного сплайсинга pre-mRNA.

• В случае SAT1 pre-mRNA, нокдаун MALAT1 приводит к включению альтернативного экзона содержащего слабый сайт сплайсинга.


Некодирующая NEAT1 РНК

• An Architectural Role for a Nuclear Noncoding RNA:NEAT1RNA Is Essential for the Structure of Paraspeckles (США), Molecular Cell 2009

• MENε/β noncoding RNAs are essential for structural integrity of nuclear paraspeckles (Япония), PNAS 2009

Обе изоформы локализованы в ядре

• «Paraspeckle» - пара-гранулы – названы так из-за их распределения в ядре; "para" – сокращение от параллельный, а "speckle" – как указание на схожесть с «splicing speckles» (интерхроматиновым гранулам) к которым они очень близки

• Функция их до сих пор неизвестна. • Известно что они могут участвовать в

контроле экспрессии генов через сохранение в ядре РНК содержащих дву-цепочечные участки подвергнувшиеся аденозин-инозин редактированию.



• Методами включения и выключения экспрессии NEAT1 РНК, было показано что она отвечает за сборку пара-гранул

• Критичным является 3’-район 23-Kb изоформы, с которым происходит взаимодействие DBHS белков.

• Интересно что формирование пара-гранул происходит рядом с местом транскрипции NEAT1 РНК.

• Помимо NEAT1 РНК у мышей в пара-гранулах есть ещё и Ctn кодирующая РНК (cationic amino acid transporter 2), которая в отличии от NEAT1 транспортируется сперва в цитоплазму, а оттуда после аденозин-инозин редактирования возвращается в пара-гранулы.

The Long Noncoding RNA RMST Interacts with SOX2 to Regulate Neurogenesis. Shi-Yan Ng, Gireesh K. Bogu, Boon Seng Soh, Lawrence W. Stanton. Molecular Cell, Volume 51, Issue 3, 8 August 2013, Pages 349–359.

Некодирующая RMST РНК

• Авторы нашли lincRNA и назвали её как RMST (rhabdomyosarcoma 2-associated transcript).

• RMST экспрессируется специфично в мозге, и регулируется транскрипционным репрессоров REST, увеличивая экспрессию в течении нейрональной дифференциации.

• Было показано, что RMST взаимодействует с транскрипционным фактором SOX2, основного нейронального регулятора, тем самым изменяя сайт связывания SOX2, он становится более вырожденным.

• В присутствии RMST SOX2 связывается с 5668 промоторами, в отсутствии с 2483.

• Анализ показал, что это взаимодействие необходимо для связывания SOX2 с промоторами последующих нейрогенных транскрипционных факторов.

An RNA Degradation Machine Sculpted by Ro Autoantigen and Noncoding RNA Xinguo Chen, David W. Taylor, Casey C. Fowler, Jorge E. Galan, Hong-Wei Wang, and Sandra L. Wolin.

Cell 153, 166–177, March 28, 2013

• Работа была сделана на бактерии Deinococcus radiodurans, в которой был известен белок Ro (ортолог белка Rsr), принимающий участие в созревании рибосомальной РНК и её распаде при различных стрессовых условиях.

• Было показано, что в этих процессах также принимает участие некодирующая РНК, длинной 100 нуклеотидов, имеющая несколько больших петель и длинный участок с которым связывается белок Ro.

• В этой работе установили, что Y РНК связывает экзорибонуклеазу и белок Ro, тем самым формируя активный рибонуклеопротеиновый комплекс, способный селективно деградировать РНК со вторичной структурой.

Некодирующая Y РНК

Резюме

• Длинные некодирующие РНК – регуляторные РНК, способные принимать участие в большом спектре различных регуляторных механизмов на разных уровнях.

• Но значит ли это что кодирующие РНК – мРНК не способны к проявлять такие же свойства? Кодирующий потенциал молекулы РНК это лишь одна из известных и очевидных нам функций, имеет ли она еще какие-то – это вопрос…

• Из десятка тысяч lincRNA пока известна информация для меньше сотни функционально исследованных lincRNA.

• Поэтому сейчас интересно исследовать регуляторные свойства РНК, механизмы по которым они осуществляются, в не зависимости от их белок-кодирующего потенциала.


Белок-кодирующие РНК Белок-некодирующие

РНК Мутация в гене

Замена в белке

Объяснение патогенеза

Анализ генетических заболеваний

Мутация в гене

?

Функция вторичной структуры РНК

Транспортная тРНК

Структурная Рибосомальная РНК

Ферментативная Рибозимы

Регуляторная Разные РНК

Потенциал вторичной структуры РНК

Более чем для 3000 транскриптов определены элементы вторичной структуры, что составляет около 50% всех генов Saccharomyces cerevisiae.

Потенциал вторичной структуры РНК

Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Rouskin S, Zubradt M, Washietl S, Kellis M, Weissman JS. Nature. 2014 Jan 30;505(7485):701-5.

Метод основан на модификации РНК диметил сульфатом, в результате чего модифицируются неспаренные аденин и цитозин

Лекция 3 Структура и функции РНК.. rna.pdf · 2014-10-20 ·...

Documents